JPS6037988A - 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 - Google Patents
組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は組換えウィルス発現ベクターの製法に関する。
より詳しくは、本発明は、バキーロウィルスプロモータ
ーにカップリングさせた、成る選ばれた遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノム中に導入し、昆虫細胞内でその選ばれ
た遺伝子を発現することのできる組換えバキーロウィル
ス発現ベクターを製造する方法に関する。 組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は特別の遺伝子或
いはその部分の単離並びにそれらの細菌、酵素、植物或
いは動物細胞並びにこれらの生物体に感染するウィルス
への転移を容易にした。転移された遺伝子物質（即ち、
変成遺伝子）は複製され、形質転換された細胞或いはウ
ィルス復製として遺伝される。その結果、形質転換細胞
は転移された遺伝子配列がコード（ｅｎｃｏｄｅ ）す
る生成物を産生ずる能力を獲得する。 ウィルス、真核生物及び原核生物の間の遺伝子或いはそ
の部分の転移及び発現は、全ての生物のＤＮＡがそれが
同一の弘つのヌクレオチドで構成されているという点に
おいて化学的に類似しているので可能である。基本的相
違は、生物のゲノムに表われるヌクレオチドの配列にあ
る。コドン（ヌクレオチド トリブレット）に配列され
た特定のヌクレオチド配列は、特定のアミノ酸配列をコ
ードする。しかしながら、アミノ酸配列とＤＮＡヌクレ
オチド配列間のコード（暗号づけ）関係は全ての生物体
に対して本質的に同一である。 ゲノムＤＮＡは、蛋白質コード配列（即ち、「構造遺伝
子」）及び構造遺伝子の発現を仲介する調節領域（転写
開始を制御するＤＮＡ配列は通常「プロモーター」と称
される）とに組織されている。一般的に、酵素ＲＮＡポ
リメラーゼがプロモーターによシ、それが構造遺伝子に
沿〜て移動するに際して、それがコードされた情報をメ
ツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写するように活
性化される。ｍＲＮＡは認識配列、リポソーム結合に対
する信号及び翻訳開始及び終止に対する信号を含む。遺
伝子のプロモーター領域（通常、遺伝子のｊ′側面隣接
領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ）と説明され
ている）における重要な転写信号の役割の遺伝学的分析
の最近の進歩は、ＤＮＡ配列を選択的に除去或いは変更
してそれらの発現における機能及び役割を研究すること
及びこれらの配列の幾つかを除去して、それらの例えば
組換えＤＮＡ宿主−ベクター系などの異種生物学系にお
ける機能を研究することを容易に行うことができるよう
にした。 真核生物のプロモーターは、通常その配置及び原核生物
プロモーター配列への構造的類似性（Ｂｒｅｓｔｈｎａ
ａｂ ＆ Ｃｈａｍｂｏｎ、 ！ＯＡｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ。 ３弘ターＪＪ’Ｊ （／９１１ ） ）が転写の促進へ
の関与を示唆する２つのヌクレオチドの保存配列により
特徴付けられている。第１のものは、ＲＮＡ開始部位（
ｍＲＮＡに対する転写開始部位であるキャップ部位）か
らｍ〜３０塩基対上流に位置する核酸アデニン及びチミ
ンに富んだ配列（Ｇｏｌｄｂａｒｇ −Ｈｏｇｎｅｓｓ
。 「Ｔ Ａ Ｔ ＡＪ或いはＦＡＴＡＪボックス）であシ
、調和配列（ｃｏｎｓａｎ＋ｓｕｇ ｇｅｑｕｅｎｃｅ
） （！’ −Ｔ ＡＴ ＡＡ−ＡＴＡ−Ｊ’）によ
シ特徴付けられている・第λの領域は、ＣＣＡＡＴボッ
クス（Ｅｆｓｔｒａｔａｄｉｇ等、−Ｚ／ Ｃｅ１ｌ
６３３−６１１１ （／り１０ ） ）であシ、それは
幾つかの遺伝子のキャップ部位から７０〜り０塩基対上
流に位置し、標準的配列、ｔ’−ＧＧ（い） ＣＡＡＴ
ＣＴ−ｊ’ （Ｂｏｎｏｉｓｔ等、Ｊ’ Ｎｕｃｌａｌ
ｃ Ａｃｉｄｇ Ｒｅｓ、／Ｊ７−／Ｆλ（ｔ？ｔｏ
） ） を有する。これらの配列は、制限エンドヌクレ
アーゼ酵素及び組換えＤＮＡ分子を産生ずるクローニン
グの使用によって、及びクローン化されたヌクレオチド
配列のｉｎ ｖｌｔｒ。 或いは部位−特異的突然変異誘発による制御された除去
或いは変更によつて、除去或いは変成することができる
。制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子の部位−特異的
切断に触媒作用を及ばずことのできる加水分解酵素であ
る。制限酵素活性の部位は、ある特別のヌクレオチド配
列の存在により決定され、所定の制限エンドヌクレアー
ゼに対する認識部位と称される。多くの制限酵素が単離
され、それらの認識部位に従って分類されている。 幾つかの制限エンドヌクレアーゼは同一点における両方
のＤＮＡ鎖上のホスホ−ジエステル結合を加水分解し、
プラント末端を生成するのに対し、その他のものは互に
数個のヌクレオチドで隔てられた結合を加水分解し、各
ＤＮＡ分子の末端に遊離の一本鎖領域を生成する。これ
らの一本鎖末端は自己相補的であり、同一の相補的一本
鎖配列を有する加水分解されたＤＮＡ或いはもうｌっの
或いは異種のＤＮＡ配列と再結合するために使用され得
る。 制限部位は比較的稀である。しかしながら、制限エンド
ヌクレアーゼの一般的使用は、所望の制限部位配列を含
有する化学的に合成された二本鎖オリゴヌクレオチド類
の利用可能性によシ極めて改良されてきた。実質的に任
意の天然の、クローン化された遺伝子的に変更された或
いは化学的に合成されたＤＮＡのセグメントを、適当な
認識部位を含むオリゴヌクレオチドをそのＤＮＡ分子の
末端に付着させることによシ、任意のその他のセグメン
トにカップリングさせることができる。この生成物を適
当な制限エンドヌクレアーゼの加水分解作用に付するこ
とにより、ＤＮＡ分子をカップリングするだめの必要な
相補的末端を生成することができる。 特異的制限酵素に対する認識部位は、通常、ランダムに
分布している。従って、制限酵素による切断は、隣接コ
ドン間で、１つのコドン内で或いは遺伝子内の幾つかの
ランダム部位において生じ得る。この組立てには多くの
変化が可能であるが、ＤＮＡ配列をプロモーター領域に
関して適当な位置及び配向で挿入してこれらの配列を発
現させるために技術が利用可能であることに注意するこ
とが重要である。 潜在的に任意のＤＮＡ配列はこの様に外来ＤＮＡ配列な
りロー二／グヴイークル（ｖｅｈｉｃｌｅ ）或いはベ
クター分子内に挿入することによりクローン化して、時
にはキメラ或いはノーイブリッド遺伝子と称される人工
的な組換え分子或いは複合体を′構成することができる
。殆んどの目的のためには、利用されるクローニングヴ
イークルは、組換え分子が細菌、酵母、植物或いは動物
細胞内に形質転換によシ入れられた際に複製することが
できるような無欠陥のレプリコンを含む二本鎖染色体外
性ＤＮＡ配列である。普通使用されるクロー二／グヴイ
ークルは、ウィルス、及び細菌、酵母、植物及び動物細
胞に付随するプラスミドから得られる。 生化学及び組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は［異
種起源ＪＤＮＡを含有するクローニングヴイークル或い
はベクターの構成に導いた。「異種起源」という用語は
、通常細胞によっては産生されないポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを称する。この異種起源ＤＮＡは細胞のゲ
ノム中に組込まれるか或いは自己複製プラスミド或いは
ウィルスクローニングヴイークルに乗せて形質転換細胞
内に維持されうる。これらの形質転換細胞群はその他の
ベクターへの更に操作、変成及び転移のための異種ＤＮ
Ａの新たな源を提供する。外来遺伝子を有するある種の
ウィルスベクターは、形質転換細胞内で複製し、これを
溶解する。複製に際し、外来遺伝子は、その特別の細胞
タイプ内において発現することもあり、発現されないこ
ともある。 複製ウィルスを単離し、更に、追加の細胞を感染するの
に使用することが出来、このようにして更に使用するた
めの組換え体の新たな源を提供する。 一度遺伝子或いはその所望部分がクローン化され、及び
或いは所望さｂたように生化学的に変成されるか或いは
その他の生化学的に変成されるか、またはゲノム遺伝子
がそれらの発現を容易にされるようにして挿入されると
、それらは次いで発現ベクターに転移される。遺伝コー
ドの性質のために、クローン化された或いはハイプリン
ト遺伝子或いはその部分は、それがコードするアミノ酸
配列の生産を指示する。プロモーター領域と適当な関係
に位置するクローン化遺伝子を用いた発現ベクターを構
成するための一般的技術は、次の文献に記載されている
： Ｂ、Ｐｏ１ｉｓｋｙ等、７Ｊ Ｐｒｏａ、 Ｎａｔｌ、
Ａｅａｄ、Ｓｃｉ 。 Ｕ、８．Ａ、Ｊり００ （１９７４） ； Ｋ、Ｉｔａ
ｋｕｒａ 等、 ｌりｒＳｃｉｅｎｃｅ １０３７．−
１０６３ （／り７７ ） ； Ｌ、Ｖｉｌｌａ −Ｋ
ｏｍｍｒｏｆｆ等、 ７ｊ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、Ｊ７．２７−３７３
ｉ （ｔ？７１ ）など。 「発現」という用語は次のようにして特徴付けることが
できる。比較的単純な原核生物においてさえも、細胞は
多くの蛋白質を合成する能力を有する。任意の与えられ
た時間において、細胞が合成することが可能である多く
の蛋白質は実際には合成されてはいない。ある遺伝子に
よシコードされる特別のポリペプチドが細胞によシ合成
されている時、その遺伝子が発現されていると云われる
。 発現されるためには、その特別のポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列は遺伝子の制御領域に関して適当な位置
になければならない。制御領域の機能は、その制御下に
ある遺伝子の発現を任意の与えられた時点における細胞
の変化する必要性に対応するようにするものである。 本明細書においては、以下の定義が使用される。 クローニングヴイークルとは、細胞内或いは形質転換に
よる生物体内において複製することのできる無欠陥のレ
プリコンを含む染色体外性の長さの二本１ＪＪＩ Ｄ
Ｎ Ａである。一般的に、クローニングヴイークルは、
ウィルス或いはプラスミドより得られ、最も普通には環
状ＤＮＡの形態を取る。 遺伝子という用語は、単−蛋白質鎖の伝達及び合成を荷
うＤＮＡ配列を指す。 感染という用語は、条件がそれらの複製及び生育に好ま
しい場合の細胞の病原性ウィルス因子による侵略を指す
。 トランスフェクシヨン（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ）
という用語は、リン酸塩或いはその他の適当な試薬、
例えばデキストランサルフェート、を含有するＤ ＮＡ
の溶液に塩化カルシウムの添加時に、ＤＮＡの沈澱及び
細胞内への摂取によシ、精製核酸で細胞を感染させる手
法を指す。 遺伝子的に変成された生物体による蛋白質の工業的或い
は実験室的合成に使用するために上記一般的方式及び技
術を利用する多くの宿主−ベクター系が開発されてきた
。これらの宿主−ベクター系の多くは米国特許第μ、３
３１，３７７号明細書に記載されているような原核生物
宿主−ベクター系である０更に、Ａ、 ＭＩｙａｎｏｈ
ａｒａ等、１０ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃ５ｄ、Ｓｃｌ、Ｕ、Ｓ、Ａ、／ （／りｆｊ）に記
載されるようなり型肝炎表面抗原合成に用いられる系、
及びＰｌｔｚｅｍａｎ等 ！／タ ５ｃｉｅｎｃｅ Ａ
Ｊ、０ （／夕ｆＪ） に記載されるような酵母内にお
けるヒトインターフェロンの合成系など、ベクターとし
て酵母を使用する系も利用されている。 目的蛋白質の合成に原核生物宿主−ベクター系を利用す
る価値は、そのような系に内在するある種の制限によυ
減少している。例えば、その様な系のｍＲＮＡ転写或い
は蛋白質生成物は原核生物中においては不安定な場合が
ある。更に、蛋白質が原核生物細胞内において合成され
る前に、微生物に導入されたＤＮＡ配列は、介在ＤＮＡ
配列、ナンセンス配列、及び活性真核生物蛋白質を含ま
ないポリペプチド配列をコードする初期及び末端配列が
ないにちがいない。更に、ある種の真核生物蛋白質は生
物学的に活性となるために合成後に変成（即ち、グリコ
ジル化）を必要とし、原核生物細胞は一般的にこの様な
変成を行う能力がない。 酵母或−は原核生物宿−ベクター系に更に伴う制限は、
合成された遺伝子生成物の細ノ底内からの回収の困難性
である。米国特許第４１．３３ｔ、３３ｔ号明細書は特
に遺伝子生成物の回収の問題に向けられたものであシ、
遺伝的ＶＣ変成された細菌による蛋白質の合成及び分泌
の方法を提供するものである。 真核生物宿主−ベクター系におけるウィルスの使用は最
近の研究及び考察の相当量の主題を占めるものであった
。しかしながら、ウィルスベクター系も又それらの有用
性を減少する相当な不利益及び制限を封するものである
。例えば、多くの真核生物ウィルスベクターは哺乳動物
系にお−て腫瘍発生成Ｉ／−１（ｌ−を腫瘍形成性であ
り、そ才りにより、遺伝子生成物の発生及び偶発的な感
染を伴う深刻な健康及び安全問題についてのイｂ在的可
能性を形成し得るものである。更に、幾つかの真核生物
宿主−ウィルスベクター系にお（八ては、遺伝子生成物
それ自体が抗ウィルス活性を示し、そｔＬＫより、その
蛋白質の産生を減少させる。そのイＪｋな例としてり、
Ｇｈｅｙａｅｎ及びＷ、Ｆｉｅｒｓ、Ｉ Ｊ、 Ｍｏ
１ｅｃ、 ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、 ３！！−ＪＰ
！ （／２ｇ、２）により記載されている真核生物宿主
−ウィルスベクター系における僅かにｉｏｏ単位のイン
ターフェロンが原因トなって生じたシミアンウィルスＩ
／−０の産生Ｗおける１０％の減少が挙げられる。 真俵生物宿主−ウーイルスベクター系の使用に内在する
もう７つの問題は、ウィルスの形態により提起されるも
のである。例えば、それらは数少な−制限部位を封する
にすぎないので、外因性ＤＮＡを単純なウィルスの適当
な箇所に挿入することはより容易である。しかしながら
、真核生物遺伝子はしばしば太きすぎて単純ウィルスに
嵌め込むことが出来ないことがある。即ら、ウィルスの
形態上の理由により、単純ウィルス内に入れることので
きる外因性ＤＮＡの最Ｖｉ制限される。他方、外因性Ｄ
ＮＡを複雑ウィルスに物足の位置に挿入することはそれ
らが多（のｊｌｉ’ｆ限部位な慣するためにより置部で
ある。 本発明は、バキュロウィルス及ヒバキュロウイルスゲツ
ム中のプロモーターを利用して真俵生物宿主−ベクター
系内にウィルス発現ベクターを生成することにより上記
した。同限の多くを見服するものである。より詳しくは
、バキュロウィルスオートグラファーカリフォルニカ（
Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ） （
ＡｃＭＮＰＶ）及びそれに関連したポリへドリノ プロ
モータを利用して真核宿主ＭＪ虫細施内にある選択され
た遺伝子の極めて高いレベルの発現を行う能力のある組
換えウィルス発現ベクターを生成することが司Ｉ止であ
ることが見出された。この系の寿ら７した遺伝子生成物
は、細胞培地中に効率的に分泌さ７′１．得、蛋白質生
成物の採取に伴う殆んどの困離性を緩和するものである
。更に、又より重要なことに、この系は哺乳動物におい
て腫瘍形成性成（八は［１１１瘍生成性のものではな（
β。 ＞％ｈ生物宿主−ウィルスベクター系におけるバキュロ
ウィルスを第１１月することの理論的な利点は、Ｎ、
Ｊ、 Ｐａｎｏｐｏｕｌｏａ編「植物料学における遺伝
子工竿（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉ
ｎ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ ５ｃｉｅｎｃｅ）Ｊ（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｌａｈｅｒａ
、／ ９＃ ／ ｐｐ、２０３〜．ｚ、ｚｐ ）のり
、 Ｋ、 Ｍｉｌｌｅｒによる［無を椎動物における遺
伝子工学のためのウィルスベクター（ＡＶｉｒｕｓ Ｖ
ｅｃｔ、ｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ １ｎＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ ） Ｊ
により詳細に論じられている。 その最も広い範囲にお層で、本発明は、ウィルス転移ベ
クター、組換えウィルス転移ベクター及び組換えウィル
ス発現ベクターの製造方法を提供するものである。得ら
れた組換えウィルス発現ベクターは、宿主昆虫＃ＩＴＩ
胞内において選はノｔた遺伝子を発現する能力を有する
。 本発明に従えば、バキュロウィルス遺伝子を含んでなる
バキュロウィルスＤ Ｎ Ａ 或Ｌ／１１ｒｉ Ｍバキ
ュロウィルス遺伝子のプロモーターを含むその一部を切
断して少なくとも該プロモーターを含有するＩ）ＮＡ断
片を得る。好藍し層方法圧おいては、適当ナバキュロウ
ィルス、例えば好ましくはハ＋ｚロウィルス オートグ
ラファ争カリフォルニカ（ＡａＭＮＰＶ） 、のポリヘ
トリン遺伝子及び側面瞬接ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮ
Ａを先ず単離する。 所望ＤＮＡを次
ーにカップリングさせた、成る選ばれた遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノム中に導入し、昆虫細胞内でその選ばれ
た遺伝子を発現することのできる組換えバキーロウィル
ス発現ベクターを製造する方法に関する。 組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は特別の遺伝子或
いはその部分の単離並びにそれらの細菌、酵素、植物或
いは動物細胞並びにこれらの生物体に感染するウィルス
への転移を容易にした。転移された遺伝子物質（即ち、
変成遺伝子）は複製され、形質転換された細胞或いはウ
ィルス復製として遺伝される。その結果、形質転換細胞
は転移された遺伝子配列がコード（ｅｎｃｏｄｅ ）す
る生成物を産生ずる能力を獲得する。 ウィルス、真核生物及び原核生物の間の遺伝子或いはそ
の部分の転移及び発現は、全ての生物のＤＮＡがそれが
同一の弘つのヌクレオチドで構成されているという点に
おいて化学的に類似しているので可能である。基本的相
違は、生物のゲノムに表われるヌクレオチドの配列にあ
る。コドン（ヌクレオチド トリブレット）に配列され
た特定のヌクレオチド配列は、特定のアミノ酸配列をコ
ードする。しかしながら、アミノ酸配列とＤＮＡヌクレ
オチド配列間のコード（暗号づけ）関係は全ての生物体
に対して本質的に同一である。 ゲノムＤＮＡは、蛋白質コード配列（即ち、「構造遺伝
子」）及び構造遺伝子の発現を仲介する調節領域（転写
開始を制御するＤＮＡ配列は通常「プロモーター」と称
される）とに組織されている。一般的に、酵素ＲＮＡポ
リメラーゼがプロモーターによシ、それが構造遺伝子に
沿〜て移動するに際して、それがコードされた情報をメ
ツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写するように活
性化される。ｍＲＮＡは認識配列、リポソーム結合に対
する信号及び翻訳開始及び終止に対する信号を含む。遺
伝子のプロモーター領域（通常、遺伝子のｊ′側面隣接
領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ）と説明され
ている）における重要な転写信号の役割の遺伝学的分析
の最近の進歩は、ＤＮＡ配列を選択的に除去或いは変更
してそれらの発現における機能及び役割を研究すること
及びこれらの配列の幾つかを除去して、それらの例えば
組換えＤＮＡ宿主−ベクター系などの異種生物学系にお
ける機能を研究することを容易に行うことができるよう
にした。 真核生物のプロモーターは、通常その配置及び原核生物
プロモーター配列への構造的類似性（Ｂｒｅｓｔｈｎａ
ａｂ ＆ Ｃｈａｍｂｏｎ、 ！ＯＡｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ。 ３弘ターＪＪ’Ｊ （／９１１ ） ）が転写の促進へ
の関与を示唆する２つのヌクレオチドの保存配列により
特徴付けられている。第１のものは、ＲＮＡ開始部位（
ｍＲＮＡに対する転写開始部位であるキャップ部位）か
らｍ〜３０塩基対上流に位置する核酸アデニン及びチミ
ンに富んだ配列（Ｇｏｌｄｂａｒｇ −Ｈｏｇｎｅｓｓ
。 「Ｔ Ａ Ｔ ＡＪ或いはＦＡＴＡＪボックス）であシ
、調和配列（ｃｏｎｓａｎ＋ｓｕｇ ｇｅｑｕｅｎｃｅ
） （！’ −Ｔ ＡＴ ＡＡ−ＡＴＡ−Ｊ’）によ
シ特徴付けられている・第λの領域は、ＣＣＡＡＴボッ
クス（Ｅｆｓｔｒａｔａｄｉｇ等、−Ｚ／ Ｃｅ１ｌ
６３３−６１１１ （／り１０ ） ）であシ、それは
幾つかの遺伝子のキャップ部位から７０〜り０塩基対上
流に位置し、標準的配列、ｔ’−ＧＧ（い） ＣＡＡＴ
ＣＴ−ｊ’ （Ｂｏｎｏｉｓｔ等、Ｊ’ Ｎｕｃｌａｌ
ｃ Ａｃｉｄｇ Ｒｅｓ、／Ｊ７−／Ｆλ（ｔ？ｔｏ
） ） を有する。これらの配列は、制限エンドヌクレ
アーゼ酵素及び組換えＤＮＡ分子を産生ずるクローニン
グの使用によって、及びクローン化されたヌクレオチド
配列のｉｎ ｖｌｔｒ。 或いは部位−特異的突然変異誘発による制御された除去
或いは変更によつて、除去或いは変成することができる
。制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子の部位−特異的
切断に触媒作用を及ばずことのできる加水分解酵素であ
る。制限酵素活性の部位は、ある特別のヌクレオチド配
列の存在により決定され、所定の制限エンドヌクレアー
ゼに対する認識部位と称される。多くの制限酵素が単離
され、それらの認識部位に従って分類されている。 幾つかの制限エンドヌクレアーゼは同一点における両方
のＤＮＡ鎖上のホスホ−ジエステル結合を加水分解し、
プラント末端を生成するのに対し、その他のものは互に
数個のヌクレオチドで隔てられた結合を加水分解し、各
ＤＮＡ分子の末端に遊離の一本鎖領域を生成する。これ
らの一本鎖末端は自己相補的であり、同一の相補的一本
鎖配列を有する加水分解されたＤＮＡ或いはもうｌっの
或いは異種のＤＮＡ配列と再結合するために使用され得
る。 制限部位は比較的稀である。しかしながら、制限エンド
ヌクレアーゼの一般的使用は、所望の制限部位配列を含
有する化学的に合成された二本鎖オリゴヌクレオチド類
の利用可能性によシ極めて改良されてきた。実質的に任
意の天然の、クローン化された遺伝子的に変更された或
いは化学的に合成されたＤＮＡのセグメントを、適当な
認識部位を含むオリゴヌクレオチドをそのＤＮＡ分子の
末端に付着させることによシ、任意のその他のセグメン
トにカップリングさせることができる。この生成物を適
当な制限エンドヌクレアーゼの加水分解作用に付するこ
とにより、ＤＮＡ分子をカップリングするだめの必要な
相補的末端を生成することができる。 特異的制限酵素に対する認識部位は、通常、ランダムに
分布している。従って、制限酵素による切断は、隣接コ
ドン間で、１つのコドン内で或いは遺伝子内の幾つかの
ランダム部位において生じ得る。この組立てには多くの
変化が可能であるが、ＤＮＡ配列をプロモーター領域に
関して適当な位置及び配向で挿入してこれらの配列を発
現させるために技術が利用可能であることに注意するこ
とが重要である。 潜在的に任意のＤＮＡ配列はこの様に外来ＤＮＡ配列な
りロー二／グヴイークル（ｖｅｈｉｃｌｅ ）或いはベ
クター分子内に挿入することによりクローン化して、時
にはキメラ或いはノーイブリッド遺伝子と称される人工
的な組換え分子或いは複合体を′構成することができる
。殆んどの目的のためには、利用されるクローニングヴ
イークルは、組換え分子が細菌、酵母、植物或いは動物
細胞内に形質転換によシ入れられた際に複製することが
できるような無欠陥のレプリコンを含む二本鎖染色体外
性ＤＮＡ配列である。普通使用されるクロー二／グヴイ
ークルは、ウィルス、及び細菌、酵母、植物及び動物細
胞に付随するプラスミドから得られる。 生化学及び組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は［異
種起源ＪＤＮＡを含有するクローニングヴイークル或い
はベクターの構成に導いた。「異種起源」という用語は
、通常細胞によっては産生されないポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを称する。この異種起源ＤＮＡは細胞のゲ
ノム中に組込まれるか或いは自己複製プラスミド或いは
ウィルスクローニングヴイークルに乗せて形質転換細胞
内に維持されうる。これらの形質転換細胞群はその他の
ベクターへの更に操作、変成及び転移のための異種ＤＮ
Ａの新たな源を提供する。外来遺伝子を有するある種の
ウィルスベクターは、形質転換細胞内で複製し、これを
溶解する。複製に際し、外来遺伝子は、その特別の細胞
タイプ内において発現することもあり、発現されないこ
ともある。 複製ウィルスを単離し、更に、追加の細胞を感染するの
に使用することが出来、このようにして更に使用するた
めの組換え体の新たな源を提供する。 一度遺伝子或いはその所望部分がクローン化され、及び
或いは所望さｂたように生化学的に変成されるか或いは
その他の生化学的に変成されるか、またはゲノム遺伝子
がそれらの発現を容易にされるようにして挿入されると
、それらは次いで発現ベクターに転移される。遺伝コー
ドの性質のために、クローン化された或いはハイプリン
ト遺伝子或いはその部分は、それがコードするアミノ酸
配列の生産を指示する。プロモーター領域と適当な関係
に位置するクローン化遺伝子を用いた発現ベクターを構
成するための一般的技術は、次の文献に記載されている
： Ｂ、Ｐｏ１ｉｓｋｙ等、７Ｊ Ｐｒｏａ、 Ｎａｔｌ、
Ａｅａｄ、Ｓｃｉ 。 Ｕ、８．Ａ、Ｊり００ （１９７４） ； Ｋ、Ｉｔａ
ｋｕｒａ 等、 ｌりｒＳｃｉｅｎｃｅ １０３７．−
