DE69505076T2 - Trypsintyp-Enzyme, dafür kodierende Nukleinsäuresequenz und Verfahren zur Herstellung des Enzymes - Google Patents

Trypsintyp-Enzyme, dafür kodierende Nukleinsäuresequenz und Verfahren zur Herstellung des Enzymes

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine DNA- oder RNA-Nucleinsäuresequenz, die für ein trypsinartiges Enzym codiert, insbesondere eine Protease, die in Hustenphlegma etc. von Patienten gefunden wird, die an einer chronischen Erkrankung der Atemwege leiden, und ein Verfahren zur Herstellung der Protease unter Verwendung der Nucleinsäuresequenz.
  • Es ist bekannt, daß in den menschlichen Lungen und in den Atemwegen Proteasen vorhanden sind. Beispiele für Proteasen, die von Neutrophilen abgeleitet sind und die in den Lungen und den Atemwegen von Patienten gefunden werden, die an chronischer Erkrankung des Atemwegsystems leiden, sind Elastase, Cathepsin G, Collagenase, Gelatinase, Protease 3 etc. Es wird angenommen, daß die Neutrophilen als Schutzmechanismus gegen Fremdsubstanzen, wie z. B. Bakterien und Viren, wirken. Wenn jedoch die Entzündung schlimmer wird oder chronisch geworden ist, können sie die Fremdsubstanzen nicht behandeln und die Freisetzung der Neutrophilen-Proteasen findet unter Zerstörung der Neutrophilen selbst statt.
  • Weiterhin ist auch bekannt hinsichtlich trypsinartige Enzyme aus Mastzellen, daß eine Tryptase mit einem Molekulargewicht von etwa 140.000 in den Lungen und den Atemwegen vorhanden ist, jedoch ist deren physiologische Rolle nicht vollständig aufgeklärt (J. B. C., , 11046-11051, 1984).
  • Als trypsinartiges Enzym, das von dieser Tryptase verschieden ist, ist eine Protease bekannt, die ein Molekulargewicht von 20.000 bei Rohreinigung aus Hustenphlegma eines Patienten, der an einer chronischen Erkrankung dem Atemwege leidet, hat (The Japanese Journal of Thoracic Diseases, Bd. 30, Supplement, Apr./1982, S. 280, G-77, S. 319, I-36). Es wird gezeigt, daß diese Protease ein synthetisches Substrat für Thrombin und ein synthetisches Substrat für Trypsin spaltet und daß sie Fibrinogen als natürliches Substrat spaltet, jedoch ist ihre physiologische Rolle unklar.
  • Was Enzyme betrifft, die eine Spaltaktivität gegenüber Fibrinogen, bei dem es sich um ein natürliches Substrat handelt, besitzen, wird ihre Anwendung als ein Mittel zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erwogen. Fibrin ist in Phlegma, insbesondere im Zehenphlegma, bei Erkrankungen des Atemwegsystems, wie z. B. Bronchialasthma, enthalten, und es wird angenommen, daß Fibrin zu der Viskosität beiträgt (The Japanese Journal of Thoracic Diseases, Bd. 31, Supplement, März/1993, S. 311, K1-58). Somit wird erwartet, daß ein trypsinartiges Enzym, das in der Lage ist, in selektiver Weise Fibrinogen, das ein Vorläufer von Fibrin ist, zu spalten, als schleimlösendes Mittel verwendet werden kann. Weiterhin ist bekannt, daß die Fibrinnetzwerkbildung bei der Implantation von Tumorzellen in den Gefäßboden während der Metastasenbildung mitwirkt (Irish. J. Med. Sci. , 474- 479, 1958) und weiterhin spielt das Fibrinnetzwerk eine Rolle in Bezug auf den Schutz der Tumorzellen gegen Immunocyten (Thromb. Diath. Haem. Sappl. , 139-156, 1974). Somit wird angenommen, daß ein trypsinartiges Enzym, das in der Lage ist, Fibrinogen zu spalten und die Fibrinnetzwerkbildung zu verringern, als ein Tumorzellen-implantationshemmendes Mittel verwendet werden kann. In Bezug auf ein trypsinartiges Enzym, das in der Lage ist, Fibrinogen in den Blutgefäßen zu spalten und die Blutgerinnungszeit zu verlängern, wird dessen Anwendung als gerinnungshemmendes Mittel im weiten Sinne für Erkrankungen im Kreislaufsystem, wie z. B. chronischer Arterienverstopfung und periphere Kreislauferkrankungen, erwartet.
  • Biochemistry, 1988, Bd. 27, S. 1067-1074, 5. Leytus et al., betrifft eine trypsinartige Serinprotease (Hepsin) mit einer putativen Transmembrandomäne, die in menschlicher Leber und Hepatomzellen exprimiert wird. Insbesondere beschreibt diese Literaturstelle rekombinante Clone mit cDNA-Insertionen, die für eine neue Serinprotease (Hepsin) codieren und die von cDNA-Genbanken isoliert wurden, die aus menschlicher Leber und Hepatomzellinien-mRNA hergestellt wurden. Es wird berichtet, daß die Gesamtlänge der cDNA etwa 1,8 kb ist und eine 5'-nichttranslatierte Region, 1251 Nucleotide, die für ein Protein von 417 Aminosäuren codieren, eine 3'-nichttranslatierte Region und einen poly(A)-Schwanz einschließt.
  • Die Erfinder isolierten ein Enzym mit Trypsinaktivität (Protease) aus Hustenphlegma eines Patienten, der an einer chronischen Erkrankung der Atemwege litt, sie bestimmten die Aminosäuresequenz, die aus 20 Aminosäuren am N-Terminus zusammengesetzt war, synthetisierten eine DNA, die für die oben genannte N-terminale Aminosäuresequenz codierte und waren in Bezug auf die Clonierung einer Nucleinsäuresequenz, die für das Enzym codiert, erfolgreich. Dies erfolgte gemäß der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (im folgenden als RACE abgekürzt) unter Verwendung dieser DNA. Die gesamte Aminosäuresequenz des Enzymes wurde bestimmt.
  • Somit stellt die Erfindung eine Nucleinsäuresequenz bereit, die für ein trypsinartiges Enzym mit der folgenden Aminosäuresequenz [I] codiert.
  • Das trypsinartige Enzym, das von der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz codiert wird, ist eine Protease, die im unteren Atemwegsystem des Menschen vorkommt, insbesondere in Hustenphlegma, Atemwegsschleim, Atemwegsspülungen usw. Von Patienten, die an chronischen Erkrankungen der Atemwege leiden. Das trypsinartige Enzym besitzt die folgenden physikochemischen Charakteristika.
  • 1 Wirkung: Trypsinartige Proteaseaktivität (proteolytisches Enzym).
  • 2 Substratspezifität: Das Enzym spaltet ein synthetisches Substrat für Trypsin und ein synthetisches Substrat für Thrombin gut, es spaltet jedoch nicht ein synthetisches Substrat für Chymotrypsin, ein synthetisches Substrat für Elastase, ein synthetisches Substrat für Collagenase und ein synthetisches Substrat für Leucinaminopeptidase.
  • 3 Optimum-pH: 8,2 bis 9,2 (Tris-HCl-Puffer), insbesondere um den pH-Wert von 8,6 in einem Aktivitäts-Assay unter Verwendung des synthetischen Substrats für Trypsin.
  • 4 Titer-Assay-Verfahren: Assay der Proteaseaktivität unter Verwendung des synthetischen Substrats für Trypsin.
  • 5 Temperatur für die Aktivität: Etwa 37ºC.
  • 6 pH-Inaktivierung: Bei einem pH von 6,0; bei einem pH von 7,6 sind etwa 80% des Enzyms inaktiviert.
  • 7 Inhibition: Inhibition durch DFP (Diisopropylfluorphosphat), PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) (die oben genannten zwei Verbindungen sind Serinproteaseinhibitoren), Leupeptin und Antipain (die oben genannten beiden Verbindungen sind Trypsininhibitoren).
  • 8 Reinigungsverfahren: Durch Säulenchromatographie aus dem Hustenphlegma eines Patienten, der an einer chronischen Erkrankung der Atemwege leidet, gereinigt.
  • 9 Molekulargewicht: 28.000 Da [durch das SDS-Polyacrylgelamid-Elektrophoreseverfahren (im folgenden als SDS-PAGE bezeichnet)].
    • Insbesondere spaltet das oben genannte trypsinartige Enzym gut:
  • ein synthetisches Substrat für Trypsin:
  • Boc-Phe-Ser-Arg-MCA und
  • Boc-Gln-Ala-Arg-MCA und
  • ein synthetisches Substrat für Thrombin:
  • Boc-Val-Pro-Arg-MCA.
    • Das Enzym spaltet geringfügig:
  • ein synthetisches Substrat für Faktor Xa:
  • Boc-Ile-Gln-Gly-Arg-MCA,
  • ein synthetisches Substrat für Urokinase:
  • Boc-Gln-Gly-Arg-MCA, und
  • ein synthetisches Substrat für Plasmin:
  • Boc-Val-Leu-Lys-MCA.
    • Das Enzym spaltet nicht:
  • ein synthetisches Substrat für Chymotrypsin:
  • Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA,
  • ein synthetisches Substrat für Elastase:
  • Suc-Ala-Pro-Ala-MCA, und
  • ein synthetisches Substrat für Collagenase:
  • Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA
  • (MCA bedeutet Methylcumarinamid).
  • Weiterhin spaltet das trypsinartige Enzym als natürliche Substrate Fibrinogen, VIP (vasoaktives intestinales Peptid), spaltet jedoch IgA, IgG, Albumin, α1-Antitrypsin und Substanz P nicht.
  • Weiterhin hat im Gegensatz zu Trypsin das trypsinartige Enzym auch eine Wirkung zur Inaktivierung von Influenza-Viren, des NDV-Miyardera-Stammes und des VSV-New-Jersey-Stammes (siehe: The Society of Japanese Virologist, 42. General Meeting Lecture Extracts, S. 201, Nr. 4022).
  • Das trypsinartige Enzym, das die oben erwähnten physikochemischen Charakteristika besitzt, kann durch Isolierung und Reinigung des Enzyms aus z. B. Hustenphlegma, Schleim aus den Atemwegen, Waschungen der Atemwege usw. von Patienten, die an chronischer Erkrankung der Atemwege leiden, gemäß dem Verfahren, das im später beschriebenen Beispiel 1 in spezifischer Weise beschrieben wird, z. B. durch Chromatographie unter Verwendung eines oder einer Kombination von zwei oder mehr Verfahren, ausgewählt aus hydrophober Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, reverser Phasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie etc., gewonnen werden.
