JPH0779700B2 - 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 - Google Patents

組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法

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JPH0779700B2
JPH0779700B2 JP59108279A JP10827984A JPH0779700B2 JP H0779700 B2 JPH0779700 B2 JP H0779700B2 JP 59108279 A JP59108279 A JP 59108279A JP 10827984 A JP10827984 A JP 10827984A JP H0779700 B2 JPH0779700 B2 JP H0779700B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えウィルス発現ベクターの製法に関する。
より詳しくは、本発明は、バキュロウィルスプロモータ
ーにカップリングさせた、或る選ばれた遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノム中に導入し、昆虫細胞内でその選ばれ
た遺伝子を発現することのできる組換えバキュロウィル
ス発現ベクターを製造する方法に関する。
組換えDNA技術における最近の進歩は特別の遺伝子或い
はその部分の単離並びにそれらの細菌、酵素、植物或い
は動物細胞並びにこれらの生物体に感染するウィルスへ
の転移を容易にした。転移された遺伝子物質（即ち、変
成遺伝子）は複製され、形質転換された細胞或いはウィ
ルス複製として遺伝される。その結果、形質転換細胞は
転移された遺伝子配列がコード（encode）する生成物を
産生する能力を獲得する。
ウィルス、真核生物及び原核生物の間の遺伝子或いはそ
の部分の転移及び発現は、全ての生物のDNAがそれが同
一の４つのヌクレオチドで構成されているという点にお
いて化学的に類似しているので可能である。基本的相違
は、生物のゲノムに表われるヌクレオチドの配列にあ
る。コドン（ヌクレオチド トリプレット）に配列され
た特定のヌクレオチド配列は、特定のアミノ酸配列をコ
ードする。しかしながら、アミノ酸配列とDNAヌクレオ
チド配列間のコード（暗号づけ）関係は全ての生物体に
対して本質的に同一である。
ゲノムDNAは、蛋白質コード配列（即ち、「構造遺伝
子」）及び構造遺伝子の発現を仲介する調節領域（転写
開始を制御するDNA配列は通常「プロモーター」と称さ
れる）とに組織されている。一般的に、酵素RNAポリメ
ラーゼがプロモーターにより、それが構造遺伝子に沿っ
て移動するに際して、それがコードされた情報をメッセ
ンジャーリボ核酸（mRNA）に転写するように活性化され
る。mRNAは認識配列、リボソーム結合に対する信号及び
翻訳開始及び終止に対する信号を含む。遺伝子のプロモ
ーター領域（通常、遺伝子の５′側面隣接領域（flanki
ng region）と説明されている）における重要な転写信
号の役割の遺伝子的分析の最近の進歩は、DNA配列を選
択的に除去或いは変更してそれらの発現における機能及
び役割を研究すること及びこれらの配列の幾つかを除去
して、それらの例えば組換えDNA宿主‐ベクター系など
の異種生物学系における機能を研究することを容易に行
うことができるようにした。
真核生物のプロモーターは、通常その配置及び原核生物
プロモーター配列への構造的類似性（Breathnach＆Cham
bon,50 Ann.Rev.Biochem.349−383（1981））が転写の
促進への関与を示唆する２つのヌクレオチドの保存配列
により特徴付けられている。第１のものは、RNA開始部
位（mRNAに対する転写開始部位であるキャップ部位）か
ら20〜30塩基対上流に位置する核酸アデニン及びチミン
に富んだ配列（Goldberg−Hogness、「TATA」或いは「A
TA」ボックス）であり、調和配列（consensus sequenc
e）（５′‐TATAA-ATA-3′）により特徴付けられてい
る。第２の領域は、CCAATボックス（Efstratadis等、21
Cell 653−668（1980））であり、それは幾つかの遺伝
子のキャップ部位から70〜90塩基対上流に位置し、標準
的配列５′‐GG（C/T）CAATCT-3′（Benoist等、8 Nucl
eic Acids Res.127−142（1980））を有する。これらの
配列は、制限エンドヌクレアーゼ酵素及び組換えDNA分
子を産生するクローニングの使用によって、及びクロー
ン化されたヌクレオチド配列のin vitro或いは部位‐特
異的突然変異誘発による制御された除去或いは変更によ
って、除去或いは変成することができる。制限エンドヌ
クレアーゼはDNA分子の部位‐特異的切断に触媒作用を
及ぼすことのできる加水分解酵素である。制限酵素活性
の部位は、ある特別のヌクレオチド配列の存在により決
定され、所定の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部
位と称される。多くの制限酵素が単離され、それらの認
識部位に従って分類されている。幾つかの制限エンドヌ
クレアーゼは同一点における両方のDNA鎖上のホスホ‐
ジエステル結合を加水分解し、プラント末端を生成する
のに対し、その他のものは互に数個のヌクレオチドで隔
てられた結合を加水分解し、各DNA分子の末端に遊離の
一本鎖領域を生成する。これらの一本鎖末端は自己相補
的であり、同一の相補的一本鎖配列を有する加水分解さ
れたDNA或いはもう１つの或いは異種のDNA配列と再結合
するために使用され得る。
制限部位は比較的稀である。しかしながら、制限エンド
ヌクレアーゼの一般的使用は、所望の制限部位配列を含
有する化学的に合成された二本鎖オリゴヌクレオチド類
の利用可能性により極めて改良されてきた。実質的に任
意の天然の、クローン化された遺伝子的に変更された或
いは化学的に合成されたDNAのセグメントを、適当な認
識部位を含むオリゴヌクレオチドをそのDNA分子の末端
に付着させることにより、任意のその他のセグメントに
カップリングさせることができる。この生成物を適当な
制限エンドヌクレアーゼの加水分解作用に付することに
より、DNA分子をカップリングするための必要な相補的
末端を生成することができる。
特異的制限酵素に対する認識部位は、通常、ランダムに
分布している。従って、制限酵素による切断は、隣接コ
ドン間で、１つのコドン内で或いは遺伝子内の幾つかの
ランダム部位において生じ得る。この組立てには多くの
変化が可能であるが、DNA配列をプロモーター領域に関
して適当な位置及び配向で挿入してこれらの配列を発現
させるために技術が利用可能であることに注意すること
が重要である。
潜在的に任意のDNA配列はこの様に外来DNA配列をクロー
ニングヴィークル（vehicle）或いはベクター分子内に
挿入することによりクローン化して、時にはキメラ或い
はハイブリッド遺伝子と称される人工的な組換え分子或
いは複合体を構成することができる。殆んどの目的のた
めには、利用されるクローニングヴィークルは、組換え
分子が細菌、酵母、植物或いは動物細胞内に形質転換に
より入れられた際に複製することができるような無欠陥
のレプリコンを含む二本鎖染色体外性DNA配列である。
普通使用されるクローニングヴィークルは、ウィルス、
及び細菌、酵母、植物及び動物細胞に付随するプラスミ
ドから得られる。
生化学及び組換えDNA技術における最近の進歩は「異種
起源」DNAを含有するクローニングヴィークル或いはベ
クターの構成に導いた。「異種起源」という用語は、通
常細胞によっては産生されないポリペプチドをコードす
るDNAを称する。この異種起源DNAは細胞のゲノム中に組
込まれるか或いは自己複製プラスミド或いはウィルスク
ローニングヴィークルに乗せて形質転換細胞内に維持さ
れうる。これらの形質転換細胞群はその他のベクターへ
の更に操作、変成及び転移のための異種DNAの新たな源
を提供する。外来遺伝子を有するある種のウィルスベク
ターは、形質転換細胞内で複製し、これを溶解する。複
製に際し、外来遺伝子は、その特別の細胞タイプ内にお
いて発現することもあり、発現されないこともある。複
製ウィルスを単離し、更に、追加の細胞を感染するのに
使用することが出来、このようにして更に使用するため
の組換え体の新たな源を提供する。
一度遺伝子或いはその所望部分がクローン化され、及び
或いは所望されたように生化学的に変成されるか或いは
その他の生化学的に変成されるか、またはゲノム遺伝子
がそれらの発現を容易にされるようにして挿入される
と、それらは次いで発現ベクターに転移される。遺伝コ
ードの性質のために、クローン化された或いはハイブリ
ッド遺伝子或いはその部分は、それがコードするアミノ
酸配列の生産を指示する。プロモーター領域と適当な関
係に位置するクローン化遺伝子を用いた発現ベクターを
構成するための一般的技術は、次の文献に記載されてい
る： B.Polisky等、73 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.3900（197
6）;K.Itakura等、198 Science 1056-1063（1977）;L.V
illa-Komaroff等、75 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.3727
−3731（1978）など。
「発現」という用語は次のようにして特徴付けることが
できる。比較的単純な原核生物においてさえも、細胞は
多くの蛋白質を合成する能力を有する。任意の与えられ
た時間において、細胞が合成することが可能である多く
の蛋白質は実際には合成されてはいない。ある遺伝子に
よりコードされる特別のポリペプチドが細胞により合成
されている時、その遺伝子が発現されていると云われ
る。発現されるためには、その特別のポリペプチドをコ
ードするDNA配列は遺伝子の制御領域に関して適当な位
置になければならない。制御領域の機能は、その制御下
にある遺伝子の発現を任意の与えられた時点における細
胞の変化する必要性に対応するようにするものである。