１０６３ （／り７７ ） ； Ｌ、Ｖｉｌｌａ −Ｋ
ｏｍｍｒｏｆｆ等、 ７ｊ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、Ｊ７．２７−３７３
ｉ （ｔ？７１ ）など。 「発現」という用語は次のようにして特徴付けることが
できる。比較的単純な原核生物においてさえも、細胞は
多くの蛋白質を合成する能力を有する。任意の与えられ
た時間において、細胞が合成することが可能である多く
の蛋白質は実際には合成されてはいない。ある遺伝子に
よシコードされる特別のポリペプチドが細胞によシ合成
されている時、その遺伝子が発現されていると云われる
。 発現されるためには、その特別のポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列は遺伝子の制御領域に関して適当な位置
になければならない。制御領域の機能は、その制御下に
ある遺伝子の発現を任意の与えられた時点における細胞
の変化する必要性に対応するようにするものである。 本明細書においては、以下の定義が使用される。 クローニングヴイークルとは、細胞内或いは形質転換に
よる生物体内において複製することのできる無欠陥のレ
プリコンを含む染色体外性の長さの二本１ＪＪＩ Ｄ
Ｎ Ａである。一般的に、クローニングヴイークルは、
ウィルス或いはプラスミドより得られ、最も普通には環
状ＤＮＡの形態を取る。 遺伝子という用語は、単−蛋白質鎖の伝達及び合成を荷
うＤＮＡ配列を指す。 感染という用語は、条件がそれらの複製及び生育に好ま
しい場合の細胞の病原性ウィルス因子による侵略を指す
。 トランスフェクシヨン（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ）
という用語は、リン酸塩或いはその他の適当な試薬、
例えばデキストランサルフェート、を含有するＤ ＮＡ
の溶液に塩化カルシウムの添加時に、ＤＮＡの沈澱及び
細胞内への摂取によシ、精製核酸で細胞を感染させる手
法を指す。 遺伝子的に変成された生物体による蛋白質の工業的或い
は実験室的合成に使用するために上記一般的方式及び技
術を利用する多くの宿主−ベクター系が開発されてきた
。これらの宿主−ベクター系の多くは米国特許第μ、３
３１，３７７号明細書に記載されているような原核生物
宿主−ベクター系である０更に、Ａ、 ＭＩｙａｎｏｈ
ａｒａ等、１０ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃ５ｄ、Ｓｃｌ、Ｕ、Ｓ、Ａ、／ （／りｆｊ）に記
載されるようなり型肝炎表面抗原合成に用いられる系、
及びＰｌｔｚｅｍａｎ等 ！／タ ５ｃｉｅｎｃｅ Ａ
Ｊ、０ （／夕ｆＪ） に記載されるような酵母内にお
けるヒトインターフェロンの合成系など、ベクターとし
て酵母を使用する系も利用されている。 目的蛋白質の合成に原核生物宿主−ベクター系を利用す
る価値は、そのような系に内在するある種の制限によυ
減少している。例えば、その様な系のｍＲＮＡ転写或い
は蛋白質生成物は原核生物中においては不安定な場合が
ある。更に、蛋白質が原核生物細胞内において合成され
る前に、微生物に導入されたＤＮＡ配列は、介在ＤＮＡ
配列、ナンセンス配列、及び活性真核生物蛋白質を含ま
ないポリペプチド配列をコードする初期及び末端配列が
ないにちがいない。更に、ある種の真核生物蛋白質は生
物学的に活性となるために合成後に変成（即ち、グリコ
ジル化）を必要とし、原核生物細胞は一般的にこの様な
変成を行う能力がない。 酵母或−は原核生物宿−ベクター系に更に伴う制限は、
合成された遺伝子生成物の細ノ底内からの回収の困難性
である。米国特許第４１．３３ｔ、３３ｔ号明細書は特
に遺伝子生成物の回収の問題に向けられたものであシ、
遺伝的ＶＣ変成された細菌による蛋白質の合成及び分泌
の方法を提供するものである。 真核生物宿主−ベクター系におけるウィルスの使用は最
近の研究及び考察の相当量の主題を占めるものであった
。しかしながら、ウィルスベクター系も又それらの有用
性を減少する相当な不利益及び制限を封するものである
。例えば、多くの真核生物ウィルスベクターは哺乳動物
系にお−て腫瘍発生成Ｉ／−１（ｌ−を腫瘍形成性であ
り、そ才りにより、遺伝子生成物の発生及び偶発的な感
染を伴う深刻な健康及び安全問題についてのイｂ在的可
能性を形成し得るものである。更に、幾つかの真核生物
宿主−ウィルスベクター系にお（八ては、遺伝子生成物
それ自体が抗ウィルス活性を示し、そｔＬＫより、その
蛋白質の産生を減少させる。そのイＪｋな例としてり、
Ｇｈｅｙａｅｎ及びＷ、Ｆｉｅｒｓ、Ｉ Ｊ、 Ｍｏ
１ｅｃ、 ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、 ３！！−ＪＰ
！ （／２ｇ、２）により記載されている真核生物宿主
−ウィルスベクター系における僅かにｉｏｏ単位のイン
ターフェロンが原因トなって生じたシミアンウィルスＩ
／−０の産生Ｗおける１０％の減少が挙げられる。 真俵生物宿主−ウーイルスベクター系の使用に内在する
もう７つの問題は、ウィルスの形態により提起されるも
のである。例えば、それらは数少な−制限部位を封する
にすぎないので、外因性ＤＮＡを単純なウィルスの適当
な箇所に挿入することはより容易である。しかしながら
、真核生物遺伝子はしばしば太きすぎて単純ウィルスに
嵌め込むことが出来ないことがある。即ら、ウィルスの
形態上の理由により、単純ウィルス内に入れることので
きる外因性ＤＮＡの最Ｖｉ制限される。他方、外因性Ｄ
ＮＡを複雑ウィルスに物足の位置に挿入することはそれ
らが多（のｊｌｉ’ｆ限部位な慣するためにより置部で
ある。 本発明は、バキュロウィルス及ヒバキュロウイルスゲツ
ム中のプロモーターを利用して真俵生物宿主−ベクター
系内にウィルス発現ベクターを生成することにより上記
した。同限の多くを見服するものである。より詳しくは
、バキュロウィルスオートグラファーカリフォルニカ（
Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ） （
ＡｃＭＮＰＶ）及びそれに関連したポリへドリノ プロ
モータを利用して真核宿主ＭＪ虫細施内にある選択され
た遺伝子の極めて高いレベルの発現を行う能力のある組
換えウィルス発現ベクターを生成することが司Ｉ止であ
ることが見出された。この系の寿ら７した遺伝子生成物
は、細胞培地中に効率的に分泌さ７′１．得、蛋白質生
成物の採取に伴う殆んどの困離性を緩和するものである
。更に、又より重要なことに、この系は哺乳動物におい
て腫瘍形成性成（八は［１１１瘍生成性のものではな（
β。 ＞％ｈ生物宿主−ウィルスベクター系におけるバキュロ
ウィルスを第１１月することの理論的な利点は、Ｎ、
Ｊ、 Ｐａｎｏｐｏｕｌｏａ編「植物料学における遺伝
子工竿（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉ
ｎ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ ５ｃｉｅｎｃｅ）Ｊ（Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ 、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｌａｈｅｒａ
、／ ９＃ ／ ｐｐ、２０３〜．ｚ、ｚｐ ）のり
、 Ｋ、 Ｍｉｌｌｅｒによる［無を椎動物における遺
伝子工学のためのウィルスベクター（ＡＶｉｒｕｓ Ｖ
ｅｃｔ、ｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ １ｎＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ ） Ｊ
により詳細に論じられている。 その最も広い範囲にお層で、本発明は、ウィルス転移ベ
クター、組換えウィルス転移ベクター及び組換えウィル
ス発現ベクターの製造方法を提供するものである。得ら
れた組換えウィルス発現ベクターは、宿主昆虫＃ＩＴＩ
胞内において選はノｔた遺伝子を発現する能力を有する
。 本発明に従えば、バキュロウィルス遺伝子を含んでなる
バキュロウィルスＤ Ｎ Ａ 或Ｌ／１１ｒｉ Ｍバキ
ュロウィルス遺伝子のプロモーターを含むその一部を切
断して少なくとも該プロモーターを含有するＩ）ＮＡ断
片を得る。好藍し層方法圧おいては、適当ナバキュロウ
ィルス、例えば好ましくはハ＋ｚロウィルス オートグ
ラファ争カリフォルニカ（ＡａＭＮＰＶ） 、のポリヘ
トリン遺伝子及び側面瞬接ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮ
Ａを先ず単離する。 所望ＤＮＡを次
【八で適当な制限操作により切断する。
これにより、その幾つかがポリへドリノプロモーター及
びポリヘトリン蛋白質或（八はその一部をコードする少
な（とも７つのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片を生
成する。その様な７つのＤＮＡ断片は、ポリヘトリンプ
ロモーターとポリヘトリン蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を含んでなるＥｃｏＲＩ−Ｉ断片である。 次に、上り己ＤＮＡ断片を適当なりローニンググイーク
ル、■えは、プラスミドｐＵＣｇ中に挿入することによ
り転移ベクターを調製する。従って、ポリヘトリン転移
ベクターと称される好複しい転移ベクターは、ポリヘト
リンプロモーターと、ある選ばれた遺伝子或（ハはその
一部なりローニングするために利用回目はな部位とを、
その選ばれた遺伝子がポリヘトリンプロモーターの転写
制御下にあるようＶＣヨ有する適当なりローニンググイ
ークルよりなるものである。好贅しい転移ベクターは、
ホリドリン蛋白質或いはその一部をコードするＤＮＡ配
列を含んでも又′８−１な（てもよいものである。 組換え転移ベクターは、その鏝上記転移ベクターの利用
可能／Ａクローニング部位中に選ばれたＪＬ伝子或いは
その部分を挿入することにより調製される。潜在的には
、本発明の転移ベクターには任意の遺伝子或いは複数の
遺伝子をクローン化させ、バキーロウィルスプロモータ
ー配列とカップｌ）ングさせることが出来る。更に、適
当な組換えＤＮＡ手法により、上記の好ましい転移ベク
ターから、ポリヘトリン蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を、得られたりａ−ン化遺伝子生成物が選ばれた蛋白質
それ自体となるように欠失することができる。 或いは又、ポリヘトリン蛋白質をコードする配列が欠失
されない場合、或いはポリヘトリン蛋白質をコードする
少なくとも１つの配列が好ましい転移ベクターから欠失
されない場合には、得られたクローン化された遺伝子生
成物は、選ばれた蛋白質及びポリヘトリン蛋白質或いは
その一部よりなるハイブリッド、即ち融合蛋白質である
であろう。 組換え発現ベクターを製造するためには、組換え転移ベ
クターを適当なバキュロウィルスＤＮＡと組換えを行う
ように接触させることにより所望の遺伝子物質をバキー
ロウィルスゲノム中に組入れる。組換えを達成する好ま
しい手段は、公知のトランスフエフシロンの方法でアル
。トランスフエフシロンの方法は、ｌＯＯチのウィルス
中においては起こらないので得られる結果は弁組換え体
及び組換え体の混合物である。 宿主昆虫細胞内で選ばれた遺伝子を発現する能力を有す
る組換えバキュロウィルス発現ベクターは、その後、こ
の組換え及び弁組換えパキーロウィルスの混合物から適
当なスクリーニング或いは遺伝子選択技術により選択さ
れる。発現ベクターを選択する１つの手段は、ポリヘト
リン遺伝子の挿入不活化により感染細胞の核内にウィル
スの封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ） を欠くウィルス
を同定及び単離することにより行われる。 本発明は又上記方法によシ製造された組換えバキーロウ
づルス発現ベクターに向けられたものである。その様な
発現ベクターは、ウィルスゲノムに連結され、その中で
安定である少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはその
部分を含有する感染性ハキーロウィルスを含んでなるも
のである。昆虫細胞或いは昆虫内における発現ベクター
の複製に際して、選ばれた遺伝子はバキーロウィルスの
転写信号の制御下、或いはそれ自身のプロモーターのｉ
ｉｉ制御下制御子れかにおいて発現され得る。バキーロ
ウィルス発現ベクターの１例として、β−インターフェ
ロンに対する遺伝子をポリへドリンプロモーターの転写
制御下にあるような位置にＡｃＭＮＰＶ ゲノム中に挿
入して含有する組換えＡｃＭＮＰＶ ウィルスがある。 潜在的には、任意のバキュロウィルスプロモーター及び
ｉ 虫ａａ 系統を使用することができる。 本発明は更に上記方法により生成された転移ベクターに
向けられたものである。少なくともポリへドリンプロモ
ーター配列と、選ばれた遺伝子或いはその一部の挿入の
ために利用可能なりローニング部位とを、選ばれた遺伝
子がポリへドリンプロモーターの転写制御下にあるよう
に含んでなる好ましいポリヘトリン転移ベクターなバキ
ュロウィルスの遺伝子操作のだめの中間ヴイークルとし
て使用する。このポリヘトリン転移ベクターはポリヘト
リン蛋白質をコードするＤＮＡの配列を全く含まなくて
も或いはその全て或いは一部を含んでもよい。 本発明は更に上記方法で製造された組換え転移ベクター
に向けられるものである。ポリへドリンプロモーターと
カップリングされた選ばれた遺伝子或いはその一部を含
んでなる本発明の好ましい転移ベクターは、所望の遺伝
情報をパキーロウィルスゲノム中に組込むためのヴイー
クルとして使用される。 本発明は、選ばれた遺伝子の真核生物宿主昆虫細胞内に
おける発現を促進するために宿主−ベクター系において
バキュロウィルスプロモーターを使用することに基づい
ている。特に、ポリヘトリン蛋白質は、ウィルス感染真
核生物宿主細胞内において最も豊富に合成される蛋白質
の１つであるので、好ましい方法は選ばれた遺伝子がポ
リへドリンプロモーターとカンプリングされるようにこ
の選ばれた遺伝子の適当なバキーロウイルスゲノム中へ
の組込みを含むものである。その様な組換えバキーロウ
ィルスは、選ばれた遺伝子生成物の合成のだめの有効な
機構を提供するものである。 従って、本発明は、宿主昆虫細胞から合成され且つ効率
的に分泌される極めて高いレベルの目的遺伝子生成物、
例えばβ−インターフェロン、として有意義な有用性を
有するものである。 本発明の実施に際して使用されるバキーロウィｋｙ、
はオー）！ラファーカリフォルニカ（ＡｃＭＮＰｖ）で
ある。このバキーロウィルスは下記の如く特徴付けられ
る。 その自然の感染性形態において、ＡｃＭＮＰＶは通常ウ
ィルス封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ）中に見出される
。 これらのウィルス封入体は、通常、ポリヘトリン蛋白質
ザブユニットの構造配列を含む−シラ結晶蛋白質マトリ
ックス内に包埋された数個のウィルス粒子を含有する。 封入体は適当な宿主昆虫により摂取され、それが腸の内
腔に到達するとアルカリ性状態が封入体の解離を引起こ
し、ウィルスを放出する。 ウィルスは腸壁の細胞を侵し、それらの＃Ｉ胞の核に移
動し、複製を行う。これらの細胞内において２つの感染
形態、即ち細胞外すなわち非封入ウィルス形態、及び封
入ウィルスがこれらの細胞において生成される。細胞外
ウィルスは細胞の表面から芽を出し、その他の細胞を感
染する。感染後約１２時間後に細胞外ウィルス発芽にお
ける減少、ポリヘトリン合成の開始及び封入ウィルス粒
子の増大した産生が生ずる。極めて多量の封入体が感染
細胞及び組織中に産生され、最終的に昆虫を溶解する。 このウィルスの封入形態はその他の昆虫への感染の広が
りの原因となるものである。 細胞培養培地内において容易に培養することのできるＭ
Ｊ］１ｆｆｉ外ウィルスが本発明の例示方法において使
用される。細胞外ウィルス及び封入ウィルスは同一のゲ
ノムを有するが異った表現型特性を示す。 これらの封入体の主たる構造成分であるポリヘトリンは
ほぼλり、０００ の分子量の蛋白質である。 ＡｃＭＮＰＶ ゲノムの特性付けは、ＡｃＭＮＰＶ ポ
リヘトリンの遺伝子は、ＤＮＡ制限地図のＯポイントか
ら約ｕｏｏｏ塩基対下流のＥｃｏＲＩ’ｌ断片における
約ｌコ００の塩基対の隣接ＤＮＡ配列まで認められるこ
とを示している（ Ｇ、 Ｅ、 ＳｍＨｈ 、 Ｊ、
Ｍ。 Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 ４’ｊ
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２ｔｊ−２２！ （／’７１３
）参照）。全ＡｃＭＮＰＶ ゲノムの地図（遺伝子地
図）はＪ、 Ｍ、 Ｖｌｉｋ及びＧ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔ
ｈ、ｕ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、／／／Ｊ’−／／、２／
（１５’ｌｌ’Ｊ ） に示されておシ、ポリヘトリン
遺伝子のＤＮＡ配列はＨｏｏｆｔｖａｎ Ｉｄｄｅｋｉ
ｎｇｅ 、 Ｇ、 Ｂ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、
Ｓｕｍｍｅｒｓ、１３ノ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ’Ａ／
−！Ａ！ （／りｆｆＪ）に示されている。 ポリヘトリン蛋白質の構造及び機能はそれが公知の最も
高度に発現された真核生物遺伝子の１つであるので、相
当に興味深いものである。ＡｃＭＮＰＶで感染されたス
ボドブテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞において、ポリヘトリンは
それが感染細胞中の全蛋白質の５ｏ４以上を形成し、感
染細胞ｌ当９ｏ０．２．１９を越えるポリヘトリン蛋白
質が生成されるような高割合に蓄積される。この遺伝子
は次の理由によシ又興味深いものである：（１１ＡｃＭ
ＮＰＶのポリヘトリン遺伝子はバキーロウィルス中に高
度に保存されているＤＮＡ配列を含有すること、（２）
ゲノムのこの領域において密接に関連した株間の組換え
が高い頻度で起こシ、組換え子孫におけるポリヘトリン
遺伝子の分離及び発現を可能にする、及び（３）遺伝子
の発現が宿主、組織、及び細胞系統依存性であること、
である。 遺伝子工学者の観点からは、ポリヘトリン遺伝子はウィ
ルスがそれなしでも細胞培養液中で複製が可能なので不
必要である。仁の遺伝子の発現の高い割合及びそれがウ
ィルス複製に必須ではないという事実のために、ポリへ
ドリンプロモーター及びＡｃＭＮＰＶの遺伝子を組換え
遺伝子の発現のための系の一部として使用することの可
能性が相当な考察の源泉となっていた（ Ｅ、Ｂ、 Ｃ
ａｒａｔａｎｇ 。 Ｓ、Ｔ、Ｔｊｉａ 及びＷ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ 、ツタ
Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ３ざ６−３り♂ （ｌり７タ ）
； Ｐ、Ｄｏｂｏｓ 及びＭ、Ａ、Ｃｏｃｈｒａｎ
。 ノ０３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｕ４’／； −弘６μ （
ツタざ０）；Ｈ，Ａ。 Ｗｏｏｄ 、１０．２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、２／ −
，２７（／９Ｊ’θ）；Ｊ、Ｅ。 Ｍａｒｕｎｉａｋ及びＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 １
０９ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ２６−３０−（ｌり♂／ ）
； Ｌ、に、Ｍｉｌｌｅｒ 、” Ａ ＶｉｒｕｓＶｅ
ｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ ｉｎ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｇ”［Ｎ、Ｊ
、Ｐａｎｏｐｏｕｌｏａ ＠ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｔｈ＠Ｐｌａｎｔ ５ｃｉｅｎ
ｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 、 ＰｒａｅｇｅｒＰｕｂ
ｌｌｓｈｅｒｓ 、 １９１／ ｐｐ、 、２θ３〜ｘ
、ｌ）中に掲載〕、及びり、 Ｋ、 Ｍｉｌｌｅｒ等λ
ｌ？５ｃｉｅｎｃｅ ７／ｊ −７２１（ｌりＪ’Ｊ
） ； Ｇ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ 、 Ｍ、 Ｊ、 Ｆ
ｒａｓｅｒ及びＭ、Ｄ。 Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｊ、Ｖｌｒｏｌ 、！１ｒ４Ａ−ｊり
Ｊ（／りｆＪ）参照）。 しかしながら、本発明の前にはだれもその様な系を開発
することができなか−た。 本出願人等による実験は、もうｌっの遺伝子生成物、Ｉ
ＯＫも又ポリヘトリンに匹敵する高レベルで発現される
ことを示している（ Ｇ、 Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ 。 Ｊ８Ｍ、 Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ
、 ｕｊ Ｊ、 Ｖｌｒｏ１２１１−．２λｊ （１？
Ｉ３ ）参照〕。この生成される１０Ｋ蛋白質は非構造
的のようであり、感染の後期において多量に産生される
。１０Ｋ ＡｅＭＮＰＶ蛋白質遺伝子の位置はＨｉｎｄ
ｍ断片Ｐ及びＱＫ認められている。ポリへドリンプロ
モーター及び構造遺伝子と同様にこのプロモーターは、
組換え遺伝子の発現のためのＡｃＭＮＰＶを使用する系
の一部としてのその有利な用途としての考察の対象であ
った。 しかしながら、本発明までにこのプロモーターのその様
な有利な用途なｏＪ能にするような系は開発されていな
かった。 本発明の例示方法に従えば、ＡｃＭＮＰＶの特別の株、
Ｍ３或いはＥ、２が利用される。しかし１よから、当業
者には、その他のバキーロウィルス及ヒソノ他のバキュ
ロウィルス株が組換えバキュロウィルス転移及び発現ベ
クターの製造に適当であることが明らかであろう。特に
、密接に関連し、天然に存在するバキーロウィルス株ト
リコブルシア・二（Ｔｒｉｃｂｏ −ｐｌｕｇｉａ ｎ
ｉ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ、ラキブルシア拳オウ（Ｒａｃ
ｈｉｐｌｕ８ｉａ ｏｕ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ 、ガ１
／リア・メロネラ（Ｇａ１ｌｅｒｔａ ｍｅｌｌｏｎｅ
ｌｌａ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ及び任意のプラーク精製法
、例えば本実験室において特性付けられ、Ｇ、 Ｅ、Ｓ
ｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ。 ３０ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、？、２Ｊ’−ｇ３１ （／り７
り）及び Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、、 Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ 、 ３３ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、Ｊ／／−Ｊ
／Ｐ （ｌ？ＩＯ） Ｋよシ説明されているＡｃＭＮＰ
ＶのＥＪ、Ｒり、Ｓ／及びＳ３株などを有利に使用する
ことができる。これら及びその他の株についての説明は
、更にＧ、Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、Ｄ。 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、ｒタ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ３１７−
！；２７ （ｌり７７） に記載されている。 本発明の方法に従えば、有利に利用されるのはポリヘト
リン構造遺伝子及びプロモーターである。 この遺伝子はＳ／ヌクレアーゼ実験により認められてい
る。ポリへドリンコード領域のｊ′末端のヌクレオチド
配列及び転写開始から、：２００塩基上流が第３図に示
されている。第３図に示された部位は、ポリヘトリンｍ
ＲＮＡに対して最も頻繁に使用される転写開始部位であ
る。 ＡＴＧ翻訳開始信号（Ａ残基割当て位置」−７を有する
）は転写開始部位からほぼ５ｇ塩基目に起こシ、その後
引続き内部オーブン読取りが２３ｋにおける１ｌｎｄ
ｍの部位まで及びこれを含んで行われる。多くの真核生
物構造遺伝子において同様の位置に見られる「ＴＡＴＡ
Ｊ及びｌ”ＣＡＡＴＪボックスはそれぞれ転写開始部位
から上流の５及び３５番目の塩基間及びＡＯ及び７００
番目塩基間の間に位置している。転写開始部位から７５
塩基上流及びりＯ塩基上流の中心には直接繰返し配列［
ＣＡＣＡＡＡＣＴＪがある。更にＡｃＭＮＰＶポリヘト
リン遺伝子は翻訳開始コドンに先立ちｓｇ塩基の非翻訳
リーダー配列を有し、且つＡｃＭＮＰＶポリヘトリンｍ
ＲＮＡについての適当な実験操作により示唆される如く
、何等の介在配列も存在しない。上記Ｓｍ１ｔｈ 、
Ｖｌａｋ及びＳｕｍｍｅｒｓの文献、及びＧ、 Ｆ。 ＲｏｈｒｍＪｌｎ 等、 ／、２／ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６１−６０ （ｔりｒコ）参照。 本発明の実施に当り、ポリヘトリン遺伝子を有するＤＮ
ＡをバキュロウィルスＡｃＭＮＰＶから単離し、精製す
る。当業者には、この遺伝子はポリヘトリン遺伝子を有
する任意のバキュロウィルス、特に上記関連性のある株