  • Die erfindungsgemäße Nucleinsäure, die für das trypsinartige Enzym codiert, kann gemäß dem RACE-Verfahren (Frohman, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)) synthetisiert werden und ein Überblick über dieses Verfahren wird im folgenden gegeben.
  • Allgemein ausgedrückt, wenn ein Teil der Sequenz einer cDNA bekannt ist, ist das RACE-Verfahren ein Verfahren zum effi zienten Erhalt der daraufberuhenden Vollänge-cDNA. Es handelt sich dabei um ein Verfahren zum Erhalt der cDNA durch Amplifikation des Fragments zwischen dem 3'-Ende oder 5'-Ende der mRNA und der bekannten Sequenz in der Mitte davon unter Verwendung von PCR. Ein Primer wird auf eine derartige Weise hergestellt, daß ein Strang in Richtung des 3'-Endes oder des 5'-Endes der Region mit bekannter Sequenz verlängert werden kann, und dann wird die cDNA synthetisiert. Somit werden in der PCR ein Primer, der in spezifischer Weise an die bekannte Region hybridisiert und ein Primer, der an das 3'-Ende an die poly(A)-Sequenz der mRNA hybridisiert, verwendet, wohingegen ein Primer an das 5'- Ende mit einer Sequenz hybridisiert, die durch eine Tailing- Reaktion, eine Ligationsreaktion oder dgl. zugefügt wird. Dann werden unter Verwendung der Teile der duplizierten Sequenzen die synthetisierte cDNA-Sequenz der 3'-terminalen Seite und die synthetisierte cDNA-Sequenz der 5'-terminalen Seite ligiert, um die Vollängen-cDNA zu ergeben.
  • Insbesondere werden die 20 N-terminalen Aminosäuresequenzreste eines trypsinartigen Enzyms, das aus Hustenphlegma eines Patienten, der an einer humanen chronischen Erkrankung des Atemwegtrakts leidet, isoliert wurde, sequenziert und auf der Basis dieser Sequenz werden ein Oligonucleotidgemisch, das in der Lage ist, für die Aminosäuren 1 bis 7 zu codieren, und ein Oligonucleotidgemisch des komplementären Strangs einer Sequenz, die in der Lage ist, für die Aminosäuren 15 bis 20 zu codieren, hergestellt, wobei die Degeneration der entsprechenden Codons berücksichtigt wird. Wird die PCR unter Verwendung dieser Gemische als Primer (degenerierte Primer) und der humanen Trachea-cDNA als Template durchgeführt, wird bevorzugt ein 59 bp DNA-Fragment amplifiziert. Durch Sequenzierung dieses 59 bp Fragments gemäß eines üblichen Verfahrens wird ermittelt, daß dieses 59 bp DNA-Fragment ein Teil der cDNA des trypsinartigen Enzyms ist, da es für die N-terminalen 19 Aminosäuresequenzreste des trypsinartigen Enzyms codiert. Basierend auf der Sequenz dieses Teils der cDNA kann die Sequenz der Vollänge-cDNA auf die unten beschriebene Art und Weise erhalten werden.
  • Zunächst wird beschrieben, wie die cDNA der 3'-terminalen Seite erhalten wird. Eine einzelsträngige cDNA wird von einer humanen Trachea-mRNA mit einer reversen Transkriptase unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers mit einer zusätzlichen Sequenz 1 am 5'-Ende synthetisiert. Die PCR wird mit dieser einzelsträngigen cDNA als Matrize unter Verwendung eines Primers, der in spezifischer Weise an Teile der obigen 59 bp Fragmentsequenz hydrisiert, und eines Primers, der der zusätzlichen Sequenz 1 entspricht, durchgeführt. Durch Wiederholung der PCR unter Verwendung der gleichen Primer oder Primer, die sich im inneren Bereich befinden, kann in Abhängigkeit des Ausmaßes der Amplifikation ein amplifiziertes Produkt erhalten werden. Die cDNA des N-Terminus wird unter Verwendung dieses amplifizierten Produkts cloniert und eine Sequenzierung kann durchgeführt werden.
  • In Bezug auf die 5'-terminale Seite wird eine einzelsträngige cDNA von der humanen Trachea-mRNA unter Verwendung eines Primers, der in spezifischer Weise mit der bestimmten cDNA-Sequenz hydritisiert, synthetisiert. Die einzelsträngige cDNA wird gereinigt, und eine zusätzliche Sequenz an das 3'-Ende über eine Ligationsreaktion ligiert. Unter Verwendung dieser ligierten cDNA als Template wird die PCR mit einem Primer, der in spezifischer Weise mit einer Sequenz hybridisiert, die weiter innen liegt als die Sequenz, an die der Primer, der in der reversen Transkription verwendet wurde, hybridisierte, und mit einem Primer, der der zusätzlichen Sequenz 2 entspricht, durchgeführt. Danach können die gleichen Arbeitsgänge wie für die 3'-terminale Seite vorgenommen werden, um die Sequenzierung durchzuführen.
  • Unter Verwendung der Teile der duplizierten Sequenzen können die cDNAs der 3'-terminalen und der 5'-terminalen Seite ligiert werden, um die Vollänge-cDNA des trypsinartigen Enzyms zu ergeben.
  • Die auf diese Weise synthetisierte und clonierte cDNA-Sequenz des trypsinartigen Enzyms hat eine Basensequenz, die in Sequenz Nr. 15 gezeigt ist, und diese Sequenz kann, so wie sie ist, in ein Vektorplasmid integriert werden, ein geeigneter Wirt kann mit dem Plasmid transformiert werden, und das Gen kann exprimiert werden. Weiterhin ist es ebenfalls möglich, die entsprechende mRNA-Sequenz unter Verwendung der cDNA als Matrize zu synthetisieren.
  • Somit kann die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz insbesondere die folgende Sequenz [II] haben.
  • in der X für T oder U steht.
  • Weiterhin kann der codierende Strang, der für das trypsinartige Enzym codiert, nicht nur in Form der oben gezeigten kontinuierlichen Basensequenz (cDNA oder mRNA) vorkommen, sondern kann auch als Gen mit einer Exon-Intron-Struktur, die ein Vorläufer der cDNA oder mRNA ist, in einer derartig unterbrochenen Form, daß der codierende Strang durch das Dazwischenliegen von Introns unterbrochen ist, vorkommen.
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz ist es möglich, das trypsinartige Enzym mit der oben gezeigten Aminosäuresequenz zu erzeugen.
  • Obwohl ein trypsinartiges Enzym aus menschlichem Hustenphlegma gereinigt werden kann, ist dieses Verfahren kompliziert und teuer, da die Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials begrenzt ist und die Konzentration des trypsinartigen Enzyms niedrig ist. Die Produktion eines trypsinartigen Enzyms in einer zweckdienlichen Menge ist offensichtlich wichtig (angesichts der Möglichkeit einer klinischen Anwendung des trypsinartigen Enzyms).
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines trypsinartigen Enzyms durch gentechnologische Verfahren wird unten beschrieben.
  • Das erfindungsgemäße trypsinartige Enzym kann z. B. durch Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Vektor oder Virus, der bzw. das eine Sequenz enthält, die die folgenden Bestandteile enthält, tranformiert oder infiziert wurde, hergestellt werden:
  • (a) ein Promotor,
  • (b) ggf. ein Enhancer, der den Promotor stimuliert, und
  • (c) die folgende DNA-Sequenz [III], deren Transkription durch einen Promotor initiiert werden kann:
  • (A) m-(B)n-C ... [III]
  • worin
  • A für eine DNA-Sequenz steht, die für ein Signalpeptid (Prepeptid) und/oder ein Prepropeptid codiert,
  • B für eine DNA-Sequenz steht, die für eine spaltbare Sequenz oder ein Translationsinitiations-Codon codiert,
  • m für 0 oder 1 steht, und n für 0 oder 1 steht, und
  • C für eine DNA-Sequenz steht, die für die Aminosäuresequenz der obigen Formel [I] codiert,
  • und worin (a), (b) und (c) so angeordnet sind, daß ein trypsinartiges Enzym exprimiert werden kann und wobei das sekretierte oder akkumulierte trypsinartige Enzym isoliert wird.
  • In der oben gezeigten Sequenz [III] ist die Sequenz A eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid (Prepeptid) und/oder ein Prepropeptid codiert, und diese Signalpeptide (Prepeptid) und/oder Prepropeptid können Peptide sein, die in einer Wirtszelle als Signalpeptid (Prepeptid) und/oder Prepropeptid wirksam sind, in der das gewünschte Protein exprimiert wird.
  • Weiterhin ist in der oben gezeigten Sequenz [III] die Sequenz B eine DNA-Sequenz, die für eine Spaltsequenz oder ein Translationsinitiations-Codon codiert, und eine Sequenz, die für einen derartigen Zweck verwendbar ist, ist wünschenswerterweise eine Sequenz, die mit einer Signalpeptidase oder prozessierenden Protease der Wirtszelle spaltbar ist, eine enzymatisch spaltbare Sequenz, oder Met. Die Aminosäure dieser Spaltsequenz ist eine Aminosäure, die den Arten des Signalpeptids (Prepeptid) und/oder einem Prepropeptid entspricht, wie oben bereits erwähnt. Als Aminosäure der Spaltsequenz können z. B. Gln, Ala, Ser, Glu, Arg, Lys, Asp, Gly etc. erwähnt werden, und als DNA-Sequenz, die für diese Sequenz codiert, kann z. B. CAG, das Gln entspricht, erwähnt werden. Weiterhin kann ATG als eine DNA-Sequenz erwähnt werden, die für die Sequenz von Met, das die Aminosäure des Translationsinitiations-Codons ist, codiert.
  • Die Sequenz C steht für die DNA-Sequenz des trypsinartigen Enzyms oder ein Protein, das diesem biochemisch äquivalent ist. Z. B. können in einem solchen Bereich, in dem im wesentlichen die gleiche Funktion der DNA-Sequenz des trypsinartigen Enzyms beibehalten wird, Teile der DNA durch Austausch, Insertion oder Deletion verändert werden. Hier schließt das dem trypsinartigen Enzym biochemisch äquivalente Protein ein Protein ein, das durch ein immunochemisches Assay-Verfahren für trypsinartiges Enzym nachweisbar ist, bevorzugter ein Protein, das durch ein enzymatisches Assay-Verfahren für das trypsinartige Enzym nachweisbar ist.