本明細書においては、以下の定義が使用される。
クローニングヴィークルとは、細胞内或いは形質転換に
よる生物体内において複製することのできる無欠陥のレ
プリコンを含む染色体外性の長さの二本鎖DNAである。
一般的に、クローニングヴィークルは、ウィルス或いは
プラスミドより得られ、最も普通には環状DNAの形態を
取る。
遺伝子という用語は、単一蛋白質鎖の伝達及び合成を荷
うDNA配列を指す。
感染という用語は、条件がそれらの複製及び生育に好ま
しい場合の細胞の病原性ウィルス因子による侵略を指
す。
トランスフェクション（transfection）という用語は、
リン酸塩或いはその他の適当な試薬、例えばデキストラ
ンサルフェート、を含有するDNAの溶液に塩化カルシウ
ムの添加時に、DNAの沈澱及び細胞内への摂取により、
精製核酸で細胞を感染させる手法を指す。
遺伝子的に変成された生物体による蛋白質の工業的或い
は実験室的合成に使用するために上記一般的方式及び技
術を利用する多くの宿主‐ベクター系が開発されてき
た。これらの宿主‐ベクター系の多くは米国特許第4,33
8,397号明細書に記載されているような原核生物宿主‐
ベクター系である。更に、A.Miyanohara等、80 Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.1（1983）に記載されるようなＢ型
肝炎表面抗原合成に用いられる系、及びPitzeman等219
Science 620（1983）に記載されるような酵母内におけ
るヒトインターフェーロンの合成系など、ベクターとし
て酵母を使用する系も利用されている。
目的蛋白質の合成に原核生物宿主‐ベクター系を利用す
る価値は、そのような系に内在するある種の制限により
減少している。例えば、その様な系のmRNA転写或いは蛋
白質生成物は原核生物中においては不安定な場合があ
る。更に、蛋白質が原核生物細胞内において合成される
前に、微生物に導入されたDNA配列は、介在DNA配列、ナ
ンセンス配列、及び活性真核生物蛋白質を含まないポリ
ペプチド配列をコードする初期及び末端配列がないにち
がいない。更に、ある種の真核生物蛋白質は生物学的に
活性となるために合成後に変成（即ち、グリコシル化）
を必要とし、原核生物細胞は一般的にこの様な変成を行
う能力がない。
酵母或いは原核生物宿‐ベクター系に更に伴う制限は、
合成された遺伝子生物の細胞内からの回収の困難性であ
る。米国特許第4,336,336号明細書は特に遺伝子生成物
の回収の問題に向けられたものであり、遺伝的に変成さ
れた細菌による蛋白質の合成及び分泌の方法を提供する
ものである。
真核生物宿主‐ベクター系におけるウィルスの使用は最
近の研究及び考察の相当量の主題を占めるものであっ
た。しかしながら、ウィルスベクター系も又それらの有
用性を減少する相当な不利益及び制限を有するものであ
る。例えば、多くの真核生物ウィルスベクターは哺乳動
物系において腫瘍発生或いは腫瘍形成性であり、それに
より、遺伝子生成物の発生及び偶発的な感染を伴う深刻
な健康及び安全問題についての潜在的可能性を形成し得
るものである。更に、幾つかの真核生物宿主‐ウィルス
ベクター系においては、遺伝子生成物それ自体が抗ウィ
ルス活性を示し、それにより、その蛋白質の産生を減少
させる。その様な例としてD.Gheysen及びW.Fiers、1J.M
olec.Applied Genet.385−394（1982）により記載され
ている真核生物宿主‐ウィルスベクター系における僅か
に100単位のインターフェロンが原因となって生じたシ
ミアンウィルス40の産生における80％の減少が挙げられ
る。
真核生物宿主‐ウィルスベクター系の使用に内在するも
う１つの問題は、ウィルスの形態により提起されるもの
である。例えば、それらは数少ない制限部位を有するに
すぎないので、外因性DNAを単純なウィルスの適当な箇
所に挿入することはより容易である。しかしながら、真
核生物遺伝子はしばしば大きすぎて単純ウィルスに嵌め
込むことが出来ないことがある。即ち、ウィルスの形態
上の理由により、単純ウィルス内に入れることのできる
外因性DNAの量は制限される。他方、外因性DNAを複雑ウ
ィルスに特定の位置に挿入することはそれらが多くの制
限部位を有するためにより困難である。
本発明は、バキュロウィルス及びバキュロウィルスゲノ
ム中のプロモーターを利用して真核生物宿主‐ベクター
系内にウィルス発現ベクターを生成することにより上記
した制限の多くを克服するものである。より詳しくは、
バキュロウィルスオートグラファ・カルフォルニカ（Au
tographa californica）（AcMNPV）及びそれに関連した
ポリヘドリン プロモータを利用して真核宿主昆虫細胞
内にある選択された遺伝子の極めて高いレベルの発現を
行う能力のある組換えウィルス発現ベクターを生成する
ことが可能であることが見出された。この系の得られた
遺伝子生成物は、細胞培地中に効率的に分泌され得、蛋
白質生成物の採取に伴う殆んどの困難性を緩和するもの
である。更に、又より重要なことに、この系は哺乳動物
において腫瘍形成性或いは腫瘍生成性のものではない。
真核生物宿主‐ウィルスベクター系におけるバキュロウ
ィルスを利用することの理論的な利点は、N.J.Panopoul
os編「植物科学における遺伝子工学（Genetic Engineer
ing in the Plant Science）」（New York,Praeger Pub
lishers,1981 pp.203〜224）のL.K.Millerによる「無脊
椎動物における遺伝子工学のためのウィルスベクター
（A Virus Vector for Genetic Engineering in Invere
brates）」により詳細に論じられている。
その最も広い範囲において、本発明は、ウィルス転移ベ
クター、組換えウィルス転移ベクター及び組換えウィル
ス発現ベクターの製造方法を提供するものである。得ら
れた組換えウィルス発現ベクターは、宿主昆虫細胞内に
おいて選ばれた遺伝子を発現する能力を有する。
本発明に従えば、バキュロウィルス遺伝子を含んでなる
バキュロウィルスDNA或いは該バキュロウィルス遺伝子
のプロモーターを含むその一部を切断して少なくとも該
プロモーターを含有するDNA断片を得る。好ましい方法
においては、適当なバキュロウィルス、例えば好ましく
はバキュロウィルス オートグラファ・カルフォルニカ
（AcMNPV）、のポリヘドリン遺伝子及び側面隣接DNA配
列を含んでなるDNAを先ず単離する。所望DNAを次いで適
当な制限操作により切断する。これにより、その幾つか
がポリヘドリンプロモーター及びポリヘドリン蛋白質或
いはその一部をコードする少なくとも１つのDNA配列を
含んでなるDNA断片を生成する。その様な１つのDNA断片
は、ポリヘドリンプロモーターとポリヘドリン蛋白質を
コードするDNA配列を含んでなるEcoRI-I断片である。
次に、上記DNA断片を適当なクローニングヴィークル、
例えば、プラスミドpUC8中に挿入することにより転移ベ
クターを調製する。従って、ポリヘドリン転移ベクター
と称される好ましい転移ベクターは、ポリヘドリンプロ
モーターと、ある選ばれた遺伝子或いはその一部をクロ
ーニングするために利用可能な部位とを、その選ばれた
遺伝子がポリヘドリンプロモーターの転写制御下にある
ように含有する適当なクローニングヴィークルよりなる
ものである。好ましい転移ベクターは、ポリドリン蛋白
質或いはその一部をコードするDNA配列を含んでも又含
まなくてもよいものである。
組換え転移ベクターは、その後上記転移ベクターの利用
可能なクローニング部位中に選ばれた遺伝子或いはその
部分を挿入することにより調製される。潜在的には、本
発明の転移ベクターには任意の遺伝子或いは複数の遺伝
子をクローン化させ、バキュロウィルスプロモーター配
列とカップリングさせることが出来る。更に、適当な組
換えDNA手法により、上記の好ましい転移ベクターか
ら、ポリヘドリン蛋白質をコードするDNA配列を、得ら
れたクローン化遺伝子生成物が選ばれた蛋白質それ自体
となるように欠失することができる。或いは又、ポリヘ
ドリン蛋白質をコードする配列が欠失されない場合、或
いはポリヘドリン蛋白質をコードする少なくとも１つの
配列が好ましい転移ベクターから欠失されない場合に
は、得られたクローン化された遺伝子生成物は、選ばれ
た蛋白質及びポリヘドリン蛋白質或いはその一部よりな
るハイブリッド、即ち融合蛋白質であるであろう。
組換え発現ベクターを製造するためには、組換え転移ベ
クターを適当なバキュロウィルスDNAと組換えを行うよ
うに接触させることにより所望の遺伝子物質をバキュロ
ウィルスゲノム中に組入れる。組換えを達成する好まし
い手段は、公知のトランスフェクションの方法である。
トランスフェクションの方法は、100％のウィルス中に
おいては起こらないので得られる結果は非組換え体及び
組換え体の混合物である。
宿主昆虫細胞内で選ばれた遺伝子を発現する能力を有す
る組換えバキュロウィルス発現ベクターは、その後、こ
の組換え及び非組換えバキュロウィルスの混合物から適
当なスクリーニング或いは遺伝子選択技術により選択さ
れる。発現ベクターを選択する１つの手段は、ポリヘド
リン遺伝子の挿入不活化により感染細胞の核内にウィル
スの封入体（occlusion）を欠くウィルスを同定及び単
離することにより行われる。
本発明は又上記方法により製造された組換えバキュロウ
ィルス発現ベクターに向けられたものである。その様な
発現ベクターは、ウィルスゲノムに連結され、その中で
安定である少なくとも１つの選ばれた遺伝子或いはその
部分を含有する感染性バキュロウィルスを含んでなるも
のである。昆虫細胞或いは昆虫内における発現ベクター
の複製に際して、選ばれた遺伝子はバキュロウィルスの
転写信号の制御下、或いはそれ自身のプロモーターの制
御下のいずれかにおいて発現され得る。バキュロウィル
ス発現ベクターの１例として、β‐インターフェロンに
対する遺伝子をポリヘドリンプロモーターの転写制御下
にあるような位置にAcMNPVゲノム中に挿入して含有する
組換えAcMNPVウィルスがある。潜在的には、任意のバキ
ュロウィルスプロモーター及び昆虫細胞系統を使用する
ことができる。
本発明は更に上記方法により生成された転移ベクターに