から単離され得ることが判るであろう。 所望のＤＮＡを次いで適当な制限操作によりＥｃｏ Ｒ
Ｉ ｆｆｔｌｌ限エンドヌクレアーゼで消化し、ポリヘ
トリン遺伝子を含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ−ｉ断
片或いはその他の適当な断片を生成する。 上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片はその後適当なりローニングヴ
イークルのＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、転移ベクタ
ーを生成する。ＡｃＭＮＰＶゲノムは、選ばれた遺伝子
を効果的に部位−特異的に導入することができる知られ
た独特の制限部位を有していないのでキメラプラスミド
ベクター（転移ベクター）を構成して遺伝子転移のため
の中間ヴイークルとしての役割を果す必要がある。従−
て、選ばれた遺伝子をポリへドリンプロモーター配列に
隣接するウィルスゲノム中に導入するために、ポリヘト
リン遺伝子を含んでなシ、ポリヘトリン転移ベクターと
称される転移ベクターが構成され、クローニング部位は
、その部位に適当に挿入される遺伝子がポリへドリンプ
ロモーターの制御下にあるように配置され、隣接ウィル
スＤＮＡはポリヘトリン遺伝子のいずれかの側に連結さ
れている。 この転移ベクターの構成を第１図及び第一図に概略的に
示す。更に隣接ウィルスＤＮＡの存在が、野性タイプの
バキュロウィルスとの組換えを容易にし、選ばれた遺伝
子の複製ウィルスゲノム中への転移を可能にしているこ
とに注意すべきである。 従って、上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片は、それぞれプラスミ
ドｐＢＲ３２６及びｐＵＣｆ中にクローン化及びサブク
ローン化される。ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片中の２つのＢａｍ
ＨＩ制限部位は、その後、ポリヘトリン遺伝子の翻訳開
始部位からほぼココ０塩基のポリへトリ／プロモーター
配列から下流の３′方向に位置する単−ＢｓｍＨ１クロ
ーニング部位を有するＩ）ＡＣ１０１と称されるポリヘ
トリン転移ベクターを産生ずるように除去される（第３
図参照）。プラスミドｐＢＲＪλｊ及びｐｕｃ ｒはポ
リヘトリン転移ベクターの構成に利用されるプラスミド
であるが、ポリヘトリン遺伝子及び隣接ウィルスＤＮＡ
が機能的に導入される限り、その他の適当なりローニン
グヴイークルが利用可能であることは当業者には明らか
であろう。 このポリヘトリン転移ベクターは、その後選ばれた遺伝
子を挿入するために、転写開始部位の近辺、即ちポリヘ
トリン遺伝子の約−５ｇ〜末端までのポリヘトリン合成
をコードする配列の幾つか或いは全てを欠失することに
よシ変成することができる（第３図参照）。ＢａｍＨＩ
制限部位配列を有する天然或いは合成オリゴヌクレオチ
ドを含むＤＮＡリンカ−を次いで欠失部位に挿入し、Ｄ
ＮＡセグメントのカップリングをその制限部位において
行う。転移ベクターの変成は第２図に概略的に示されて
おり、ポリへドリンコード配列を欠失する手段はｉｎ
ｖｉｔｒｏの突然変異誘発によるものである。しかしな
がら、当業者にはポリへドリンコード配列の一部或いは
全部を欠失するために代替的な操作方法が利用可能であ
り、欠失部位に代替的合成又は天然のオリゴヌクレオチ
ドリンカー配列を挿入することが可能であシ、及び選ば
れた遺伝子及びその一部が組込まれる代替的変成ポリヘ
トリン転移ベクターを本発明において適当に利用できる
ことが明らかであろう。 本発明の標準的クローニング技術に従えば、選ばれた遺
伝子、例えばヒトβ−インターフェロン合成をコードす
るＩＦＮ−β遺伝子、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーセ合成ヲコートスるＣＡＴ遺伝子、及び
ヒトインターロイキン−２合成をコードするＩＬλ遺伝
子をその後ポリヘトリン転移ベクターの利用可能な制限
部位に挿入し、組換え転移ベクターを生成する。β−イ
ンターフェロン遺伝子の転移ベクターｐＡｃ ３１０中
への挿入は第μ図に概略的に示されて℃゛る。 更に、ＩＦＮ−β、ＣＡＴ及びインターロイキン−コバ
ポリヘトリン転移ベクターにクローニングし、ポリへト
リ／プロモーター配列とカップリングさせるための遺伝
子の具体例であるが、本発明或いはその上記代替的形態
においては、潜在的に任意の選ばれた遺伝子が利用可能
であることが認識されるであろう。 組換え転移ベクターの遺伝子であるポリへドリンー選択
遺伝子ハイブリッドはその後適当なバキュロウィルス、
例エハハキーロウィルスＡａＭＮＰＶ、のゲノム中に転
移され、宿主昆虫細胞内においてβ−インターフェロン
をコードする遺伝子を発現する能力を有する組換えウィ
ルス発現ベクターを生成する。ハイブリッド遺伝子の転
移は例えばスボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などの宿主昆虫細胞
内のトランスフェクシ舊ンの方法によシ達成される（Ｊ
、Ｐ。 Ｂｕｒｉｎｄ 等、 １０／ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ２１
ｒ６−２りθ （１ｙｒｏ ）参照）。組換え転移ベク
ターｐｋｃ３ＩＯ−Ｉ Ｆ！Ｎ −βを利用するこの方
法は第５図に概略的に図示されている。トランスフエフ
シロン後のＡｃＭＮＰＶＤＮＡの複製の際に、ハイブリ
ッド遺伝子は組換え転移ベクターとＡｃＭＮＰＶ ＤＮ
Ａ間の組換えにＪ：、！ｌ）ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡに転
移される。従って弁組換え及び組換えバキュロウィルス
を含んだ混合物が生成され、その内後者がＩＦＮ−β遺
伝子を発現する能力を有するものである。トランスフェ
クシヨンがハイブリッド遺伝子をバキーロウィルスゲノ
ム中に転移するための好ましい方法であるが、当業者に
はその他の方法もハイプリント遺伝子をバキーロウィル
スゲノム中に挿入するために適当であることが理解され
るであろう。更に、ノルイブリッド遺伝子の配列と他の
株の対応する配列間に組換えを行わせるに十分な相同性
が存在する限シにおいて、組換えは切換え転移ベクター
とその他のバキーロウィルス株との間に達成することも
できる。例えば、その様な組換えは上記株、トリコブル
シア・二（Ｔｒｉｅｈｏｐｌｕｇｌａ ｎｌ ） ＭＮ
Ｐ’Ｖ、ラキプルシアΦオウ（Ｒａｃｂｔｐｌｕｓｉａ
ｏｕ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ、及びガレリア会メロネラ
（Ｇａ１ｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ）Ｍ Ｎ
Ｐ Ｖ並びＫＡｃＭＮＰＶ株ＥＪ、ＲＰ、Ｓｌ及びＳ
３のいずれから単離された遺伝子との間に生じ得る。又
、組換えは相同的配列を含有しないと思われるゲノムの
領域においても生じ得ることが可能である。これについ
ての機構は理解されていない。 ＡｃＭＮＰＶゲノム中に導入された遺伝子であるポリへ
ドリンー選ばれた遺伝子ノーイプリ・ノドを含む組換え
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは、その後弁組換え及び組換
えバキュロウィルスの混合物から選択される。選択の１
つの手段は、ウィルス封入体を産生しないウィルス（Ｏ
−と称される）で感染された宿主昆虫細胞によシ形成さ
れたプラークについてスクリーニングを行うことである
。組換えウィルスはポリ−・トリ／遺伝子の挿入不活性
化によシウィルス封入体の産生について欠陥を有してい
るために、この様にして選択が容易に行われる。 トランスフエフシロンを行わされた細胞からの子孫ウィ
ルスから産生されたウィルスプラークのうち平均０．１
％が仮想的な組換え０−ウィルスからのものであろう。 従りて、Ｏ−プラーク−形成組換えウィルスからのＤＮ
Ａをその後ｆ＊製し、及び適当な制限酵素で分析して組
換えＡｃＭＮＰＶベクターが選ばれた遺伝子を適当なＥ
ａｏＲＩ−Ｉ位置に挿入していることを確認する。 上記選択方法は、組換えバキーロウィルスー選ばれた遺
伝子発現ベクターの選択のだめの有効且つ便利な手段を
提供するが、しかし、本発明に従えば、その他の選択操
作も又利用可能であることが当業者には明らかであろう
。真核生物細胞内の外来ＤＮＡのｌｎ ５Ｉｔｕ検出の
だめの比較的便利な方法（即ち、標識化ＤＮＡプローブ
を感染された動物細胞内に産生されたプラーク中に存在
するウィルスＤＮＡに）〜イブリッド化する方法）はＶ
ｉｌｌａｒｒｅａｌ及びＢｅｒｇ 、 １９Ａ ５ｃｉ
ｅｎｃｅ １１３−１１Ａ（ツタ７７）、及びＨｉｙｄ
ａｙ等、／ｊ Ｇｏｎｅ ！３−６ｊ（／りｆｚ） に
記載されている〇 選ばれた遺伝子の発現は、感染しやすい宿主昆虫細胞、
例えばスボドプテラ・フラギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などを適当な生育培地
中において組換えパキーロウィルスー選ばれた遺伝子発
現ベクターで感染させることによシ達成される。Ａ ｃ
Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ発現ベクターは感染性ウィルス粒子の
複製及び組立てによシ昆虫細胞或いは昆虫内において増
殖させる。とれらの感染性ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを
使用して適当な昆虫細胞中に選ばれた遺伝子を生成する
ことが出来、この様にして選ばれたＤＮＡ配列の感染細
胞内における効率的な発現が容易に行われる。 感染時に、選ばれた遺伝子のＤＮＡ配列に相補的である
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクター−特異性ｍＲＮＡが生成され
る。このベクター−特異性ｍＲＮＡは通常感染細胞内で
翻訳されて選ばれた遺伝子によυ完全に或いは部分的に
コードされる蛋白質を生成し、及び場合により選ばれた
遺伝子生成物はグリコジル化、分泌、ホスホリル化或い
はその他の後−翻訳変成などの工程に付される。 組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターにより生成された遺伝
子生成物が選ばれた蛋白質のみのアミノ酸配列よりなり
、ＡｃＭＮＰＶポリヘトリンのアミン末端から得られた
１個以上の追加のアミノ酸残基を含有するノ〜イプリ・
ノド蛋白質であるかどう力・、或いは選ばれた蛋白質及
び−イブリ・ノド蛋白質の両生酸物が生成されるか否か
は、ポリヘトリン転移ベクターが変成される方法に応じ
て異る。選＋ｆ。 れた遺伝子に由来する単一の翻訳開始信号（ＡＴＧ）の
みがノルイブリッド遺伝子配列中に存在し、且つ選ばれ
た遺伝子が約−７Ｓ〜＋１位間のノーイフ。 リッド遺伝子配列内に存在するならば、選ばれた蛋白質
のみ、例えばβ−インターフェロン、が生成される（第
３図参照）。これに対して、選ばれた遺伝子が、ポリへ
ドリンプロモーターに２つの翻訳開始部位即ち＋１位に
おけるポリヘトリンＡＴＧ信号及び＋３とポリへドリン
コード配列の末端の間の選ばれた遺伝子ＡＴＧ信号があ
るようにポリへドリンプロモーターに融合される場合に
は、ハイブリッド蛋白質及び選ばれた蛋白質の両者が生
成される可能性がある。しかしながら、生成される各蛋
白質の割合は第コのＡＴＧ信号の位置及び選ばれた遺伝
子の配列の性質に応じて異る。或いは又、遺伝子がそれ
自身のＡＴＧ開始信号なしにポリへドリンプロモーター
に融合される場合には、合成ＡＴＧ或いはポリヘトリン
ＡＴＧ翻訳開始信号が蛋白質コード配列に選ばれた遺伝
子に対する正しい翻訳読み取り枠を維持するように融合
されることが要求される。生成される蛋白質生成物は、
ここでも又上記要因に依存する。 転移ベクター及び組換え発現ベクターの寄託組換えバキ
ーロウィルス発現ベクターＡｅＪざＱ−ＩＦＮ−βはＡ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒ％ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ州、 Ｒ
ｏｃｋｖｔｌｌｅ ）にｌりｒ３年５月１３日に寄託し
、寄託番号ＡＴＣＣ≠００７ｔを与えられた。Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ Ｋ−７２中の変成ポリヘトリン転移ベクターｙ
ｈｃ３ｒｏプラスミド及びＥ、 ｃｏｌｔＫ−／ｊ中の
組換え転移ベクＩＸ−ｐＡｃ３１０− Ｉ ＦＮ−βは
Ａ ＲＣＣ（Ａｇｒｉｃｕｔｕｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 ｌ１ｌ
ｉｎｏｉｓ州Ｐｅｏｒ＋ａ ）に／りｔ３年５月１３日
に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ −／＃２１及びＮＲ
ＲＬ Ｂ−ｉｊ≠、２７をそれぞれ与えられた。変成ポ
リヘトリン転移ベクターｐＡｃＪ７ＪはＡＲＣＣにｌり
ｒａ年ｊ月７日に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−／１
７７１を与えられた。 以下の具体例で使用されたプラスミドはＥ。 ｃｏａｌ中のＰＢＲ３２！及びｐＵｃＩであＦ） 、
Ｍｓｒｙ１ｓｎｄ州Ｇａｔｔｈｅｒｓｂｕｒｇ（７）Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅａｅａｒｃｂ Ｌａｂｉ、から得
られたものであった。 ウィルスＤＮＡ 具体例において、ウィルスＤＮＡの出発源として使用さ
れたＡｏＭＮＰＶ、Ｍ３株、並びにＡｃＭＮＰＶ、Ｅ、
２株及び野性タイプ、は本実験室においてＧ、 Ｅ、
Ｓｍ１ｔｈ 、及びＭ、 Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ 、ざり
Ｖｉｒｏｌｏｇｙｊ１７−３．１０ （／り７♂）及び
Ｇ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ。 ８ｕｒｎｍｓｒｓ、 ３タ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ １２ｊ
−／３７ （／９１／ ）に記載される手法に従って、
単離されたものであうた。 ＩＦＮ−β ＤＮＡ 具体例において使用されたＩＦＮ−β遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は西ドイツ、ＢｒａｕｎｓｅｈｗｅｉｇＳｔｏｃ
ｋｈｅｉｎ 、 Ｇｅｇｅｌｌｇｃｈａｆｔ ｆｉｒ
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅＦｏｒｓｃｈｕｎ
ｇ （Ｇ Ｂ Ｆ ）のＪｏｈｎ Ｃａ１ｌｌｎｓ 博
士から得られたプラスミドｐＢＲ／Ｊより単離されたも
のであった。 ＣＡＴ ＤＮＡ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ州、Ｂｅｔｈｅｓｄｅ国立癌研究所のＢｅｒｎａｒｄ
Ｍｏｓｓ及びＭｓｒｋ Ｃｏｃｂｒｈｎ両博士より得ら
れたプラスミドｐＢＲＪ、２♂よシ単離されたものであ
りた。 ＩＬコ ＤＮＡ する遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Ｎｅｖｒ Ｊｅｒ
ｓｅｙ州、 Ｎｕｔｌｅｙ 、 Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＣｅｎｔｅｒのＧｒａ
ｃｅ Ｊｕ及びＰｅｔｅｒ Ｌｏｍｅｄｉｃｏ両博士よ
シ得られたプラスミドｐｌＬ２−２Ｂから単離されたも
のであった。 細菌細胞 ＰＵＣｒプラスミドのクローニングのために具体例によ
シ使用されたＥ、 ｃｏａｌ ＪＭｒ３はＭａｒｙｌａ
ｎｄ州、Ｇｉｌｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、のＢｅｔｂｅｇ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂａ、から得られたもの
であった。 ｐＢＲＪλｊプラスミドのクローニングのために具体例
で使用されたＥ、 ｃｏｌｔ ＲＲノはＴ＠ＸＪＩＩＩ
州、Ｈｏｕｓｔｏｎ 、 Ｂａｙｌｏｒ ＣｏＣｏ１１
ｅ ｏｆ Ｍｅｄｉａｉｎｓ 、の５ａｖｉ。 Ｗｏｏ博士から得られたものであった。 酵素 以下の制限エンドヌクレアーゼはＭａｒｙｌａｎｄ州、
Ｇａ１ｔｈｓｒ＋ｓｂｕｒｇ 、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得ら
れ、供給者の推薦事項に従−て使用された：ＥａｏＲＩ
、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨｌ、、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ。 ＲａｔＷＩＴＶ−−ＤＶ’Ｖ−−丁Ｕｙｙ（ｕ＋、、＋
ｍｌ！１１ｔｒ）酵素も又Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｇ から得られたも
のであった：仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ Ｌ ＤＮＡリガーゼ、Ｂ轟１３／エキソヌクレアー
ゼ、Ｓ／ヌクレアーゼ及ヒＴ４Ｌポリヌクレオチドキナ
ーゼ。 方法 具体例において示されたクローニング操作に従って用い
られた標準的方法は、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ 、Ｅ。 Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ４
ｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 １
９ｒ２年に記載されテイル。（Ｊ’）参考文献は次の標
準的方法の操作を含むものである： Ｅ、ｃｏｌｔ プ
ラスミドを用いるクローニング操作、Ｅ、ｃｏｌ＋細胞
の形質転換、プラスミドＤＮＡ精製、ＤＮＡのフェノー
ル抽出、ＤＮＡのエタノール沈澱、アガロースゲル電気
泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の留製、及び制
限エンドヌクレアーゼ及びその他のＤＮＡ−変成酵素反
応。全ての場合において、ＤＮＡはフェノール抽出の後
エタノール沈澱を行って精製された。 具体例において使用されたウィルススト／りは、ＴＮＭ
−ＦＨ培地（Ｗ、 Ｆ、 Ｈｉｎｋ −２２６Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ ） ’ＡＡｌｒ −μ４７ （／
り７０）参照）十／（：１％ウシ胎児血清を用いてスボ
ドプテラ フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｓｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ ） 細刀包 （ＩＰＬＢ −ｓｆ
２／ −ＡＥ）中において調製され、滴定した。ウィル
ス及び細胞の培養方法はり、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍｉｎ及
びＭ、 Ｄ。 ８ ｕｍｍｅｒｓ ツタ Ｊ、Ｖｌｒｏｌ 、００−１
３．２（／り７ｊ年）、及びり、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍａ
ｎ 、 Ｍ、 Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＣ，Ｈ。 Ｉ（＋ｉｅｈ ／９ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 １２０−１
３２ （ツタ７６年）に説明されている。ウィルス生長
速度論はＳ、フルギベルダ及び／、、！ｔ％アガロース
重層を用いて上記Ｖｌｌｌｋｍｍｌ等の方法により決定
した。 例■ ポリヘトリン転移ベクターの構成 本発明によるポリヘトリン転移ベクターを構成するため
に、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖボリヘドリ／遺伝子を含む
ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ，！’のＥＧＯＩｌ（部
位中にクローン化した。これは、Ｍ３ （Ｇ、 Ｅ、
Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 Ｉり
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ！／７− ！２７（ｔ９７１ ））
と称されるＡｃＭＮＰＶのブラークー精製法をウィルス
ＤＮＡ源として使用することにより達成された。ＡｃＭ
ＮＰ Ｖ Ｄ Ｎ Ａは上記参考文献においてスミス（
Ｓｍ１ｔｈ ）及びサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒ＋＋ ）に
より説明されているように、ウィルスから抽出し、塩化
セシウム密度勾配における平衡遠心分離によυ精製した
。ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡはＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレ
アーゼにより完全に消化した。（皓られたＡｃＭＮＰＶ
Ｅｃｏ ＲＩ −Ｉ断片を先ずｐＢＲＪｕｔ中にクロ
ーン化してｐＩ １０を形成し、次いで標準的クローニ
ング操作法を用いてｐＵＣｒ中にサブクローン化してｐ
ｔ ｆを形成した（第１図参照）。 この組換えプラスミドｐＩ♂は３個のＢａｍＨＩ認識部
位を有する（第２図参照）＝１つは位置４ｔ、２ＩＯに
おけるポリヘトリン遺伝子中に、１つは７３００におけ
るｐＵＣｆにおいて、及びノつは位置６１６０における
ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片におけるものである。４１６０及び
７３００における部位は、所望の遺伝子、例えばＣＡＴ
、ＩＬ、！或いはＩＦＮ＝β遺伝子、がポリへドリンプ
ロモーターに隣接した所望の位置（位置４ＡＪ、ＩＯ）
におけるｐｌＪ’中に便利にクローン化されるようにｐ
ＩＪ’から除去される。 ポリヘトリン遺伝子中に位置していない約７．３００に
おけるｐＩｆ中のｐＵＣＩ Ｂａｍ ＨＩ制限部位は次
のようにして除去された：ｌＯμｇのｐ［をＰＩＩｔ工
及びＳｍａ Ｉで消化し、このＤ Ｎ Ａを精製し、Ｓ
ｌヌクレアーゼ緩衝液（０，０３Ｍ酢酸ナトリウム、Ｐ
Ｈ４１−、ｊＡ 、 ０．２３ Ｍ ＮａＣ１及びｏ、
ｏｏｐｓ Ｍ Ｚｎｃ１２）プラスＳＯＯ単位の３／
ヌクレアーゼ／ ｍｌ中に再）懸濁させた。この反応混
合物を、１７℃においてｉｓ分間インキａベート後、Ｄ
ＮＡをｏ３噛アガロースゲル中において電気泳動させた
。高分子量線状ＤＮＡをゲルから精製し、Ｅ、 ｃｏｌ
ｔ Ｊ Ｍ １３細胞をアンピシリン耐性（ａｍｒ）、
ガラクトシダーゼ陰性（ｇａｌ−）に形質転換するため
に使用した。ｐｔｒｃにクローニング領域において、Ｐ
ｓｔ Ｉ 、 Ｂ轟ｍＨＩ、Ｓｍｉ Ｉ 、及びＥｃｏ
ＲＩ部位を有しないプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐｉｆｓＰｓとした（第７図参照）。 ＡｃＭＮＰＶ ＥｃｏＲＩ −１（ｐＩｌｒＳＰＳの一
部）中の位置６１６０におけるＢａｍＨＩ （Ｇ、 Ｂ
、 Ｓｍ１ｔｂ 。 ＪｏＭ、Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ 、 ｌＡｊ ：、２／！−ムＲ）
を次のようにして除去した。即ち、１０１１９のｐＩｆ
ｓＰｓを１０単位のＢａｍＨＩと５０μｌの緩衝液中で
混合し１，７７℃でインキ−ベートした。 ３．４ 、 ／：２．２０及び３０分後に１０μｌずつ
のアリコートを取り、反応は１０ｍＭまでＥＤＴＡを酪
加することにより停止させた。これらのアリコートをプ
ールし、０．７％アガロース中において電気泳動を行−
だ。ゲルから全長の線状ＤＮＡな鵬離し、上記Ｓノヌク
レアーゼで処理し、次いでＴ４’ＤＮＡリガーゼを用い
て環化させた。Ｊ Ｍ Ｉ３細胞はａｍｒ、 ｇｌｌｌ
−に形質転換させ、組換えプラスミドは位置ｔ／１，０
に１３コｍＨＩ制限部位が欠けるものと同定された。こ
のプラスミドはポリヘトリン遺伝子の翻訳開始部位から
＋／７！塩基の位置４ｔ−２ＩＯに単一のＢａｍＨＩク
ローニング部位を有しく第３図参照〕、従って、「親Ｊ
ＡｃＭＮＰＶポリヘト″リン遺伝子転移ベクターである
ｐＡｃ １０／と命名された（第１図参照）。 例■ 転移ベクターの変成 選ばれた遺伝子の挿入のだめのポリヘトリン遺伝子にお
ける適当な位置を決定するためにｐＡｃｌｏｌの他に多
くの転移ベクターを構成した（第２図参照）。これらの
転移ベクターはポリヘトリンのｒ６アミノー末端残基及
びｊ′非−翻訳ポリヘトリンｍＲＮＡ配列をコードする
幾つか或いは全てのＤＮＡ配列を除去し、次いで以下の
方法により削除の部位にＢａｍＨＩ認識部位を有するオ
リゴヌクレオチド合成りＮＡリンカ−を挿入することに
より構成した。 例工と同様にしてｐ ｉ １０からのＥｃｏ ＲＩ 乃
至ＢａｍＨＩ断片（Ｏ−Ｌ２１０）をｐＵｃｆｆ中にサ
ブクローン化し、得られたプラスミ′ドをｐＢ′と命名
した（第２図参照）。この断片は＋１７５までのポリヘ
トリン遺伝子及びポリヘトリン遺伝子に加えて４ｔ、ｏ
ｏθ塩基対のＡｅＭＮＰＶ ＤＮＡ配列を含有する。１
１２１０位におけるＢａｍＨＩ部位の周りの欠失を次の
ようにして ｎ７中に導入した（第２図）ニゲ０μｇの
ｐＢ′を１３コｍＩ（Ｉで消化し、ＤＮＡを精製し、０
．７％アガロースゲル上で電気泳動を行つた。線状ＤＮ
Ａ断片をゲルから抽出し、０．ｌ単位のＢａ１３／エキ
ソヌクレアーゼを有する１００μｌの緩衝液中において
３０℃でグＯ分間インキュベートした。ｌＯμｌずつの
アリコートを１１コ、！、１０．７５％２０゜Ｊｌ、３
０，３３及びグθ分間隔で集め、反応は各アリコートに
１０μｌの０．２ｔＭ ＥＤＴＡを添加するととにより
停止させた。これらの了りコートを集め、ＤＮＡを精製