  • Als eine derartige Sequenz C kann eine DNA-Sequenz, die für die zuvor genannte Aminosäuresequenz [I] des reifen trypsinartigen Enzyms codiert, erwähnt werden. Jedoch kann nach Belieben eine humane cDNA verwendet werden, die durch die zuvor genannte Basensequenz [II] dargestellt wird, in der X für T steht.
  • Die erfindungsgemäße DNA-Verbindung, die für ein trypsinartiges Enzym codiert, ist insbesondere zur Transformation oder Infektion einer Insektenzelle oder einer anderen eukaryotischen Wirtszelle und für die Expression einer trypsinartigen Enzymaktivität geeignet. Viele Insekten- und Säugerwirtszellen besitzen einen zellulären Mechanismus, der für die Erkennung des Signalpeptids (Prepeptid) und/oder Prepropeptids, die am N-Terminus des trypsinartigen Enzyms vorkommen, notwendig ist, und eine geeignete Prozessierung wird durchgeführt. Es gibt viele und verschiedene Vektoren oder Viren zur Transformation oder Infektion eukaryotischer Wirtszellen, und durch die Nennung spezifischer Vektoren oder Viren, die unten exemplarisch genannt sind, wird in keinster Weise beabsichtigt, den Bereich der Erfindung zu beschränken.
  • Bezüglich der Mittel zur Expression eines gewünschten Proteins in einer eukaryotischen Zelle sind viele Systeme auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Z. B. kann als System zur Expression in Hefe "Expression of Polypeptide in Yeast", beschrieben in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 159489/1982 (= EP 60057 B), erwähnt werden und als System zur Expression in einer Insektenzelle kann "Process for Producing Recombinant Baculovirus Expression Vector", beschrieben in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 37988/1985 (= US-PSen 4 745 051 und 4 879 236) erwähnt werden und als System zur Expression in einer Säugerzelle kann "Improvement of Eucaryotic Expression", beschrieben in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 171198/1990 (= EP 363127 A3), erwähnt werden, es gibt jedoch viele andere Systeme als diese.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines trypsinartigen Enzyms in einer eukaryotischen Wirtszelle wird unten beschrieben, wobei als repräsentatives Beispiel ein wie oben exemplarisch dargestelltes Baculovirus-Expressionssystem verwendet wird. In diesem Fall wird ein Baculovirus-Promotor als eukaryotischer Promotor verwendet. Ein Promotor eines Virus, mit dem eine eukaryotische Zelle infiziert ist, ist ein "eukaryotischer Promotor", da er seine Promotorfunktion in einer eukaryotischen Zelle exprimiert.
  • Weiterhin kann ein Enhancer, der so angeordnet ist, daß er den Promotor stimuliert, in einfacher Weise durch Verwendung eines Baculovirus-Enhancers angeordnet werden. Das geeignete Mittel für diese Zusammensetzung kann durch Verwendung eines Proteinexpressionssystems, z. B. eines Baculovirus-Polyhydringens und durch Durchführen der Substitution oder Insertion einer DNA-Sequenz, die für die oben gezeigte Aminosäuresequenz [I] codiert, bevorzugter eine DNA-Sequenz, die von der oben gezeigten Formel [III] dargestellt wurde, in die Polyhydringenregion erreicht werden.
  • Insbesondere kann ein gewünschtes Protein, z. B. unter Verwendung des vollständigen EcoRI-I-Fragments [R. D. Posse et al., Virology, 185 (1991), 229-241] des Autographa Californica vielkernigen Polyhedrosisvirus (Autographa Californica multiple nuclear polyhedrosis virus): AcMNPV durch die Durchführung der Substitution oder Insertion der oben genannten DNA-Sequenz in den Polyhydringenteil des Virus zur Erzeugung eines mutanten Virus, Infektion einer Insektenzelle, z. B. eines etablierten Stammes SF-9 (ATCC CRL1711) von Spodoptera frugiperda mit dem Virus und durch Kultivation der infizierten Zelle erzeugt werden. Die obige Herstellung eines mutanten Virus kann nach Belieben durch homologe Rekombination durchgeführt werden, und ein spezifisches Mittel dafür wird ebenso in detaillierter Weise in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 37988/1985 beschrieben. Zur Herstellung des oben genannten Expressionssystems sind das Baculovirus AcMNPV, ein Vektor zur homologen Rekombination und der SF-9-Stamm als Ausgangsmaterialien notwendig. Ein derartiges Expressionssystem wird von Funakoshi Co., Ltd. (MaxBacR Baculovirus-Expressionssystem; INV IV-0822-04) verkauft und jedermann kann es erhalten. Insoweit Baculoviren selbst betroffen sind, kann man sie weiterhin aus der Natur gemäß dem Verfahren, das in G. E. Smith & M. D. Summers, Virology, 89 (1978), 517-527, beschrieben wurde, erhalten.
  • Weiterhin kann ein Vektor zur homologen Rekombination, z. B. auch durch Insertion des oben erwähnten EcoRI-I-Fragments von AcMNPV in die EcoRI-Spaltstelle von pBR322 und Ersatz des Teils des Polyhydrinstrukturgens durch die DNA-Sequenz, die durch die Formel [III] dargestellt wird, erhalten werden.
  • Der so erhaltene Vektor zur homologen Rekombination kann mit dem Baculovirus AcMNPV gemischt werden, und dann kann die SF-9-Zellkultur mit dem Gemisch kotransfiziert werden. Eine Viruspopulation, die rekombinante Baculoviren und nichtrekombinante Baculoviren umfaßt, wird auf diese Weise erhalten. Üblicherweise beträgt der Virustiter im Überstand am 3. Tag nach der Transfektion 10&sup5; bis 10&sup6; pfu/ml. Wird die Verdünnung so durchgeführt, daß 100 Plaques je 35 ml-Schälchen gebildet werden können, wird der Assay durchgeführt, und 1/2 bis 1/3 des Gemisches werden farblose, transparente Plaques oder werden blau gefärbte Plaques mit X-Gel in jedem Medium, wenn der Vektor zur homologen Rekombination ein lacZ-Markergen enthält. Diese werden als Kandidatenstämme für rekombinante Baculoviren ausgewählt und die Viren werden gewonnen. Von diesen Kandidatenstämmen kann ein rekombinantes Baculovirus durch Nachweis einer DNA, die für ein trypsinar tiges Enzym codiert, mit Hilfe des PCR-Verfahrens oder eines Hybridisierungsverfahrens erhalten werden. Eine große Menge dieses rekombinanten Baculovirus kann dadurch erhalten werden, daß man frische SF-9-Zellen erneut mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert.
  • Im obigen Verfahren können nichtinfizierte SF-9-Zellen in einem Medium, das 10% Rinderserum enthält, bei 28ºC kultiviert werden.
  • SF-9-Kulturzellen, die kultiviert und in einem Medium gehalten wurden, werden mit dem oben genannten rekombinanten Baculovirus infiziert und dazu gebracht, das Protein zu exprimieren. Dies kann durch kontinuierliche Kultur bei 28ºC während einer Zeit im Bereich von 72 bis 96 h im obigen Medium oder in einem serumfreien Medium erreicht werden.
  • Die entstehende Kulturbrühe enthält das gewünschte Protein, AcMNPV, SF-9-Zellen, tote SF-9-Zellen und DNAs und Proteine, die von SF-9 oder AcMNPV stammen. Damit das trypsinartige Enzym erhalten wird, wird das trypsinartige Enzym aus dem Kulturmedium mit den folgenden Schritten gereinigt und getrennt.
    • Reinigungsverfahren aus Kulturüberstand
  • (1) Zellen werden zentrifugiert.
  • (2) Das Virus wird durch Ultrafiltration entfernt.
  • (3) Die Dialyse oder Verdünnung wird gegen bzw. mit 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) durchgeführt.
  • (4) Die entstehende Probe wird auf eine Benzamidinaffinitätssäule, die mit 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchlorid puffer (pH 8,0) äquilibriert wurde, aufgetragen, mit dem gleichen Puffer gewaschen, und mit 10 mM Salzsäure - 500 mM Natriumchloridlösung (pH 2,0) eluiert, und der Nachweis wird auf trypsinartiger Enzymaktivität geführt und der Haupt-Peak wird gesammelt.
  • Das erhaltene trypsinartige Enzym zeigt eine Bande bei der SDS-PAGE.
    • Reinigungsverfahren aus kultivierten Zellen
  • (1) Die Zellen werden zentrifugiert und gesammelt.
  • (2) Die Zellen werden in 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) suspendiert.
  • (3) Triton X-100 wird so zugegeben, daß die Endkonzentration 1% beträgt, und man läßt das Gemisch während 60 min bei 0ºC stehen, um die Zellen aufzulösen.
  • (4) Die Zelltrümmer werden abzentrifugiert.
  • (5) Der Überstand wird gegen 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) dialysiert oder mit 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) verdünnt.
  • (6) Die entstehende Probe wird auf eine Affinitätsbenzamidinaffinitätssäule, die mit 50 mM TrisHCl - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) äquilibriert wurde, aufgetragen, mit dem gleichen Puffer gewaschen, und mit 10 mM Salzsäure - 500 mM Natriumchloridlösung (pH 2,0) eluiert, und der Nachweis erfolgt auf trypsinartige Enzymaktivität, und der Haupt-Peak wird gesammelt.
  • Das entstehende trypsinartige Enzym zeigt eine Bande in der SDS-PAGE.
  • Die erfindungsgemäße DNA-Verbindung kann auch in prokaryotischen Wirtszellen, wie z. B. , und exprimiert werden. Durch Expression einer DNA, die für eine trypsinartige Enzymaktivität in einer prokaryotischen Wirtszelle codiert, kann das trypsinartige Enzym gebildet werden.
  • Das trypsinartige Enzym kann als ein Antigen zur Stimulation der Produktion von Antikörpern, die für ein trypsinartiges Enzym spezifisch sind oder ebenso zur quantitativen Analyse eines trypsinartigen Enzyms verwendet werden. In vielen Assay-Verfahren zur Bestimmung des Spiegels eines Proteins in einer Probe wird kompetitive Antikörperbindung verwendet. Namentlich kann ein von Prokaryoten gebildetes trypsinartiges Enzym, das mit Radioaktivität (oder mit Hilfe eines anderen Verfahrens) markiert wurde, als ein "kompetierendes Molekül" in Assays auf ein trypsinartiges Enzym in der Atemwegsflüssigkeit verwendet werden.