向けられたものである。少なくともポリヘドリンプロモ
ーター配列と、選ばれた遺伝子或いはその一部の挿入の
ために利用可能なクローニング部位とを、選ばれた遺伝
子がポリヘドリンプロモーターの転写制御下にあるよう
に含んでなる好ましいポリヘドリン転移ベクターをバキ
ュロウィルスの遺伝子操作のための中間ヴィークルとし
て使用する。このポリヘドリン転移ベクターはポリヘド
リン蛋白質をコードするDNAの配列を全く含まなくても
或いはその全て或いは一部を含んでもよい。
本発明は更に上記方法で製造された組換え転移ベクター
に向けられるものである。ポリヘドリンプロモーターと
カップリングされた選ばれた遺伝子或いはその一部を含
んでなる本発明の好ましい転移ベクターは、所望の遺伝
情報をバキュロウィルスゲノム中に組込むためのヴィー
クルとして使用される。
本発明は、選ばれた遺伝子の真核生物宿主昆虫細胞内に
おける発現を促進するために宿主‐ベクター系において
バキュロウィルスプロモーターを使用することに基づい
ている。特に、ポリヘドリン蛋白質は、ウィルス感染真
核生物宿主細胞内において最も豊富に合成される蛋白質
の１つであるので、好ましい方法は選ばれた遺伝子がポ
リヘドリンプロモーターとカップリングされるようにこ
の選ばれた遺伝子の適当なバキュロウィルスゲノム中へ
の組込みを含むものである。その様な組換えバキュロウ
ィルスは、選ばれた遺伝子生成物の合成のための有効な
機構を提供するものである。従って、本発明は、宿主昆
虫細胞から合成され且つ効率的に分泌される極めて高い
レベルの目的遺伝子生成物、例えばβ‐インターフェロ
ン、として有意義な有用性を有するものである。
本発明の実施に際して使用されるバキュロウィルスはオ
ートグラファ・カルフォルニカ（AcMNPV）である。この
バキュロウィルスは下記の如く特徴付けられる。
その自然の感染性形態において、AcMNPVは通常ウィルス
封入体（occlusion）中に見出される。これらのウィル
ス封入体は、通常、ポリヘドリン蛋白質サブユニットの
構造配列を含むバラ結晶蛋白質マトリックス内に包埋さ
れた数個のウィルス粒子を含有する。封入体は適当な宿
主昆虫により摂取され、それが腸の内腔に到達するとア
ルカリ性状態が封入体の解離を引起こし、ウィルスを放
出する。
ウィルスは腸壁の細胞を侵し、それらの細胞の核に移動
し、複製を行う。これらの細胞内において２つの感染形
態、即ち細胞外すなわち非封入ウィルス形態、及び封入
ウィルスがこれらの細胞において生成される。細胞外ウ
ィルスは細胞の表面から芽を出し、その他の細胞を感染
する。感染後約12時間後に細胞外ウィルス発芽における
減少、ポリヘドリン合成の開始及び封入ウィルス粒子の
増大した産生が生ずる。極めて多量の封入体が感染細胞
及び組織中に産生され、最終的に昆虫を溶解する。この
ウィルスの封入形態はその他の昆虫への感染の広がりの
原因となるものである。
細胞培養培地内において容易に培養することのできる細
胞外ウィルスが本発明の例示方法において使用される。
細胞外ウィルス及び封入ウィルスは同一のゲノムを有す
るが異った表現型特性を示す。
これらの封入体の主たる構造成分であるポリヘドリンは
ぼぼ29,000の分子量の蛋白質である。AcMNPVゲノムの特
性付けは、AcMNPVポリヘドリンの遺伝子は、DNA制限地
図の０ポイントから約4000塩基対下流のEcoRI-I断片に
おける約1200の塩基対の隣接DNA配列まで認められるこ
とを示している（G.E.Smith、J.M.Vlak及びM.D.Summer
s、45 J.Virol.215−225（1983）参照）。全AcMNPVゲノ
ムの地図（遺伝子地図）はJ.M.Vlak及びG.E.Smith、4
J.Virol.1118−1121（1982）に示されており、ポリヘド
リン遺伝子のDNA配列はHooft van Iddekinge、G.E.Smit
h及びM.D.Summers、131 Virology 561−565（1983）に
示されている。
ポリヘドリン蛋白質の構造及び機能はそれが公知の最も
高度に発現された真核生物遺伝子の１つであるので、相
当に興味深いものである。AcMNPVで感染されたスポドプ
テラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に
おいて、ポリヘドリンはそれが感染細胞中の全蛋白質の
50％以上を形成し、感染細胞ｌ当り0.2gを越えるポリヘ
ドリン蛋白質が生成されるような高割合に蓄積される。
この遺伝子は次の理由により又興味深いものである：
（１）AcMNPVのポリヘドリン遺伝子はバキュロウィルス
中に高度に保存されているDNA配列を含有すること、
（２）ゲノムのこの領域において密接に関連した株間の
組換えが高い頻度で起こり、組換え子孫におけるポリヘ
ドリン遺伝子の分離及び発現を可能にする、及び（３）
遺伝子の発現が宿主、組織、及び細胞系統依存性である
こと、である。
遺伝子工学者の観点からは、ポリヘドリン遺伝子はウィ
ルスがそれなしでも細胞培養液中で複製が可能なので不
必要である。この遺伝子の発現の高い割合及びそれがウ
ィルス複製に必須ではないという事実のために、ポリヘ
ドリンプロモーター及びAcMNPVの遺伝子を組換え遺伝子
の発現のための系の一部として使用することの可能性が
相当な考察の源泉となっていた（E.B.Carstens、S.T.Tj
ia及びW.Doerfler、99 Virolgy 386−398（1979）;P.Do
bos及びM.A.Cochran、103 Virology 446−464（1980）;
H.A.Wood、102 Virology 21−27（1980）;J.E.Maruniak
及びM.D.Summers、109 Virology 25−34（1981）;L.K.M
iller、“A Virus Vector for Genetic Engineering in
Invertebrates"〔N.J.Panopoulos編Genetic Engineeri
ng in the Plant Science（New York,Praeger Publishe
rs,1981 pp.203〜224）中に掲載〕、及びL.K.Miller等2
19 Science 715−721（1983）;G.E.Smith、M.J.Fraser
及びM.D.Summers,J.Virol、584−593（1983）参照）。
しかしながら、本発明の前にはだれもその様な系を開発
することができなかった。
本出願人等による実験は、もう１つの遺伝子生成物、10
Kも又ポリヘドリンに匹敵する高レベルで発現されるこ
とを示している（G.E.Smith,J.M.Vlak及びM.D.Summers,
45 J.Virol 215−225（1983）参照）。この生成される1
0K蛋白質は非構造的のようであり、感染の後期において
多量に産生される。10K AcMNPV蛋白質遺伝子の位置はHi
nd III断片Ｐ及びＱに認められている。ポリヘドリンプ
ロモーター及び構造遺伝子と同様にこのプロモーター
は、組換え遺伝子の発現のためのAcMNPVを使用する系の
一部としてのその有利な用途しての考察の対象であっ
た。しかしながら、本発明までにこのプロモーターのそ
の様な有利な用途を可能にするような系は開発されてい
なかった。
本発明の例示方法に従えば、AcMNPVの特別の株、M3或い
はE2が利用される。しかしながら、当業者には、その他
のバキュロウィルス及びその他のバキュロウィルス株が
組換えバキュロウィルス転移及び発現ベクターの製造に
適当であることが明らかであろう。特に、密接に関連
し、天然に存在するバキュロウィルス株トリコプルシア
・ニ（Tricho-plusia ni）MNPV、ラキプルシア・オウ
（Rachiplusia ou）MNPV、ガレリア・メロネラ（Galler
ia mellonella）MNPV及び任意のプラーク精製株、例え
ば本実験室において特性付けられ、G.E.Smith及びM.D.S
ummers,30 J.Virol.828-838（1979）及びG.E.Smith及び
M.D.Summers,33 J.Virol.311-319（1980）により説明さ
れているAcMNPVのE2、R9、S1及びS3株などを有利に使用
することができる。これら及びその他の株についての説
明は、更にG.E.Smith及びM.D.Summers,89 Virology 517
-527（1978）に記載されている。
本発明の方法に従えば、有利に利用されるのはポリヘド
リン構造遺伝子及びプロモーターである。この遺伝子は
S1ヌクレアーゼ実験により認められている。ポリヘドリ
ンコード領域の５′末端のヌクレオチド配列及び転写開
始から200塩基上流が第３図に示されている。第３図に
示された部位は、ポリヘドリンmRNAに対して最も頻繁に
使用される転写開始部位である。
ATG翻訳開始信号（Ａ残基割当て位置＋１を有する）は
転写開始部位からほぼ58塩基目に起こり、その後引続き
内部オープン読取りが255におけるHind IIIの部位まで
及びこれを含んで行われる。多くの真核生物構造遺伝子
において同様の位置に見られる「TATA」及び「CAAT」ボ
ックスはそれぞれ転写開始部位から上流の25及び35番目
の塩基間及び60及び70番目の塩基間の間に位置してい
る。転写開始部位から78塩基上流及び90塩基上流の中心
には直接繰返し配列「CACAAACT」がある。更にAcMNPVポ
リヘドリン遺伝子は翻訳開始コドンに先立ち58塩基の非
翻訳リーダー配列を有し、且つAcMNPVポリヘドリンmRNA
についての適当な実験操作により示唆される如く、何等
の介在配列も存在しない。上記Smith、Vlak及びSummers
の文献、及びG.F.Rohrman等、121 Virology 51−60（19
82）参照。
本発明の実施に当り、ポリヘドリン遺伝子を有するDNA
をバキュロウィルスAcMNPVから単離し、精製する。当業
者には、この遺伝子はポリヘドリン遺伝子を有する任意
のバキュロウィルス、特に上記関連性のある株から単離
され得ることが判るであろう。
所望のDNAを次いで適当な制限操作によりEcoRI制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、ポリヘドリン遺伝子を含む7.