した。ＤＮＡの末端はμ単位のＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて１００μｌの緩
衝液中において９℃で３０分間インキーヘートさせて修
復した。ＤＮＡを精製し、ｌμＩのホスホリル化Ｂａｍ
ＨＩ リンカ−（！’−ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ−Ｊ’）を
１００μ１反応混合物中に２０単位のＴ ４１．Ｄ Ｎ
Ａ ＩＪガーゼと共に添加した。室温で２時Ｉｕｌイ
ンキーベージ日ン後、ＤＮＡを精製した。 次いで、ＤＮＡベレットを１００μｌの緩衝液十二〇単
位のＢａｍＨＩ中に再懸濁させ５，７７°Ｃでμ時間消
化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロース中で電気泳
動を行い、ゲルから２００塩基対欠失までのｐＢ’截頭
プラスミド′を精製した。ＤＮＡをＴｌＤＮＡ リガー
ゼを用いて環化させ、Ｊ Ｍ １３ 細胞をａｍ 、
ｇａｌに形質転換するために使用した。得られたクロー
ンはＢａｍＨＩ認識部位の位置に応じてｐＢ’Ｂａｌ
／ 、 、２．３などと称される突然変異プラスミドの
「ライブラリー（ＬＩＢＲＡＲＹ）Ｊを構成した。 数個のｐＢ’ Ｂａｔ欠失突然変異プラスミドを選択し
、各々からのＸｈｏ Ｉ （１９００）からＢａｍＨＩ
リンカ−（４１００θ〜４ＬＵ／θ位）までの断片をア
ガロースゲルから精製した（断片Ａ）（第２図）。）（
ｈｏＩ（ｌりＯθ）からＢａｍＨＩ（μｘｉｏ ） ま
での断片をｐＡｃｌｏｌから除去し、残存配列をアガロ
ースゲルから精製した（断片Ｂ）（第一２図）。断片Ａ
の各々約０．１μｇを０．／ｌｑｉの断片Ｂと混合し、
ｌ単位のＴ≠ ＤＮＡＩＪガーゼを有する２０μｌの緩
衝液中においてインキ瓢ベートさせて連結し、次いでＪ
Ｍｌｒ３細胞をｌ１ｍ’ 、ｇ”−に形質転換するため
に使用した。得られたプラスミドは、変成転移べ〆ター
であり、例えばｐＢ’ Ｂａｌ ／／に由来する場合に
はｐＡｃ Ｊ／／ 、 ｐＢ’ Ｂａｌ １０に由来す
る場合にはｐＡｃ３６０などのように命名した。この様
にして、「変成」転移ベクターを構成し、代表的なもの
はポリヘトリン遺伝子における十１７３〜−１ｏｏ位に
おけるＢａｍＨＩクローニング部位を有するものであっ
た。μつの変成転移ベクター、ｐｋｃＪＩＯ％ｐＡａ３
７３、ｐＡｃ 、３ｉｔ及びｐＡｃ Ｊ６０におけるＢ
ａｍＨＩ認識部位の位置並びに親転移ベクターｐＡｃ１
０１におけるその位置は第３図に示されている。 例■ 例Ｉ或いは例■の方法に従りて調製された転移ベクター
は、いずれも、利用される特別の変成転移ベクターに応
じて目的遺伝子が各種の位置においてポリヘトリン遺伝
子に結合されている組換え転移ベクターの構成に利用す
ることができる。ヒトβ−インターフェロン合成をコー
ドするＩＦＮ−β遺伝子の上記文献に示される標準的ク
ローニング技術を用いて変成転移ベクターの１つ、ｐＡ
ｃ３１ｒＯ中への単−ＢａｍＨＩクローニング部位にお
ける挿入によ’） ｐＡｃ ３（θ−ＩＦＮ−βと称さ
れるプラスミドを形成する方法が第φ図に概略的に示さ
れている。 ＩＦＮ−β遺伝子は、ヒトＩＦＮ−β（ｐＢＲ／Ｊと称
される、Ｈ，Ｈａｕｓｏｒ等参照、コタ７ Ｎａｔｕｒ
ｅ（Ｌｏｎｄｏｎ ） Ａｌ１− ＋ｊｇ （／２ｔλ
）及びＧ、 Ｇｒｏｓｓ等、タ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓ Ｒａｓ、２ゲタｊ−２３０７（／りＩＩ））の
ゲノムクローンから得られ、且つＩＮＦ−βに対する全
蛋白質コード配列、ＡＴＧ翻訳開始信号前の３個の追加
塩基及びポリアデニル化に対する信号を含む全ての非−
翻訳３′配列を含有する０、７１．７キロベースＨ１ｎ
ａ■ 断片として特徴付けられる。ＩＦＮ−βに対する
ヌクレオチド配列及び各種転写及び翻訳信号の位置はＲ
，Ｄｅｒｙｎｃｋ等、ｚｒｊＮａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ
ｏｎ ） ｊｕｉ −ｓａｙ （／り１０ ）； Ｇ、
Ｇｒｏｓｓ等、 タ Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒａｓ、
Ｊ、ｌＬり、ｔ −，２ｊ０７ （／りＩＩ）；及びＢ
、 ０ｈｎｏ及びＴ、 Ｔａｎｉｇｕｃｂｉ 、 ７７
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ３３０！−３１０り（１ｙ
ｒｉ ）などに記載されている。 − ＩＦＮ−β遺伝子を含むＨｉｎｅｎ ＤＮＡ断片は、挿
入がＡ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖポリへドリンプロモーター
に隣接し、ポリヘトリン遺伝子とｊ′乃至３′配向であ
るようにＩＦＮ−β遺伝子断片上の合成オリゴヌクレオ
チドリンカーを用いてｐＡｅ ３１０の利用可能なりａ
ｍＨＩ制限部位に挿入される。 はぼ同様にして、ＩＦＮ−β遺伝子をその他の変成転移
ベクターｐＡｅ ３／／ 、 ｐＡｃ Ｊ６０及びｐＡ
ｃ３７３及び親転移ベクターｐＡｃ １０／中にクロー
ン化し、各々ｐＡｃ Ｊ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡａ
ＪＡθ−ＩＦＮ−β、ｐＡｃ ３７３− Ｉ Ｆ Ｎ
−β及びｐＡｃ １０／ −ＩＦＮ−βと称される組換
え転移ベクターを形成した。 潜在的には、その遺伝子或いは任意のその他の選ばれた
遺伝子は、ＢａｍＨＩ認識部位或いは転移ベクター内の
任意の位置に挿入された任意のその他の適当な制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位を有する任意の転移ベクター中
にクローン化するととが可能である。更に、例Ｉにおい
て略述した如く、適当な制限エンドヌクレアーゼクロー
ニング部位を、プラスミド中に取υ込むことができるＡ
ｃＭＮＰｖゲノムの任意の断片における任意の点におい
て誘発することが出来るので、ＢａｍＨＩ認識部位を挿
入するためにポリヘトリン構造配列の一部又は全部を欠
失させる必要はない。 例■ 例■の方法によシ調製された組換え転移ベクターは、い
ずれも、ＡｃＭＮＰＶのゲノム中にＩＦＮ−β遺伝子を
転移させるために使用して組換えバキーロウィルス発現
ベクターを形成することができる。転移はＣｍ”及びＳ
、フルギペルダ（Ｓ。 ｆｒｕｇｔｐｅｒｄａ ）のような感染しやすい昆虫宿
主細胞の存在下においてトランスフエフシロン（ｔｒａ
ｎｇｆｅｃｔｌｏｎ ） により行われた。 Ｆ、 Ｌ、 Ｇｒａｂａｍ及びＡ、 Ｊ、 Ｖａｎ Ｄ
ｅｒ Ｅｂ 、 ｊ、２Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１３４−
ｕＡ７ （／り７３）に記載されている方法の修正方法
を次のように利用した。Ａ ｃ Ｍ Ｎ ＰＶ（／μｇ
）から抽出され精製されたＤ Ｎ Ａをｌ〜ノθμＩ
の組換え転移ベクターＤＮＡ、特に組換え転移ベクター
ｐＡｃ Ｊざ０−ＩＦＮ−βと混合し、ｄ当り／！；μ
Ｉの担体仔ウシ胸腺ＤＮＡを有する１−ＨＥＰＥＳ（Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−コーエタン
スルホン酸） −１１ｉ衝ｍ水（ｐＨ７，０３）中でり
！Ｏｐｌにした。混合物を渦巻き混合機中で攪拌しなが
ら３０ ｍｌのλ、ｊＭ ＣａＣｌ、を滴下し、沈澱を
室温で３０分間形成させた。ｔｍｌの沈澱したＤＮＡを
感染しやすい昆虫宿主細胞、この場合にはＳ、フルギペ
ルダ、に６０關培養ブＶ−ト内のλｔｎｌの培地内にお
いて添加した。μ時間後、細胞単層を培地で洗浄し、１
０％ウシ胎児血清を含むλｍｌの培地中において３日間
インキ−ベートした。得られた子孫は組換え及び弁組換
えＡｃＭＮＰＶウィルスの混合物よシなるものであった
。 例Ｖ 組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターの選択次に、例１ｖに
より得られた弁組換え及び組換えバキーニウィルスの混
合物からＡｃＭＮＰＶ組換え発現ベクターを単離するこ
とが必要であった。この単離がポリヘトリン構造遺伝子
の全て或いは一部が欠失した組換え体において達成され
る方法は、（１１ポリヘトリンがこれらのウィルスによ
り全く生成されない、及び（２）非−封入（ポリへドリ
ンコートに欠ける）ウィルス形態が昆虫細胞培養液中に
おいて生育可能であり、感染性であるという事実を利用
するものである。 ポリヘトリン構造遺伝子の全て或いは一部が欠失した組
換えＡ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖウィルスにおいて、例えば
組換え転移ベクターｐＡｃｉＯｔ −Ｉ ＦＮ−β、ｐ
ＡｅＪ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡｃ Ｊ６０− Ｉ
Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅＪ７Ｊ −Ｉ ＦＮ−β及びｐＡｃ
３ざ０−ＩＦＮ−β、とのトランスフェクシ１ンから
得られた組換え体において、組換えＡｅＭＮＰＶウィル
スは下記の如くして単離される。 トランス７工クシ１ン後３日目に培地中に存在する外部
細胞ウィルスを、Ｌ、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍａｎ 、 Ｍ
、 Ｄ。 ８ ｕｍｍｅｒｉ及びＣ，Ｈ，Ｈｓｉｅｈ 、 ／りＪ
、 Ｖｉｒｏｌ、１２０−１３２ （／り７６）に記載
されている標準的Ａ ｃ Ｍ Ｎ ＰＶポリへドリンブ
ラークアッセイにおいて使用した。発達したプラークは
、ウィルス封入体を生成する弁組換えＡ ｃ Ｍ Ｎ
Ｐ Ｖで感染された細胞或いはウィルス封入体を生成し
ない組換えＡｃＭＮＰＶウィルスで感染された細胞のい
ずれかからの結果であった。後者のタイプのプラーク（
０−プラーク）は当初低倍率双眼顕微鏡の下においてそ
れらの外観により前者（０＋プラーク）と識別された。 Ｏ−プラークはマークを付し、倒立顕微鏡により検査を
行ったところ、個々のウィルス封入体が存在する場合に
は感染細胞の核内に観察することができた。 ０′″ プラークからのウィルスをプラーク精製し、Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素で分析し、組換えＡ（ＩＭＮｐｖ
ベクターはＥｃｏ ＲＩ −Ｉの適当な位置に外来遺伝
子を挿入して有していることを確認した。ウィルスゲノ
ムにおけるその他の変化は何等検出されなかつた。次い
で感染しやすい昆虫細胞に標準操作を用いて感染させる
ことによシ多量の目的組換えウィルスを得た。 例■ 目的遺伝子生成物を製造するためには、組換えバキーロ
ウィルスは感染しやすい宿主昆虫細胞内で感染されなけ
ればならない。組換え転移ベクターＡｃ １０１− Ｉ
Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅＪ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡｅ
３６０− Ｉ Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅ ３７３− Ｉ
Ｆ Ｎ−β及びｐＡｅＪｆ＜１１− Ｉ ＦＮ−β（ｇ
−を図参照）を用いた組換えによシ形成されたＡｃＭＮ
ＰＶ発現ベクターの具体例に対して次の操作を利用した
。 感染しゃすいＳ、フラギペルダの宿主細胞を先ず懸濁培
養成いは単層（単分子層）において／ −ｊ×ｌＯ６細
胞／ｒｎｌ（最適発現のための細胞濃度は各ＡｃＭＮＰ
Ｖ発現ベクターに応じて異る）の密度まで生育させた。 生育培地を除去し、細胞当りｏ、ｉ〜１００（最適濃度
は変シ得る）のプラーク形成単位の組換えウィルス例え
ばＡｃ ３１０− Ｉ ＦＮ−β（、ｌＥｊ図）、を含
有する培地とＪ”Ｃにおいて約１時間変換した。この接
種物は細胞上に残されても或いは除去されて適量の新し
い培地と交換されてもよい。 クローン化されたＩＦＮ−β遺伝子からの蛋白質はＡｃ
−３１０−Ｉ ＦＮ−β発現ベクターで感染されたＳ、
フルギベルダ細胞内において感染後約７３時間乃至感染
後３日生成された。ウィルス蛋白質合成、ウィルス組立
て及び細胞溶解を含む全感染過程は約７２時間で完結し
た。感染後！；０−Ａθ時間の間に蛋白質合成に顕著な
減少が見られ、細胞溶解は感染後約ＳＯ時間において最
初に検出された。ＩＦＮ−β遺伝子の発現の機構は、宿
主細胞の種類及び遺伝子がポリヘトリン遺伝子にクロー
ニングされた部位に応じて興った。 各組換えウィルスに対するＩＦＮ−β発現の機構を表７
にまとめて示す。各発現ベクターで感染された細胞内に
感染後ケｇ時間までに相当なレベルのインターフェロン
が検出された。検討された発現ベクターの中でＡｃ ３
７３− Ｉ ＦＮ−β及びＡＣ３１０−ＩＦＮ−βは最
も高いインターフェロン活性の力価を生成した（表１）
。 インターフェロン活性の細胞内のレベルも又測定され、
表１に示されている。感染後戦時間においてＡｅ Ｊ７
Ｊ −Ｉ ＦＮ−β及びＡＣ３１０−Ｉ ＦＮ−β感染
細胞の内部には全インターフェロン活性のｊチ未満が留
まシ、これは、Ｉ ＦＮ −７分泌信号が認識され、蛋
白質が感染中に培地内に効率よく放出されたことを示し
ている。感染後／：１時間において、Ａｃ ３７３−
Ｉ ＦＮ−β及びＡｃ ３１０− Ｉ ＦＮ−β感染細
胞からの培地は約ｔＯ，０００ＩＵ／＋ｍのインターフ
ェロンを有し、感染後戦時間までにほぼｊ×１０６１Ｕ
／ｍｌの最大に増大した。 表７ 各種発現ベクターにより感染されたＳ、フルギペルダ細
胞内におけるインターフェロン発現の機構を試験した。 これらの実験の結果は下記の通りである： 心 七 ＝ｉ 七 七 七 局 ＡｃＭＮＰＶ 感染細胞中のポリヘトリンの合成は同様
な時間的発現パターンに従うことが知られている。Ａｃ
５６０−ＩＦＮ−β中に産生されるインターフェロンの
量はより少なく 、Ａｃ３／／ −ＩＦＮ−βウィルス
感染細胞中にお層ては伺少ないがツタ係を超える活性が
培地中に存在した（表／）。Ａｌ！／（１）／−ＩＦＮ
−β感染細胞中には比較的低レベルのインターフェロン
が検出され、その殆んどが卸１ ）腔内のものであった
（表／）。 組換えウィルス感染細軸の力価は、Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ
Ｖ＋％染細ＩＪａの典型的なものである培地ａ当り３〜
ｇｘｉｏ”プラーク形成単位の最大値に到達した。この
様に、ＩＦＮ−β遺伝子のポリヘトリン遺伝子への挿入
はウィルスの複製に何等の大きな影響を及ｔ１°さない
ように思われる。これを試験するために、、２ｘｉｏ６
個のＳ、フルギベルダ細胞を、Ｊ−Ｘ １０６Ｉ ＵＡ
ｎパでのＡｃＪざ０−ＩＦＮ−β感染細胞培地中に産生
されたインターフェロン或いはｊ×１０５ ■Ｕ／１ｎ
ｌの国際標準のヒトインターフェロンで７．２時間処理
し、その後処理細胞をｉｏｏプラーク形成単位のＡｃＭ
ＮＰＶ或いはＡｃＪざ０−ＩＦＮ−βで感染させた。細
胞のインターフェロンへの曝露は、発達したウィルスプ
ラーク数に測定可能な影響は及ｅ１さなかった。 水庖性ロ内炎ウィルス感作されたヒト羊１ＷＩＳＨ細胞
におけるウィルスプラーク減少アッセイを用いてインタ
ーフェロン活性の分析を行った。 ウィルス粒子を遠心分離で除去するとＡｃＭＮＰＶ感染
細胞からの培地中には何等のインターフェロン活性も測
尾されなかった。しかしながら、インターフェロンアッ
セイの際にＡｃＭＮＰＶウィルス含有培地を使用すると
、１０００〜３０００国際標準単位（ＩＵ）／ｍ／のイ
ンターフェロンが生成さｉ−Ｌ、ＡｃＭＮＰＶヴイリオ
ンが明らかｍｗｉｓｎ細ノ胞内に内因性インターフェロ
ンを誘発したことを示した。多くの禎類のエンベロープ
に封入されたウィルスがヒト細胞におをハてインターフ
ェロンの産生を誘発することが知られているので、これ
らの結果は予想されたものであった。この影響を避ける
ために、以下の全ての試料は試験前に退心分陥にかけら
れた。 培地中に存在する血清アルブミン（ｇツ／ｄ）及び仔ウ
シ血清（１０％ ） （Ｗ、 Ｆ、 Ｈｉｎｋ 、、２
２乙Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ ） ４！＆ Ａ−
ＩＩ乙７（／？７０）参照）がＡｃ３１０−ＩＦＮ−β
で感染されたＳ、フルギペルダ細胞内におけるＩＦＮ−
βの発現に必要であるか否かを決定するために７つの実
験を行った。感采稜ｒ時間目に培地をｏ−ｉｏ％のウシ
胎児血清を含有するＧｒａｃｅの培地（非血清アルブミ
ン、Ｔ、 Ｃ，Ｃ。 Ｇｒａｃｅ 、 ／り、！ Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ
ｏｎ ） ７Ｊ’ Ｉ −７Ｊ’り（／２４．２）参照
）で交換した。各変成培地について感染後ｔざ時間後に
インターフェロン活性の分析を行った。 無血清の場合には、インターフェロン活性に約７０倍の
減少があった。ｏ、ｒ％の血清の添加により／θチの血
清を含有する対照例におけるのと同一レベルの活性が産
生された。Ａｃｊざ０４ＦＮ−β感染細ノ泡中のＩＦＮ
−βの特異活性はｏ、ｒ’Ｊ６血消を含有するＧｒｉｃ
ｅの培地中に産生された際ＶＣは約ｊ Ｘ １０６エＵ
／ダ の蛋白質であつ１こ。悄製β−インターフェロン
の活性をλ十１０８１ＵＡｎｌと想定すると（Ｅ。 Ｋｒ＋１ｇｈｔ 、 Ｊｒ、、７３ Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ。 ｒ、２ｏ −ｒ２３（／ｓ＞７ｇ ）参照）、β−イン
ターフェロンは培地中の全蛋白質の約／チを表わすであ
ろう。 更に、Ａｃ５７３−ＩＦＮ−β及びＡｃ５１０−ＩＦＮ
−β感染ａｌ 施の培地中で測定されたインターフェロ
ン活性の分析１−ｔ ／７，０００ （／７Ｋ ）及び
２０．ｊｔＫ分子景のλつのポリペプチドを明らかにし
た。非グリコジル化及びグリコジル化ヒ）ＩＦＮ−β蛋
白質の大きさは各々／７Ｋ及び、２０゜ｊＫポリペプチ
ドに匹敵するものであることが報告さノｔている。感染
後３０時間目に／”ＩＫポリペプチドはＡｃ３乙０４Ｆ
Ｎ−β感染細胞中に作られており、感染後ｑ時間迄に７
７Ｋ及び；）、０． ｔ Ｋポリペプチドの両者が検出
された。 Ａｃ３／／−ＩＦＮ−β感染細胞内には／７
にポリペプチドのみが感感後３０時間目及びｌｔｇ時間
目に検出された。 Ａｃ、？！；０−ＩＦＮ−βノ＝＜染細ノ］ｍ中１でｉ
Ｉ′ｊ：豊富に産生された。２ｊ、 ｊ Ｋ蛋白質が観
察された。この大きさは２７個のアミノ酸信号ペプチド
プラスボリヘドリン遺伝子の最初の／θコドン由来の追
加の／ｌ／、個のアミノ酸及びＢａｍＨＩリンカ−配列
を含む全インターフェロン蛋白質よりなるノ・イブリッ
ド蛋白質に対して予想されたものである。 Ａｃ３ど０−ＩＦＮ−βおよび（少ない程度で）Ａｃ３
６０−ＩＦＮ−β感染細胞内で作られた７７Ｋ及び、７
（１，ｚ Ｋ ｉ 白質はヒ）ＩＦＮ−βモノクローナ
ル抗体と反応した。（ＩＦＮ−βモノクロナール抗体は
ｐ 、Ｗ、 Ｔｒｏｗｎ及びＨｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒ
ｏｃｈｅ社により提供された。）この抗体の／７に蛋白
質に対する反応性に対比して、２０． ｊ Ｋ蛋白質に
対する反応性が減少されていることが注目された。これ
は、幾分１、）、ＯＪＫよりも７７Ｋが細ｌ泡中により
高いレベルで蓄積すると１／１５事実によるものである
。更に、この抗体は例えば：）、０．４− Ｋポリペプ
チドのグリコジル化により部分的にマスクされて（／す
る／７にポリペプチド上のエピトープと反応しているｏ
Ｊ能性がある。 この想像上のハイブリッド、ｎｊＫ及び３．２に蛋白質
は又ＩＦＮ−β抗体と反応した。ポリヘトリンに対する
ポリクローナル抗体は、ＤＮＡ配列から）・イブリッド
蛋白質のＮ−末端に存在することが予想される。ＺＪＪ
Ｋ蛋白質の７０個のアミン１声及び３ツに蛋白質の５７
個のアミノ酸を認識した。 ２０．！ＫＩＦＮ−βがグリコジル化されていることを
示すために、Ａｃｊざ０−ＩＦＮ−β感染細胞を感染の
後期において（５Ｈ）マンノースで標識した。 ２．０．ｊＫ ＩＦＮ−β及び３個の追加の蛋白質１ｄ
Ａｃ ３♂０−ＩＦＮ−β感染Ａ１１ｌｌ ノｊ［！
におＩ八て標識された主たるマンノース倉荷グリコ蛋白
質であった。 例■ −の構成 Ｅ、 ｃｏｌｔ転置囚子Ｔｎりは、抗生物質クロラムフ
ェニコールに対する耐性を与える酵素クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ、Ｔ）に対する
遺伝子を含有する。ＣＡＴの真核生物ベクター内におけ
る発現は動物細胞におけるプロモーターの発現を測定す
る便利な手段であることが示されて１ハる。（Ｍ、 Ｍ
ａｃｋｅｔｔ ％ Ｇ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＢ、Ｍｏａａ
、／りざＩＩ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、ＩＩり： ざｊ７−
ｒ＆Ｆ及びそれに示される参考文献を参照）。ＡｃＭ
ＮＰＶ−ＣＡ１発現ベクターはバキ瓢ロウィルスベクタ
ー中における外来遺伝子の産生を最適化するように設計
された実験において有用である。 ＣＡＴ−コード配列を含有する７７０塙基対ＴａｑＩ
ＤＮＡ断片をｐＢＲＪ−！Ｊ’から単離し、ｐＵＣ７の
ＡｃｃＩ 部位にクローン化した。このＣＡＴ−コード
配列をＢａｍＨＩで切シ出し、ｐＡｃｊ７Ｊ中のＢａｍ
Ｉ（Ｉ部位に挿入した。得られたプラスミド転移ベクタ
ーをｐＡｃ ３７３− ＣＡＴと称する。 例■ ヒトインターロイΦンー、ｚ（ＩＬ、ｚ）は有糸分裂促
進剤或すは抗原により刺戟されたヒトリンパ球内に微量
に産生される。ＩＬ−２は当初培養液中のＴリンパ細胞
の長期間の生育を維持することのできる因子であると説
明されて（ハた（ Ｄ 、 Ａ 、 Ｍｏｒｇａｎ 。 Ｆ 、 Ｗ、 Ｒｕａｃｅｔｔｌ 及び Ｒ，Ｇａ１ｌ
ｏ 、５ｃｉｅｎｃｅ ／り３ ：ｔｏｏｑ−１０ｏｔ
（ｔｙｙＡ））。それは、免役応答の刺戟及び維持に
おりて中心的役割を果たすようであシ、ある種のヒトの
病気に介在していたために、複雑なものであった（ Ａ
、 Ａｌｔｍａｎ 、Ａ、 Ｎ。 Ｔｈｅｏｆｌｌｏｐｏｕｌｏｓ ％Ｒ，Ｗｅｊｎｅｒ
、Ｄ、 Ｈ，ＫａｔｚおよびＦ、 Ｊ、 Ｄｊｘｏｎ
、Ｊ、 Ｅｘｐｌ、Ｍｅｄ、／！’Ｉ ： ／１１０３
−ハｔｙｙ（／Ｐ♂／））。 大証のＩＬ−ｊの製造の
ためにＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用することは、ヒ
ト免役系の臨床的診断及び治療操作を非常に容易にする
ことが期待される。最近、幾つかの実験室は、ＩＬ−２
の遺伝子の単離及びプラスミドベクターを用１八た細菌
細胞中における生物学的に活性な工Ｌ−，２の製造を報
告して（八る（ Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２２３ ： ハＺ／、２−ｉ１１．／ｚ （１ｙｉ
ａ）及びその中の参考文献参照）。 ＩＬ、！−コード配列を含有する１ｏｏｏ塩基対のＢａ
ｍ ＨＩ断片をｐＩＬ、２−．２Ｂから単離し、ｐＡｃ
３７３及びｐＡｃ３１０のＢａｍＨＩ部位に挿入した。 得られたプラスミド転移ベクターをｐＡｃＪ７Ｊ〜ＩＬ
２及びｐＡｃ Ｊざ０− ＩＬ、２と称する。 例■ ポリへドリノ−ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノムへの転移 ポリへドリノ−ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノム中への転移及び組換えＡｅＭＮＰＶ発現ベクター
の選択は、上記例１ｖに説明したように行った。ｐＡｃ
３７３− Ｉ Ｌｊ、ｐＡｅ ３１０− Ｌ Ｌ２及
びｐＡｃｊ７Ｊ−ＣＡＴから産生したＡｃ ＭＮ Ｐ
Ｖ発現ベクターは各々Ａｃｊ７Ｊ−ＩＬ２、Ａａ３１０
−ＩＬ２及びＡｅＪ７Ｊ−ＣＡＴと称する。 例Ｘ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＩＬ２の製造Ｓ、
フルギペルダ細胞をｋａ３１０−ＩＦＮ−βにつ込て説
明したものと同様なＡｃＪ７Ｊ−ＩＬ、２或（八けＡｃ
３ざ０−ＩＬ、２発現ベクターで感染させた。感染後
ｔＡｇＡｇ時間項地及び感染細胞を集め、インターロイ
キンの生物学的活性のレベルをＧ１１ｌｓ等、Ｊ。 Ｉｍｒｎｕｎｏｌ 、 ／２０ ： ２０２７−２０３
．２（／り７ｒ）によシ説明されているＩＬ２アッセイ
を用いて測定した。このアッセイを用いて、ＩＬ２の特
異活性は蛋白質ツ当シ／Ｘ１０”単位と測定された。両
発現ベクター共に高レベルのインターロイキン活性を産
生じたが、しかし、Ａｃ５７３−ＩＬ２はＡａ３１ｒＯ
−ＩＬ、２よりもほぼグ倍のインターロイキンを産生じ
たく表２参照）。インターロイキン活性の約１０係は培
地内に存在し、蛋白質が感染中】細胞か−ら効率的に分
泌されることを示した。Ｈｏｆｆｍａｎ −ＬａＲｏｃ
ｈｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ−のＧｒａｃｅ
Ｊｕ博士によシ行われた別の実験においては、Ｓ、フ
ルギベルダ細胞をＡｃ３７３− Ｉ Ｌ２及びＡａＪ♂
ｏ −Ｉ Ｌ２で感染させ、インターロイキン活性を堵
地内妬お（八て感染後、２ｕ＋寺聞、≠ｇ時間、７２時
間目に測定した。新鮮な培地を３時間及びＩＬｇ時聞時
間適用した。実質的に全ての活性は感染後０−Ｊり時間
及びＪ〜弘５時間の間に産生された（表２）。ＩＬ、２
の特異活性から、ｋ：３７３−ＩＬ２Ｊ水染細ノ泡のｌ
当シ少な（とも／ツのＩＬ２蛋白質が産生され、分泌さ
れたと計算される。 ＡｃＪ７Ｊ−ＩＬ、２及びＡｃ３♂θ−ＩＬ２感染細胞
において合成された蛋白質の分析を行った。これらのＡ
ｃＭＮＰＶ発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染細廁に
おいては作られない２つの蛋白質が多量に作られた。こ
れらの新蛋白質は約／３． ｊ Ｋ及び／６にダルトン
の大きさのものである。これは、ＤＮＡ配列から予想さ
れたインターロイキンの大きさが約／３．！にであると
ｂう事実（蛋白質のアミン末端の、２０個のアミノ酸信
号ペプチドが除去されたと仮定して）と一致するもので