  • Üblicherweise prozessieren Prokaryoten eukaryotische Signalpeptide (Prepeptide) und/oder Prepropeptide nicht in effizienter Weise. Deshalb ist es relativ ineffizient, den Teil in einem Prokaryoten zu exprimieren, der für das Signalpeptid (Prepeptid) und/oder Prepropeptid des Enzyms des trypsinartigen Enzymstrukturgens codiert. Somit ist es ebenso möglich, vor der Expression einer DNA-Verbindung, die für die trypsinartige Enzymaktivität codiert, in einer prokaryotischen Wirtszelle die DNA, die für das Prepropeptid codiert, zu entfernen. Obwohl es in der vorliegenden Beschreibung nicht im besonderen dargestellt wird, schließt die Erfindung weiterhin eine Fusion zwischen der codierenden DNA eines prokaryotischen Signalpeptids (Prepeptid) und der co dierenden DNA einer trypsinartigen Enzymaktivität ein, mit dem Ziel, das trypsinartige Enzym in einem Prokaryoten zu exprimieren und zu sekretieren.
  • Die Aminosäurereste -186 bis -1 (siehe Sequenz Nr. 15) des im Entstehen befindlichen Polypeptids des trypsinartigen Enzyms codieren vermutlich für ein Signalpeptid (Prepeptid) zur extrazellulären Sekretion und für ein Propeptid und kommen im reifen trypsinartigen Enzym nicht vor. Es ist nicht notwendig, daß diese Bereiche des trypsinartigen Enzyms in einem prokaryotischen Expressionsvektor codiert werden, jedoch kann erfindungsgemäß auch ein prokaryotischer Vektor, der für das Prepropeptid des trypsinartigen Enzyms codiert, verwendet werden.
  • Da die Auswahl eines Promotors für die Durchführbarkeit der Erfindung nicht kritisch ist, wird die Expression des trypsinartigen Enzyms in niemals darauf beschränkt, einen spezifischen Promotor zu verwenden. Als Beispiele können die Promotoren von -Lactose (lac), -trp, Bakteriophage λPLOL, Bakteriophage λPROR usw. genannt werden, jedoch werden die Promotoren nicht darauf beschränkt. Weiterhin ist es ebenso möglich, die Expression des trypsinartigen Enzymstrukturgens unter Verwendung eines oder mehrerer Promotor(en), z. B. des trp-Promotors und des lac-Promotors, die in Reihe angeordnet sind, oder unter Verwendung eines Hybridpromotors, wie z. B. dem tac-Promotor, durchzuführen. All die oben genannten Promotoren sind bereits charakterisiert und dem Fachmann gut bekannt und können synthetisch oder, ausgehend von einem bekannten Plasmid, zusammengestellt werden.
  • Wird ein fremdes Gen, wie z. B. das erfindungsgemäße trypsinartige Enzym, stromabwärts des lac-Promotors cloniert, nimmt die Syntheserate des Proteins in bemerkenswerter Weise aufgrund der Induktion durch Lactose zu, und gleichzeitig werden in den Zellen Proteingranula gebildet. Die Homogenität der Proteinzusammensetzung dieser Granula ist hoch, und wenigstens 50%, meistens 80% (hierbei handelt es sich um Trockengewichtsprozent) oder mehr dieser Granula sind aus dem gewünschten Proteinprodukt zusammengesetzt. Diese Granula können leicht aus den Zelllysaten hergestellt werden und sind stabil, wenn sie mit Harnstoff niedriger Konzentration oder mit einer Detergenslösung gewaschen werden. Durch dieses Waschen werden Proteine, die nichtspezifisch an die Granula binden, entfernt.
  • Der prokaryotische Expressionsvektor kann für eine Vielzahl von Wirtsorganismen verwendet werden; vor allem für gram-negative Bakterien, wie z. B. , K12, K12 C600, K12 HB101 und K12 JM109.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung der tatsächlichen Selektionsmarker, die in den rekombinanten Plasmiden oder Viren, die in der vorliegenden Beschreibung exemplarisch dargestellt sind, enthalten sind, beschränkt. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Selektionsmarkern von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen, die in günstiger Weise in rekombinanten DNA-Vektoren oder Viren, die die erfindungsgemäße DNA-Verbindung (oder Sequenz) enthalten, verwendet werden.
  • Mit den exemplarisch dargestellten, erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, Plasmiden und Viren können viele Modifikationen und Veränderungen vorgenommen werden. Z. B. kann aufgrund der Degeneriertheit der genetischen Codes Austausch von Nucleotiden durchgeführt werden, und zwar über die gesamte codierende Region des Polypeptids. Derartige Sequenzen können von der Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz des trypsinar tigen Enzyms gemutmaßt werden und können gemäß den folgenden, üblichen synthetischen Verfahren zusammengesetzt werden. Eine derartige Synthese kann im wesentlichen nach dem Verfahren von Itakura et al. (Itakura et al., 1977, Science, 198 : 1059) und nach dem Verfahren von Crea et al. (Crea et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 : 5765) durchgeführt werden. Deshalb ist die Erfindung nicht auf die DNA-Sequenz, die Plasmide und Viren, die besonders beispielhaft dargestellt werden, beschränkt.
  • Es ist für einen Fachmann verständlich, daß die Expressionsvektoren oder Viren der Erfindung in jeder eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle verwendet werden können und daß dadurch ein Polypeptid mit trypsinartiger Enzymaktivität in den Wirt exprimiert werden kann.
  • Im Falle eines Vektors, der einen Promotor enthält, der in der Wirtszelle funktionell ist und der die Transkription des trypsinartigen Strukturgens beginnen läßt, wenn die Wirtszelle mit dem Vektor transformiert oder infiziert wird, kann das trypsinartige Enzym aus dem Medium isoliert werden, wenn die Wirtszelle einen zellulären Mechanismus zur Durchführung der Prozessierung des Signalpeptids (Prepeptid) und/oder Prepropeptids besitzt. Bei einer anderen Expressionssituation muß das trypsinartige Enzym aus der Wirtszelle isoliert werden, wenn die Wirtszelle keinen zellulären Mechanismus zum Durchführen des Prozessierens des Signalpeptids (Prepeptid) und/oder Prepropeptids besitzt.
  • Die Erfindung wird weiter in spezifischer Weise gemäß den Beispielen beschrieben, es sollte jedoch deutlich sein, daß diese Beispiele nicht dazu dienen, den Bereich der Erfindung einzuschränken.
    • Erklärung bezüglich der Reagentien und der experimentellen Durchführung
  • (1) Wenn nicht anders ausdrücklich angemerkt, werden DNAmodifizierende Enzyme (z. B. ampliTaq-DNA-Polymerase) und Kits, die von Takara, Pharmacia, Boehringer Mannheim und Clontech erhalten wurden, gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
  • (2) Ein Oligonucleotid kann mit Hilfe des Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthesegerätes synthetisiert werden und durch OPC- (Oligonucleotide Purification Cartridge) Säulen, die von der gleichen Firma hergestellt wurden, gereinigt werden.
  • (3) Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) kann mit Hilfe eines DNA-Thermal-Cyclers, der von Perkin-Elmer Cetus Instruments Co. hergestellt wurde, unter Verwendung der ampliTaq-DNA- Polymerase durchgeführt werden, wobei in spezifischer Weise DNAs amplifiziert werden.
  • (4) Eine -Zelle kann nach dem in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschriebenen Verfahren transformiert werden.
  • (5) Ein Plasmid kann durch Übernachtkultivation eines plasmidtragenden bei 37ºC auf etwa 25 cm² L-Brühe Agarmedium (1% Pepton, 1% NaCl, 0,5% Hefeextrakt und 1,5 % Agar) und dann unter Verwendung des von QIAGEN Co. hergestellten QIAGEN-Plasmid-Kits isoliert werden.
  • Die Zeichnungen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, werden im folgenden kurz beschrieben.
  • Fig. 1 ist ein SDS-PAGE-Muster, das für die Messung des Molekulargewichts des im Beispiel 1 erhaltenen trypsinartigen Enzyms verwendet wird.
  • Fig. 2 ist ein Graph, der den Einfluß des pHs auf die Aktivität des im Beispiel 1 erhaltenen trypsinartigen Enzyms zeigt.
  • Fig. 3 ist ein Graph, der den Einfluß des im Beispiel 1 erhaltenen trypsinartigen Enzyms auf die thrombininduzierte Koagulationszeit von Fibrinogen zeigt.
  • Fig. 4 ist eine Zeichnung, die das Plasmid pPHAT1 zeigt, das das trypsinartige Enzym, das im Beispiel 12 erhalten wurde, enthält.
  • Fig. 5 ist eine Zeichnung, die einen Ausgangsvektor pBlueBac III zur Erzeugung eines rekombinanten Vektors zeigt.
  • Fig. 6 ist eine Zeichnung, die den im Beispiel 6 erhaltenen Vektor pBacPHAT1 zur homologen Rekombination zeigt.
  • Fig. 7 ist eine Zeichnung, die die Beziehung zwischen den im Beispiel 15 erhaltenen Elutionsfraktionen der Affinitätssäule und ihren Aktivitäten zeigt.
  • Fig. 8 ist die SDS-PAGE und der Western Blot des im Beispiel 15 erhaltenen gereinigten trypsinartigen Enzyms.
    • Beispiel 1: Isolierung und Reinigung eines trypsinartigen Enzyms
  • 1000 ml Hustenphlegma eines Patienten, der an einer chronischen Erkrankung der Atemwege leidet, würde mit der gleichen Menge 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 0,3 M NaCl gemischt, und das Gemisch wurde während 1 min bei Kühlung mit Eis mittels eines Homogenisators homogenisiert und zentrifugiert (19.000 UpM). Ammoniumsulfat wurde dem Überstand so zugesetzt, daß die Endkonzentration 40% betrug. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10.000 UpM) entfernt, Proteasen im Überstand wurden auf einem Butyl-Toyoperl-Gel adsorbiert, und Proteasefraktionen wurden unter Verwendung von 5% (NH4)&sub2;SO&sub4;; 10% Glycerin; 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5) eluiert.