3キロベースEcoRI-I断片或いはその他の適当な断片を生
成する。
上記EcoRI-I断片はその後適当なクローニングヴィーク
ルのEcoRI部位にクローン化し、転移ベクターを生成す
る。AcMNPVゲノムは、選ばれた遺伝子を効果的に部位‐
特異的に導入することができる知られた独特の制限部位
を有していないのでキメラプラスミドベクター（転移ベ
クター）を構成して遺伝子転移のための中間ヴィークル
としての役割を果す必要がある。従って、選ばれた遺伝
子をポリヘドリンプロモーター配列に隣接するウィルス
ゲノム中に導入するために、ポリヘドリン遺伝子を含ん
でなり、ポリヘドリン転移ベクターと称される転移ベク
ターが構成され、クローニング部位は、その部位に適当
に挿入される遺伝子がポリヘドリンプロモーターの制御
下にあるように配置され、隣接ウィルスDNAはポリヘド
リン遺伝子のいずれかの側に連結されている。この転移
ベクターの構成を第１図及び第２図に概略的に示す。更
に隣接ウィルスDNAの存在が、野性タイプのバキュロウ
ィルスとの組換えを容易にし、選ばれた遺伝子の複製ウ
ィルスゲノム中への転移を可能にしていることに注意す
べきである。
従って、上記EcoRI-I断片は、それぞれプラスミドpBR32
5及びpUC8中にクローン化及びサブクローン化される。E
coRI-I断片中の２つのBamHI制限部位は、その後、ポリ
ヘドリン遺伝子の翻訳開始部位からほぼ220塩基のポリ
ヘドリンプロモーター配列から下流の３′方向に位置す
る単一BamHIクローニング部位を有するpAc101と称され
るポリヘドリン転移ベクターを産生するように除去され
る（第３図参照）。プラスミドpBR325及びpUC8はポリヘ
ドリン転移ベクターの構成に利用されるプラスミドであ
るが、ポリヘドリン遺伝子及び隣接ウィルスDNAが機能
的に導入される限り、その他の適当なクローニングヴィ
ークルが利用可能であることは当業者には明らかであろ
う。
このポリヘドリン転移ベクターは、その後選ばれた遺伝
子を挿入するために、転写開始部位の近辺、即ちポリヘ
ドリン遺伝子の約−58〜末端までのポリヘドリン合成を
コードする配列の幾つか或いは全てを欠失することによ
り変成することができる（第３図参照）。BamHI制限部
位配列を有する天然或いは合成オリゴヌクレオチドを含
むDNAリンカーを次いで欠失部位に挿入し、DNAセグメン
トのカップリングをその制限部位において行う。転移ベ
クターの変成は第２図に概略的に示されており、ポリヘ
ドリンコード配列を欠失する手段はin vitroの突然変異
誘発によるものである。しかしながら、当業者にはポリ
ヘドリンコード配列の一部或いは全部を欠失するために
代替的な操作方法が利用可能であり、欠失部位に代替的
合成又は天然のオリゴヌクレオチドリンカー配列を挿入
することが可能であり、及び選ばれた遺伝子及びその一
部が組込まれる代替的変成ポリヘドリン転移ベクターを
本発明において適当に利用できることが明らかであろ
う。
本発明の標準的クローニング技術に従えば、選ばれた遺
伝子、例えばヒトβ‐インターフェロン合成をコードす
るIFN-β遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ合成をコードするCAT遺伝子、及びヒトイ
ンターロイキン‐２合成をコードするIL2遺伝子をその
後ポリヘドリン転移ベクターの利用可能な制限部位に挿
入し、組換え転移ベクターを生成する。β‐インターフ
ェロン遺伝子の転移ベクターpAc380中への挿入は第４図
に概略的に示されている。
更に、IFN-β、CAT及びインターロイキン‐２はポリヘ
ドリン転移ベクターにクローニングし、ポリヘドリンプ
ロモーター配列とカップリングさせるための遺伝子の具
体例であるが、本発明或いはその上記代替的形態におい
ては、潜在的に任意の選ばれた遺伝子が利用可能である
ことが認識されるであろう。
組換え転移ベクターの遺伝子であるポリヘドリン‐選択
遺伝子ハイブリッドはその後適当なバキュロウィルス、
例えばバキュロウィルスAcMNPV、のゲノム中に転移さ
れ、宿主昆虫細胞内においてβ‐インターフェロンをコ
ードする遺伝子を発現する能力を有する組換えウィルス
発現ベクターを生成する。ハイブリッド遺伝子の転移は
例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi
perda）などの宿主昆虫細胞内のトランスフェクション
の方法により達成される（J.P.Burand等、101 Virology
286−290（1980）参照）。組換え転移ベクターpAc380-
IFN-βを利用するこの方法は第５図に概略的に図示され
ている。トランスフェクション後のAcMNPV DNAの複製の
際に、ハイブリッド遺伝子は組換え転移ベクターとAcMN
PV DNA間の組換えによりAcMNPV DNAに転移される。従っ
て非組換え及び組換えバキュロウィルスを含んだ混合物
が生成され、その内後者がIFN-β遺伝子を発現する能力
を有するものである。トランスフェクションがハイブリ
ッド遺伝子をバキュロウィルスゲノム中に転移するため
の好ましい方法であるが、当業者にはその他の方法もハ
イブリッド遺伝子をバキュロウィルスゲノム中に挿入す
るために適当であることが理解されるであろう。更に、
ハイブリッド遺伝子の配列と他の株の対応する配列間に
組換えを行わせるに十分な相同性が存在する限りにおい
て、組換えは切換え転移ベクターとその他のバキュロウ
ィルス株との間に達成することもできる。例えば、その
様な組換えは上記株、トリコプルシア・ニ（Trichoplus
ia ni）MNPV、ラキプルシア・オウ（Rachiplusia ou）M
NPV、及びガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）
MNPV並びにAcMNPV株E2、R9、S1及びS3のいずれから単離
された遺伝子との間に生じ得る。又、組換えは相同的配
列を含有しないと思われるゲノムの領域においても生じ
得ることが可能である。これについての機構は理解され
ていない。
AcMNPVゲノム中に導入さた遺伝子であるポリヘドリン‐
選ばれた遺伝子ハイブリッドを含む組換えAcMNPV発現ベ
クターは、その後非組換え及び組換えバキュロウィルス
の混合物から選択される。選択の１つの手段は、ウィル
ス封入体を産生しないウィルス（O-と称される）で感染
された宿主昆虫細胞により形成されたプラークについて
スクリーニングを行うことである。組換えウィルスはポ
リヘドリン遺伝子の挿入不活性化によりウィルス封入体
の産生について欠陥を有しているために、この様にして
選択が容易に行われる。トランスフェクションを行わさ
れた細胞からの子孫ウィルスから産生されたウィルスプ
ラークのうち平均0.5％が仮想的な組換えO-ウィルスか
らのものであろう。従って、O-プラーク‐形成組換えウ
ィルスからのDNAをその後精製し、及び適当な制限酵素
で分析して組換えAcMNPVベクターが選ばれた遺伝子を適
当なEcoRI-I位置に挿入していることを確認する。
上記選択方法は、組換えバキュロウィルス‐選ばれた遺
伝子発現ベクターの選択のための有効且つ便利な手段を
提供するが、しかし、本発明に従えば、その他の選択操
作も又利用可能であることが当業者には明らかであろ
う。真核生物細胞内の外来DNAのin situ検出のための比
較的便利な方法（即ち、標識化DNAプローブを感染され
た動物細胞内に産生されたプラーク中に存在するウィス
ルDNAにハイブリッド化する方法）はVillarreal及びBer
g、196 Science 183−186（1977）、及びHayday等、15
Gene 53−65（1981）に記載されている。
選ばれた遺伝子の発現は、感染しやすい宿主昆虫細胞、
例えばスポドプテラ・フラギペルダ（Spodoptera frugi
perda）などを適当な生育培地中において組換えバキュ
ロウィルス‐選ばれた遺伝子発現ベクターで感染させる
ことにより達成される。AcMNPV発現ベクターは感染性ウ
ィルス粒子の複製及び組立てにより昆虫細胞或いは昆虫
内において増殖させる。これらの感染性AcMNPV発現ベク
ターを使用して適当な昆虫細胞中に選ばれた遺伝子を生
成することが出来、この様にして選ばれたDNA配列の感
染細胞内における効率的な発現が容易に行われる。
感染時に、選ばれた遺伝子のDNA配列に相補的であるAcM
NPV発現ベクター‐特異性mRNAが生成される。このベク
ター‐特異性mRNAは通常感染細胞内で翻訳されて選ばれ
た遺伝子により完全に或いは部分的にコードされる蛋白
質を生成し、及び場合により選ばれた遺伝子生成物はグ
リコシル化、分泌、ホスホリル化或いはその他の後‐翻
訳変成などの工程に付される。
組換えAcMNPV発現ベクターにより生成された遺伝子生成
物が選ばれた蛋白質のみのアミノ酸配列よりなり、AcMN
PVポリヘドリンのアミノ末端から得られた１個以上の追
加のアミノ酸残基を含有するハイブリッド蛋白質である
かどうか、或いは選ばれた蛋白質及びハイブリッド蛋白
質の両生成物が生成されるか否かは、ポリヘドリン転移
ベクターが変成される方法に応じて異る。選ばれた遺伝
子に由来する単一の翻訳開始信号（ATG）のみがハイブ
リッド遺伝子配列中に存在し、且つ選ばれた遺伝子が約
−75〜＋１位間のハイブリッド遺伝子配列内に存在する
ならば、選ばれた蛋白質のみ、例えばβ‐インターフェ
ロン、が生成される（第３図参照）。これに対して、選
ばれた遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターに２つの翻
訳開始部位即ち＋１位におけるポリヘドリンATG信号及
び＋３とポリヘドリンコード配列の末端の間の選ばれた
遺伝子ATG信号があるようにポリヘドリンプロモーター
に融合される場合には、ハイブリッド蛋白質及び選ばれ
た蛋白質の両者が生成される可能性がある。しかしなが
ら、生成される各蛋白質の割合は第２のATG信号の位置
及び選ばれた遺伝子の配列の性質に応じて異る。或いは
又、遺伝子がそれ自身のATG開始信号なしにポリヘドリ
ンプロモーターに融合される場合には、合成ATG或いは
ポリヘドリンATG翻訳開始信号が蛋白質コード配列に選
ばれた遺伝子に対する正しい翻訳読み取り枠を維持する
ように融合されることが要求される。生成される蛋白質
生成物は、ここでも又上記要因に依存する。
転移ベクター及び組換え発現ベクターの寄託 組換えバキュロウィルス発現ベクターAc380-IFN-βはAT
CC（American Type Culture Collection、Maryland州、
Rockville）に1983年５月13日に寄託し、寄託番号ATCC
40071を与えられた。E.coli K-12中の変成ポリヘドリン
転移ベクターpAc380プラスミド及びE.coli K-12中の組
換え転移ベクターpAc380-IFN-βはARCC（Agricutural R
esearch Culture Collection、Illinois州Peoria）に19
83年５月13日に寄託し、寄託番号NRRL B−15428及びNRR
L B−15427をそれぞれ与えられた。変成ポリヘドリン転
移ベクターpAc373はARCCに1984年５月７日に寄託し、寄
託番号NRRL B−15778を与えられた。
出発材料及び方法 プラスミドDNA 以下の具体例で使用されたプラスミドはE.coli中のpBR3