ある。 表− ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターで感染されたＳ、フルギベル
ダ細胞中のインターロイキン−λ活性の産生。 感染陽ＩＶｃ＞−て培地及び感染細ｊＭの試料は感染後
ψｇ時間目に集められた。感染Ｎｏ、２にお（八では、
培地の試料は感染後Ｊ’時間、Ｉｌ−ざ時間及び７２時
間目に集められ、新鮮な培地は感染０；、Ｊ時間目、及
び≠ｇ時間目に適用された。 感染Ｎｎ／ａ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ．２ＪＸ１０７／ Ｘ／θ８ ／
、、２！ １０％ＡｃＪざ０−ＩＬＪ ／、ＯＸ／θ７
！Ｘ／θ７ θ、６ｇグ係感染Ｎ［１２ｂ Ａｃ３７３−ＩＬ、２２グ ｊ、／Ｘ／θ７ θ、ｊＡ
ａ３７３−ＩＬ２ ’Ｉｔ ｊ、／ Ｘ１０７０ＪＡＯ
Ｊ７Ｊ −ＩＬＪ ７２ Ｉｌ、♂Ｘ１０６０．θ！Ａ
ｃ５１０−ＩＬ２ ２’ｌ ／、３ Ｘ１０７０．／３
Ａｃ３１０−ＩＬ２ ＩＩＩ ／、３ Ｘ１０７０．／
１ａ Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎ１ｖｅ’ｒａｌ’
ｔｙで製造ｂ Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｒ
ａａｅａｒａｈ Ｃｅｎｔｅｒで製造 例Ｍ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＣＡＴの製造Ｓ、
フルギベルダ細胞をＡｃ３ざ０−ＩＦＮ−βについて説
明したと同様にしてＡａＪ７３−ＣＡＴ でＬａ染させ
、感染後２’１時間目にＣＡＴ酵素活性を上記Ｍａｃｋ
ｅｔｔ等に記載された方法で＃Ａ胞及び増地中において
測定した。未感染細胞或いはＡｃＭＮＰＶで感染された
細胞には検出可能なＣＡＴ酵素活性は仔在しなかったが
、しかし、Ａｃｊ７Ｊ−ＣＡＴ によっては細胞及び培
地の両者に高レベルの活性が産生された。 Ａｃ３７３−ＣＡＴ感染細胞において付成された蛋白質
の分析を行りた。この発現ベクターによシＡｃＭＮＰＶ
感染、！８胞においては作られなかったＪ７にダルトン
の新しい蛋白質が産生された。ＣＡＴの大きさはＤＮＡ
配列から約２７にであると予測された。多電の２７に蛋
白質が感染細胞及び培地の両者に存在した。ポリアクリ
ルアミドゲル上にｍＷされた蛋白質の電からＡｃ ３７
３− ＣＡＴ感染細胞のｌ当シ約句ツのＣＡＴ酵素が製
造されるものと推定される。 本発明及びそれによって提供される利点及び便宜は本発
明の幾つかの好筐しい実施態様を説明するにすぎない上
記記載より認められるであろう。 本発明の範囲及び精神から離れることブエく、或すはそ
の利点の如何なるものも害することなく物質・方法及び
物質の使用鎚において多ぐの変化をなし得ることが明ら
かである。更に、上記発明が、木兄１ｆｆＨ’バキュロ
ウィルスゲノムの幾つかの位置の任意の位置に２いて、
任意の速ばれた遺伝子を挿入するために利用することが
できるという事実を第１１用することに基づ（用途を有
することが認められるであろう。 例えば、ポリヘトリン遺伝子の全て或いは一部が欠失さ
れていな層組換えＡｃＭＮＰＶウィルスの単ｔ’ｆｌｎ
に操作が第１１用可能であると（ハう槌実は、本発明を
多くの方法において利用することを可能にするものであ
る。これらの用途はＡｃＭＮＰＶウィルスの封入形愈の
ポリヘトリン被覆が外ｌ（ｔ！ 影響に対して極めて耐
性であると” ５ ’Ｊ ’ＪＬを利用するものである
。例えば、例■１で述べた如く、選ばれた遺伝子をウィ
ルスゲノム中にポリヘトリン遺伝子内以外の場所に、特
に、選ばれた遺伝子が高いレベルで発現されるように１
０Ｋプロモーターによ多制御されるような場所に、クロ
ーン化することが出来る。 このＡｃＭＮＰＶウィルスは次いで単層され、安尾な発
現ベクタ・−として利用することができる。 その様な安短な発現ベクターは、将来ある指定された時
に、目的蛋白質の製造に使用する為に、組換えＡａ Ｍ
Ｎ Ｐ Ｖウィルスを進当な宿主細胞及び十分な培地の
培養液と共に７つの実験菫から別の実験室に移すことの
できる安矩な形層で利用できる。 この発現ベクターは又、特定の宿主昆虫種、或いは広範
囲の感染しやす（へ宿主昆虫種に拵性をイイする蛋白質
を産生ずる遺伝子を選択し、その遺伝子をＡｃＭＮＰ
Ｖ 発現ベクター中にクローニングすることによシ害虫
集団を抑制するための系にも使用することが可能である
（これらの可能性はり、 Ｋ。 Ｍｉｌｌｅｒ等、２／り５ｃｉｅｎｃｅ ７／ｊ−７Ｊ
／ （／り♂３）に論じられている）。組換え発現ベク
ターは、昆虫が害虫である植物或いは動物に適用するこ
とが出来、それが害虫により上記の如く摂取された場合
には封入体は腸の内腔にお（八で解離し、組換えウィル
スは腸壁のＭ施を侵し、金製を開始する。 哉製の際に、害虫に毒性を有する蛋白質の遺伝子が発現
され、昆虫の不能化或いは死がもたらされる。その時１
ＩＩＩ ＩｒＪ：、昆虫が野性タイプのＡａＭＮＰＶウ
ィルスを摂取した場合より逼かに短く、この場合、昆虫
はウィルス感染の程度に応じて異る時ｍＪ後に溶解され
る。これ及びその他の実験室における実験の示すところ
によれば、１０Ｋ蛋白質の発現は感染後２を時間程度の
早期に起こり、約弘ざ時間目に高レベルで起こることが
判明している。その結果、１０Ｋプロモーターの制御下
にＡａＭＮＰＶゲノム中にクローン化される目的昆虫毒
素をコードする遺伝子は父、そのタイムスケジュールに
従って発現されることが予想される。昆虫の死或いは不
能化はその選ばれた遺伝子の発現の開始後間もな（起こ
ることが予想され、その結果、昆虫の野性タイプバキュ
ロウィルスによるｔａｌｋに対比して、その害虫の寄生
する植物或いは動物に対する損傷が同時に減少する。 遺伝子は又、バキュロウィルスゲノム中にポリヘトリン
被覆が昆虫の腸のアルカリ性条件によシ解離された場合
に、毒性遺伝子生成物が放出されるようにポリヘトリン
構造配列に融合されるように挿入することができた。本
発明のその様な用途は、昆虫脳細胞における組換え遺伝
子の発現を行うことなく昆虫の破毒を生ずるものと思わ
れる。 更に、上記共体例で測足されたよりも高いレベルの遺伝
子発現が本発明を用いて可能であることが認められるで
あろう。例えば、ＩＦＮ−β遺伝子（或いはその他の任
意の遺伝子）はバキュロウィルスゲノム中に７回以上ク
ローン化することが可能である。特に、発現がポリへド
リンプロモーターの制御下におかれるようにコピーを挿
入することが出来、その他のコピーを発現が１０Ｋプロ
モーターの制御下にあるように挿入することが可能であ
シ、従って、他の幾つかのコピーをイｔ々のその他の制
限部位に挿入することか出来、各コピーは自らのプロモ
ーター或（八はバキュロウィルスによりプロモーターと
してｔｇ Ｒされる幾つかのその他のＤＮＡ配列を含有
する。感染しやすｂ昆虫細胞中に感染時に産生されるイ
ンターフェロン（或（八けその池のポリペプチド）の量
は上記泗ｊ定レベルをはるかに越える量となシ得る。 ここに開示されている本発明の一層の修正は、当業者に
可能であり、全てのその様な饅正は特許請求の範囲に規
定される本％明の硝神及び範囲内にあるものと看做され
る。
びポリヘトリン蛋白質或（八はその一部をコードする少
な（とも７つのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片を生
成する。その様な７つのＤＮＡ断片は、ポリヘトリンプ
ロモーターとポリヘトリン蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を含んでなるＥｃｏＲＩ−Ｉ断片である。 次に、上り己ＤＮＡ断片を適当なりローニンググイーク
ル、■えは、プラスミドｐＵＣｇ中に挿入することによ
り転移ベクターを調製する。従って、ポリヘトリン転移
ベクターと称される好複しい転移ベクターは、ポリヘト
リンプロモーターと、ある選ばれた遺伝子或（ハはその
一部なりローニングするために利用回目はな部位とを、
その選ばれた遺伝子がポリヘトリンプロモーターの転写
制御下にあるようＶＣヨ有する適当なりローニンググイ
ークルよりなるものである。好贅しい転移ベクターは、
ホリドリン蛋白質或いはその一部をコードするＤＮＡ配
列を含んでも又′８−１な（てもよいものである。 組換え転移ベクターは、その鏝上記転移ベクターの利用
可能／Ａクローニング部位中に選ばれたＪＬ伝子或いは
その部分を挿入することにより調製される。潜在的には
、本発明の転移ベクターには任意の遺伝子或いは複数の
遺伝子をクローン化させ、バキーロウィルスプロモータ
ー配列とカップｌ）ングさせることが出来る。更に、適
当な組換えＤＮＡ手法により、上記の好ましい転移ベク
ターから、ポリヘトリン蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を、得られたりａ−ン化遺伝子生成物が選ばれた蛋白質
それ自体となるように欠失することができる。 或いは又、ポリヘトリン蛋白質をコードする配列が欠失
されない場合、或いはポリヘトリン蛋白質をコードする
少なくとも１つの配列が好ましい転移ベクターから欠失
されない場合には、得られたクローン化された遺伝子生
成物は、選ばれた蛋白質及びポリヘトリン蛋白質或いは
その一部よりなるハイブリッド、即ち融合蛋白質である
であろう。 組換え発現ベクターを製造するためには、組換え転移ベ
クターを適当なバキュロウィルスＤＮＡと組換えを行う
ように接触させることにより所望の遺伝子物質をバキー
ロウィルスゲノム中に組入れる。組換えを達成する好ま
しい手段は、公知のトランスフエフシロンの方法でアル
。トランスフエフシロンの方法は、ｌＯＯチのウィルス
中においては起こらないので得られる結果は弁組換え体
及び組換え体の混合物である。 宿主昆虫細胞内で選ばれた遺伝子を発現する能力を有す
る組換えバキュロウィルス発現ベクターは、その後、こ
の組換え及び弁組換えパキーロウィルスの混合物から適
当なスクリーニング或いは遺伝子選択技術により選択さ
れる。発現ベクターを選択する１つの手段は、ポリヘト
リン遺伝子の挿入不活化により感染細胞の核内にウィル
スの封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ） を欠くウィルス
を同定及び単離することにより行われる。 本発明は又上記方法によシ製造された組換えバキーロウ
づルス発現ベクターに向けられたものである。その様な
発現ベクターは、ウィルスゲノムに連結され、その中で
安定である少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはその
部分を含有する感染性ハキーロウィルスを含んでなるも
のである。昆虫細胞或いは昆虫内における発現ベクター
の複製に際して、選ばれた遺伝子はバキーロウィルスの
転写信号の制御下、或いはそれ自身のプロモーターのｉ
ｉｉ制御下制御子れかにおいて発現され得る。バキーロ
ウィルス発現ベクターの１例として、β−インターフェ
ロンに対する遺伝子をポリへドリンプロモーターの転写
制御下にあるような位置にＡｃＭＮＰＶ ゲノム中に挿
入して含有する組換えＡｃＭＮＰＶ ウィルスがある。 潜在的には、任意のバキュロウィルスプロモーター及び
ｉ 虫ａａ 系統を使用することができる。 本発明は更に上記方法により生成された転移ベクターに
向けられたものである。少なくともポリへドリンプロモ
ーター配列と、選ばれた遺伝子或いはその一部の挿入の
ために利用可能なりローニング部位とを、選ばれた遺伝
子がポリへドリンプロモーターの転写制御下にあるよう
に含んでなる好ましいポリヘトリン転移ベクターなバキ
ュロウィルスの遺伝子操作のだめの中間ヴイークルとし
て使用する。このポリヘトリン転移ベクターはポリヘト
リン蛋白質をコードするＤＮＡの配列を全く含まなくて
も或いはその全て或いは一部を含んでもよい。 本発明は更に上記方法で製造された組換え転移ベクター
に向けられるものである。ポリへドリンプロモーターと
カップリングされた選ばれた遺伝子或いはその一部を含
んでなる本発明の好ましい転移ベクターは、所望の遺伝
情報をパキーロウィルスゲノム中に組込むためのヴイー
クルとして使用される。 本発明は、選ばれた遺伝子の真核生物宿主昆虫細胞内に
おける発現を促進するために宿主−ベクター系において
バキュロウィルスプロモーターを使用することに基づい
ている。特に、ポリヘトリン蛋白質は、ウィルス感染真
核生物宿主細胞内において最も豊富に合成される蛋白質
の１つであるので、好ましい方法は選ばれた遺伝子がポ
リへドリンプロモーターとカンプリングされるようにこ
の選ばれた遺伝子の適当なバキーロウイルスゲノム中へ
の組込みを含むものである。その様な組換えバキーロウ
ィルスは、選ばれた遺伝子生成物の合成のだめの有効な
機構を提供するものである。 従って、本発明は、宿主昆虫細胞から合成され且つ効率
的に分泌される極めて高いレベルの目的遺伝子生成物、
例えばβ−インターフェロン、として有意義な有用性を
有するものである。 本発明の実施に際して使用されるバキーロウィｋｙ、
はオー）！ラファーカリフォルニカ（ＡｃＭＮＰｖ）で
ある。このバキーロウィルスは下記の如く特徴付けられ
る。 その自然の感染性形態において、ＡｃＭＮＰＶは通常ウ
ィルス封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ）中に見出される
。 これらのウィルス封入体は、通常、ポリヘトリン蛋白質
ザブユニットの構造配列を含む−シラ結晶蛋白質マトリ
ックス内に包埋された数個のウィルス粒子を含有する。 封入体は適当な宿主昆虫により摂取され、それが腸の内
腔に到達するとアルカリ性状態が封入体の解離を引起こ
し、ウィルスを放出する。 ウィルスは腸壁の細胞を侵し、それらの＃Ｉ胞の核に移
動し、複製を行う。これらの細胞内において２つの感染
形態、即ち細胞外すなわち非封入ウィルス形態、及び封
入ウィルスがこれらの細胞において生成される。細胞外
ウィルスは細胞の表面から芽を出し、その他の細胞を感
染する。感染後約１２時間後に細胞外ウィルス発芽にお
ける減少、ポリヘトリン合成の開始及び封入ウィルス粒
子の増大した産生が生ずる。極めて多量の封入体が感染
細胞及び組織中に産生され、最終的に昆虫を溶解する。 このウィルスの封入形態はその他の昆虫への感染の広が
りの原因となるものである。 細胞培養培地内において容易に培養することのできるＭ
Ｊ］１ｆｆｉ外ウィルスが本発明の例示方法において使
用される。細胞外ウィルス及び封入ウィルスは同一のゲ
ノムを有するが異った表現型特性を示す。 これらの封入体の主たる構造成分であるポリヘトリンは
ほぼλり、０００ の分子量の蛋白質である。 ＡｃＭＮＰＶ ゲノムの特性付けは、ＡｃＭＮＰＶ ポ
リヘトリンの遺伝子は、ＤＮＡ制限地図のＯポイントか
ら約ｕｏｏｏ塩基対下流のＥｃｏＲＩ’ｌ断片における
約ｌコ００の塩基対の隣接ＤＮＡ配列まで認められるこ
とを示している（ Ｇ、 Ｅ、 ＳｍＨｈ 、 Ｊ、
Ｍ。 Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 ４’ｊ
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ２ｔｊ−２２！ （／’７１３
）参照）。全ＡｃＭＮＰＶ ゲノムの地図（遺伝子地
図）はＪ、 Ｍ、 Ｖｌｉｋ及びＧ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔ
ｈ、ｕ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、／／／Ｊ’−／／、２／
（１５’ｌｌ’Ｊ ） に示されておシ、ポリヘトリン
遺伝子のＤＮＡ配列はＨｏｏｆｔｖａｎ Ｉｄｄｅｋｉ
ｎｇｅ 、 Ｇ、 Ｂ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、
Ｓｕｍｍｅｒｓ、１３ノ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ’Ａ／
−！Ａ！ （／りｆｆＪ）に示されている。 ポリヘトリン蛋白質の構造及び機能はそれが公知の最も
高度に発現された真核生物遺伝子の１つであるので、相
当に興味深いものである。ＡｃＭＮＰＶで感染されたス
ボドブテラ・フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）細胞において、ポリヘトリンは
それが感染細胞中の全蛋白質の５ｏ４以上を形成し、感
染細胞ｌ当９ｏ０．２．１９を越えるポリヘトリン蛋白
質が生成されるような高割合に蓄積される。この遺伝子
は次の理由によシ又興味深いものである：（１１ＡｃＭ
ＮＰＶのポリヘトリン遺伝子はバキーロウィルス中に高
度に保存されているＤＮＡ配列を含有すること、（２）
ゲノムのこの領域において密接に関連した株間の組換え
が高い頻度で起こシ、組換え子孫におけるポリヘトリン
遺伝子の分離及び発現を可能にする、及び（３）遺伝子
の発現が宿主、組織、及び細胞系統依存性であること、
である。 遺伝子工学者の観点からは、ポリヘトリン遺伝子はウィ
ルスがそれなしでも細胞培養液中で複製が可能なので不
必要である。仁の遺伝子の発現の高い割合及びそれがウ
ィルス複製に必須ではないという事実のために、ポリへ
ドリンプロモーター及びＡｃＭＮＰＶの遺伝子を組換え
遺伝子の発現のための系の一部として使用することの可
能性が相当な考察の源泉となっていた（ Ｅ、Ｂ、 Ｃ
ａｒａｔａｎｇ 。 Ｓ、Ｔ、Ｔｊｉａ 及びＷ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ 、ツタ
Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ３ざ６−３り♂ （ｌり７タ ）
； Ｐ、Ｄｏｂｏｓ 及びＭ、Ａ、Ｃｏｃｈｒａｎ
。 ノ０３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｕ４’／； −弘６μ （
ツタざ０）；Ｈ，Ａ。 Ｗｏｏｄ 、１０．２ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、２／ −
，２７（／９Ｊ’θ）；Ｊ、Ｅ。 Ｍａｒｕｎｉａｋ及びＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 １
０９ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ２６−３０−（ｌり♂／ ）
； Ｌ、に、Ｍｉｌｌｅｒ 、” Ａ ＶｉｒｕｓＶｅ
ｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ ｉｎ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｇ”［Ｎ、Ｊ
、Ｐａｎｏｐｏｕｌｏａ ＠ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｔｈ＠Ｐｌａｎｔ ５ｃｉｅｎ
ｃｅ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 、 ＰｒａｅｇｅｒＰｕｂ
ｌｌｓｈｅｒｓ 、 １９１／ ｐｐ、 、２θ３〜ｘ
、ｌ）中に掲載〕、及びり、 Ｋ、 Ｍｉｌｌｅｒ等λ
ｌ？５ｃｉｅｎｃｅ ７／ｊ −７２１（ｌりＪ’Ｊ
） ； Ｇ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ 、 Ｍ、 Ｊ、 Ｆ
ｒａｓｅｒ及びＭ、Ｄ。 Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｊ、Ｖｌｒｏｌ 、！１ｒ４Ａ−ｊり
Ｊ（／りｆＪ）参照）。 しかしながら、本発明の前にはだれもその様な系を開発
することができなか−た。 本出願人等による実験は、もうｌっの遺伝子生成物、Ｉ
ＯＫも又ポリヘトリンに匹敵する高レベルで発現される
ことを示している（ Ｇ、 Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ 。 Ｊ８Ｍ、 Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ
、 ｕｊ Ｊ、 Ｖｌｒｏ１２１１−．２λｊ （１？
Ｉ３ ）参照〕。この生成される１０Ｋ蛋白質は非構造
的のようであり、感染の後期において多量に産生される
。１０Ｋ ＡｅＭＮＰＶ蛋白質遺伝子の位置はＨｉｎｄ
ｍ断片Ｐ及びＱＫ認められている。ポリへドリンプロ
モーター及び構造遺伝子と同様にこのプロモーターは、
組換え遺伝子の発現のためのＡｃＭＮＰＶを使用する系
の一部としてのその有利な用途としての考察の対象であ
った。 しかしながら、本発明までにこのプロモーターのその様
な有利な用途なｏＪ能にするような系は開発されていな
かった。 本発明の例示方法に従えば、ＡｃＭＮＰＶの特別の株、
Ｍ３或いはＥ、２が利用される。しかし１よから、当業
者には、その他のバキーロウィルス及ヒソノ他のバキュ
ロウィルス株が組換えバキュロウィルス転移及び発現ベ
クターの製造に適当であることが明らかであろう。特に
、密接に関連し、天然に存在するバキーロウィルス株ト
リコブルシア・二（Ｔｒｉｃｂｏ −ｐｌｕｇｉａ ｎ
ｉ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ、ラキブルシア拳オウ（Ｒａｃ
ｈｉｐｌｕ８ｉａ ｏｕ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ 、ガ１
／リア・メロネラ（Ｇａ１ｌｅｒｔａ ｍｅｌｌｏｎｅ
ｌｌａ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ及び任意のプラーク精製法
、例えば本実験室において特性付けられ、Ｇ、 Ｅ、Ｓ
ｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ。 ３０ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、？、２Ｊ’−ｇ３１ （／り７
り）及び Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、、 Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ 、 ３３ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、Ｊ／／−Ｊ
／Ｐ （ｌ？ＩＯ） Ｋよシ説明されているＡｃＭＮＰ
ＶのＥＪ、Ｒり、Ｓ／及びＳ３株などを有利に使用する
ことができる。これら及びその他の株についての説明は
、更にＧ、Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、Ｄ。 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、ｒタ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ３１７−
！；２７ （ｌり７７） に記載されている。 本発明の方法に従えば、有利に利用されるのはポリヘト
リン構造遺伝子及びプロモーターである。 この遺伝子はＳ／ヌクレアーゼ実験により認められてい
る。ポリへドリンコード領域のｊ′末端のヌクレオチド
配列及び転写開始から、：２００塩基上流が第３図に示
されている。第３図に示された部位は、ポリヘトリンｍ
ＲＮＡに対して最も頻繁に使用される転写開始部位であ
る。 ＡＴＧ翻訳開始信号（Ａ残基割当て位置」−７を有する
）は転写開始部位からほぼ５ｇ塩基目に起こシ、その後
引続き内部オーブン読取りが２３ｋにおける１ｌｎｄ
ｍの部位まで及びこれを含んで行われる。多くの真核生
物構造遺伝子において同様の位置に見られる「ＴＡＴＡ
Ｊ及びｌ”ＣＡＡＴＪボックスはそれぞれ転写開始部位
から上流の５及び３５番目の塩基間及びＡＯ及び７００
番目塩基間の間に位置している。転写開始部位から７５
塩基上流及びりＯ塩基上流の中心には直接繰返し配列［
ＣＡＣＡＡＡＣＴＪがある。更にＡｃＭＮＰＶポリヘト
リン遺伝子は翻訳開始コドンに先立ちｓｇ塩基の非翻訳
リーダー配列を有し、且つＡｃＭＮＰＶポリヘトリンｍ
ＲＮＡについての適当な実験操作により示唆される如く
、何等の介在配列も存在しない。上記Ｓｍ１ｔｈ 、
Ｖｌａｋ及びＳｕｍｍｅｒｓの文献、及びＧ、 Ｆ。 ＲｏｈｒｍＪｌｎ 等、 ／、２／ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６１−６０ （ｔりｒコ）参照。 本発明の実施に当り、ポリヘトリン遺伝子を有するＤＮ
ＡをバキュロウィルスＡｃＭＮＰＶから単離し、精製す
る。当業者には、この遺伝子はポリヘトリン遺伝子を有
する任意のバキュロウィルス、特に上記関連性のある株
から単離され得ることが判るであろう。 所望のＤＮＡを次いで適当な制限操作によりＥｃｏ Ｒ
Ｉ ｆｆｔｌｌ限エンドヌクレアーゼで消化し、ポリヘ
トリン遺伝子を含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ−ｉ断
片或いはその他の適当な断片を生成する。 上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片はその後適当なりローニングヴ
イークルのＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、転移ベクタ
ーを生成する。ＡｃＭＮＰＶゲノムは、選ばれた遺伝子
を効果的に部位−特異的に導入することができる知られ
た独特の制限部位を有していないのでキメラプラスミド
ベクター（転移ベクター）を構成して遺伝子転移のため
の中間ヴイークルとしての役割を果す必要がある。従−
て、選ばれた遺伝子をポリへドリンプロモーター配列に
隣接するウィルスゲノム中に導入するために、ポリヘト
リン遺伝子を含んでなシ、ポリヘトリン転移ベクターと
称される転移ベクターが構成され、クローニング部位は
、その部位に適当に挿入される遺伝子がポリへドリンプ
ロモーターの制御下にあるように配置され、隣接ウィル
スＤＮＡはポリヘトリン遺伝子のいずれかの側に連結さ
れている。 この転移ベクターの構成を第１図及び第一図に概略的に
示す。更に隣接ウィルスＤＮＡの存在が、野性タイプの
バキュロウィルスとの組換えを容易にし、選ばれた遺伝
子の複製ウィルスゲノム中への転移を可能にしているこ