  • Ammoniumsulfat wurde dem Eluat so zugesetzt, daß die Endkonzentration 65% betrug; das Gemisch wurde zentrifugiert (10.000 UpM), das entstehende Präzipitat wurde in 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 10% Glycerin gelöst, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu ergeben, und die Lösung wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert. Proteasen in der dialysierten Lösung wurden an SP-Toyoperl 650 M-Gel adsorbiert, dreimal mit 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0) und zweimal mit 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 0,1 M NaCl gewaschen, und Proteasefraktionen wurden mit 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 10% Glycerin, 0,3 M NaCl eluiert. Ammoniumsulfat wurde dem Eluat so zugegeben, daß die Endkonzentration 80% betrug; das Gemisch wurde zentrifugiert (8.000 UpM), das entstehende Präzipitat wurde in 40 ml 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 10% Glycerin gelöst, und die Lösung wurde gegen den gleichen Puffer dialysiert.
  • Die dialysierte Lösung wurde erneut auf eine SP-Toyoperl 650-Säule (1,2 · 2 cm) gegeben und einer Gradientenelution von 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 10% Glycerin bis 0,05 M Acetatpuffer (pH 4, 5), 10% Glycerin, 0,2 M NaCl unterzogen, um Proteasefraktionen zu ergeben. Das Eluat wurde auf etwa 30 ml durch Ultrafiltration (YM10 Membran) konzentriert, und das Konzentrat wurde gegen 0,05 M Tris-HCl (pH 9,2), 10% Glycerin, 0,5 M NaCl dialysiert.
  • Die dialysierte Lösung wurde durch Affinitätschromatographie gereinigt. Namentlich wurde die dialysierte Lösung auf eine Benzamidin-Sepharose 6B-Säule gegeben, mit 0,05 M Tris-HCl (pH 9,2), 10% Glycerin, 0,5 M NaCl gewaschen und mit 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,0), 10% Glycerin, 0,5 M NaCl eluiert, um eine Lösung eines gereinigten Proteins zu ergeben. Dieses trypsinartige Enzym wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert, und als Ergebnis wurde es als eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 28.000 (Fig. 1) nachgewiesen.
  • Als Molekulargewichtsmarker wurden die folgenden Marker, die von Bio-Rad Laboratories erhältlich sind, verwendet.
  • 97. 4kDa: Phosphorylase b
  • 66. 2kDa: Albumin
  • 42. 7kDa: Ovalbumin
  • 31. OkDa: Carbonanhydrase
  • 21. SkDA: Sojabohnentrypsininhibitor
  • 14. 4kDa: Lysozym
    • Beispiel 2: Assay-Verfahren für Trypsinaktivität
  • 50 ul der Lösung der trypsinartigen Protease, die im Beispiel 1 erhalten wurde, wurden zu 1,5 ml 0,1 M Tris-HCl- Puffer (pH 8,6), enthaltend 100 uM eines synthetischen Substrats für Trypsin, nämlich Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (MCA = Methylcumarinamid) gegeben, und das Gemisch wurde einer Inkubation bei 37ºC während 1 h unterzogen. 1 ml 30%ige Essigsäure wurde dann zugegeben, die Menge gebildeten 7-Amino-4- methylcumarins (AMC) wurde durch Fluoreszenz-Assay (Fluoreszenz 440 nm, Anregungslicht 380 nm) bestimmt, und die Aktivität des Enzyms wurde, basierend darauf, berechnet. Eine Eine Aktivität der Bildung von 1 pM AMC in 1 min wird als eine Einheit definiert (1 Einheit = 1 pM AMC/min).
    • Beispiel 3: Messung des Optimum-pH eines trypsinartigen Enzyms
  • Die folgenden Puffer wurden hergestellt, um die Trypsinaktivität bei verschiedenen pH-Werten zu bestimmen.
  • EMES-Puffer;
  • pH 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8
  • HEPES-Puffer;
  • pH 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6
  • Tris-Puffer;
  • PH 7,4, 7,6, 7, 8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,7, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4
  • Die Aktivität des im Beispiel 1 erhaltenen trypsinartigen Enzyms wurde in jedem Puffer nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gemessen, und die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
  • Das Enzym zeigte eine starke Aktivität im Bereich eines pHs von 8,2 bis 9,2, und vor allem zeigten sich die höchsten Aktivitäten bei einem pH von 8,4, 8,6, 8,7 und 8,8.
    • Beispiel 4: Substratspezifität eines trypsinartigen Enzyms (1) Synthetisches Substrat
  • Die Aktivität des im Beispiel 1 erhaltenen trypsinartigen Enzyms wurde gemäß des im Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens beschrieben. Als Reaktionspuffer wurde 0,1 M Tris-HCl- Puffer (pH 8,6) verwendet. Es wurde ein Substrat für Trypsin (Boc-Phe-Ser-Arg-MCA, Boc-Gln-Ala-Arg-MCA), ein Substrat für Thrombin (Boc-Val-Pro-Arg-MCA), ein Substrat für den Faktor Xa (Hoc-Ile-Gln-Gly-Arg-MCA), ein Substrat für Urokinase (Boc-Gln-Gly-Arg-MCA), ein Substrat für Plasmin (Boc-Val- Leu-Lys-MCA), ein Substrat für Chymotrypsin (Boc-Ala-Ala- Pro-Phe-MCA), ein Substrat für Elastase (Suc-Ala-Pro-Ala- MCA), ein Substrat für Collagenase (Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro- MCA) und ein Substrat für Leucinaminopeptidase (Leu-MCA) verwendet. Die Reaktivität des trypsinartigen Enzyms in Bezug auf jedes Substrat ist in Tabelle 1 gezeigt; die Aktivität gegenüber Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (ein Substrat für Trypsin) wurde gleich 100% gesetzt. Weiterhin sind in Tabelle 1 auch die Reaktivitäten einer humanen neutrophilen Elastase und einer Rattenmastzellen-abgeleiteten Tryptase mit jedem Substrat gezeigt, wobei die Aktivitäten gegenüber Suc-Ala- Pro-Ala-MCA bzw. Suc-Phe-Ser-Arg-MCA gleich 100% gesetzt wurden.
  • Als Ergebnis spaltete das im Beispiel 1 erhaltene trypsinartige Enzym das Substrat für Trypsin und das Substrat für Thrombin gut und zeigte weder Chymotrypsinaktivität, Elastaseaktivität, Collagenaseaktivität noch eine Leucinaminopeptidaseaktivität. Die humane neutrophile Elastase und die Rattenmastzellen abgeleitete Tryptase unterschieden sich in Bezug auf die Substratspezifität.
    • (2) Natürliche Substrate
  • IgA, IgG, Albumin, α1-Antitrypsinfibrinogen, VIP (vasoaktives intestinales Peptid) und Substanz P wurden verwendet; das im Beispiel 1 erhaltene trypsinartige Enzym wurde mit jedem dieser Stoffe umgesetzt, und die Spaltung jedes Substrats wurde durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nachgewiesen. Als Ergebnis wurden lediglich Fibrinogen und VIP spezifisch gespalten, und die anderen natürlichen Substrate wurden nicht gespalten. Tabelle 1: Substratspezifität des trypsinartigen Enzyms
    • Beispiel 5: Effekt von Proteaseinhibitoren auf das trypsinartige Enzym
  • Als Proteaseinhibitoren wurden die Serinproteaseinhibitoren DFP (Diisopropylfluorphosphat) und PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), die Trypsininhibitoren Leupeptin und Antipain, der Elastininhibitor Elastinol, der Leucinaminopeptidaseinhibitor Bestatin, der Chymotrypsininhibitor Amastatin und der Blutproteaseinhibitor α1-Antitrypsin verwendet, und der Inhibitionseffekt dieser Proteaseinhibitoren auf das im Beispiel 1 erhaltene trypsinartige Enzym auf die vom Menschen abgeleitete neutrophile Elastase und die von Rattenmastzellen abgeleitete Tryptase wurde untersucht. Bezüglich der Konzentration der Inhibitoren wurde lediglich die von PMSF auf 1 mM eingestellt, wohingegen die der anderen Inhibitoren auf 10 uM eingestellt wurde. Nachdem jeder Inhibitor und jedes Enzym umgesetzt wurde, wurde die enzymatische Aktivität nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren bestimmt, und das Inhibitionsverhältnis (%) der enzymatischen Aktivität durch den Inhibitor wurde berechnet und in Tabelle 2 gezeigt.
  • Als Ergebnis wurde das trypsinartige Enzym durch DFP, PMSF, Leupeptin, Antipain und α1-Antitrypsin inhibiert, nicht jedoch durch Elastinol, Bestatin und Amastatin. Mit der Substratspezifität und dem Inhibitionseffekt eines jeden Inhibitors als Beurteilungsbasis zeigte das trypsinartige Enzym Eigenschaften, die von denen der humanen neutrophilen Elastase und der rattenmastzellenabgeleiteten Tryptase verschieden waren. Tabelle 2: Einfluß von Proteaseinhibitoren auf das trypsinartige Enzym
    • Beispiel 6: Einfluß des trypsinartigen Enzyms auf die Koagulation von Fibrinogen
  • Fibrinogen wurde in 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 0,01 M CaCl&sub2;, 0,15 M NaCl gelöst, so daß die Konzentration 2 mg/ml betrug. Das in Beispiel 1 erhaltene trypsinartige Enzym wurde zugegeben, wobei seine Aktivitätseinheit sich änderte; das Gemisch wurde auf 37ºC erhitzt; 0,1 ml dieser Reaktionslösung wurden mit 0,1 ml einer Thrombinlösung (2,5 Einheiten/ml) gemischt, und die Koagulationszeit des Gemisches wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Steigt die Aktivitätseinheit des trypsinartigen Enzyms, wurde die Koagulationszeit im Verhältnis verlängert.
    • Beispiel 7: N-Terminale Aminosäuresequenz des trypsinartigen Enzyms
  • Das im Beispiel 1 erhaltene trypsinartige Enzym wurde einer reversen Phasen-HPLC (Vydac214TP54) unterzogen, und das Enzym wurde mit Acetonitril mit einer Konzentration von 50,4% eluiert. Das Eluat wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels konzentriert und mit einem Proteinsequenziergerät (Applied Biosystems Modell 477A) die N-terminale Aminosäuresequenz analysiert.
  • Als Ergebnis war die Sequenz bis zum 20. Rest vom N-Terminus des trypsinartigen Enzyms Ile-Leu-Gly-Gly-Thr-Glu-Ala-Glu- Glu-Gly-Ser-Trp-Pro-Trp-Gln-Val-Ser-Leu-Arg-Leu.