25及びpUC8であり、Maryland州GaithersburgのBethesda
Research Labs.から得られたものであった。
ウィルスDNA 具体例において、ウィルスDNAの出発源として使用され
たAcMNPV、M3株、並びにAcMNPV、E2株及び野性タイプ、
は本実験室においてG.E.Smith、及びM.D.Summers、89Vi
rology517−520（1978）及びG.E.Smith及びM.D.Summer
s、39 J.Virol 125−137（1981）に記載される手法に従
って、単離されたものであった。
IFN-β DNA 具体例において使用されたIFN-β遺伝子を含むDNA断片
は西ドイツ、Braunschweig Stockhein、Gesellschaft f
r Biotechnologische Forschung（GBF）のJohn Calli
ns博士から得られたプラスミドpBR13より単離されたも
のであった。
CAT DNA クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CA
T）遺伝子を含有するDNA断片は、Maryland州、Bethesde
国立癌研究所のBernard Moss及びMark Cochran両博士に
より得られたプラスミドpBR328より単離されたものであ
った。
IL2 DNA ヒトインターロイキン‐２（IL2）をコードする遺伝子
を含有するDNA断片は、New Jersey州、Nutley、Hoffman
LaRoche Research CenterのGrace Ju及びPeter Lomedi
co両博士より得られたプラスミドpIL2-2Bから単離され
たものであった。
細菌細胞 pUC8プラスミドのクローニングのために具体例により使
用されたE.coli JM83はMaryland州、Gaithersburg、のB
ethesda Research Labs.から得られたものであった。
pBR325プラスミドのクローニングのために具体例で使用
されたE.coli RR1はTexas州、Houston、Baylor College
of Medicine、のSavio Woo博士から得られたものであ
った。
酵素 以下の制限エンドヌクレアーゼはMaryland州、Gaithers
burg、Bethesda Research Laboratoriesから得られ、供
給者の推薦事項に従って使用された:EcoRI、XhoI、BamH
I、SmaI、PstI、BstEII、EcoRV、KpnI及びHindIII。以
下の酵素も又Bethesda Research Laboratoriesから得ら
れたものであった：仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
（CAP）、DNAリガーゼ、Ba131エキソヌクレアーゼ、S1
ヌクレアーゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ。
方法 具体例において示されたクローニング操作に従って用い
られる標準的方法は、T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sa
mbrook、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Col
d Spring Harbor Laboratories,1982年に記載されてい
る。この参考文献は次の標準的方法の操作を含むもので
ある:E.coliプラスミドを用いるクローニング操作、E.c
oli細胞の形質転換、プラスミドDNA精製、DNAのフェノ
ール抽出、DNAのエタノール沈澱、アガロースゲル電気
泳動、アガロースゲルからのDNA断片の精製、及び制限
エンドヌクレアーゼ及びその他のDNA-変成酵素反応。全
ての場合において、DNAはフェノール抽出の後エタノー
ル沈澱を行って精製された。
具体例において使用されたウィルスストックは、TNM−F
H培地（W.F.Hink 226 Nature（London）466−467（197
0）参照）＋10％ウシ胎児血清を用いてスポドプテラ
フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（IPLB−S
f21-AE）中において調製され、滴定した。ウィルス及び
細胞の培養方法はL.E.Volkman及びM.D.Summers 19 J.Vi
rol.820−832（1975年）、及びL.E.Volkman、M.D.Summe
rs及びC.H.Hsieh 19 J.Virol.820−832（1976年）に説
明されている。ウィルス生長速度論はS.フルギペルダ及
び1.5％アガロース重層を用いて上記Valkman等の方法に
より決定した。
例Ｉ ポリヘドリン転移ベクターの構成 本発明によるポリヘドリン転移ベクターを構成するため
に、AcMNPVポリヘドリン遺伝子を含むDNA断片をプラス
ミドpUC8のEcoRI部位中にクローン化した。これは、M3
（G.E.Smith及びM.D.Summers,89 Virology 517−527（1
978））と称されるAcMNPVのプラーク‐精製株をウィル
スDNA源として使用することにより達成された。AcMNPV
DNAは上記参考文献においてスミス（Smith）及びサマー
ズ（Summers）により説明されているように、ウィルス
から抽出し、塩化セシウム密度勾配における平衡遠心分
離により精製した。AcMNPV DNAはEcoRI制限エンドヌク
レアーゼにより完全に消化した。得られたAcMNPV EcoRI
-I断片を先ずpBR325中にクローン化してpI10を形成し、
次いで標準的クローニング操作法を用いてpUC8中にサブ
クローン化してpI8を形成した（第１図参照）。
この組換えプラスミドpI8は３個のBamHI認識部位を有す
る（第１図参照）:1つは位置4210におけるポリヘドリン
遺伝子中に、１つは7300におけるpUC8において、及び１
つは位置6160におけるEcoRI-I断片におけるものであ
る。6160及び7300における部位は、所望の遺伝子、例え
ばCAT、IL2或いはIFN-β遺伝子、がポリヘドリンプロモ
ーターに隣接した所望の位置（位置4210）におけるpI8
中に便利にクローン化されるようにpI8から除去され
る。
ポリヘドリン遺伝子中に位置していない約7300における
pI8中のpUC8 BamHI制限部位は次のようにして除去され
た:10μｇのpI8をPstI及びSmaIで消化し、このDNAを精
製し、S1ヌクレアーゼ緩衝液（0.03M酢酸ナトリウム、p
H4.4、0.25M NaCl及び0.0045M ZnCl2）プラス500単位の
S1ヌクレアーゼ/ml中に再懸濁させた。この反応混合物
を37℃において15分間インキュベート後、DNAを0.8％ア
ガロースゲル中において電気泳動させた。高分子量線状
DNAをゲルから精製し、E.coli JM83細胞をアンピシリン
耐性（amr）、ガラクトシダーゼ陰性（gal-）に形質転
換するために使用した。pUC8クローニング領域におい
て、PstI、BamHI、SmaI、及びEcoRI部位を有しないプラ
スミドを単離した。このプラスミドをpI8SPSとした（第
１図参照）。
AcMNPV EcoRI−Ｉ（pI8SPSの一部）中の位置6160におけ
るBamHI（G.E.Smith,J.M.Vlak及びM.D.Summers,J.Viro
l.45:215−225）を次のようにして除去した。即ち、10
μｇのpI8SPSを10単位のBamHIと50μｌの緩衝液中で混
合し、37℃でインキュベートした。３、６、12、20及び
30分後に10μｌずつのアリコートを取り、反応は10mMま
でEDTAを添加することにより停止させた。これらのアリ
コートをプールし、0.7％アガロース中において電気泳
動を行った。ゲルから全長の線状DNAを単離し、上記S1
ヌクレアーゼで処理し、次いでT4DNAリガーゼを用いて
環化させた。JM83細胞はamr，gal-に形質転換させ、組
換えプラスミドは位置6160にBamHI制限部位が欠けるも
のと同定された。このプラスミドはポリヘドリン遺伝子
の翻訳開始部位から＋175塩基の位置4210に単一のBamHI
クローニング部位を有し（第３図参照）、従って、
「親」AcMNPVポリヘドリン遺伝子転移ベクターであるpA
c101と命名された（第１図参照）。
例II 転移ベクターの変成 選ばれた遺伝子の挿入のためのポリヘドリン遺伝子にお
ける適当な位置を決定するためにpAc101の他に多くの転
移ベクターを構成した（第２図参照）。これらの転移ベ
クターはポリヘドリンの86アミノ‐末端残基及び５′非
‐翻訳ポリヘドリンmRNA配列をコードする幾つか或いは
全てのDNA配列を除去し、次いで以下の方法により削除
の部位にBamHI認識部位を有するオリゴヌクレオチド合
成DNAリンカーを挿入することにより構成した。
例Ｉと同様にしてpI10からのEcoRI乃至BamHI断片（０〜
4210）をpUC8中にサブクローン化し、得られたプラスミ
ドをpB′と命名した（第２図参照）。この断片は＋175
までのポリヘドリン遺伝子及びポリヘドリン遺伝子に加
えて4000塩基対のAcMNPV DNA配列を含有する。4210位に
おけるBamHI部位の周りの欠失を次のようにしてpB′中
に導入した（第２図）:40μｇのpB′をBamHIで消化し、
DNAを精製し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動を行っ
た。線状DNA断片をゲルから抽出し、0.5単位のBal31エ
キソヌクレアーゼを有する100μｌの緩衝液中において3
0℃で40分間インキュベートした。10μｌずつのアリコ
ートを１、２、５、10、15、20、25、30、35及び40分間
隔で集め、反応は各アリコートに10μｌの0.25M EDTAを
添加することにより停止させた。これらのアリコートを
集め、DNAを精製した。DNAの末端は４単位のE.coli DNA
ポリメラーゼ（Klenow断片）を用いて100μｌの緩衝液
中において23℃で30分間インキュベートさせて修復し
た。DNAを精製し、１μｇのホスホリル化BamHIリンカー
（５′‐pCGG ATCCG-3′）を100μｌ反応混合物中に20
単位のT4 DNAリガーゼと共に添加した。室温で２時間イ
ンキュベーション後、DNAを精製した。
次いで、DNAペレットを100μｌの緩衝液＋20単位のBamH
I中に再懸濁させ、37℃で４時間消化させた。消化DNAを
0.7％アガロース中で電気泳動を行い、ゲルから800塩基
対欠失までのpB′截頭プラスミドを精製した。DNAをT4
DNAリガーゼを用いて環化させ、JM83細胞をamr、gal-に
形質転換するために使用した。得られたクローンはBamH
I認識部位の位置に応じてpB′Bal1、２、３などと称さ
れる突然変異プラスミドの「ライブラリー（LIBRAR
Y）」を構成した。
数個のpB′Bal欠失突然変異プラスミドを選択し、各々
からのXhoI（1900）からBamHIリンカー（4000〜4210
位）までの断片をアガロースゲルから精製した（断片
Ａ）（第２図）。XhoI（1900）からBamHI（4210）まで
の断片をpAc101から除去し、残存配列をアガロースゲル
から精製した（断片Ｂ）（第２図）。断片Ａの各々約0.