とに注意すべきである。 従って、上記ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片は、それぞれプラスミ
ドｐＢＲ３２６及びｐＵＣｆ中にクローン化及びサブク
ローン化される。ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片中の２つのＢａｍ
ＨＩ制限部位は、その後、ポリヘトリン遺伝子の翻訳開
始部位からほぼココ０塩基のポリへトリ／プロモーター
配列から下流の３′方向に位置する単−ＢｓｍＨ１クロ
ーニング部位を有するＩ）ＡＣ１０１と称されるポリヘ
トリン転移ベクターを産生ずるように除去される（第３
図参照）。プラスミドｐＢＲＪλｊ及びｐｕｃ ｒはポ
リヘトリン転移ベクターの構成に利用されるプラスミド
であるが、ポリヘトリン遺伝子及び隣接ウィルスＤＮＡ
が機能的に導入される限り、その他の適当なりローニン
グヴイークルが利用可能であることは当業者には明らか
であろう。 このポリヘトリン転移ベクターは、その後選ばれた遺伝
子を挿入するために、転写開始部位の近辺、即ちポリヘ
トリン遺伝子の約−５ｇ〜末端までのポリヘトリン合成
をコードする配列の幾つか或いは全てを欠失することに
よシ変成することができる（第３図参照）。ＢａｍＨＩ
制限部位配列を有する天然或いは合成オリゴヌクレオチ
ドを含むＤＮＡリンカ−を次いで欠失部位に挿入し、Ｄ
ＮＡセグメントのカップリングをその制限部位において
行う。転移ベクターの変成は第２図に概略的に示されて
おり、ポリへドリンコード配列を欠失する手段はｉｎ
ｖｉｔｒｏの突然変異誘発によるものである。しかしな
がら、当業者にはポリへドリンコード配列の一部或いは
全部を欠失するために代替的な操作方法が利用可能であ
り、欠失部位に代替的合成又は天然のオリゴヌクレオチ
ドリンカー配列を挿入することが可能であシ、及び選ば
れた遺伝子及びその一部が組込まれる代替的変成ポリヘ
トリン転移ベクターを本発明において適当に利用できる
ことが明らかであろう。 本発明の標準的クローニング技術に従えば、選ばれた遺
伝子、例えばヒトβ−インターフェロン合成をコードす
るＩＦＮ−β遺伝子、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーセ合成ヲコートスるＣＡＴ遺伝子、及び
ヒトインターロイキン−２合成をコードするＩＬλ遺伝
子をその後ポリヘトリン転移ベクターの利用可能な制限
部位に挿入し、組換え転移ベクターを生成する。β−イ
ンターフェロン遺伝子の転移ベクターｐＡｃ ３１０中
への挿入は第μ図に概略的に示されて℃゛る。 更に、ＩＦＮ−β、ＣＡＴ及びインターロイキン−コバ
ポリヘトリン転移ベクターにクローニングし、ポリへト
リ／プロモーター配列とカップリングさせるための遺伝
子の具体例であるが、本発明或いはその上記代替的形態
においては、潜在的に任意の選ばれた遺伝子が利用可能
であることが認識されるであろう。 組換え転移ベクターの遺伝子であるポリへドリンー選択
遺伝子ハイブリッドはその後適当なバキュロウィルス、
例エハハキーロウィルスＡａＭＮＰＶ、のゲノム中に転
移され、宿主昆虫細胞内においてβ−インターフェロン
をコードする遺伝子を発現する能力を有する組換えウィ
ルス発現ベクターを生成する。ハイブリッド遺伝子の転
移は例えばスボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などの宿主昆虫細胞
内のトランスフェクシ舊ンの方法によシ達成される（Ｊ
、Ｐ。 Ｂｕｒｉｎｄ 等、 １０／ Ｖｌｒｏｌｏｇｙ ２１
ｒ６−２りθ （１ｙｒｏ ）参照）。組換え転移ベク
ターｐｋｃ３ＩＯ−Ｉ Ｆ！Ｎ −βを利用するこの方
法は第５図に概略的に図示されている。トランスフエフ
シロン後のＡｃＭＮＰＶＤＮＡの複製の際に、ハイブリ
ッド遺伝子は組換え転移ベクターとＡｃＭＮＰＶ ＤＮ
Ａ間の組換えにＪ：、！ｌ）ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡに転
移される。従って弁組換え及び組換えバキュロウィルス
を含んだ混合物が生成され、その内後者がＩＦＮ−β遺
伝子を発現する能力を有するものである。トランスフェ
クシヨンがハイブリッド遺伝子をバキーロウィルスゲノ
ム中に転移するための好ましい方法であるが、当業者に
はその他の方法もハイプリント遺伝子をバキーロウィル
スゲノム中に挿入するために適当であることが理解され
るであろう。更に、ノルイブリッド遺伝子の配列と他の
株の対応する配列間に組換えを行わせるに十分な相同性
が存在する限シにおいて、組換えは切換え転移ベクター
とその他のバキーロウィルス株との間に達成することも
できる。例えば、その様な組換えは上記株、トリコブル
シア・二（Ｔｒｉｅｈｏｐｌｕｇｌａ ｎｌ ） ＭＮ
Ｐ’Ｖ、ラキプルシアΦオウ（Ｒａｃｂｔｐｌｕｓｉａ
ｏｕ ） Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ、及びガレリア会メロネラ
（Ｇａ１ｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ）Ｍ Ｎ
Ｐ Ｖ並びＫＡｃＭＮＰＶ株ＥＪ、ＲＰ、Ｓｌ及びＳ
３のいずれから単離された遺伝子との間に生じ得る。又
、組換えは相同的配列を含有しないと思われるゲノムの
領域においても生じ得ることが可能である。これについ
ての機構は理解されていない。 ＡｃＭＮＰＶゲノム中に導入された遺伝子であるポリへ
ドリンー選ばれた遺伝子ノーイプリ・ノドを含む組換え
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは、その後弁組換え及び組換
えバキュロウィルスの混合物から選択される。選択の１
つの手段は、ウィルス封入体を産生しないウィルス（Ｏ
−と称される）で感染された宿主昆虫細胞によシ形成さ
れたプラークについてスクリーニングを行うことである
。組換えウィルスはポリ−・トリ／遺伝子の挿入不活性
化によシウィルス封入体の産生について欠陥を有してい
るために、この様にして選択が容易に行われる。 トランスフエフシロンを行わされた細胞からの子孫ウィ
ルスから産生されたウィルスプラークのうち平均０．１
％が仮想的な組換え０−ウィルスからのものであろう。 従りて、Ｏ−プラーク−形成組換えウィルスからのＤＮ
Ａをその後ｆ＊製し、及び適当な制限酵素で分析して組
換えＡｃＭＮＰＶベクターが選ばれた遺伝子を適当なＥ
ａｏＲＩ−Ｉ位置に挿入していることを確認する。 上記選択方法は、組換えバキーロウィルスー選ばれた遺
伝子発現ベクターの選択のだめの有効且つ便利な手段を
提供するが、しかし、本発明に従えば、その他の選択操
作も又利用可能であることが当業者には明らかであろう
。真核生物細胞内の外来ＤＮＡのｌｎ ５Ｉｔｕ検出の
だめの比較的便利な方法（即ち、標識化ＤＮＡプローブ
を感染された動物細胞内に産生されたプラーク中に存在
するウィルスＤＮＡに）〜イブリッド化する方法）はＶ
ｉｌｌａｒｒｅａｌ及びＢｅｒｇ 、 １９Ａ ５ｃｉ
ｅｎｃｅ １１３−１１Ａ（ツタ７７）、及びＨｉｙｄ
ａｙ等、／ｊ Ｇｏｎｅ ！３−６ｊ（／りｆｚ） に
記載されている〇 選ばれた遺伝子の発現は、感染しやすい宿主昆虫細胞、
例えばスボドプテラ・フラギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ）などを適当な生育培地
中において組換えパキーロウィルスー選ばれた遺伝子発
現ベクターで感染させることによシ達成される。Ａ ｃ
Ｍ Ｎ Ｐ Ｖ発現ベクターは感染性ウィルス粒子の
複製及び組立てによシ昆虫細胞或いは昆虫内において増
殖させる。とれらの感染性ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを
使用して適当な昆虫細胞中に選ばれた遺伝子を生成する
ことが出来、この様にして選ばれたＤＮＡ配列の感染細
胞内における効率的な発現が容易に行われる。 感染時に、選ばれた遺伝子のＤＮＡ配列に相補的である
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクター−特異性ｍＲＮＡが生成され
る。このベクター−特異性ｍＲＮＡは通常感染細胞内で
翻訳されて選ばれた遺伝子によυ完全に或いは部分的に
コードされる蛋白質を生成し、及び場合により選ばれた
遺伝子生成物はグリコジル化、分泌、ホスホリル化或い
はその他の後−翻訳変成などの工程に付される。 組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターにより生成された遺伝
子生成物が選ばれた蛋白質のみのアミノ酸配列よりなり
、ＡｃＭＮＰＶポリヘトリンのアミン末端から得られた
１個以上の追加のアミノ酸残基を含有するノ〜イプリ・
ノド蛋白質であるかどう力・、或いは選ばれた蛋白質及
び−イブリ・ノド蛋白質の両生酸物が生成されるか否か
は、ポリヘトリン転移ベクターが変成される方法に応じ
て異る。選＋ｆ。 れた遺伝子に由来する単一の翻訳開始信号（ＡＴＧ）の
みがノルイブリッド遺伝子配列中に存在し、且つ選ばれ
た遺伝子が約−７Ｓ〜＋１位間のノーイフ。 リッド遺伝子配列内に存在するならば、選ばれた蛋白質
のみ、例えばβ−インターフェロン、が生成される（第
３図参照）。これに対して、選ばれた遺伝子が、ポリへ
ドリンプロモーターに２つの翻訳開始部位即ち＋１位に
おけるポリヘトリンＡＴＧ信号及び＋３とポリへドリン
コード配列の末端の間の選ばれた遺伝子ＡＴＧ信号があ
るようにポリへドリンプロモーターに融合される場合に
は、ハイブリッド蛋白質及び選ばれた蛋白質の両者が生
成される可能性がある。しかしながら、生成される各蛋
白質の割合は第コのＡＴＧ信号の位置及び選ばれた遺伝
子の配列の性質に応じて異る。或いは又、遺伝子がそれ
自身のＡＴＧ開始信号なしにポリへドリンプロモーター
に融合される場合には、合成ＡＴＧ或いはポリヘトリン
ＡＴＧ翻訳開始信号が蛋白質コード配列に選ばれた遺伝
子に対する正しい翻訳読み取り枠を維持するように融合
されることが要求される。生成される蛋白質生成物は、
ここでも又上記要因に依存する。 転移ベクター及び組換え発現ベクターの寄託組換えバキ
ーロウィルス発現ベクターＡｅＪざＱ−ＩＦＮ−βはＡ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒ％ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 Ｍａｒｙｌａｎｄ州、 Ｒ
ｏｃｋｖｔｌｌｅ ）にｌりｒ３年５月１３日に寄託し
、寄託番号ＡＴＣＣ≠００７ｔを与えられた。Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ Ｋ−７２中の変成ポリヘトリン転移ベクターｙ
ｈｃ３ｒｏプラスミド及びＥ、 ｃｏｌｔＫ−／ｊ中の
組換え転移ベクＩＸ−ｐＡｃ３１０− Ｉ ＦＮ−βは
Ａ ＲＣＣ（Ａｇｒｉｃｕｔｕｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 、 ｌ１ｌ
ｉｎｏｉｓ州Ｐｅｏｒ＋ａ ）に／りｔ３年５月１３日
に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ −／＃２１及びＮＲ
ＲＬ Ｂ−ｉｊ≠、２７をそれぞれ与えられた。変成ポ
リヘトリン転移ベクターｐＡｃＪ７ＪはＡＲＣＣにｌり
ｒａ年ｊ月７日に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−／１
７７１を与えられた。 以下の具体例で使用されたプラスミドはＥ。 ｃｏａｌ中のＰＢＲ３２！及びｐＵｃＩであＦ） 、
Ｍｓｒｙ１ｓｎｄ州Ｇａｔｔｈｅｒｓｂｕｒｇ（７）Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅａｅａｒｃｂ Ｌａｂｉ、から得
られたものであった。 ウィルスＤＮＡ 具体例において、ウィルスＤＮＡの出発源として使用さ
れたＡｏＭＮＰＶ、Ｍ３株、並びにＡｃＭＮＰＶ、Ｅ、
２株及び野性タイプ、は本実験室においてＧ、 Ｅ、
Ｓｍ１ｔｈ 、及びＭ、 Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ 、ざり
Ｖｉｒｏｌｏｇｙｊ１７−３．１０ （／り７♂）及び
Ｇ、 Ｅ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ。 ８ｕｒｎｍｓｒｓ、 ３タ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ １２ｊ
−／３７ （／９１／ ）に記載される手法に従って、
単離されたものであうた。 ＩＦＮ−β ＤＮＡ 具体例において使用されたＩＦＮ−β遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は西ドイツ、ＢｒａｕｎｓｅｈｗｅｉｇＳｔｏｃ
ｋｈｅｉｎ 、 Ｇｅｇｅｌｌｇｃｈａｆｔ ｆｉｒ
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅＦｏｒｓｃｈｕｎ
ｇ （Ｇ Ｂ Ｆ ）のＪｏｈｎ Ｃａ１ｌｌｎｓ 博
士から得られたプラスミドｐＢＲ／Ｊより単離されたも
のであった。 ＣＡＴ ＤＮＡ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ州、Ｂｅｔｈｅｓｄｅ国立癌研究所のＢｅｒｎａｒｄ
Ｍｏｓｓ及びＭｓｒｋ Ｃｏｃｂｒｈｎ両博士より得ら
れたプラスミドｐＢＲＪ、２♂よシ単離されたものであ
りた。 ＩＬコ ＤＮＡ する遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Ｎｅｖｒ Ｊｅｒ
ｓｅｙ州、 Ｎｕｔｌｅｙ 、 Ｈｏｆｆｍａｎ Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＣｅｎｔｅｒのＧｒａ
ｃｅ Ｊｕ及びＰｅｔｅｒ Ｌｏｍｅｄｉｃｏ両博士よ
シ得られたプラスミドｐｌＬ２−２Ｂから単離されたも
のであった。 細菌細胞 ＰＵＣｒプラスミドのクローニングのために具体例によ
シ使用されたＥ、 ｃｏａｌ ＪＭｒ３はＭａｒｙｌａ
ｎｄ州、Ｇｉｌｔｈｅｒｓｂｕｒｇ 、のＢｅｔｂｅｇ
ｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂａ、から得られたもの
であった。 ｐＢＲＪλｊプラスミドのクローニングのために具体例
で使用されたＥ、 ｃｏｌｔ ＲＲノはＴ＠ＸＪＩＩＩ
州、Ｈｏｕｓｔｏｎ 、 Ｂａｙｌｏｒ ＣｏＣｏ１１
ｅ ｏｆ Ｍｅｄｉａｉｎｓ 、の５ａｖｉ。 Ｗｏｏ博士から得られたものであった。 酵素 以下の制限エンドヌクレアーゼはＭａｒｙｌａｎｄ州、
Ｇａ１ｔｈｓｒ＋ｓｂｕｒｇ 、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得ら
れ、供給者の推薦事項に従−て使用された：ＥａｏＲＩ
、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨｌ、、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ。 ＲａｔＷＩＴＶ−−ＤＶ’Ｖ−−丁Ｕｙｙ（ｕ＋、、＋
ｍｌ！１１ｔｒ）酵素も又Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｇ から得られたも
のであった：仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ Ｌ ＤＮＡリガーゼ、Ｂ轟１３／エキソヌクレアー
ゼ、Ｓ／ヌクレアーゼ及ヒＴ４Ｌポリヌクレオチドキナ
ーゼ。 方法 具体例において示されたクローニング操作に従って用い
られた標準的方法は、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ 、Ｅ。 Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ４
ｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、 １
９ｒ２年に記載されテイル。（Ｊ’）参考文献は次の標
準的方法の操作を含むものである： Ｅ、ｃｏｌｔ プ
ラスミドを用いるクローニング操作、Ｅ、ｃｏｌ＋細胞
の形質転換、プラスミドＤＮＡ精製、ＤＮＡのフェノー
ル抽出、ＤＮＡのエタノール沈澱、アガロースゲル電気
泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の留製、及び制
限エンドヌクレアーゼ及びその他のＤＮＡ−変成酵素反
応。全ての場合において、ＤＮＡはフェノール抽出の後
エタノール沈澱を行って精製された。 具体例において使用されたウィルススト／りは、ＴＮＭ
−ＦＨ培地（Ｗ、 Ｆ、 Ｈｉｎｋ −２２６Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ ） ’ＡＡｌｒ −μ４７ （／
り７０）参照）十／（：１％ウシ胎児血清を用いてスボ
ドプテラ フルギベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｓｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ ） 細刀包 （ＩＰＬＢ −ｓｆ
２／ −ＡＥ）中において調製され、滴定した。ウィル
ス及び細胞の培養方法はり、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍｉｎ及
びＭ、 Ｄ。 ８ ｕｍｍｅｒｓ ツタ Ｊ、Ｖｌｒｏｌ 、００−１
３．２（／り７ｊ年）、及びり、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍａ
ｎ 、 Ｍ、 Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＣ，Ｈ。 Ｉ（＋ｉｅｈ ／９ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 １２０−１
３２ （ツタ７６年）に説明されている。ウィルス生長
速度論はＳ、フルギベルダ及び／、、！ｔ％アガロース
重層を用いて上記Ｖｌｌｌｋｍｍｌ等の方法により決定
した。 例■ ポリヘトリン転移ベクターの構成 本発明によるポリヘトリン転移ベクターを構成するため
に、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖボリヘドリ／遺伝子を含む
ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ，！’のＥＧＯＩｌ（部
位中にクローン化した。これは、Ｍ３ （Ｇ、 Ｅ、
Ｓｍ１ｔｈ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、 Ｉり
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ！／７− ！２７（ｔ９７１ ））
と称されるＡｃＭＮＰＶのブラークー精製法をウィルス
ＤＮＡ源として使用することにより達成された。ＡｃＭ
ＮＰ Ｖ Ｄ Ｎ Ａは上記参考文献においてスミス（
Ｓｍ１ｔｈ ）及びサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒ＋＋ ）に
より説明されているように、ウィルスから抽出し、塩化
セシウム密度勾配における平衡遠心分離によυ精製した
。ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡはＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレ
アーゼにより完全に消化した。（皓られたＡｃＭＮＰＶ
Ｅｃｏ ＲＩ −Ｉ断片を先ずｐＢＲＪｕｔ中にクロ
ーン化してｐＩ １０を形成し、次いで標準的クローニ
ング操作法を用いてｐＵＣｒ中にサブクローン化してｐ
ｔ ｆを形成した（第１図参照）。 この組換えプラスミドｐＩ♂は３個のＢａｍＨＩ認識部
位を有する（第２図参照）＝１つは位置４ｔ、２ＩＯに
おけるポリヘトリン遺伝子中に、１つは７３００におけ
るｐＵＣｆにおいて、及びノつは位置６１６０における
ＥｃｏＲＩ−Ｉ断片におけるものである。４１６０及び
７３００における部位は、所望の遺伝子、例えばＣＡＴ
、ＩＬ、！或いはＩＦＮ＝β遺伝子、がポリへドリンプ
ロモーターに隣接した所望の位置（位置４ＡＪ、ＩＯ）
におけるｐｌＪ’中に便利にクローン化されるようにｐ
ＩＪ’から除去される。 ポリヘトリン遺伝子中に位置していない約７．３００に
おけるｐＩｆ中のｐＵＣＩ Ｂａｍ ＨＩ制限部位は次
のようにして除去された：ｌＯμｇのｐ［をＰＩＩｔ工
及びＳｍａ Ｉで消化し、このＤ Ｎ Ａを精製し、Ｓ
ｌヌクレアーゼ緩衝液（０，０３Ｍ酢酸ナトリウム、Ｐ
Ｈ４１−、ｊＡ 、 ０．２３ Ｍ ＮａＣ１及びｏ、
ｏｏｐｓ Ｍ Ｚｎｃ１２）プラスＳＯＯ単位の３／
ヌクレアーゼ／ ｍｌ中に再）懸濁させた。この反応混
合物を、１７℃においてｉｓ分間インキａベート後、Ｄ
ＮＡをｏ３噛アガロースゲル中において電気泳動させた
。高分子量線状ＤＮＡをゲルから精製し、Ｅ、 ｃｏｌ
ｔ Ｊ Ｍ １３細胞をアンピシリン耐性（ａｍｒ）、
ガラクトシダーゼ陰性（ｇａｌ−）に形質転換するため
に使用した。ｐｔｒｃにクローニング領域において、Ｐ
ｓｔ Ｉ 、 Ｂ轟ｍＨＩ、Ｓｍｉ Ｉ 、及びＥｃｏ
ＲＩ部位を有しないプラスミドを単離した。このプラス
ミドをｐｉｆｓＰｓとした（第７図参照）。 ＡｃＭＮＰＶ ＥｃｏＲＩ −１（ｐＩｌｒＳＰＳの一
部）中の位置６１６０におけるＢａｍＨＩ （Ｇ、 Ｂ
、 Ｓｍ１ｔｂ 。 ＪｏＭ、Ｖｌａｋ及びＭ、 Ｄ、 Ｓｕｍｍｅｒｓ 、
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ 、 ｌＡｊ ：、２／！−ムＲ）
を次のようにして除去した。即ち、１０１１９のｐＩｆ
ｓＰｓを１０単位のＢａｍＨＩと５０μｌの緩衝液中で
混合し１，７７℃でインキ−ベートした。 ３．４ 、 ／：２．２０及び３０分後に１０μｌずつ
のアリコートを取り、反応は１０ｍＭまでＥＤＴＡを酪
加することにより停止させた。これらのアリコートをプ
ールし、０．７％アガロース中において電気泳動を行−
だ。ゲルから全長の線状ＤＮＡな鵬離し、上記Ｓノヌク
レアーゼで処理し、次いでＴ４’ＤＮＡリガーゼを用い
て環化させた。Ｊ Ｍ Ｉ３細胞はａｍｒ、 ｇｌｌｌ
−に形質転換させ、組換えプラスミドは位置ｔ／１，０
に１３コｍＨＩ制限部位が欠けるものと同定された。こ
のプラスミドはポリヘトリン遺伝子の翻訳開始部位から
＋／７！塩基の位置４ｔ−２ＩＯに単一のＢａｍＨＩク
ローニング部位を有しく第３図参照〕、従って、「親Ｊ
ＡｃＭＮＰＶポリヘト″リン遺伝子転移ベクターである
ｐＡｃ １０／と命名された（第１図参照）。 例■ 転移ベクターの変成 選ばれた遺伝子の挿入のだめのポリヘトリン遺伝子にお
ける適当な位置を決定するためにｐＡｃｌｏｌの他に多
くの転移ベクターを構成した（第２図参照）。これらの
転移ベクターはポリヘトリンのｒ６アミノー末端残基及
びｊ′非−翻訳ポリヘトリンｍＲＮＡ配列をコードする
幾つか或いは全てのＤＮＡ配列を除去し、次いで以下の
方法により削除の部位にＢａｍＨＩ認識部位を有するオ
リゴヌクレオチド合成りＮＡリンカ−を挿入することに
より構成した。 例工と同様にしてｐ ｉ １０からのＥｃｏ ＲＩ 乃
至ＢａｍＨＩ断片（Ｏ−Ｌ２１０）をｐＵｃｆｆ中にサ
ブクローン化し、得られたプラスミ′ドをｐＢ′と命名
した（第２図参照）。この断片は＋１７５までのポリヘ
トリン遺伝子及びポリヘトリン遺伝子に加えて４ｔ、ｏ
ｏθ塩基対のＡｅＭＮＰＶ ＤＮＡ配列を含有する。１
１２１０位におけるＢａｍＨＩ部位の周りの欠失を次の
ようにして ｎ７中に導入した（第２図）ニゲ０μｇの
ｐＢ′を１３コｍＩ（Ｉで消化し、ＤＮＡを精製し、０
．７％アガロースゲル上で電気泳動を行つた。線状ＤＮ
Ａ断片をゲルから抽出し、０．ｌ単位のＢａ１３／エキ
ソヌクレアーゼを有する１００μｌの緩衝液中において
３０℃でグＯ分間インキュベートした。ｌＯμｌずつの
アリコートを１１コ、！、１０．７５％２０゜Ｊｌ、３
０，３３及びグθ分間隔で集め、反応は各アリコートに
１０μｌの０．２ｔＭ ＥＤＴＡを添加するととにより
停止させた。これらの了りコートを集め、ＤＮＡを精製
した。ＤＮＡの末端はμ単位のＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて１００μｌの緩
衝液中において９℃で３０分間インキーヘートさせて修
復した。ＤＮＡを精製し、ｌμＩのホスホリル化Ｂａｍ
ＨＩ リンカ−（！’−ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ−Ｊ’）を
１００μ１反応混合物中に２０単位のＴ ４１．Ｄ Ｎ
Ａ ＩＪガーゼと共に添加した。室温で２時Ｉｕｌイ
ンキーベージ日ン後、ＤＮＡを精製した。 次いで、ＤＮＡベレットを１００μｌの緩衝液十二〇単
位のＢａｍＨＩ中に再懸濁させ５，７７°Ｃでμ時間消
化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロース中で電気泳
動を行い、ゲルから２００塩基対欠失までのｐＢ’截頭
プラスミド′を精製した。ＤＮＡをＴｌＤＮＡ リガー
ゼを用いて環化させ、Ｊ Ｍ １３ 細胞をａｍ 、
ｇａｌに形質転換するために使用した。得られたクロー
ンはＢａｍＨＩ認識部位の位置に応じてｐＢ’Ｂａｌ
／ 、 、２．３などと称される突然変異プラスミドの
「ライブラリー（ＬＩＢＲＡＲＹ）Ｊを構成した。 数個のｐＢ’ Ｂａｔ欠失突然変異プラスミドを選択し
、各々からのＸｈｏ Ｉ （１９００）からＢａｍＨＩ
リンカ−（４１００θ〜４ＬＵ／θ位）までの断片をア
ガロースゲルから精製した（断片Ａ）（第２図）。）（
ｈｏＩ（ｌりＯθ）からＢａｍＨＩ（μｘｉｏ ） ま
での断片をｐＡｃｌｏｌから除去し、残存配列をアガロ
ースゲルから精製した（断片Ｂ）（第一２図）。断片Ａ
の各々約０．１μｇを０．／ｌｑｉの断片Ｂと混合し、
ｌ単位のＴ≠ ＤＮＡＩＪガーゼを有する２０μｌの緩
衝液中においてインキ瓢ベートさせて連結し、次いでＪ
Ｍｌｒ３細胞をｌ１ｍ’ 、ｇ”−に形質転換するため
に使用した。得られたプラスミドは、変成転移べ〆ター