    • Beispiel 8: Clonierung einer 59 bp cDNA, die für die Sequenz der 20 N-terminalen Aminosäurereste des aus Hustenphlegma isolierten trypsinartigen Enzyms codiert A. Herstellung der Oligonucleotidgemische TRY-0 und TRY-00
  • Ein Oligonucleotidgemisch, das in der Lage ist, für die Aminosäuren 1 bis 7 zu codieren, die in Sequenz Nr. 2 gezeigt sind, wurde, basierend auf der im Beispiel 7 bestimmten Aminosäuresequenz, entwickelt, wobei die Degeneriertheit der entsprechenden Codons in Rechnung gezogen wurde. Dieses Gemisch wurde mit TRY-0 bezeichnet. Weiterhin wurde der komplementäre Strang einer Sequenz, die in der Lage ist, für die Aminosäuren 15 bis 20 zu codieren, nämlich ein Oligonucleotidgemisch, das in der Sequenz Nr. 3 gezeigt ist, entwickelt und mit TRY-00 bezeichnet. Diese wurden mittels eines Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA- Synthesegeräts synthetisiert und unter Verwendung von OPC- (Oligonucleotid Purification Cartridge) Säulen gereinigt.
    • B. PCR mit humaner Luftröhren-cDNA
  • Eine PCR wurde mit einem Reaktionsvolumen von 20 ul je 1 ng humaner Luftröhren-QUICK-Clone-cDNA (LOT#23022), hergestellt von Clontech Co., unter Verwendung von jeweils 0,1 ug der Oligonucleotidgemische TRY-0 und TRY-00, die im Beispiel 8A hergestellt wurden, als Primer und ampliTaq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die PCR wurde unter Verwendung des von Perkin- Elmer Cetus Instruments Co. hergestellten DNA-Thermal- Cyclers durchgeführt, wobei 35mal ein Reaktionszyklus von 94ºC 1 min. 57ºC 1 min und 30 s und 72ºC 2 min wiederholt wurde und zuletzt eine Inkubation während 7 min bei 72ºC durchgeführt wurde. Dadurch wurde ein PCR-Reaktionsgemisch erhalten.
    • C. Herstellung eines 59 bp PCR amplifizierten Produktfragments
  • Zu 20 ul des im Beispiel 8B erhaltenen PCR-Reaktionsgemisches wurde ein gleiches Volumen Chloroform zugegeben, und das Gemisch wurde heftig bewegt. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die wäßrige Phase als obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen gegeben. Zu dieser Lösung wurde NaOAc in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstehende Lösung ließ man bei -80ºC während 20 min stehen und zentrifugierte sie; DNAs wurden pelletisiert. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, in 10 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM EDTA) gelöst, einer 5,6% Polyacrylamidgel- (29 : 1, Acrylamid : Bisacrylamid) Elektrophorese unterzogen, und die Elektrophorese wurde durchgeführt, bis ein 59 bp DNA-Fragment von den anderen PCR-Produkten getrennt wurde. Das Gel wurde zuerst mit einer verdünnten Lösung von Ethidiumbromid ge färbt, und dann wurden die DNA-Banden durch Beobachtung des Gels unter Ultraviolettstrahlen untersucht.
  • Eine Region, die das 59 bp Fragment enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in Teilchen zerkleinert. 400 ul eines Extraktionspuffers (500 mM NH&sub4;OAc. 0,1% SDS : und 1 mM EDTA, pH 7,5) wurden in das Mikrozentrifugenröhrchen, das diese Gelstückchen enthielt, gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC über Nacht stehengelassen. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, der Rückstand wurde pelletisiert, und der Überstand wurde in neues Röhrchen überführt. Zu diesem Überstand wurde NaOAc in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol gegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstandene Lösung beließ man während 20 min bei -80ºC; dann erfolgte eine Zentrifugation, und die DNAs wurden pelletisiert. Diese Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, und das entstehende gereinigte Fragment wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst.
    • D. Konstruktion des Plasmids p59-14
  • Das im Beispiel 8C erhaltene Fragment wurde in die SmaI- Spaltstelle des Plasmidvektors pUC18 in die glatten Enden unter Verwendung des SureClon-Ligation-Kits, der von Pharmacia Co. hergestellt wurde, ligiert. Dann wurden von Takara Co. hergestellte kompetente JM109-Zellen mit dem entstehenden Plasmid gemäß des in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschriebenen Verfahrens transformiert.
  • Aus der entstehenden Transformante wurde, basierend auf ihrem Ampicillinresistenz-Phenotyp und basierend auf der Länge eines durch PCR erhaltenen Produkts ein p59-14-Clon selektiert; die PCR wurde durchgeführt, um den Inser tionsteil unter Verwendung eines Primers mit einer Sequenz nahe der SmaI-Spaltstelle des Plasmidvektors pUC18 zu amplifizieren. Durch Isolierung eines Plasmids aus einem positiven Clon wurde p59-14 erhalten. Die Herstellung des Plasmids erfolgte durch Kultivieren plasmidtragender bei 37ºC über Nacht auf etwa 25 cm² L-Brühe-Agarmedium (1% Pepton, 1% NaCl, 0,5% Hefeextrakt und 1,5% Agar), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, und dann unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid-Kits, der von Qiagen Co. hergestellt wurde.
    • E. DNA-Sequenzierung des Plasmid-p59-14-Insertionsteils
  • Der Plasmid-p59-14-Insertionsteil, der im Beispiel 8D erhalten wurde, wurde nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, : S. 5463-5467, 1977) sequenziert. Die DNA-Sequenz des Insertionsteils des Plasmids p59-14 ist in Sequenz Nr. 4 gezeigt. Dieser p59-14-Insertionsteil codiert für die 19 N-terminalen Aminosäuresequenzreste des trypsinartigen Enzyms, das aus dem Hustenphlegma isoliert wurde und wurde als Teil der gewünschten trypsinartigen Enzym-cDNA identifiziert.
    • Beispiel 9: Clonierung einer cDNA-Region, die für das aus dem Hustenphlegma isolierte trypsinartige Enzym codiert A. Herstellung von Oligonucleotiden TRY-1, TRY-8, TRY-10 und TRY-11
  • Das als Sequenz Nr. 5 gezeigte Oligonucleotid, das dem Bereich vom ersten A bis zum 23. A der Sequenz Nr. 4 entspricht, wurde, basierend auf der Sequenz eines Teils einer cDNA, die im Beispiel 8 bestimmt wurde und die für das trypsinartige Enzym codiert, entwickelt und mit TRY-1 bezeichnet. In ähnlicher Weise wurde das in Sequenz Nr. 6 gezeigte Oligonucleotid, das der Sequenz vom 16. 6 bis zum 40. T der Sequenz Nr. 4 entspricht, entwickelt und mit TRY-8 bezeichnet. Weiterhin wurde das Oligonucleotid, das durch die Sequenz Nr. 7 dargestellt ist und das in der Lage ist, an das 3'-Ende der poly(A)+ RNA zu hybridisieren, entwickelt und mit TRY-10 bezeichnet. Weiterhin wurde ein in der Sequenz Nr. 8 gezeigtes Oligonucleotid entwickelt, das mit den 19 5'-terminalen Resten von TRY-10 identisch ist und mit TRY-11 bezeichnet wurde.
  • Diese wurden mit einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthetisiergerät synthetisiert und unter Verwendung von OPC-Säulen, die von der gleichen Firma hergestellt wurden, synthetisiert.
    • B. Herstellung von einzelsträngiger cDNA, die humaner Luftröhren-poly(A)+ RNA entspricht, unter Verwendung von TRY-10
  • Mit 10 ng humaner Luftröhren-poly(A)+ RNA (LOT#26105), die von Clontech erhalten wurde, wurde eine wäßrige Lösung von 9 ul hergestellt. Diese Lösung wurde einer Inkubation bei 65ºC während 3 min unterzogen, und das Gefäß, das die Lösung enthält, wurde sofort während 5 min in ein Eisbad gegeben. Eine einzelsträngige cDNA wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 ul unter Verwendung der obigen Lösung und 10 ng des Oligonucleotids TRY-10, das im Beispiel 9A hergestellt wurde, als Primer und unter Verwendung eines cDNA-Synthese- Kits, der von Boehringer Mannheim Co. hergestellt wurde, hergestellt.
    • C. Amplifikation eines cDNA-Bereichs, der für das aus dem Hustenphlegma isolierte trypsinartige Enzym codiert, mittels PCR
  • Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 ul mit 1/10 der Menge der einzelsträngigen cDNA, die im Beispiel 9B unter Verwendung humaner Luftröhren-poly(A)+ RNA als Matrize hergestellt wurde, durchgeführt, wobei jeweils 0,1 ug der Oligonucleotide TRY-1 und TRY-11, die im Beispiel 9A hergestellt wurden, als Primer und ampliTaq-DNA-Polymerase verwendet wurden. Die PCR wurde durch 35fache Wiederholung des Reaktionszyklus 94ºC 1 min. 57ºC 1 min und 30 s und 72ºC 2 min durchgeführt, und zuletzt wurde während 7 min eine Inkubation bei 72ºC durchgeführt, wodurch das erste PCR- Reaktionsgemisch erhalten wurde.
  • Weiter wurde eine PCR in einem Reaktionsvolumen von 20 ul mit 1/40 der Menge des PCR-Reaktionsgemisches unter Verwendung von jeweils 0,1 ug der Oligonucleotide TRY-8 und TRY-10, die im Beispiel 9A hergestellt wurden, als Primer und ampliTaq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die PCR wurde durch 35fache Wiederholung des Reaktionszyklus 94ºC 1 min. 57ºC 1 min und 30 s und 72ºC 2 min durchgeführt, und zuletzt erfolgte eine Inkubation bei 72ºC während 7 min. dadurch wurde das zweite PCR-Reaktionsgemisch erhalten. Es wurde durch 5,6% Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestätigt, daß in diesem zweiten PCR-Reaktionsgemisch etwa 900 bp DNA selektiv amplifiziert wurden.
    • D. Herstellung des in der zweiten PCR amplifizierten Produktfragments
  • Zu 20 ul des zweiten PCR-Reaktionsgemisches, das im Beispiel 9C erhalten wurde, wurde ein gleiches Volumen Chloroform zugegeben, und das Gemisch wurde heftig gerührt. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die wäßrige Phase als die obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen überführt. Zu dieser Lösung wurde NaOAc in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstehende Lösung wurde während 20 min bei -80ºC belassen und zentrifugiert, und DNAs wurden pelletisiert. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, in 10 ul TE-Puffer gelöst, einer Elektrophorese auf 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterzogen und elektrophoretisch aufgetrennt, bis ein etwa 900 bp DNA-Fragment von den anderen PCR- Produkten abgetrennt war. Das Gel wurde zuerst mit einer verdünnten Ethidiumbromidlösung gefärbt, und dann wurden die DNA-Banden durch Beobachtung dieses Gels unter ultravioletten Strahlen untersucht.