1μｇを0.1μｇの断片Ｂと混合し、１単位のT4 DNAリガ
ーゼを有する20μｌの緩衝液中においてインキュベート
させて連結し、次いでJM83細胞をamr、gal-に形質転換
するために使用した。得られたプラスミドは、変成転移
ベクターであり、例えばpB′Bal11に由来する場合にはp
Ac311、pB′Bal60に由来する場合にはpAc360などのよう
に命名した。この様にして、「変成」転移ベクターを構
成し、代表的なものはポリヘドリン遺伝子における＋17
5〜−100位におけるBamHIクローニング部位を有するも
のであった。４つの変成転移ベクター、pAc380、pAc37
3、pAc311及びpAc360におけるBamHI認識部位の位置並び
に親転移ベクターpAc101におけるその位置は第３図に示
されている。
例III ポリヘドリン‐IFN-β遺伝子を含む組換え転移ベクター
の構成 例Ｉ或いは例IIの方法に従って調製された転移ベクター
は、いずれも、利用される特別の変成転移ベクターに応
じて目的遺伝子が各種の位置においてポリヘドリン遺伝
子に結合されている組換え転移ベクターの構成に利用す
ることができる。ヒトβ‐インターフェロン合成をコー
ドするIFN-β遺伝子の上記文献に示される標準的クロー
ニング技術を用いて変成転移ベクターの１つ、pAc380中
への単一BamHIクローニング部位における挿入によりpAc
380-IFN-βと称されるプラスミドを形成する方法が第４
図に概略的に示されている。
IFN-β遺伝子は、ヒトIFN-β（pBR13と称される、H.Hau
ser等参照、297 Nature（London）650−654（1982）及
びG.Gross等、9Nucleic Acids Res.2495−2507（198
1））のゲノムクローンから得られ、且つINF-βに対す
る全蛋白質コード配列、ATG翻訳開始信号前の３個の追
加塩基及びポリアデニル化に対する信号を含む全ての非
‐翻訳３′配列を含有する0.767キロベースHincII断片
として特徴付けられる。IFN-βに対するヌクレオチド配
列及び各種転写及び翻訳信号の位置はR.Derynck等285Na
ture（London）542−547（1980）;G.Gross等、9Nucl.Ac
ids Res.2495−2507（1981）；及びS.Ohno及びT.Tanigu
chi,78 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 3505−3509（1981）な
どに記載されている。
IFN-β遺伝子を含むHincII DNA断片は、挿入がAcMNPVポ
リヘドリンプロモーターに隣接し、ポリヘドリン遺伝子
と５′乃至３′配向であるようにIFN-β遺伝子断片上の
合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてpAc380の利用
可能なBamHI制限部位に挿入される。
ほぼ同様にして、IFN-β遺伝子をその他の変成転移ベク
ターpAc311、pAc360及びpAc373及び親転移ベクターpAc1
01中にクローン化し、各々pAc311-IFN-β、pAc360-IFN-
β、pAc373-IFN-β及びpAc101-IFN-βと称される組換え
転移ベクターを形成した。
潜在的には、その遺伝子或いは任意のその他の選ばれた
遺伝子は、BamHI認識部位或いは転移ベクター内の任意
の位置に挿入された任意のその他の適当な制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位を有する任意の転移ベクター中にク
ローン化することが可能である。更に、例Ｉにおいて略
述した如く、適当な制限エンドヌクレアーゼクローニン
グ部位を、プラスミド中に取り込むことができるAcMNPV
ゲノムの任意の断片における任意の点において誘発する
ことが出来るので、BamHI認識部位を挿入するためにポ
リヘドリン構造配列の一部又は全部を欠失させる必要は
ない。
例IV ポリヘドリン‐IFN-β遺伝子のAcMNPVゲノムへの転移 例IIIの方法により調製された組換え転移ベクターは、
いずれも、AcMNPVのゲノム中にIFN-β遺伝子を転移させ
るために使用して組換えバキュロウィルス発現ベクター
を形成することができる。転移はCa 及びS.フルギペル
ダ（S.frugiperda）のような感染しやすい昆虫宿主細胞
の存在下においてトランスフェクション（transfectio
n）により行われた。
F.L.Graham及びA.J.Van Der Eb、52 Virology 456−467
（1973）に記載されている方法の修正方法を次のように
利用した。AcMNPV（１μｇ）から抽出され精製されたDN
Aを１〜10μｇの組換え転移ベクターDNA、特に組換え転
移ベクターpAc380-IFN-βと混合し、ml当り15μｇの担
体仔ウシ胸腺DNAを有する1-HEPES（N-2-ヒドロキシエチ
ルピペラジン‐Ｎ′‐2-エタンスルホン酸）‐緩衝塩水
（pH7.05）中で950μｌにした。混合物を渦巻き混合機
中で攪拌しながら50mlの2.5M CaCl2を滴下し、沈澱を室
温で30分間形成させた。1mlの沈澱したDNAを感染しやす
い昆虫宿主細胞、この場合にはS.フルギペルダ、に60mm
培養プレート内の2mlの培地内において添加した。４時
間後、細胞単層を培地で洗浄し、10％ウシ胎児血清を含
む2mlの培地中において３日間インキュベートした。得
られた子孫は組換え及び非組換えAcMNPVウィルスの混合
物よりなるものであった。
例Ｖ 組換えAcMNPV発現ベクターの選択 次に、例IVにより得られた非組換え及び組換えバキュロ
ウィルスの混合物からAcMNPV組換え発現ベクターを単離
することが必要であった。この単離がポリヘドリン構造
遺伝子の全て或いは一部が欠失した組換え体において達
成される方法は、（１）ポリヘドリンがこれらのウィル
スにより全く生成されない、及び（２）非‐封入（ポリ
ヘドリンコートに欠ける）ウィルス形態が昆虫細胞培養
液中において生育可能であり、感染性であるという事実
を利用するものである。
ポリヘドリン構造遺伝子の全て或いは一部が欠失した組
換えAcMNPVウィルスにおいて、例えば組換え転移ベクタ
ーpAc101-IFN-β、pAc311-IFN-β、pAc360-IFN-β、pAc
373-IFN-β及びpAc380-IFN-βとのトランスフェクショ
ンから得られた組換え体において、組換えAcMNPVウィル
スは下記の如く単離される。
トランスフェクション後３日目に培地中に存在する外部
細胞ウィスルを、L.E.Volkman、M.D.Summers及びC.H.Hs
ieh、19 J.Virol.820−832（1976）に記載されている標
準的AcMNPVポリヘドリンプラークアッセイにおいて使用
した。発達したプラークは、ウィスル封入体を生成する
非組換えAcMNPVで感染された細胞或いはウィルス封入体
を生成しない組換えAcMNPVウィルスで感染された細胞の
いずれかからの結果であった。後者のタイプのプラーク
（O-プラーク）は当初低倍率双眼顕微鏡の下においてそ
れらの外観により前者（O+プラーク）と識別された。O-
プラークはマークを付し、倒立顕微鏡により検査を行っ
たところ、個々のウィルス封入体が存在する場合には感
染細胞の核内に観察することができた。
O-プラークからのウィルスをプラーク精製し、DNAを適
当な制限酵素で分析し、組換えAcMNPVベクターはEcoRI
−Ｉの適当な位置に外来遺伝子を挿入して有しているこ
とを確認した。ウィルスゲノムにおけるその他の変化は
何等検出されなかった。次いで感染しやすい昆虫細胞に
標準操作を用いて感染させることにより多量の目的組換
えウィルスを得た。
例VI AcMNPV組換え発現ベクターを使用したβ‐インターフェ
ロンの製造 目的遺伝子生成物を製造するためには、組換えバキュロ
ウィルスは感染しやすい宿主昆虫細胞内で感染されなけ
ればならない。組換え転移ベクターpAc101-IFN-β、pAc
311-IFN-β、pAc360-IFN-β、pAc373-IFN-β及びpAc380
-IFN-β（第５図参照）を用いた組換えにより形成され
たAcMNPV発現ベクターの具体例に対して次の操作を利用
した。
感染しやすいS.フラギペルダの宿主細胞を先ず懸濁培養
或いは単層（単分子層）において１〜５×106細胞/ml
（最適発現のための細胞濃度は各AcMNPV発現ベクターに
応じて異る）の密度まで生育させた。生育培地は除去
し、細胞当り0.1〜100（最適濃度は変り得る）のプラー
ク形成単位の組換えウィルス例えばAc380-IFN-β（第５
図）、を含有する培地と23℃において約１時間変換し
た。この接種物は細胞上に残されても或いは除去されて
適量の新しい培地と交換されてもよい。
クローン化されたIFN-β遺伝子からの蛋白質はAc-380-I
FN-β発現ベクターで感染されたS.フルギペルダ細胞内
において感染後約12時間乃至感染後３日生成された。ウ
ィルス蛋白質合成、ウィルス組立て及び細胞溶解を含む
全感染過程は約72時間で完結した。感染後50〜60時間の
間に蛋白質合成に顕著な減少が見られ、細胞溶解は感染
後約50時間において最初に検出された。IFN-β遺伝子の
発現の機構は、宿主細胞の種類及び遺伝子がポリヘドリ
ン遺伝子にクローニングされた部位に応じて異った。
各組換えウィルスに対するIFN-β発現の機構を表１にま
とめて示す。各発現ベクターで感染された細胞内に感染
後48時間までに相当なレベルのインターフェロンが検出
された。検討された発現ベクターの中でAc373-IFN-β及
びAc380-IFN-βは最も高いインターフェロン活性の力価
を生成した（表１）。
インターフェロン活性の細胞内のレベルも又測定され、
表１に示されている。感染後48時間においてAc373-IFN-
β及びAc380-IFN-β感染細胞の内部には全インターフェ
ロン活性の５％未満が留まり、これは、IFN-β分泌信号
が認識され、蛋白質が感染中に培地内に効率よく放出さ
れたことを示している。感染後12時間において、Ac373-
IFN-β及びAc380-IFN-β感染細胞からの培地は約10,000
IU/mlのインターフェロンを有し、感染後42時間までに
ほぼ５×106IU/mlの最大に増大した。
AcMNPV感染細胞中のポリヘドリンの合成は同様な時間的
発現パターンに従うことが知られている。Ac360-IFN-β
中に産生されるインターフェロンの量はより少なく、Ac
311-IFN-βウィルス感染細胞中においては尚少ないが95
％を超える活性が培地中に存在した（表１）。Ac101-IF
N-β感染細胞中には比較的低レベルのインターフェロン
が検出され、その殆んどが細胞内のものであった（表
１）。
組換えウィルス感染細胞の力価は、AcMNPV感染細胞の典
型的なものである培地ml当り３〜８×108プラーク形成
単位の最大値に到達した。この様に、IFN-β遺伝子のポ
リヘドリン遺伝子への挿入はウィルスの複製に何等の大
きな影響を及ぼさないように思われる。これを試験する
ために、２×106個のS.フルギペルダ細胞を、５×106IU
/mlまでのAc380-IFN-β感染細胞培地中に産生されたイ
ンターフェロン或いは５×103IU/mlの国際標準のヒトイ
ンターフェロンで12時間処理し、その後処理細胞を100
プラーク形成単位のAcMNPV或いはAc380-IFN-βで感染さ
せた。細胞のインターフェロンへの曝露は、発達したウ
ィルスプラーク数に測定可能な影響は及ぼさなかった。
水疱性口内炎ウィルス感作されたヒト羊膜WISH細胞にお
けるウィルスプラーク減少アッセイを用いてインターフ
ェロン活性の分析を行った。
ウィルス粒子を遠心分離で除去するとAcMNPV感染細胞か