であり、例えばｐＢ’ Ｂａｌ ／／に由来する場合に
はｐＡｃ Ｊ／／ 、 ｐＢ’ Ｂａｌ １０に由来す
る場合にはｐＡｃ３６０などのように命名した。この様
にして、「変成」転移ベクターを構成し、代表的なもの
はポリヘトリン遺伝子における十１７３〜−１ｏｏ位に
おけるＢａｍＨＩクローニング部位を有するものであっ
た。μつの変成転移ベクター、ｐｋｃＪＩＯ％ｐＡａ３
７３、ｐＡｃ 、３ｉｔ及びｐＡｃ Ｊ６０におけるＢ
ａｍＨＩ認識部位の位置並びに親転移ベクターｐＡｃ１
０１におけるその位置は第３図に示されている。 例■ 例Ｉ或いは例■の方法に従りて調製された転移ベクター
は、いずれも、利用される特別の変成転移ベクターに応
じて目的遺伝子が各種の位置においてポリヘトリン遺伝
子に結合されている組換え転移ベクターの構成に利用す
ることができる。ヒトβ−インターフェロン合成をコー
ドするＩＦＮ−β遺伝子の上記文献に示される標準的ク
ローニング技術を用いて変成転移ベクターの１つ、ｐＡ
ｃ３１ｒＯ中への単−ＢａｍＨＩクローニング部位にお
ける挿入によ’） ｐＡｃ ３（θ−ＩＦＮ−βと称さ
れるプラスミドを形成する方法が第φ図に概略的に示さ
れている。 ＩＦＮ−β遺伝子は、ヒトＩＦＮ−β（ｐＢＲ／Ｊと称
される、Ｈ，Ｈａｕｓｏｒ等参照、コタ７ Ｎａｔｕｒ
ｅ（Ｌｏｎｄｏｎ ） Ａｌ１− ＋ｊｇ （／２ｔλ
）及びＧ、 Ｇｒｏｓｓ等、タ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓ Ｒａｓ、２ゲタｊ−２３０７（／りＩＩ））の
ゲノムクローンから得られ、且つＩＮＦ−βに対する全
蛋白質コード配列、ＡＴＧ翻訳開始信号前の３個の追加
塩基及びポリアデニル化に対する信号を含む全ての非−
翻訳３′配列を含有する０、７１．７キロベースＨ１ｎ
ａ■ 断片として特徴付けられる。ＩＦＮ−βに対する
ヌクレオチド配列及び各種転写及び翻訳信号の位置はＲ
，Ｄｅｒｙｎｃｋ等、ｚｒｊＮａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ
ｏｎ ） ｊｕｉ −ｓａｙ （／り１０ ）； Ｇ、
Ｇｒｏｓｓ等、 タ Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ Ｒａｓ、
Ｊ、ｌＬり、ｔ −，２ｊ０７ （／りＩＩ）；及びＢ
、 ０ｈｎｏ及びＴ、 Ｔａｎｉｇｕｃｂｉ 、 ７７
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ３３０！−３１０り（１ｙ
ｒｉ ）などに記載されている。 − ＩＦＮ−β遺伝子を含むＨｉｎｅｎ ＤＮＡ断片は、挿
入がＡ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖポリへドリンプロモーター
に隣接し、ポリヘトリン遺伝子とｊ′乃至３′配向であ
るようにＩＦＮ−β遺伝子断片上の合成オリゴヌクレオ
チドリンカーを用いてｐＡｅ ３１０の利用可能なりａ
ｍＨＩ制限部位に挿入される。 はぼ同様にして、ＩＦＮ−β遺伝子をその他の変成転移
ベクターｐＡｅ ３／／ 、 ｐＡｃ Ｊ６０及びｐＡ
ｃ３７３及び親転移ベクターｐＡｃ １０／中にクロー
ン化し、各々ｐＡｃ Ｊ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡａ
ＪＡθ−ＩＦＮ−β、ｐＡｃ ３７３− Ｉ Ｆ Ｎ
−β及びｐＡｃ １０／ −ＩＦＮ−βと称される組換
え転移ベクターを形成した。 潜在的には、その遺伝子或いは任意のその他の選ばれた
遺伝子は、ＢａｍＨＩ認識部位或いは転移ベクター内の
任意の位置に挿入された任意のその他の適当な制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位を有する任意の転移ベクター中
にクローン化するととが可能である。更に、例Ｉにおい
て略述した如く、適当な制限エンドヌクレアーゼクロー
ニング部位を、プラスミド中に取υ込むことができるＡ
ｃＭＮＰｖゲノムの任意の断片における任意の点におい
て誘発することが出来るので、ＢａｍＨＩ認識部位を挿
入するためにポリヘトリン構造配列の一部又は全部を欠
失させる必要はない。 例■ 例■の方法によシ調製された組換え転移ベクターは、い
ずれも、ＡｃＭＮＰＶのゲノム中にＩＦＮ−β遺伝子を
転移させるために使用して組換えバキーロウィルス発現
ベクターを形成することができる。転移はＣｍ”及びＳ
、フルギペルダ（Ｓ。 ｆｒｕｇｔｐｅｒｄａ ）のような感染しやすい昆虫宿
主細胞の存在下においてトランスフエフシロン（ｔｒａ
ｎｇｆｅｃｔｌｏｎ ） により行われた。 Ｆ、 Ｌ、 Ｇｒａｂａｍ及びＡ、 Ｊ、 Ｖａｎ Ｄ
ｅｒ Ｅｂ 、 ｊ、２Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１３４−
ｕＡ７ （／り７３）に記載されている方法の修正方法
を次のように利用した。Ａ ｃ Ｍ Ｎ ＰＶ（／μｇ
）から抽出され精製されたＤ Ｎ Ａをｌ〜ノθμＩ
の組換え転移ベクターＤＮＡ、特に組換え転移ベクター
ｐＡｃ Ｊざ０−ＩＦＮ−βと混合し、ｄ当り／！；μ
Ｉの担体仔ウシ胸腺ＤＮＡを有する１−ＨＥＰＥＳ（Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−コーエタン
スルホン酸） −１１ｉ衝ｍ水（ｐＨ７，０３）中でり
！Ｏｐｌにした。混合物を渦巻き混合機中で攪拌しなが
ら３０ ｍｌのλ、ｊＭ ＣａＣｌ、を滴下し、沈澱を
室温で３０分間形成させた。ｔｍｌの沈澱したＤＮＡを
感染しやすい昆虫宿主細胞、この場合にはＳ、フルギペ
ルダ、に６０關培養ブＶ−ト内のλｔｎｌの培地内にお
いて添加した。μ時間後、細胞単層を培地で洗浄し、１
０％ウシ胎児血清を含むλｍｌの培地中において３日間
インキ−ベートした。得られた子孫は組換え及び弁組換
えＡｃＭＮＰＶウィルスの混合物よシなるものであった
。 例Ｖ 組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターの選択次に、例１ｖに
より得られた弁組換え及び組換えバキーニウィルスの混
合物からＡｃＭＮＰＶ組換え発現ベクターを単離するこ
とが必要であった。この単離がポリヘトリン構造遺伝子
の全て或いは一部が欠失した組換え体において達成され
る方法は、（１１ポリヘトリンがこれらのウィルスによ
り全く生成されない、及び（２）非−封入（ポリへドリ
ンコートに欠ける）ウィルス形態が昆虫細胞培養液中に
おいて生育可能であり、感染性であるという事実を利用
するものである。 ポリヘトリン構造遺伝子の全て或いは一部が欠失した組
換えＡ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖウィルスにおいて、例えば
組換え転移ベクターｐＡｃｉＯｔ −Ｉ ＦＮ−β、ｐ
ＡｅＪ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡｃ Ｊ６０− Ｉ
Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅＪ７Ｊ −Ｉ ＦＮ−β及びｐＡｃ
３ざ０−ＩＦＮ−β、とのトランスフェクシ１ンから
得られた組換え体において、組換えＡｅＭＮＰＶウィル
スは下記の如くして単離される。 トランス７工クシ１ン後３日目に培地中に存在する外部
細胞ウィルスを、Ｌ、 Ｅ、 Ｖｏｌｋｍａｎ 、 Ｍ
、 Ｄ。 ８ ｕｍｍｅｒｉ及びＣ，Ｈ，Ｈｓｉｅｈ 、 ／りＪ
、 Ｖｉｒｏｌ、１２０−１３２ （／り７６）に記載
されている標準的Ａ ｃ Ｍ Ｎ ＰＶポリへドリンブ
ラークアッセイにおいて使用した。発達したプラークは
、ウィルス封入体を生成する弁組換えＡ ｃ Ｍ Ｎ
Ｐ Ｖで感染された細胞或いはウィルス封入体を生成し
ない組換えＡｃＭＮＰＶウィルスで感染された細胞のい
ずれかからの結果であった。後者のタイプのプラーク（
０−プラーク）は当初低倍率双眼顕微鏡の下においてそ
れらの外観により前者（０＋プラーク）と識別された。 Ｏ−プラークはマークを付し、倒立顕微鏡により検査を
行ったところ、個々のウィルス封入体が存在する場合に
は感染細胞の核内に観察することができた。 ０′″ プラークからのウィルスをプラーク精製し、Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素で分析し、組換えＡ（ＩＭＮｐｖ
ベクターはＥｃｏ ＲＩ −Ｉの適当な位置に外来遺伝
子を挿入して有していることを確認した。ウィルスゲノ
ムにおけるその他の変化は何等検出されなかつた。次い
で感染しやすい昆虫細胞に標準操作を用いて感染させる
ことによシ多量の目的組換えウィルスを得た。 例■ 目的遺伝子生成物を製造するためには、組換えバキーロ
ウィルスは感染しやすい宿主昆虫細胞内で感染されなけ
ればならない。組換え転移ベクターＡｃ １０１− Ｉ
Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅＪ／／ −Ｉ ＦＮ−β、ｐＡｅ
３６０− Ｉ Ｆ Ｎ−β、ｐＡｅ ３７３− Ｉ
Ｆ Ｎ−β及びｐＡｅＪｆ＜１１− Ｉ ＦＮ−β（ｇ
−を図参照）を用いた組換えによシ形成されたＡｃＭＮ
ＰＶ発現ベクターの具体例に対して次の操作を利用した
。 感染しゃすいＳ、フラギペルダの宿主細胞を先ず懸濁培
養成いは単層（単分子層）において／ −ｊ×ｌＯ６細
胞／ｒｎｌ（最適発現のための細胞濃度は各ＡｃＭＮＰ
Ｖ発現ベクターに応じて異る）の密度まで生育させた。 生育培地を除去し、細胞当りｏ、ｉ〜１００（最適濃度
は変シ得る）のプラーク形成単位の組換えウィルス例え
ばＡｃ ３１０− Ｉ ＦＮ−β（、ｌＥｊ図）、を含
有する培地とＪ”Ｃにおいて約１時間変換した。この接
種物は細胞上に残されても或いは除去されて適量の新し
い培地と交換されてもよい。 クローン化されたＩＦＮ−β遺伝子からの蛋白質はＡｃ
−３１０−Ｉ ＦＮ−β発現ベクターで感染されたＳ、
フルギベルダ細胞内において感染後約７３時間乃至感染
後３日生成された。ウィルス蛋白質合成、ウィルス組立
て及び細胞溶解を含む全感染過程は約７２時間で完結し
た。感染後！；０−Ａθ時間の間に蛋白質合成に顕著な
減少が見られ、細胞溶解は感染後約ＳＯ時間において最
初に検出された。ＩＦＮ−β遺伝子の発現の機構は、宿
主細胞の種類及び遺伝子がポリヘトリン遺伝子にクロー
ニングされた部位に応じて興った。 各組換えウィルスに対するＩＦＮ−β発現の機構を表７
にまとめて示す。各発現ベクターで感染された細胞内に
感染後ケｇ時間までに相当なレベルのインターフェロン
が検出された。検討された発現ベクターの中でＡｃ ３
７３− Ｉ ＦＮ−β及びＡＣ３１０−ＩＦＮ−βは最
も高いインターフェロン活性の力価を生成した（表１）
。 インターフェロン活性の細胞内のレベルも又測定され、
表１に示されている。感染後戦時間においてＡｅ Ｊ７
Ｊ −Ｉ ＦＮ−β及びＡＣ３１０−Ｉ ＦＮ−β感染
細胞の内部には全インターフェロン活性のｊチ未満が留
まシ、これは、Ｉ ＦＮ −７分泌信号が認識され、蛋
白質が感染中に培地内に効率よく放出されたことを示し
ている。感染後／：１時間において、Ａｃ ３７３−
Ｉ ＦＮ−β及びＡｃ ３１０− Ｉ ＦＮ−β感染細
胞からの培地は約ｔＯ，０００ＩＵ／＋ｍのインターフ
ェロンを有し、感染後戦時間までにほぼｊ×１０６１Ｕ
／ｍｌの最大に増大した。 表７ 各種発現ベクターにより感染されたＳ、フルギペルダ細
胞内におけるインターフェロン発現の機構を試験した。 これらの実験の結果は下記の通りである： 心 七 ＝ｉ 七 七 七 局 ＡｃＭＮＰＶ 感染細胞中のポリヘトリンの合成は同様
な時間的発現パターンに従うことが知られている。Ａｃ
５６０−ＩＦＮ−β中に産生されるインターフェロンの
量はより少なく 、Ａｃ３／／ −ＩＦＮ−βウィルス
感染細胞中にお層ては伺少ないがツタ係を超える活性が
培地中に存在した（表／）。Ａｌ！／（１）／−ＩＦＮ
−β感染細胞中には比較的低レベルのインターフェロン
が検出され、その殆んどが卸１ ）腔内のものであった
（表／）。 組換えウィルス感染細軸の力価は、Ａｃ Ｍ Ｎ Ｐ
Ｖ＋％染細ＩＪａの典型的なものである培地ａ当り３〜
ｇｘｉｏ”プラーク形成単位の最大値に到達した。この
様に、ＩＦＮ−β遺伝子のポリヘトリン遺伝子への挿入
はウィルスの複製に何等の大きな影響を及ｔ１°さない
ように思われる。これを試験するために、、２ｘｉｏ６
個のＳ、フルギベルダ細胞を、Ｊ−Ｘ １０６Ｉ ＵＡ
ｎパでのＡｃＪざ０−ＩＦＮ−β感染細胞培地中に産生
されたインターフェロン或いはｊ×１０５ ■Ｕ／１ｎ
ｌの国際標準のヒトインターフェロンで７．２時間処理
し、その後処理細胞をｉｏｏプラーク形成単位のＡｃＭ
ＮＰＶ或いはＡｃＪざ０−ＩＦＮ−βで感染させた。細
胞のインターフェロンへの曝露は、発達したウィルスプ
ラーク数に測定可能な影響は及ｅ１さなかった。 水庖性ロ内炎ウィルス感作されたヒト羊１ＷＩＳＨ細胞
におけるウィルスプラーク減少アッセイを用いてインタ
ーフェロン活性の分析を行った。 ウィルス粒子を遠心分離で除去するとＡｃＭＮＰＶ感染
細胞からの培地中には何等のインターフェロン活性も測
尾されなかった。しかしながら、インターフェロンアッ
セイの際にＡｃＭＮＰＶウィルス含有培地を使用すると
、１０００〜３０００国際標準単位（ＩＵ）／ｍ／のイ
ンターフェロンが生成さｉ−Ｌ、ＡｃＭＮＰＶヴイリオ
ンが明らかｍｗｉｓｎ細ノ胞内に内因性インターフェロ
ンを誘発したことを示した。多くの禎類のエンベロープ
に封入されたウィルスがヒト細胞におをハてインターフ
ェロンの産生を誘発することが知られているので、これ
らの結果は予想されたものであった。この影響を避ける
ために、以下の全ての試料は試験前に退心分陥にかけら
れた。 培地中に存在する血清アルブミン（ｇツ／ｄ）及び仔ウ
シ血清（１０％ ） （Ｗ、 Ｆ、 Ｈｉｎｋ 、、２
２乙Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ ） ４！＆ Ａ−
ＩＩ乙７（／？７０）参照）がＡｃ３１０−ＩＦＮ−β
で感染されたＳ、フルギペルダ細胞内におけるＩＦＮ−
βの発現に必要であるか否かを決定するために７つの実
験を行った。感采稜ｒ時間目に培地をｏ−ｉｏ％のウシ
胎児血清を含有するＧｒａｃｅの培地（非血清アルブミ
ン、Ｔ、 Ｃ，Ｃ。 Ｇｒａｃｅ 、 ／り、！ Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ
ｏｎ ） ７Ｊ’ Ｉ −７Ｊ’り（／２４．２）参照
）で交換した。各変成培地について感染後ｔざ時間後に
インターフェロン活性の分析を行った。 無血清の場合には、インターフェロン活性に約７０倍の
減少があった。ｏ、ｒ％の血清の添加により／θチの血
清を含有する対照例におけるのと同一レベルの活性が産
生された。Ａｃｊざ０４ＦＮ−β感染細ノ泡中のＩＦＮ
−βの特異活性はｏ、ｒ’Ｊ６血消を含有するＧｒｉｃ
ｅの培地中に産生された際ＶＣは約ｊ Ｘ １０６エＵ
／ダ の蛋白質であつ１こ。悄製β−インターフェロン
の活性をλ十１０８１ＵＡｎｌと想定すると（Ｅ。 Ｋｒ＋１ｇｈｔ 、 Ｊｒ、、７３ Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ。 ｒ、２ｏ −ｒ２３（／ｓ＞７ｇ ）参照）、β−イン
ターフェロンは培地中の全蛋白質の約／チを表わすであ
ろう。 更に、Ａｃ５７３−ＩＦＮ−β及びＡｃ５１０−ＩＦＮ
−β感染ａｌ 施の培地中で測定されたインターフェロ
ン活性の分析１−ｔ ／７，０００ （／７Ｋ ）及び
２０．ｊｔＫ分子景のλつのポリペプチドを明らかにし
た。非グリコジル化及びグリコジル化ヒ）ＩＦＮ−β蛋
白質の大きさは各々／７Ｋ及び、２０゜ｊＫポリペプチ
ドに匹敵するものであることが報告さノｔている。感染
後３０時間目に／”ＩＫポリペプチドはＡｃ３乙０４Ｆ
Ｎ−β感染細胞中に作られており、感染後ｑ時間迄に７
７Ｋ及び；）、０． ｔ Ｋポリペプチドの両者が検出
された。 Ａｃ３／／−ＩＦＮ−β感染細胞内には／７
にポリペプチドのみが感感後３０時間目及びｌｔｇ時間
目に検出された。 Ａｃ、？！；０−ＩＦＮ−βノ＝＜染細ノ］ｍ中１でｉ
Ｉ′ｊ：豊富に産生された。２ｊ、 ｊ Ｋ蛋白質が観
察された。この大きさは２７個のアミノ酸信号ペプチド
プラスボリヘドリン遺伝子の最初の／θコドン由来の追
加の／ｌ／、個のアミノ酸及びＢａｍＨＩリンカ−配列
を含む全インターフェロン蛋白質よりなるノ・イブリッ
ド蛋白質に対して予想されたものである。 Ａｃ３ど０−ＩＦＮ−βおよび（少ない程度で）Ａｃ３
６０−ＩＦＮ−β感染細胞内で作られた７７Ｋ及び、７
（１，ｚ Ｋ ｉ 白質はヒ）ＩＦＮ−βモノクローナ
ル抗体と反応した。（ＩＦＮ−βモノクロナール抗体は
ｐ 、Ｗ、 Ｔｒｏｗｎ及びＨｏｆｆｍａｎ Ｌａ Ｒ
ｏｃｈｅ社により提供された。）この抗体の／７に蛋白
質に対する反応性に対比して、２０． ｊ Ｋ蛋白質に
対する反応性が減少されていることが注目された。これ
は、幾分１、）、ＯＪＫよりも７７Ｋが細ｌ泡中により
高いレベルで蓄積すると１／１５事実によるものである
。更に、この抗体は例えば：）、０．４− Ｋポリペプ
チドのグリコジル化により部分的にマスクされて（／す
る／７にポリペプチド上のエピトープと反応しているｏ
Ｊ能性がある。 この想像上のハイブリッド、ｎｊＫ及び３．２に蛋白質
は又ＩＦＮ−β抗体と反応した。ポリヘトリンに対する
ポリクローナル抗体は、ＤＮＡ配列から）・イブリッド
蛋白質のＮ−末端に存在することが予想される。ＺＪＪ
Ｋ蛋白質の７０個のアミン１声及び３ツに蛋白質の５７
個のアミノ酸を認識した。 ２０．！ＫＩＦＮ−βがグリコジル化されていることを
示すために、Ａｃｊざ０−ＩＦＮ−β感染細胞を感染の
後期において（５Ｈ）マンノースで標識した。 ２．０．ｊＫ ＩＦＮ−β及び３個の追加の蛋白質１ｄ
Ａｃ ３♂０−ＩＦＮ−β感染Ａ１１ｌｌ ノｊ［！
におＩ八て標識された主たるマンノース倉荷グリコ蛋白
質であった。 例■ −の構成 Ｅ、 ｃｏｌｔ転置囚子Ｔｎりは、抗生物質クロラムフ
ェニコールに対する耐性を与える酵素クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ、Ｔ）に対する
遺伝子を含有する。ＣＡＴの真核生物ベクター内におけ
る発現は動物細胞におけるプロモーターの発現を測定す
る便利な手段であることが示されて１ハる。（Ｍ、 Ｍ
ａｃｋｅｔｔ ％ Ｇ、 Ｓｍ１ｔｈ及びＢ、Ｍｏａａ
、／りざＩＩ Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、ＩＩり： ざｊ７−
ｒ＆Ｆ及びそれに示される参考文献を参照）。ＡｃＭ
ＮＰＶ−ＣＡ１発現ベクターはバキ瓢ロウィルスベクタ
ー中における外来遺伝子の産生を最適化するように設計
された実験において有用である。 ＣＡＴ−コード配列を含有する７７０塙基対ＴａｑＩ
ＤＮＡ断片をｐＢＲＪ−！Ｊ’から単離し、ｐＵＣ７の
ＡｃｃＩ 部位にクローン化した。このＣＡＴ−コード
配列をＢａｍＨＩで切シ出し、ｐＡｃｊ７Ｊ中のＢａｍ
Ｉ（Ｉ部位に挿入した。得られたプラスミド転移ベクタ
ーをｐＡｃ ３７３− ＣＡＴと称する。 例■ ヒトインターロイΦンー、ｚ（ＩＬ、ｚ）は有糸分裂促
進剤或すは抗原により刺戟されたヒトリンパ球内に微量
に産生される。ＩＬ−２は当初培養液中のＴリンパ細胞
の長期間の生育を維持することのできる因子であると説
明されて（ハた（ Ｄ 、 Ａ 、 Ｍｏｒｇａｎ 。 Ｆ 、 Ｗ、 Ｒｕａｃｅｔｔｌ 及び Ｒ，Ｇａ１ｌ
ｏ 、５ｃｉｅｎｃｅ ／り３ ：ｔｏｏｑ−１０ｏｔ
（ｔｙｙＡ））。それは、免役応答の刺戟及び維持に
おりて中心的役割を果たすようであシ、ある種のヒトの
病気に介在していたために、複雑なものであった（ Ａ
、 Ａｌｔｍａｎ 、Ａ、 Ｎ。 Ｔｈｅｏｆｌｌｏｐｏｕｌｏｓ ％Ｒ，Ｗｅｊｎｅｒ
、Ｄ、 Ｈ，ＫａｔｚおよびＦ、 Ｊ、 Ｄｊｘｏｎ
、Ｊ、 Ｅｘｐｌ、Ｍｅｄ、／！’Ｉ ： ／１１０３
−ハｔｙｙ（／Ｐ♂／））。 大証のＩＬ−ｊの製造の
ためにＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用することは、ヒ
ト免役系の臨床的診断及び治療操作を非常に容易にする
ことが期待される。最近、幾つかの実験室は、ＩＬ−２
の遺伝子の単離及びプラスミドベクターを用１八た細菌
細胞中における生物学的に活性な工Ｌ−，２の製造を報
告して（八る（ Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２２３ ： ハＺ／、２−ｉ１１．／ｚ （１ｙｉ
ａ）及びその中の参考文献参照）。 ＩＬ、！−コード配列を含有する１ｏｏｏ塩基対のＢａ
ｍ ＨＩ断片をｐＩＬ、２−．２Ｂから単離し、ｐＡｃ
３７３及びｐＡｃ３１０のＢａｍＨＩ部位に挿入した。 得られたプラスミド転移ベクターをｐＡｃＪ７Ｊ〜ＩＬ
２及びｐＡｃ Ｊざ０− ＩＬ、２と称する。 例■ ポリへドリノ−ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノムへの転移 ポリへドリノ−ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノム中への転移及び組換えＡｅＭＮＰＶ発現ベクター
の選択は、上記例１ｖに説明したように行った。ｐＡｃ
３７３− Ｉ Ｌｊ、ｐＡｅ ３１０− Ｌ Ｌ２及
びｐＡｃｊ７Ｊ−ＣＡＴから産生したＡｃ ＭＮ Ｐ
Ｖ発現ベクターは各々Ａｃｊ７Ｊ−ＩＬ２、Ａａ３１０
−ＩＬ２及びＡｅＪ７Ｊ−ＣＡＴと称する。 例Ｘ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＩＬ２の製造Ｓ、
フルギペルダ細胞をｋａ３１０−ＩＦＮ−βにつ込て説
明したものと同様なＡｃＪ７Ｊ−ＩＬ、２或（八けＡｃ
３ざ０−ＩＬ、２発現ベクターで感染させた。感染後
ｔＡｇＡｇ時間項地及び感染細胞を集め、インターロイ
キンの生物学的活性のレベルをＧ１１ｌｓ等、Ｊ。 Ｉｍｒｎｕｎｏｌ 、 ／２０ ： ２０２７−２０３
．２（／り７ｒ）によシ説明されているＩＬ２アッセイ
を用いて測定した。このアッセイを用いて、ＩＬ２の特
異活性は蛋白質ツ当シ／Ｘ１０”単位と測定された。両
発現ベクター共に高レベルのインターロイキン活性を産
生じたが、しかし、Ａｃ５７３−ＩＬ２はＡａ３１ｒＯ
−ＩＬ、２よりもほぼグ倍のインターロイキンを産生じ
たく表２参照）。インターロイキン活性の約１０係は培
地内に存在し、蛋白質が感染中】細胞か−ら効率的に分
泌されることを示した。Ｈｏｆｆｍａｎ −ＬａＲｏｃ
ｈｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ−のＧｒａｃｅ
Ｊｕ博士によシ行われた別の実験においては、Ｓ、フ
ルギベルダ細胞をＡｃ３７３− Ｉ Ｌ２及びＡａＪ♂
ｏ −Ｉ Ｌ２で感染させ、インターロイキン活性を堵
地内妬お（八て感染後、２ｕ＋寺聞、≠ｇ時間、７２時
間目に測定した。新鮮な培地を３時間及びＩＬｇ時聞時
間適用した。実質的に全ての活性は感染後０−Ｊり時間
及びＪ〜弘５時間の間に産生された（表２）。ＩＬ、２
の特異活性から、ｋ：３７３−ＩＬ２Ｊ水染細ノ泡のｌ
当シ少な（とも／ツのＩＬ２蛋白質が産生され、分泌さ
れたと計算される。 ＡｃＪ７Ｊ−ＩＬ、２及びＡｃ３♂θ−ＩＬ２感染細胞
において合成された蛋白質の分析を行った。これらのＡ
ｃＭＮＰＶ発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染細廁に
おいては作られない２つの蛋白質が多量に作られた。こ
れらの新蛋白質は約／３． ｊ Ｋ及び／６にダルトン
の大きさのものである。これは、ＤＮＡ配列から予想さ
れたインターロイキンの大きさが約／３．！にであると
ｂう事実（蛋白質のアミン末端の、２０個のアミノ酸信
号ペプチドが除去されたと仮定して）と一致するもので
ある。 表− ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターで感染されたＳ、フルギベル
ダ細胞中のインターロイキン−λ活性の産生。 感染陽ＩＶｃ＞−て培地及び感染細ｊＭの試料は感染後
ψｇ時間目に集められた。感染Ｎｏ、２にお（八では、
培地の試料は感染後Ｊ’時間、Ｉｌ−ざ時間及び７２時
間目に集められ、新鮮な培地は感染０；、Ｊ時間目、及
び≠ｇ時間目に適用された。 感染Ｎｎ／ａ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ．２ＪＸ１０７／ Ｘ／θ８ ／
、、２！ １０％ＡｃＪざ０−ＩＬＪ ／、ＯＸ／θ７
！Ｘ／θ７ θ、６ｇグ係感染Ｎ［１２ｂ Ａｃ３７３−ＩＬ、２２グ ｊ、／Ｘ／θ７ θ、ｊＡ
ａ３７３−ＩＬ２ ’Ｉｔ ｊ、／ Ｘ１０７０ＪＡＯ
Ｊ７Ｊ −ＩＬＪ ７２ Ｉｌ、♂Ｘ１０６０．θ！Ａ
ｃ５１０−ＩＬ２ ２’ｌ ／、３ Ｘ１０７０．／３
Ａｃ３１０−ＩＬ２ ＩＩＩ ／、３ Ｘ１０７０．／
１ａ Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎ１ｖｅ’ｒａｌ’
ｔｙで製造ｂ Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｒ
ａａｅａｒａｈ Ｃｅｎｔｅｒで製造 例Ｍ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＣＡＴの製造Ｓ、
フルギベルダ細胞をＡｃ３ざ０−ＩＦＮ−βについて説
明したと同様にしてＡａＪ７３−ＣＡＴ でＬａ染させ
、感染後２’１時間目にＣＡＴ酵素活性を上記Ｍａｃｋ
ｅｔｔ等に記載された方法で＃Ａ胞及び増地中において
測定した。未感染細胞或いはＡｃＭＮＰＶで感染された
細胞には検出可能なＣＡＴ酵素活性は仔在しなかったが
、しかし、Ａｃｊ７Ｊ−ＣＡＴ によっては細胞及び培
地の両者に高レベルの活性が産生された。 Ａｃ３７３−ＣＡＴ感染細胞において付成された蛋白質
の分析を行りた。この発現ベクターによシＡｃＭＮＰＶ
感染、！８胞においては作られなかったＪ７にダルトン
の新しい蛋白質が産生された。ＣＡＴの大きさはＤＮＡ
配列から約２７にであると予測された。多電の２７に蛋
白質が感染細胞及び培地の両者に存在した。ポリアクリ
ルアミドゲル上にｍＷされた蛋白質の電からＡｃ ３７
３− ＣＡＴ感染細胞のｌ当シ約句ツのＣＡＴ酵素が製
造されるものと推定される。 本発明及びそれによって提供される利点及び便宜は本発
明の幾つかの好筐しい実施態様を説明するにすぎない上