  • Eine Region, die das etwa 900 bp DNA-Fragment enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. TE-Puffer wurde in das Mikrozentrifugenröhrchen, welches die Gelstücke enthielt, gegeben, so daß das Gesamtvolumen 400 ul betrug, und das Gemisch wurde einer Inkubation unterzogen, bis sich das Agarosegel löste. Zu dieser Lösung wurde ein gleiches Volumen phenolgesättigter TE-Puffer, der zuvor auf eine Temperatur von 65ºC eingestellt wurde, gegeben, und das Gemisch wurde heftig gerührt und zentrifugiert, und die wäßrige Phase als die obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen überführt. Diese Handlungen wurde erneut wiederholt. Dann wurde zu der entstehenden Lösung ein gleiches Volumen Chloroform gegeben, und das Gemisch wurde heftig gerührt. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die wäßrige Phase als obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen überführt. Zu dieser Lösung wurde NaOAc in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstehende Lösung wurde bei -80ºC während 20 min belassen und zentrifugiert, und DNAs wurden pelletisiert. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, und das entstehende gereinigte Fragment wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst.
    • E. Zusammenbau des Plasmids p19-33
  • Das im Beispiel 9D erhaltene Fragment wurde in die SmaI- Spaltstelle an die glatten Enden des Plasmidvektors pUC18 unter Verwendung des von Pharmacia Co. hergestellten SureClone-Ligation-Kits ligiert. Dann wurden kompetente JM109-Zellen, die von Takara Co. produziert wurden, mit dem entstehenden Plasmid transformiert. Aus der entstehenden Transformante wurde ein p19-33-Clon ausgewählt, und zwar basierend auf seinem Ampicillinresistenz-Phenotyp und basierend auf der Länge eines durch PCR erhaltenen Produkts; die PCR wurde unter Verwendung eines Primers, der eine Sequenz in der Nähe der SmaI-Spaltstelle des Plasmidvektors pUC18 besitzt, zur Amplifizierung des Insertionsteils durchgeführt. Durch Isolierung eines Plasmids aus einem positiven Clon wurde p19-33 erhalten.
    • F. DNA-Sequenzierung des Plasmid-p19-33-Insertionsteils
  • Der Insertionsteil des Plasmids p19-33, das im Beispiel 9E erhalten wurde, wurde nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: S. 5463-5467, 1977) sequenziert. Die DNA-Sequenz des Plasmid-p19-33-Insertionsteils ist in Sequenz Nr. 9 gezeigt. Dieser p19-33-Insertionsteil codiert für einen Teil der 20 N-terminalen Aminosäurereste des trypsinartigen Enzyms, das aus Hustenphlegma isoliert wurde und wurde als Teil der gewünschten trypsinartigen Enzym-cDNA identifiziert.
    • Beispiel 10: Clonierung des stromaufwärts gelegenen Bereichs der trypsinartigen Enzym-cDNA
  • A. Herstellung der Oligonucleotide TRY-25 und TRY-26 Das in Sequenz Nr. 10 gezeigte Oligonucleotid, das der Sequenz vom 127. A bis zum 151. T der Sequenz Nr. 9 komplementär ist, wurde entwickelt und mit TRY-25 bezeichnet. In ähnlicher Weise wurde ein Oligonucleotid, das in der Sequenz Nr. 11 dargestellt ist und das der Sequenz vom 83. A bis zum 107. A der Sequenz Nr. 9 komplementär ist, entwickelt und mit TRY-26 bezeichnet.
  • Diese wurden mit einem Applied Biosystems Modell 394 DNA/RNA-Synthetisiergerät synthetisiert und unter Verwendung von OPC-Säulen, die von der gleichen Firma hergestellt wurden, gereinigt.
    • B. Herstellung einer Ankerligations-einzelsträngigen cDNA entsprechend der menschlichen Luftröhren-poly(A)+ RNA unter Verwendung von TRY-25
  • Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit 2 ug humaner Luftröhren-poly(A) + RNA (LOT#29099), die von Clontech erhalten wurde, unter Verwendung des 5'-AmpliFinder-Race-Kits, der von Clontech Co. hergestellt wurde und unter Verwendung von 83 ng des im Beispiel 10A hergestellten Oligonucleotids TRY-25 als Primer durchgeführt, und dadurch wurde eine einzelsträngige cDNA synthetisiert. Dann wurde die RNA in dem Reaktionsgemisch alkalihydrolysiert, eine Neutralisation wurde durchgeführt, und die einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von Glaspulver, das im Kit enthalten war, gereinigt. Der im Kit vorhandene AmpliFinder-Anker, der als Sequenz Nr. 12 gezeigt ist, wurde an das 3'-Ende dieser einzelsträngigen cDNA unter Verwendung einer T4-RNA-Ligase ligiert.
    • C. Amplifikation des stromaufwärts gelegenen Bereichs der trypsinartigen Enzym-cDNA durch PCR
  • Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 50 ul mit 1/100 der Menge der im Beispiel 10B erhaltenen Ankerligations-einzelsträngigen cDNA, die humaner Luftröhren-poly(A)+ RNA entspricht, unter Verwendung des Oligonucleotids TRY-26 und des AmpliFinder-Anker-Primers, der im 5'-AmpliFinder-Race-Kit, der von Clontech Co. hergestellt wurde, enthalten war, und der als Sequenz Nr. 13 dargestellt ist, als Primer, die jeweils in der Endkonzentration von 0,2 uM vorhanden waren und unter Verwendung von ampliTaq-DNA-Polymerase durchgeführt. Die PCR wurde durch 35fache Wiederholung des Reaktionszyklus 94ºC 45 s, 60ºC 45 s und 72ºC 2 min durchgeführt, und zuletzt wurde eine Inkubation während 7 min bei 72ºC durchgeführt, und dadurch wurde ein PCR-Reaktionsgemisch erhalten. Durch 5,6% Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde bestätigt, daß in diesem PCR-Reaktionsgemisch etwa 790 bp DNA in selektiver Weise amplifiziert wurden.
    • D. Herstellung des PCR amplifizierten Produktfragments
  • Zu 40 ul des im Beispiel 10C erhaltenen PCR-Reaktionsgemischs wurde ein gleiches Volumen Chloroform zugegeben, und das Gemisch wurde heftig gerührt. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die wäßrige Phase als obere Schicht wurde in ein neues Röhrchen überführt. Zu dieser Lösung wurde NaOAc in einer solche Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstehende Lösung wurde während 20 min bei -80ºC belassen und zentrifugiert, und DNAs wurden pelletisiert. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, in 10 ml TE-Puffer gelöst, einer 5,6% Polyacrylamidgel- (29 : 1, Acrylamid : Bisacrylamid) Elektrophorese unterzogen und elektrophoretisch aufgetrennt, bis ein etwa 790 bp DNA-Fragment von den anderen PCR-Produkten abgetrennt wurde. Das Gel wurde zuerst mit einer verdünnten Ethidiumbromidlösung gefärbt, und dann wurden die DNA-Banden durch Beobachten diese Gels unter ultravioletten Strahlen untersucht.
  • Ein Bereich, der das etwa 790 bp DNA-Fragment enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in kleine Stückchen zerkleinert. 400 ul eines Extraktionspuffers (500 mM NH&sub4;OAc : 0,1% SDS : und 1 mM EDTA, pH 7,5) wurden in das Mikrozentrifugenröhrchen, das diese Gelstückchen enthielt, gegeben, so daß das Gesamtvolumen 400 ml betrug, und das Gemisch wurde über Nacht bei 37ºC alleine gelassen. Dann wurde das Gemisch zentrifugiert, der Rückstand wurde pelletisiert, und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt. Zu diesem Überstand wurde NaOAc in einer solchen Menge, daß die Endkonzentration des NaOAc 0,3 M betrug, und 2,5 Volumina Ethanol gegeben, und das Gemisch wurde gemischt. Die entstehende Lösung wurde während 20 min bei -80ºC belassen und zentrifugiert, und DNAs wurden pelletisiert. Die Pellets wurden mit 70% Ethanol gespült, und das entstehende gereinigte Fragment wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst.
    • E. Zusammenbau des Plasmids p5-119
  • Das im Beispiel 10D erhaltene Fragment wurde in die SmaI- Spaltstelle des Plasmidvektors pUC18 an die glatten Enden unter Verwendung des von Pharmacia Co. hergestellten Sure- Clone-Ligation-Kits ligiert. Dann wurden kompetente JM109-Zellen, die von Takara Co. hergestellt wurden, mit dem entstehenden Plasmid transformiert. Aus den resultierenden Transformanten wurde ein p5-119-Clon, basierend auf seinem Ampicillinresistenz-Phenotyp und basierend auf der Länge eines Produkts, zur Amplifikation des Insertionsteils, das durch PCR unter Verwendung eines Primers, der eine Sequenz in der Nähe der SmaI-Spaltstelle des Plasmidvektors pUC18 besitzt, erhalten wurde, ausgewählt und durch Isolierung eines Plasmids aus einem positiven Clon wurde p5-119 erhalten.
    • F. DNA-Sequenzierung des Insertionsteils des Plasmids p5-119
  • Der Insertionsteil des Plasmids p5-119, das im Beispiel 10E erhalten wurde, wurde nach dem Didesoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: S. 5463-5467, 1977) sequenziert. Die DNA-Sequenz des Insertionsteils des Plasmids p5-119 ist als Sequenz Nr. 14 gezeigt. Dieser Insertionsteil von 789 bp enthält eine Region, die für die 20 N-terminalen Aminosäuresequenzreste des trypsinartigen Enzyms, das von Hustenphlegma isoliert wurde, codiert und wurde als Teil der gewünschten trypsinartigen Enzym-cDNA identifiziert.
    • Beispiel 11: Bestimmung der trypsinartigen Enzymgen-cDNA-Sequenz
  • Die überlappenden Teile von 107 bp zwischen den in den Beispielen 9 bzw. 10 bestimmten Sequenzen wurden identifiziert, und dadurch wurde ihre Identität bestätigt. Aus der Sequenzanalyse wurde bestätigt, daß diese überlappenden Sequenzen einen Bereich enthielten, die für die Aminosäuren der 20 N- terminalen Reste des aus Hustenphlegma isolierten trypsinartigen Enzym codiert. Aus den zuvor genannten wurden die Sequenzen ligiert und die gewünschte trypsinartige Enzymgen- cDNA-Sequenz wurde bestimmt. Diese DNA und Aminosäuresequenz ist in Sequenz Nr. 15 gezeigt.