らの培地中には何等のインターフェロン活性も測定され
なかった。しかしながら、インターフェロンアッセイの
際にAcMNPVウィルス含有培地を使用すると、1000〜3000
国際標準単位（IU）/mlのインターフェロンが生成さ
れ、AcMNPVヴィリオンが明らかにWISH細胞内に内因性イ
ンターフェロンを誘発したことを示した。多くの種類の
エンベロープに封入されたウィルスがヒト細胞において
インターフェロンの産生を誘発することが知られている
ので、これらの結果は予想されたものであった。この影
響を避けるために、以下の全ての試料は試験前に遠心分
離にかけられた。
培地中に存在する血清アルブミン（6mg/ml）及び仔ウシ
血清（10％）（W.F.Hink,226 Nature（London）466−46
7（1970）参照）がAc380-IFN-βで感染されたS.フルギ
ペルダ細胞内におけるIFN-βの発現に必要であるか否か
を決定するために１つの実験を行った。感染後８時間目
に培地を０〜10％のウシ胎児血清を含有するGraceの培
地（非血清アルブミン、T.C.C.Grace,195 Nature（Lond
on）788−789（1962）参照）で交換した。各変成培地に
ついて感染後48時間後にインターフェロン活性の分析を
行った。無血清の場合には、インターフェロン活性に約
10倍の減少があった。0.5％の血清の添加により10％の
血清を含有する対照例におけるのと同一レベルの活性が
産生された。Ac380-IFN-β感染細胞中のIFN-βの特異活
性は0.5％血清を含有するGraceの培地中に産生された際
には約５×106IU/mgの蛋白質であった。精製β‐インタ
ーフェロンの活性を２＋108IU/mlと想定すると（E.Knig
ht,Jr.,73 Proc.Natl.Acad.U.S.A.520−523（1976）参
照）、β‐インターフェロンは培地中の全蛋白質の約１
％を表わすであろう。
更に、Ac373-IFN-β及びAc380-IFN-β感染細胞の培地中
での測定されたインターフェロン活性の分析は17,000
（17K）及び20.5K分子量に２つのポリペプチドを明らか
にした。非グリコシル化及びグリコシル化ヒトIFN-β蛋
白質の大きさは各々17K及び20.5Kポリペプチドに匹敵す
るものであることが報告されている。感染後30時間目に
17KポリペプチドはAc360-IFN-β感染細胞中に作られて
おり、感染後48時間迄に17K及び20.5Kポリペプチドの両
者が検出された。Ac311-IFN-β感染細胞内には17Kポリ
ペプチドのみが感感後30時間目及び48時間目に検出され
た。Ac360-IFN-β感染細胞中には豊富に産生された23.5
K蛋白質が観察された。この大きさは21個のアミノ酸信
号ペプチドプラスポリヘドリン遺伝子の最初の10コドン
由来の追加の14個のアミノ酸及びBamHIリンカー配列を
含む全インターフェロン蛋白質よりなるハイブリッド蛋
白質に対して予想されたものである。
Ac380-IFN-βおよび（少ない程度で）Ac360-IFN-β感染
細胞内で作られた17K及び20.5K蛋白質はヒトIFN-βモノ
クローナル抗体と反応した。（IFN-βモノクローナル抗
体はP.W.Trown及びHoffman La Roche社により提供され
た。）この抗体の17K蛋白質に対する反応性に対比し
て、20.5K蛋白質に対する反応性が減少されていること
が注目された。これは、幾分、20.5Kよりも17Kが細胞中
により高いレベルで蓄積するという事実によるものであ
る。更に、この抗体は例えば20.5Kポリペプチドのグリ
コシル化により部分的にマスクされている17Kポリペプ
チド上のエピトープと反応している可能性がある。
この想像上のハイブリッド23.5K及び32K蛋白質は又IFN-
β抗体と反応した。ポリヘドリンに対するポリクローナ
ル抗体は、DNA配列からハイブリッド蛋白質のN-末端に
存在することが予想される23.5K蛋白質の10個のアミノ
酸及び32K蛋白質の57個のアミノ酸を認識した。
20.5K IFN-βがグリコシル化されていることを示すため
に、Ac380-IFN-β感染細胞を感染の後期において〔3H〕
マンノースで標識した。20.5K IFN-β及び３個の追加の
蛋白質はAc380-IFN-β感染細胞において標識された主た
るマンノース含有グリコ蛋白質であった。
例VII クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子及びAcMNPV組換え転移ベクターの構成 E.coli転置因子Tn9は、抗生物質クロラムフェニコール
に対する耐性を与える酵素クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（CAT）に対する遺伝子を含有す
る。CATの真核生物ベクター内における発現は動物細胞
におけるプロモーターの発現を測定する便利な手段であ
ることが示されている。（M.Mackett、G.Smith及びB.Mo
ss.1984 J.Virol,49:857−864及びそれに示される参考
文献を参照）。AcMNPV-CAT発現ベクターはバキュロウィ
ルスベクター中における外来遺伝子の産生を最適化する
ように設計された実験において有用である。
CAT-コード配列を含有する770塩基対TaqI DNA断片をpBR
328から単離し、pUC 7のAccI部位にクローン化した。こ
のCAT-コード配列をBamHIで切り出し、pAc373中のBamHI
部位に挿入した。得られたプラスミド転移ベクターをpA
c373-CATと称する。
例VIII ヒトインターロイキン‐２遺伝子及びAcMNPV組換え転移
ベクターの構成 ヒトインターロイキン‐２（IL2）は有糸分裂促進剤或
いは抗原により刺戟されたヒトリンパ球内に微量に産生
される。IL-2は当初培養液中のＴリンパ細胞の長期間の
生育を維持することのできる因子であると説明されてい
た（D.A.Morgan、F.W.Ruscetti及びR.Gallo、Science 1
93:1007−1008（1976））。それは、免疫応答の刺戟及
び維持において中心的役割を果たすようであり、ある種
のヒトの病気に介在していたために、複雑なものであっ
た（A.Altman、A.N.Theofilopoulos、R.Weiner、D.H.Ka
tzおよびF.J.Dixon,J.Expl.Med.154:1403−1417（198
1））。大量のIL−２の製造のためにAcMNPV発現ベクタ
ーを使用することは、ヒト免疫系の臨床的診断及び治療
操作を非常に容易にすることが期待される。最近、幾つ
かの実験室は、IL-2の遺伝子の単離及びプラスミドベク
ターを用いた細菌細胞中における生物学的に活性なIL-2
の製造を報告している（Rosenberg等、Science 223:141
2−1415（1984）及びその中の参考文献参照）。
IL2-コード配列を含有する1000塩基対のBamHI断片をpIL
2-2Bから単離し、pAc373及びpAc380のBamHI部位に挿入
した。得られたプラスミド転移ベクターをpAc373-IL2及
びpAc380-IL2と称する。
例IX ポリヘドリン‐IL2及びCAT遺伝子のAcMNPVゲノムへの転
移 ポリヘドリン‐IL2及びCAT遺伝子のAcMNPVゲノム中への
転移及び組換えAcMNPV発現ベクターの選択は、上記例IV
に説明したように行った。pAc373-IL2、pAc380-IL2及び
pAc373-CATから産生したAcMNPV発現ベクターは各々Ac37
3-IL2、Ac380-IL2及びAc373-CATと称する。
例Ｘ AcMNPV発現ベクターを使用するIL2の製造 S.フルギペルダ細胞をAc380-IFN-βについて説明したも
のと同様なAc373-IL2或いはAc380-IL2発現ベクターで感
染させた。感染後48時間目に培地及び感染細胞を集め、
インターロイキンの生物学的活性のレベルをGills等、
J.Immunol.120:2027−2032（1978）により説明されてい
るIL2アッセイを用いて測定した。このアッセイを用い
て、IL2の特異活性は蛋白質mg当り１×108単位と測定さ
れた。両発現ベクター共に高レベルのインターロイキン
活性を産生したが、しかし、Ac373-IL2はAc380-IL2より
もほぼ４倍のインターロイキンを産生した（表２参
照）。インターロイキン活性の約80％は培地内に存在
し、蛋白質が感染中細胞から効率的に分泌されることを
示した。Hoffman-La Roche Research Center-のGrace J
u博士により行われた別の実験においては、S.フルギペ
ルダ細胞をAc373-IL2及びAc380-IL2で感染させ、インタ
ーロイキン活性を培地内において感染後24時間、48時
間、72時間目に測定した。新鮮な培地を24時間及び48時
間目に適用した。実質的に全ての活性は感染後０〜24時
間及び24〜48時間の間に産生された（表２）。IL2の特
異活性から、Ac373-IL2感染細胞のｌ当り少なくとも1mg
のIL2蛋白質が産生され、分泌されたと計算される。
Ac373-IL2及びAc380-IL2感染細胞において合成された蛋
白質の分析を行った。これらのAcMNPV発現ベクターによ
りAcMNPV感染細胞においては作られない２つの蛋白質が
多量に作られた。これらの新蛋白質は約15.5K及び16Kダ
ルトンの大きさのものである。これは、DNA配列から予
想されたインターロイキンの大きさが約15.5Kであると
いう事実（蛋白質のアミノ末端の20個のアミノ酸信号ペ
プチドが除去されたと仮定して）と一致するものであ
る。
例XI AcMNPV発現ベクターを使用するCATの製造 S.フルギペルダ細胞をAc380-IFN-βについて説明したと
同様にしてAc373-CATで感染させ、感染後24時間目にCAT
酵素活性を上記Mackett等に記載された方法で細胞及び
培地中において測定した。未感染細胞或いはAcMNPVで感
染された細胞には検出可能なCAT酵素活性は存在しなか
ったが、しかし、Ac373-CATによっては細胞及び培地の
両者に高レベルの活性が産生された。
Ac373-CAT感染細胞において合成された蛋白質の分析を
行った。この発現ベクターによりAcMNPV感染細胞におい
ては作られなかった27Kダルトンの新しい蛋白質が産生
された。CATの大きさはDNA配列から約27Kであると予測
された。多量の27K蛋白質が感染細胞及び培地の両者に
存在した。ポリアクリルアミドゲル上に観察された蛋白
質の量からAc373-CAT感染細胞のｌ当り約40mgのCAT酵素
が製造されるものと推定される。
本発明及びそれによって提供される利点及び便宜は本発
明の幾つかの好ましい実施態様を説明するにすぎない上
記記載より認められるであろう。本発明の範囲及び精神
から離れることなく、或いはその利点の如何なるものも
害することなく物質、方法及び物質の使用量において多
くの変化をなし得ることが明らかである。更に、上記発
明が、本発明をバキュロウィルスゲノムの幾つかの位置
の任意の位置において、任意の選ばれた遺伝子を挿入す
るために利用することができるという事実を利用するこ
とに基づく用途を有することが認められるであろう。
例えば、ポリヘドリン遺伝子の全て或いは一部が欠失さ
れていない組換えAcMNPVウィルスの単離に操作が利用可
能であるという事実は、本発明を多くの方法において利
用することを可能にするものである。これらの用途はAc
MNPVウィルスの封入形態のポリヘドリン被覆が外部影響
に対して極めて耐性であるという事実を利用するもので
ある。例えば、例IIIで述べた如く、選ばれた遺伝子を
ウィルスゲノム中にポリヘドリン遺伝子内以外の場所
に、特に、選ばれた遺伝子が高いレベルで発現されるよ
うに10Kプロモーターにより制御されるような場所に、