記記載より認められるであろう。 本発明の範囲及び精神から離れることブエく、或すはそ
の利点の如何なるものも害することなく物質・方法及び
物質の使用鎚において多ぐの変化をなし得ることが明ら
かである。更に、上記発明が、木兄１ｆｆＨ’バキュロ
ウィルスゲノムの幾つかの位置の任意の位置に２いて、
任意の速ばれた遺伝子を挿入するために利用することが
できるという事実を第１１用することに基づ（用途を有
することが認められるであろう。 例えば、ポリヘトリン遺伝子の全て或いは一部が欠失さ
れていな層組換えＡｃＭＮＰＶウィルスの単ｔ’ｆｌｎ
に操作が第１１用可能であると（ハう槌実は、本発明を
多くの方法において利用することを可能にするものであ
る。これらの用途はＡｃＭＮＰＶウィルスの封入形愈の
ポリヘトリン被覆が外ｌ（ｔ！ 影響に対して極めて耐
性であると” ５ ’Ｊ ’ＪＬを利用するものである
。例えば、例■１で述べた如く、選ばれた遺伝子をウィ
ルスゲノム中にポリヘトリン遺伝子内以外の場所に、特
に、選ばれた遺伝子が高いレベルで発現されるように１
０Ｋプロモーターによ多制御されるような場所に、クロ
ーン化することが出来る。 このＡｃＭＮＰＶウィルスは次いで単層され、安尾な発
現ベクタ・−として利用することができる。 その様な安短な発現ベクターは、将来ある指定された時
に、目的蛋白質の製造に使用する為に、組換えＡａ Ｍ
Ｎ Ｐ Ｖウィルスを進当な宿主細胞及び十分な培地の
培養液と共に７つの実験菫から別の実験室に移すことの
できる安矩な形層で利用できる。 この発現ベクターは又、特定の宿主昆虫種、或いは広範
囲の感染しやす（へ宿主昆虫種に拵性をイイする蛋白質
を産生ずる遺伝子を選択し、その遺伝子をＡｃＭＮＰ
Ｖ 発現ベクター中にクローニングすることによシ害虫
集団を抑制するための系にも使用することが可能である
（これらの可能性はり、 Ｋ。 Ｍｉｌｌｅｒ等、２／り５ｃｉｅｎｃｅ ７／ｊ−７Ｊ
／ （／り♂３）に論じられている）。組換え発現ベク
ターは、昆虫が害虫である植物或いは動物に適用するこ
とが出来、それが害虫により上記の如く摂取された場合
には封入体は腸の内腔にお（八で解離し、組換えウィル
スは腸壁のＭ施を侵し、金製を開始する。 哉製の際に、害虫に毒性を有する蛋白質の遺伝子が発現
され、昆虫の不能化或いは死がもたらされる。その時１
ＩＩＩ ＩｒＪ：、昆虫が野性タイプのＡａＭＮＰＶウ
ィルスを摂取した場合より逼かに短く、この場合、昆虫
はウィルス感染の程度に応じて異る時ｍＪ後に溶解され
る。これ及びその他の実験室における実験の示すところ
によれば、１０Ｋ蛋白質の発現は感染後２を時間程度の
早期に起こり、約弘ざ時間目に高レベルで起こることが
判明している。その結果、１０Ｋプロモーターの制御下
にＡａＭＮＰＶゲノム中にクローン化される目的昆虫毒
素をコードする遺伝子は父、そのタイムスケジュールに
従って発現されることが予想される。昆虫の死或いは不
能化はその選ばれた遺伝子の発現の開始後間もな（起こ
ることが予想され、その結果、昆虫の野性タイプバキュ
ロウィルスによるｔａｌｋに対比して、その害虫の寄生
する植物或いは動物に対する損傷が同時に減少する。 遺伝子は又、バキュロウィルスゲノム中にポリヘトリン
被覆が昆虫の腸のアルカリ性条件によシ解離された場合
に、毒性遺伝子生成物が放出されるようにポリヘトリン
構造配列に融合されるように挿入することができた。本
発明のその様な用途は、昆虫脳細胞における組換え遺伝
子の発現を行うことなく昆虫の破毒を生ずるものと思わ
れる。 更に、上記共体例で測足されたよりも高いレベルの遺伝
子発現が本発明を用いて可能であることが認められるで
あろう。例えば、ＩＦＮ−β遺伝子（或いはその他の任
意の遺伝子）はバキュロウィルスゲノム中に７回以上ク
ローン化することが可能である。特に、発現がポリへド
リンプロモーターの制御下におかれるようにコピーを挿
入することが出来、その他のコピーを発現が１０Ｋプロ
モーターの制御下にあるように挿入することが可能であ
シ、従って、他の幾つかのコピーをイｔ々のその他の制
限部位に挿入することか出来、各コピーは自らのプロモ
ーター或（八はバキュロウィルスによりプロモーターと
してｔｇ Ｒされる幾つかのその他のＤＮＡ配列を含有
する。感染しやすｂ昆虫細胞中に感染時に産生されるイ
ンターフェロン（或（八けその池のポリペプチド）の量
は上記泗ｊ定レベルをはるかに越える量となシ得る。 ここに開示されている本発明の一層の修正は、当業者に
可能であり、全てのその様な饅正は特許請求の範囲に規
定される本％明の硝神及び範囲内にあるものと看做され
る。
第１図は、Ａｃ ＭＮ Ｐ Ｖのプラーク精製法、Ｍ３
、プラスミドｐＢＲＪ、２ｊ、及びプラスミドｐＵＣ♂
を用いて開始した転移ベクター、ｐＡｃ１０／の構成の
概略図を示す。 第２図は、プラスミドｐＩ１０．ｐＵｃＩ及び合成りａ
ｍＨＩＩＪンカーを用（八て開始した変成転移ベクター
ｐＡｃｊ／へｐＡｃ３ＡＯ，ｐＡｃ３７３及びｐＡｃｊ
Ｊ’Ｏを構成するための概略図を示し、図中「ライブラ
リー」という用語は、ポリヘトリン遺伝子における各可
能性のある位置において欠失突然変異を開発することに
より構成することのできる変成 ＢＺＢａｌプラスミド
のライブラリーを表わす。プラスミドｐＢ’ Ｂ＋１
／／ 、 ｐＢ’ Ｂａｌ ＡＯｌｐ Ｂ’ Ｂａｌ
７ｊ及びｐＢ’ Ｂａｌ １０を次いでこの突然変異プ
ラスミドのライブラリーから選択して更に転移ベクター
ｐＡｃＪ／／ 、 ｐＡｃ ３６０ 、ｐＡｃ ３７３
及びｐＡｃ ３１０に変成した。 第３図は、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖのポリヘトリン遺伝
子の部分的ヌクＶオチド配列及びその遺伝子のすぐ上流
の配列を概略的に示すものである。特徴的なりａｍＨｉ
クローニング部位の位置に加えて、欠失突然変異が誘発
されて転移ベクターｐＡａ １０１、ｐＡｃ ３１１
、 ｐＡｃ Ｅ６０ 、 ｐＡｃ ３７３及びｐＡａ
３♂Ｏを構成する点は矢印で示されている。ポリヘトリ
ン遺伝子のｌ’−ＴＡＴＡＪ及びｒｃＡＡＴＪボックス
はそれらの配列の周シに描かれた長方形により示されて
おり、遺伝子の転写開始部位は、星印で示されている。 第３図は又、ポリヘトリン遺伝子の近くに位置するＥｃ
ｏＲＶ及びＨｉｎｄｍ 制限部位を示す。 第≠図は、好ましいＩＦＮ−β遺伝子を転移ベクターｐ
Ａｃ ３１０にクローニングして組換え発現ベクターｐ
Ａｃ ３１０− Ｉ ＦＮ −βを構成する概略図を示
す。第り図は又、ＩＦＮ−β遺伝子を含有する出発物質
プラスミドｐ ＢＲ／Ｊも示す。プラスミドｐ７７０は
、ｐＵＣ♂に対する配列及び合成オクタヌクＶオチドＢ
♂ｍＨＩＩＪンヵーが隣接した７ｔ７塩基対Ｈｉｎｃ［
断片に対する配列をも含有する。この７６７塩基対断片
はＩＦＮ−βに対する全コード配列を含有する。 第５図は、組換え発現ベクターｐＡｃ ３♂０−ＩＦＮ
−βの培養スボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕＨｉｐｅｒｄａ ）細胞内におけるバ
キ、ロウィルスによるトランスフェクゾ四ン及びそれに
引続く、培養Ｓ、フルギベルダ細胞のプラーク−精製組
換えバキュロウィルスによる感染の概略図を示す。 第６図は、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ ＶゲノムのＥｃｏＲＴ
ＫＧ 片のＢａｍＨＩクローニング部位に挿入された
ＩＦＮ−β遺伝子を有する組換え転移ベクターｐＡｃ
３１０−ＩＦＮ−βを示す。ポリへドリンブロモーター
配列はベタ焦で示され、ＥｃｏＲｌ−Ｉ配列はプラスミ
ドｐＵＣＩ中に組込まれたものとして示されている。 出願人代理人 猪 股 清 ・二・撃ト・１へ７Ｆ−ｓ（１）徒） （ｐＡｃ３１１１ｐＡｃＭＤ、ｐｋ３８０）１
、プラスミドｐＢＲＪ、２ｊ、及びプラスミドｐＵＣ♂
を用いて開始した転移ベクター、ｐＡｃ１０／の構成の
概略図を示す。 第２図は、プラスミドｐＩ１０．ｐＵｃＩ及び合成りａ
ｍＨＩＩＪンカーを用（八て開始した変成転移ベクター
ｐＡｃｊ／へｐＡｃ３ＡＯ，ｐＡｃ３７３及びｐＡｃｊ
Ｊ’Ｏを構成するための概略図を示し、図中「ライブラ
リー」という用語は、ポリヘトリン遺伝子における各可
能性のある位置において欠失突然変異を開発することに
より構成することのできる変成 ＢＺＢａｌプラスミド
のライブラリーを表わす。プラスミドｐＢ’ Ｂ＋１
／／ 、 ｐＢ’ Ｂａｌ ＡＯｌｐ Ｂ’ Ｂａｌ
７ｊ及びｐＢ’ Ｂａｌ １０を次いでこの突然変異プ
ラスミドのライブラリーから選択して更に転移ベクター
ｐＡｃＪ／／ 、 ｐＡｃ ３６０ 、ｐＡｃ ３７３
及びｐＡｃ ３１０に変成した。 第３図は、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ Ｖのポリヘトリン遺伝
子の部分的ヌクＶオチド配列及びその遺伝子のすぐ上流
の配列を概略的に示すものである。特徴的なりａｍＨｉ
クローニング部位の位置に加えて、欠失突然変異が誘発
されて転移ベクターｐＡａ １０１、ｐＡｃ ３１１
、 ｐＡｃ Ｅ６０ 、 ｐＡｃ ３７３及びｐＡａ
３♂Ｏを構成する点は矢印で示されている。ポリヘトリ
ン遺伝子のｌ’−ＴＡＴＡＪ及びｒｃＡＡＴＪボックス
はそれらの配列の周シに描かれた長方形により示されて
おり、遺伝子の転写開始部位は、星印で示されている。 第３図は又、ポリヘトリン遺伝子の近くに位置するＥｃ
ｏＲＶ及びＨｉｎｄｍ 制限部位を示す。 第≠図は、好ましいＩＦＮ−β遺伝子を転移ベクターｐ
Ａｃ ３１０にクローニングして組換え発現ベクターｐ
Ａｃ ３１０− Ｉ ＦＮ −βを構成する概略図を示
す。第り図は又、ＩＦＮ−β遺伝子を含有する出発物質
プラスミドｐ ＢＲ／Ｊも示す。プラスミドｐ７７０は
、ｐＵＣ♂に対する配列及び合成オクタヌクＶオチドＢ
♂ｍＨＩＩＪンヵーが隣接した７ｔ７塩基対Ｈｉｎｃ［
断片に対する配列をも含有する。この７６７塩基対断片
はＩＦＮ−βに対する全コード配列を含有する。 第５図は、組換え発現ベクターｐＡｃ ３♂０−ＩＦＮ
−βの培養スボドブテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕＨｉｐｅｒｄａ ）細胞内におけるバ
キ、ロウィルスによるトランスフェクゾ四ン及びそれに
引続く、培養Ｓ、フルギベルダ細胞のプラーク−精製組
換えバキュロウィルスによる感染の概略図を示す。 第６図は、Ａ ｃ Ｍ Ｎ Ｐ ＶゲノムのＥｃｏＲＴ
ＫＧ 片のＢａｍＨＩクローニング部位に挿入された
ＩＦＮ−β遺伝子を有する組換え転移ベクターｐＡｃ
３１０−ＩＦＮ−βを示す。ポリへドリンブロモーター
配列はベタ焦で示され、ＥｃｏＲｌ−Ｉ配列はプラスミ
ドｐＵＣＩ中に組込まれたものとして示されている。 出願人代理人 猪 股 清 ・二・撃ト・１へ７Ｆ−ｓ（１）徒） （ｐＡｃ３１１１ｐＡｃＭＤ、ｐｋ３８０）１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、宿主昆虫細胞内において、成る選ばれた遺伝子或い
はその一部を発現することのできる組換えバキュロウィ
ルス発現ベクターの製法であって、（１１） バキーロ
ウィルスＤＮＡを切断して、ハキーロウィルス遺伝子或
いはその一部を含むＤＮＡ断片を生成し、 （ｂ） 該ＤＮＡ断片をクローニンググイ−クル中に挿
入し、その後少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはそ
の一部をこのように変成されたクローニンググイ−クル
中に該選ばれた遺伝子或いはその一部が該バキーロウィ
ルス遺伝子のプロモーター或いはそれ自身のプロモータ
ーの転写制御下におかれるように挿入することにより組
換え転移ベクターを調製し、 （ｃ）該組換え転移ベクターを組換えを起こすようにバ
キュロウィルスＤＮＡと接触させることによυ組換え及
び弁組換えバキーロウィルスの混合物を生成し、及び （ｄ） 組換えバキーロウィルス発現ベクターを該混合
物から単離することを特徴とする方法。 １２選ばれた遺伝子或いはその一部が少なくとも一部の
バキーロウィルス遺伝子の代シにクローニンググイ−ク
ル中に挿入される特許請求の範囲第７項記載の方法。 ３、バキーロウィルス遺伝子がポリへドリンプロモータ
ーを含むポリヘトリン遺伝子或いはその一部である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 μ３選ばれた遺伝子或いはその一部がポリヘトリンの合
成をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部の代υにク
ローニンググイ−クル中に挿入される特許請求の範囲第
３項記載の方法。 ｊ、バキュロウィルス遺伝子が１０Ｋプロモーターを含
む１０Ｋ遺伝子或いはその一部である特許請求の範囲第
７項記載の方法。 乙、バキ、ロウィルスがオートグラシア・カリフォルニ
カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｌｌｅａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
）、トリコブルシア・＝ （Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓ
ｊａ ｏｕ ）或いはガレリアｅメロネラ（Ｇａ１ｌｅ
ｒｔａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ）である特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ７、 バキーロウィルスがオートグラファ譬カリフォル
ニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃｌＩｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ ）である時へ午請求の範囲第１項記載の方法。 ｒ、 少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはそノ一部
ヲバキーロウィルスゲノム中に導入して有する組換え転
移ベクターの製法であ−て、（＋１） バキーロウィル
スＤＮＡを切断してバキュロウィルス遺伝子或いはその
一部を含むＤＮＡ断片を生成し、 （ｂ） 該ＤＮＡ断片をバキュロウィルス遺伝子転移ベ
クターを生成するようにクローニンググイ−クル中に挿
入し、及び （Ｃ） 少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはその一
部を該パキーロウィルス遺伝子転移ベクター中に該遺伝
子或いはその一部が該ノ；キーロウイルスのプロモータ
ー或いはそれ自身のプロモーターの転写ｆｔｉ制御下に
おかれるように挿入する、ことを特徴とする方法。 り０選ばれた遺伝子或いはその一部が少なくとも一部の
バキュロウィルス遺伝子の代りにクローニ／グヴイーク
ル中に挿入される特許請求の範囲第２項記載の方法。 ／久 バキュロウィルス遺伝子がポリへドリンプロモー
ターを含むポリヘトリン遺伝子或いはその一部である特
許請求の範囲第２項記載の方法。 ／／、選ばれた遺伝子或いはその一部がポリヘトリンの
合成をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部の代りに
クローニンググイ−クル中に挿入される特許請求の範囲
第７０項記載の方法。 ／２． バキュロウィルス遺伝子が１０Ｋプロモーター
を含む１０Ｋ遺伝子或いはその一部である特許請求の範
囲第ｒ項記載の方法。 ／３． バキュロウィルスがオートグラシア・カリフォ
ルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ ） 、 ）す１プルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕ
ｓｉａ ｎｉ ）、ラキプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐ
ｌｕｓｉａ ｏｕ ）或いはガレリア嘗メロネラ（Ｇａ
１ｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ）である特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ｌ≠、バキュロウィルスがオートグラファ囃カリフオル
ニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
）である特許請求の範囲第２項記載の方法。 ｌ！、バキュロウィルスＤＮＡの遺伝子操作の中間ヴイ
ークルとして利用可能なバキーロウイルス転移ベクター
の製法であ−て、 パキ＝−ロウィルスＤＮＡを切断して少なくとも１つの
プロモーターを含有するＤＮＡ断片を生成し、該ＤＮＡ
断片を、選ばれた遺伝子或いはその一部をクローニング
するための少なくとも７個の利用可能な部位を有する変
成りローニングヴイークルを生成するようにクローニン
ググイ−クル中に導入し、該利用ｏＪ能なりローニング
部位が該選ばれた遺伝子或いはその一部が該利用なりロ
ー二／グ部位に挿入された際に、該プロモーターの転写
制御下におかれるような位置にある ことを特徴とする方法。 ＩＡ、バキュロウィルス遺伝子がポリへドリンプロモー
ターを含むポリヘトリン遺伝子或いはその一部である特
許請求の範囲第１３項記載の方法。 １７、バキュロウィルス遺伝子が１０Ｋプロモーターを
含む１０Ｋ遺伝子或いはその一部である特許請求の範囲
第１ｊ項記載の方法。 ＩＩ、パキーロウィルスカ、オートグラファ書カリフォ
ルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｔｆｏｒｎｔｃ
ａ ）、トリコブルシアー二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉ
ｇ ｎｉ ）、ラキプルシアＯオウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕ
ｓｉａ ｏｕ ）或いはガレリア・メロネラ（Ｇ５１ｌ
ｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ ）である特許請求の
範囲第ｉｓ項記載の方法。 ｌり、バキュロウづルスがオートグラシア・カリフォル
ニカ（Ａｕｔｏｇｒｇｐｂａ ｃａｌｌｆｏｒｎｌｅａ
）である特許請求の範囲第１３項記載の方法。 コＯ２感染しやすい宿主昆虫細胞を組換えノ（キーロウ
ィルス発現ベクターによシ感染させることよりなる、成
る選ばれたポリペプチドの合成方法において、該発現ベ
クターが少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはその一
部を含む組換えバキュロウィルスゲノムであシ、該選ば
れた遺伝子或いはその一部がバキュロウィルスプロモル
タ−或イハそれ自身のプロモーターの転写ｉｆｉ制御下
におかれていることを特徴とする方法。 、２ノ、バキーロウィルスプロモーターがポリへドリン
ブロモ〜ターである特許請求の範囲第２０項記載の方法
。 、２．２． バキュロウィルスプロモーターが１０Ｋプ
ロモーターである特許請求のｉｉ・ｊ）囲第コＯ項記載
の方法。 、２３．ある選ばれた遺伝子或いはその一部を宿主昆虫
細胞中で発現することのできる組換えバキーロウィルス
発現ベクターであって、該発現ベクターは少なくとも１
つの選ばれた遺伝子或いはその一部を含んでなるバキュ
ロウィルスゲノムで、１、該選ばれた遺伝子或いはその
一部がバキュロウィルスプロモーター或いはそれ自身の
プロモーターの転写制御下におかれていることを特徴と
する組換エバキーロウィルス発現ベクター。 Ｊ、バキーロウィルスプロモーターカポリへドリンプロ
モーターである特許請求の範囲第５項記載の組換えバキ
ーロウィルス発現ベクター。 Ｊ、バキュロウィルスプロモーターがｌｏＫプロモータ
ーである特許請求の範囲第５項記載の絹換えバキーσウ
ィルス発現ベクター。 、２６．ある選ばれた遺伝子或いはその一部をバキュロ
ウィルスゲノム中に導入することのできる組換え転移ベ
クターであって、バキュロウィルス遺伝子及び該バキュ
ロウィルス遺伝子に少なくとも１つの選ばれた遺伝子或
いはその一部が該バキュロウィルス遺伝子のプロモータ
ー或いはそれ自身のプロモーターの転写制御下におかれ
るように結合された該遺伝子或いはその一部を含むＤＮ
Ａ配列を有するクロ〜ニングヴイークルを含んでなるこ
とを特徴とする組換え転移ベクター。 λ７ｏ バキュロウィルスプロモーターがポリへドリン
プロモータ〜である特許請求の範囲第５項記載の組換え
転移ベクター。 ｄ、バキュロウィルスプロモーターがｌｏＫプロモータ
ーである特許請求の範囲第、２６項記載の組換え転移ベ
クター。 ２り、バキ、Ｌロウィルスの遺伝子操作のための中間ヴ
イークルとして利用可能なバキ＝、ロウィルス転移ベク
ターであつて、バキーロウィルス転移ベクターがバキュ
ロウィルスプロモーター遺伝子及びある選ばれた遺伝子
或いはその一部をクローニングするための少なくとも１
個の利用可能な部位を含んでなり、該利用可能なりロー
ニング部位が、該選ばれた遺伝子或いはその一部が該利
用可能なりローニング部位に挿入された際にバキュロウ
ィルスプロモーターの転写制御下にあるように位置付け
られていることを特徴とするバキーロウィルス転移ベク
ター。 ３０、バキーロウィルスプロモーターカポリへドリンプ
ロモーターである特許請求の範囲第、２９項記載のバキ
ーロウィルス転移ベクター。 Ｊ／、ＮＲＲＬ Ｂ−１ｊｌＡ２ｒ或いはＮＲＲＬ Ｂ
−１ｊｔ７７ｆｆ と称される特許請求の範囲第一２９
項記載のバキーロウィルス転移ベクター。 ３λ６ バキュロウィルスプロモーターが１０Ｋプロモ
ーターである特許請求の範囲第２ｑ項記載のバキーロウ
ィルス転移ベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/498,858 US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1983-05-27 | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US60969784A | 1984-05-16 | 1984-05-16 | |
| US609697 | 1984-05-16 | ||
| US498858 | 1984-05-16 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6097988A Division JP2644447B2 (ja) | 1983-05-27 | 1994-04-12 | ポリペプチドの合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6037988A true JPS6037988A (ja) | 1985-02-27 |
| JPH0779700B2 JPH0779700B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=27052974
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59108279A Expired - Lifetime JPH0779700B2 (ja) | 1983-05-27 | 1984-05-28 | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
| JP6097988A Expired - Lifetime JP2644447B2 (ja) | 1983-05-27 | 1994-04-12 | ポリペプチドの合成方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6097988A Expired - Lifetime JP2644447B2 (ja) | 1983-05-27 | 1994-04-12 | ポリペプチドの合成方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0127839B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0779700B2 (ja) |
| KR (1) | KR910009203B1 (ja) |
| AT (1) | ATE78293T1 (ja) |
| AU (1) | AU581174B2 (ja) |
| BR (1) | BR8402666A (ja) |
| CA (1) | CA1222213A (ja) |
| DE (1) | DE3485810T2 (ja) |
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| ES (1) | ES8507176A1 (ja) |
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| IL (1) | IL71906A (ja) |
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| NO (1) | NO173944C (ja) |
| NZ (1) | NZ208259A (ja) |
| PH (1) | PH25395A (ja) |
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| WO2006137597A1 (ja) | 2005-06-24 | 2006-12-28 | Teijin Pharma Limited | 新規生理物質ｎｅｓｆａｔｉｎとその関連物質、およびそれらの用途 |
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|---|---|---|---|---|
| JPH0795954B2 (ja) * | 1982-11-30 | 1995-10-18 | アメリカ合衆国 | 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法 |
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
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