    • Beispiel 12: Zusammenbau des Plasmids pPHAT1
  • Das im Beispiel 9 erhaltene Plasmid p19-33 und das im Beispiel 10 erhaltene Plasmid p5-119 wurden getrennt mit SphI und BstXI gespalten. Ein von p19-33 abgeleitetes SphI-BstXI- Fragment von etwa 3,6 kb und ein von p5-119 abgeleitetes SphI-BstXI-Fragment von etwa 0,7 kb wurden getrennt und durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Die Ligationsreaktion wurde mit diesen beiden SphI-BstXI-Fragmenten durchgeführt, und ein JM109-Stamm wurde mit dem Ligationsprodukt transformiert. Durch Isolierung von Plasmiden aus mehreren Transformanten wurde das Plasmid bPHAT1 erhalten (Fig. 4).
    • Beispiel 13: Zusammenbau eines rekombinanten Vektors, in welchen eine cDNA, die für das trypsinartige Enzym codiert, insertiert wurde
  • pBlueBacIII (Invitrogen) wurde als Expressionsvektor verwendet. Die Sequenz dieses Vektors pBlueBacIII ist in Sequenz Nr. 16 gezeigt, und die Restriktionsspaltstellen und die Funktionskarte sind in Fig. 5 gezeigt. Wie in Fig. 5 gezeigt, enthält pBlueBacIII das AcMNPV-Gen. Dieses AcMNPV- Gen (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus gene) wird in der folgenden Literaturstelle beschrieben.
  • R. D. Posse et al., Virology, 185 (1991), S. 229-241.
  • pBlueBacIII wurde mit BamHI und HindIII gespalten und mit einem BamHI-NdeI-Fragment, das durch Hybridisieren der beiden einzelsträngigen DNAs, die als Sequenz Nr. 17 und 18 gezeigt sind, erhalten wurde, und mit einem NdeI-HindIII-Fragment, das durch Spaltung von pPHAT1 mit NdeI und Hindill und Unterwerfen des Spaltprodukts einer Agaroseelektrophorese getrennt und isoliert wurde, ligiert. Ein HB101-Stamm wurde unter Verwendung des Ligationsproduktes transformiert. Durch Isolierung von Plasmiden aus den entstehenden mehreren Transformanten wurde der Vektor pBacPHAT1 zur homologen Rekombination erhalten (Fig. 6).
    • Beispiel 14: Herstellung eines rekombinanten Baculovirus
  • AcMNPV wurde an einer Stelle mit Eco81I gespalten, um es zu linearisieren. Das erhaltene Material wurde mit 1 ug pBacPHAT1 gemischt, und das Volumen des Gemisches wurde mit sterilisiertem Wasser auf 8 ul eingestellt. Hierzu wurde ein gleiches Volumen Lipofectin (Gibco Co.), das zweifach verdünnt worden war, zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 15 min belassen und dann zu 1,5 ml serumfreiem Medium EX-CELL 400 (JRH Bio Science), das 1 · 10&sup6; SF-9-Insektenzellen enthielt, in ein Schälchen gegeben. Nachdem die Zellen während 3 Tagen kultiviert worden waren, wurde das Medium zurückgewonnen und in geeigneter Weise, z. B. 10fach, 100fach od. dgl., verdünnt, und SF-9-Monolayer- Zellkulturen wurden mit der Verdünnung infiziert, damit Plaques gebildet werden. Nach 3 Tagen Kultur wurde X-gal dem Medium zugegeben, und am nächsten Tag wurden rekombinante Baculoviren, die blau gefärbt wurden, und farblose, transparente, nichtrekombinate Baculoviren getrennt. Die blau gefärbten Plaques wurden mittels einer Pasteur-Pipette abgesaugt und in einem Medium suspendiert, und danach wurde diese Viruslösung erneut in geeigneter Weise verdünnt, eine Insektenzelle wurde mit der Verdünnung infiziert, und die Zellkultur wurde kultiviert. Auf diese oben beschriebene Weise wurde die Isolierung wiederholt, bis alle erscheinenden Plaques blau gefärbt waren. Das so erhaltene rekombinante Baculovirus wurde mit #1B3 bezeichnet.
    • Beispiel 15: Herstellung des trypsinartigen Enzyms durch rekombinantes Baculovirus
  • SF-9-Zellen wurden als Monolayer bis zu einer Dichte von 5 · 10&sup6; Zellen/ml kultiviert, das Medium wurde entfernt, serumfreies Medium, das 2 bis 5 pfu #1B3 pro Zelle enthielt, wurde zugegeben, um die Zellen zu infizieren, und die Zellen wurden während 4 Tagen kultiviert, um das trypsinartige Enzym zu exprimieren. Die Bestätigung des exprimierten Proteins wurde durch Western Blot-Verfahren (Anal. Biochem., 112, 195-203, 1981) unter Verwendung von SDS-PAGE und einem anti-trypsinartigen Enzympeptid-Antikörper durchgeführt.
  • Der Überstand und die Zellen wurden durch Zentrifugation (etwa 500 · g) getrennt, der Überstand wurde einer Ultrafiltration unterzogen (Fujifilter-Filtron-Miniset; Ausschlußgrenze am Molekulargewicht 300 kDa), um das Virus zu entfernen, und die entstehende Lösung wurde gegen 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) über Nacht dialysiert oder mit 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) über Nacht verdünnt, die Zellen wurden in 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) suspendiert, Triton X-100 wurde zugegeben, so daß die Endkonzentration 1% betrug, und das Gemisch wurde während 60 min bei 0ºC allein belassen, um die Zellen zu lysieren. Die Zelltrümmer wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde gegen 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) über Nacht dialysiert oder mit 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) über Nacht verdünnt. Die Lösung wurde auf eine Benzamidinaffinitätssäule (Pharmacia), die mit 50 mM Tris-Salzsäure - 500 mM Natriumchloridpuffer (pH 8,0) äquilibriert worden war, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer gewaschen, und die Elution wurde mit 10 mM Salzsäure - 500 mM Natriumchloridlösung (pH 2,0) durchgeführt. Die trypsinartige Enzymaktivität wurde in jeder Fraktion gemäß des im Beispiel 2 gezeigten Verfahrens bestimmt und nachgewiesen (Fig. 7); die Haupt-Peaks wurden gesammelt, SDS-PAGE wurde durchgeführt, um ein Protein nachzuweisen, das ein Molekulargewicht von etwa 28 kDa hat, und es wurde durch ein Western Blot- Verfahren unter Verwendung eines anti-trypsinartigen Enzym peptid-Antikörpers bestätigt, daß dieses 28 kDa Protein ein trypsinartiges Enzym war.
  • Das so erhaltene gereinigte trypsinartige Enzym zeigt eine Bande in der SDS-PAGE. Die Ergebnisse der SDS-PAGE und des Western Blotting des aus den infizierten Zellen isolierten trypsinartigen Enzyms sind in Fig. 8 gezeigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz dieser gereinigten Probe wurde durch ein Proteinsequenzierungsgerät (Applied Biosystems Modell 477A) bestimmt, und als Ergebnis stimmte sie mit der des natürlichen trypsinartigen Enzyms überein.
    • Vergleichsbeispiel 1: Herstellung eines anti-trypsinartigen Enzympeptid-polyclonalen Antikörpers
  • Ein Peptid mit 20 Resten, an dem sich Cystein am N-Terminus der Sequenz vom ersten Rest bis zum 19. Rest des reifen trypsinartigen Enzyms befand, wurde chemisch mittels eines Peptidsynthesegeräts (Applied Biosystems Modell 431A) synthetisiert. Dieses synthetische Peptid wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) (10 mg/ml) gelöst und bei 25ºC während 2 h mit 10 mg maleimidaktiviertem Hämocyanin (Boehringer Mannheim Biochemica) inkubiert, und die Reaktionslösung wurde gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert. Das an Hämocyanin gebundene Peptid wurde einem Kaninchen subkutan verabreicht (0,5 mg/einmal). Die Verabreichung wurde 6mal alle zwei Wochen wiederholt. Das Kaninchen wurde ausgeblutet, und das Serum wurde aus dem Blut isoliert und mittels einer Protein-A-Sepharose-4B-(Pharmacia)-Säule gereinigt, um einen anti-trypsinartigen Enzympeptid-polyclonalen Antikörper zu ergeben.
    • Sequenzlisten (1) Allgemeine Information: (i) Anmelder:
  • (A) Name: Teijin Limited
  • (B) Straße: 6-7, Minamihommachi 1-chome, Chuo-ku
  • (C) Stadt: Osaka
  • (E) Land: Japan
  • (F) Postleitzahl (ZIP): keine
    • (ii) Titel der Erfindung: Für ein trypsinartiges Enzym codierende Nucleinsäuresequenz und Verfahren zur Herstellung des Enzyms (iii) Anzahl der Sequenzen: 19 (iv) Computerlesbare Form:
  • (A) Medientyp: Diskette
  • (B) Computer: IBM-PC-kompatibel
  • (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
  • (EPO)
    • (v) Augenblickliche Anmeldungsdaten:
  • Anmeldungsnummer: EP 95 111 972.6
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  • (B) Position: 35
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    • (2) Information für SEQ ID NO 16: (i) Sequenzcharakteristika:
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    • (2) Information für SEQ ID NO 19: (i) Sequenzcharakteristika:
  • (A) Länge: 51 Basenpaare
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strangform: einzelsträngig
  • (D) Topologie: linear
    • (ii) Molekültyp: andere Nucleinsäure
  • (A) Beschreibung: /desc = "synthetische DNA" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO 19:

Claims (4)

1. Nucleinsäuresequenz, die für ein trypsinartiges Enzym mit der folgenden Aminosäuresequenz codiert:
2. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die in der Basensequenz einen codierenden Strang enthält, der durch die folgende Formel dargestellt wird:
in der X für T oder U steht.
3. Verfahren zur Herstellung eines trypsinartigen Enzyms mit der Aminosäuresequenz nach Anspruch 1, der die Herstellung des trypsinartigen Enzyms mit der Aminosäuresequenz nach Anspruch 1 durch ein gentechnologisches Verfahren unter Verwendung der Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 2 umfaßt.
4. Trypsinartiges Enzym mit der Aminosäuresequenz nach Anspruch 1.
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