クローン化することが出来る。このAcMNPVウィルスは次
いで単離され、安定な発現ベクターとして利用すること
ができる。
その様な安定な発現ベクターは、将来ある指定された時
に、目的蛋白質の製造に使用する為に、組換えAcMNPVウ
ィルスを適当な宿主細胞及び十分な培地の培養液と共に
１つの実験室から別の実験室に移すことのできる安定な
形態で利用できる。
この発現ベクターは又、特定の宿主昆虫種、或いは広範
囲の感染しやすい宿主昆虫種に毒性を有する蛋白質を産
生する遺伝子を選択し、その遺伝子をAcMNPV発現ベクタ
ー中にクローニングすることにより害虫集団を抑制する
ための系にも使用することが可能である（これらの可能
性はL.K.Miller等、219 Science 715−721（1983）に論
じられている）。組換え発現ベクターは、昆虫が害虫で
ある植物或いは動物に適用することが出来、それが害虫
により上記の如く摂取された場合には封入体は腸の内腔
において解離し、組換えウィルスは腸壁の細胞を侵し、
複製を開始する。
複製の際に、害虫に毒性を有する蛋白質の遺伝子が発現
され、害虫の不能化或いは死がもたらされる。その時間
は、昆虫が野性タイプのAcMNPVウィルスを摂取した場合
より遥かに短く、この場合、昆虫はウィルス感染の程度
に応じて異る時間後に溶解される。これ及びその他の実
験室における実験の示すところによれば、10K蛋白質の
発現は感染後24時間程度の早期に起こり、約48時間目に
高レベルで起こることが判明している。その結果、10K
プロモーターの制御下にAcMNPVゲノム中にクローン化さ
れる目的昆虫毒素をコードする遺伝子は又、そのタイム
スケジュールに従って発現されることが予想される。昆
虫の死或いは不能化はその選ばれた遺伝子の発現の開始
後間もなく起こることが予想され、その結果、昆虫の野
性タイプバキュロウィルスによる感染に対比して、その
害虫の寄生する植物或いは動物に対する損傷が同時に減
少する。
遺伝子は又、バキュロウィルスゲノム中にポリヘドリン
被覆が昆虫の腸のアルカリ性条件により解離された場合
に、毒性遺伝子生成物が放出されるようにポリヘドリン
構造配列に融合されるように挿入することができた。本
発明のその様な用途は、昆虫腸細胞における組換え遺伝
子の発現を行うことなく昆虫の被毒を生ずるものと思わ
れる。
更に、上記具体例で測定されたよりも高いレベルの遺伝
子発現が本発明を用いて可能であることが認められであ
ろう。例えば、IFN-β遺伝子（或いはその他の任意の遺
伝子）はバキュロウィルスゲノム中に１回以上クローン
化することが可能である。特に、発現がポリヘドリンプ
ロモーターの制御下におかれるようにコピーを挿入する
ことが出来、その他のコピーを発現が10Kプロモーター
の制御下にあるように挿入することが可能であり、従っ
て、他の幾つかのコピーを種々のその他の制限部位に挿
入することが出来、各コピーは自らのプロモーター或い
はバキュロウィルスによりプロモーターとして認識され
る幾つかのその他のDNA配列を含有する。感染しやすい
昆虫細胞中に感染時に産生されるインターフェロン（或
いはその他のポリペプチド）の量は上記測定レベルをは
るかに越える量となり得る。
ここに開示されている本発明の一層の修正は、当業者に
可能であり、全てのその様な修正は特許請求の範囲に規
定される本発明の精神及び範囲内にあるものと看做され
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、AcMNPVのプラーク精製株、M3、プラスミドpB
R325、及びプラスミドpUC8を用いて開始した転移ベクタ
ー、pAc101の構成の概略図を示す。 第２図は、プラスミドpI10、pUC8及び合成BamHIリンカ
ーを用いて開始した変成転移ベクターpAc311、pAc360、
pAc373及びpAc380を構成するための概略図を示し、図中
「ライブラリー」という用語は、ポリヘドリン遺伝子に
おける各可能性のある位置において欠失突然変異を誘発
することにより構成することのできる変成pB′Balプラ
スミドのライブラリーを表わす。プラスミドpB′Bal1
1、pB′Bal60、pB′Bal73及びpB′Bal80を次いでこの突
然変異プラスミドのライブラリーから選択して更に転移
ベクターpAc311、pAc360、pAc373及びpAc380に変成し
た。 第３図は、AcMNPVのポリヘドリン遺伝子の部分的ヌクレ
オチド配列及びその遺伝子のすぐ上流の配列を概略的に
示すものである。特徴的なBamHIクローニング部位の位
置に加えて、欠失突然変異が誘発されて転移ベクターpA
c101、pAc311、pAc360、pAc373及びpAc380を構成する点
は矢印で示されている。ポリヘドリン遺伝子の「TATA」
及び「CAAT」ボックスはそれらの配列の周りに描かれた
長方形により示されており、遺伝子の転写開始部位は、
星印で示されている。第３図は又、ポリヘドリン遺伝子
の近くに位置するEcoRV及びHindIII制限部位を示す。 第４図は、好ましいIFN-β遺伝子を転移ベクターpAc380
にクローニングして組換え発現ベクターpAc380-IFN-β
を構成する概略図を示す。第４図は又、IFN-β遺伝子を
含有する出発物質プラスミドpBR13も示す。プラスミドp
770は、pUC8に対する配列及び合成オクタヌクレオチドB
amHIリンカーが隣接した767塩基対HincII断片に対する
配列をも含有する。この767塩基対断片はIFN-βに対す
る全コード配列を含有する。 第５図は、組換え発現ベクターpAc380-IFN-βの培養ス
ポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）
細胞内におけるバキュロウィルスによるトランスフェク
ション及びそれに引続く、培養S.フルギペルダ細胞のプ
ラーク‐精製組換えバキュロウィルスによる感染の概略
図を示す。 第６図は、AcMNPVゲノムのEcoRI断片のBamHIクローニン
グ部位に挿入されたIFN-β遺伝子を有する組換え転移ベ
クターpAc380-IFN-βを示す。ポリヘドリンプロモータ
ー配列はベタ黒で示され、EcoRI-I配列はプラスミドpUC
8中に組込まれたものとして示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】宿主昆虫細胞内において、或る選ばれた遺
    伝子を発現することのできる組換えバキュロウィルス発
    現ベクターの製法であって、 （ａ）バキュロウィルスDNAを切断して、バキュロウィ
    ルスポリヘドリン遺伝子およびバキュロウィルスポリヘ
    ドリンプロモーターを含むDNA断片を生成し、 （ｂ）該DNA断片をクローニングヴィークル中に挿入
    し、その後少なくとも１つの選ばれた遺伝子をこのよう
    に変成されたクローニングヴィークル中に該選ばれた遺
    伝子が該バキュロウィルス遺伝子のポリヘドリンプロモ
    ーターの転写制御下におかれるように挿入することによ
    り組換え転移ベクターを調製し、 （ｃ）該組換え転移ベクターを組換えを起こすようにバ
    キュロウィルスDNAと接触させることにより組換え及び
    非組換えバキュロウィルスの混合物を生成し、及び （ｄ）組換えバキュロウィルス発現ベクターを該混合物
    から単離することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】選ばれた遺伝子が、ポリヘドリンの合成を
    コードするDNA配列の少なくとも一部の代りにクローニ
    ングヴィークル中に挿入される、特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
  3. 【請求項３】バキュロウィルスがオートグラファ・カリ
    フォルニカ（Autographa californica）、トリコプルシ
    ア・ニ（Trichoplusia ni）、ラキプルシア・オウ（Rac
    hiplusia ou）、或いはガレリア・メロネラ（Galleria
    mellonella）である、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  4. 【請求項４】バキュロウィルスがオートグラファ・カリ
    フォルニカ（Autographa californica）である、特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】少なくとも１つの選ばれた遺伝子をバキュ
    ロウィルスゲノム中に導入して有する組換え転移ベクタ
    ーの製法であって、 （ａ）バキュロウィルスDNAを切断して、バキュロウィ
    ルスポリヘドリン遺伝子およびバキュロウィルスポリヘ
    ドリンプロモーターを含むDNA断片を生成し、 （ｂ）該DNA断片をバキュロウィルス遺伝子転移ベクタ
    ーを生成するようにクローニングヴィークル中に挿入
    し、及び （ｃ）少なくとも１つの選ばれた遺伝子を該バキュロウ
    ィルス遺伝子転移ベクター中に該遺伝子が該バキュロウ
    ィルスポリヘドリンプロモーターの転写制御下におかれ
    るように挿入する、 ことを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】選ばれた遺伝子が、ポリヘドリンの合成を
    コードするDNA配列の少なくとも一部の代りにクローニ
    ングヴィークル中に挿入される、特許請求の範囲第５項
    記載の方法。
  7. 【請求項７】バキュロウィルスがオートグラファ・カリ
    フォルニカ（Autographa californica）、トリコプルシ
    ア・ニ（Trichoplusia ni）、ラキプルシア・オウ（Rac
    hiplusia ou）、或いはガレリア・メロネラ（Galleria
    mellonella）である、特許請求の範囲第５項記載の方
    法。
  8. 【請求項８】バキュロウィルスがオートグラファ・カリ
    フォルニカ（Autographa californica）である、特許請
    求の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】ある選ばれた遺伝子を宿主昆虫細胞中で発
    現することのできる組換えバキュロウィルス発現ベクタ
    ーであって、該発現ベクターはバキュロウィルスポリヘ
    ドリンプロモーターおよびバキュロウィルスポリヘドリ
    ンプロモーターの転写制御下におかれた選ばれた遺伝子
    を含んでなるバキュロウィルスゲノムであることを特徴
    とする組換えバキュロウィルス発現ベクター。
  10. 【請求項１０】バキュロウィルスの遺伝子操作のための
    中間ヴィークルとして利用可能なバキュロウィルス転移
    ベクターであって、バキュロウィルス転移ベクターがバ
    キュロウィルスポリヘドリンプロモーター遺伝子及びあ
    る選ばれた遺伝子をクローニングするための少なくとも
    １個の利用可能な部位を含んでなり、該利用可能なクロ
    ーニング部位が、該選ばれた遺伝子が該利用可能なクロ
    ーニング部位に挿入された際にバキュロウィルスポリヘ
    ドリンプロモーターの転写制御下にあるように位置付け
    られていることを特徴とするバキュロウィルス転移ベク
    ター。
  11. 【請求項１１】NRRL B−15428或いはNRRL B−15778と称
    される、特許請求の範囲第10項記載のバキュロウィルス
    転移ベクター。
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