DE3787315T2

DE3787315T2 - Menschliches Protein-S, ein Plasmaprotein, das die Blutgerinnung reguliert.

Info

Publication number: DE3787315T2
Application number: DE87304676T
Authority: DE
Inventors: Jo Ann Hoskins; George Louis Long
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-05-27
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2007-05-28
Also published as: JP2557385B2; EP0247843B1; AU600944B2; IL82648A0; DK266187D0; DK171825B1; DE3787315D1; AU7340487A; EP0247843A2; CA1338260C; EP0247843A3; JPS62289199A; DK266187A; IE60641B1; IE871369L

Description

Die Thrombinbildung, die Umwandlung von Prothrombin in Thrombin, wird durch eine Reihe an Reaktionen, bekannt als Blutgerinnungskaskade, reguliert, die durch Serinproteasen katalysiert werden. Diese Proteasen sind für ihre maximale Aktivität von mehreren Cofaktorproteinen abhängig, wie Thrombomodulin, den Faktoren Va und Villa und Protein S. Das Protein S ist ein wichtiger Bestandteil im kürzlich aufgefundenen Protein C-Protein S-Thrombomodulin- System, dem bei der Herunterregulierung der Blutgerinnung und der intravaskulären Thrombose eine entscheidende Bedeutung zukommt. Dieses spezielle Vitamin K abhängige Plasmaprotein wird als Cofaktor zur optimalen, durch aktiviertes Protein C (APC) vermittelten, Inaktivierung von Faktor Va auf Phospholipidvesikeln und der Oberfläche der Blutplättchen benötigt.
Das Protein S ist ein Plasmaprotein, das bei seiner Biosynthese von Vitamin K abhängt. Das humane Protein besitzt ein scheinbares Mr von 69-85 Kilodalton (kD) und erfordert wie andere Vitamin K abhängige Proteine zur biologischen Funktion extensive posttranslationale Modifikationen, einschließlich der Umwandlung von elf Glutaminsäureresten, die in Richtung des Aminoterminus gehäuft auftreten, in gamma(γ)-Carboxyglutaminsäure (Gla), der Umwandlung von drei Asparaginsäureresten (hierin versuchsweise als Aminosäurereste 95, 135 und 182 bezeichnet) in β- Hydroxyasparaginsäure, Glycosylierung (8 Gewichtsprozent) und Bildung von Disulfidbrücken. Die vorgeschlagene Funktion für die gamma-Carboxyglutaminsäurereste ist die Bindung von Calcium, das wiederum die Bindung des Moleküls an Phospholipiddoppelschichtmembranen erleichtert. Die Funktion der β-Hydroxyasparaginsäure ist unbekannt. Bei Polyacrylamidgelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat (SDS PAGE) unter reduzierenden Bedingungen tritt eine schwere Kette mit 75 kD und eine leichte Kette mit 16 kD auf. Bei Inkubation mit Thrombin wird ein 8 kD Fragment vom Molekül abgespalten, was zu einem Aktivitätsverlust führt.
Um die Rolle von Protein S zu definieren, wird kurz auf dieses Antikoagulationssystem eingegangen. Protein C hängt, wie Protein S, bei seiner Biosynthese von Vitamin K ab und macht die posttranslationalen Modifikationen Glu→Gla und Asp→β- Hydroxyasparaginsäure durch. Das Protein C, ein normales Plasmaprotein, zirkuliert als Serinproteasezymogen. Der physiologische Aktivator von Protein C ist Thrombin, das mit einem Membranglycoprotein einer Endothelzelle, Thrombomodulin, komplexiert ist. Freies Thrombin ist ein Hauptblutgerinnungsprotein und es wandelt Fibrinogen in Fibrin um, aktiviert Blutplättchen und die Hauptcofaktoren in der Blutgerinnungskaskade, die Faktoren Va und Villa, wodurch es eine wichtige Positivrückkopplung liefert, die die Blutgerinnungsreaktion stark amplifiziert. Im Gegensatz dazu ist freies Thrombin ein langsamer und uneffektiver Aktivator von Protein C. Wenn es mit Thrombomodulin komplexiert ist, ändert Thrombin schlagartig sein enzymatisches Aktivitätsspektrum. Im Komplex mit Thrombomodulin wandelt Thrombin Fibrinogen nicht mehr zu Fibrin um, aktiviert die Blutplättchen nicht mehr oder aktiviert die Blutgerinnungsfaktoren Va und Villa nicht mehr. Anstelle dessen wird Thrombomodulin-Thrombin ein hoch effizienter Aktivator von Protein C. Aktiviertes Protein C besitzt zwei Angriffspunkte. Es baut die aktivierten Formen der Cofaktoren Va und VIIIa proteolytisch ab und inaktiviert sie, während die Vorläuferformen der Cofaktoren Va und VIIIa sehr schlechte Substrate für aktiviertes Protein C sind. Das Protein S ist ein wichtiger Cofaktor für aktiviertes Protein C. In der Abwesenheit von Protein S baut aktiviertes Protein C die Cofaktoren Va und VIIIa nur minimal ab und inaktiviert sie nur minimal.
Diese zuerst in vitro festgestellten komplexen Reaktionen haben wichtige klinische Konsequenzen. Homozygote Protein C Defizienz führt zu einer Entwicklung von Purpura fulminans, einer letalen Form von disseminierter intravaskulärer Koagulation, die im Kleinkindalter oder in der frühen Kindheit auftritt. Die Anzahl an berichteten Fällen von heterozygoter Protein C und speziell Protein S Defizienz verbunden mit einer Thrombose der tiefen Venen und wiederkehrender pulmonaler Embolie steigt rapide an und eine vorläufige Schätzung vermutet, daß 10% aller Fälle von wiederkehrender Thrombose der tiefen Venen/pulmonaler Embolie eine heterozygote Protein S Defizienz darstellen.
Darüberhinaus legen neue Erkenntnisse nahe, daß erworbene Protein S Defizienz eine übliche Störung sein kann. Das Protein S kommt im Kreislauf in zwei Formen vor: Als freies Protein S und in einem eins plus eins Komplex mit C4b Bindungsprotein. Das C4b Bindungsprotein besitzt ein Mr von 570 kD und leistet eine wichtige Funktion bei der Herunterregulierung des Komplementsystems in der flüssigen Phase und an Zelloberflächen. Das Protein S besitzt mit dem C4b Bindungsprotein komplexiert keine bekannte biologische Aktivität. Bei einer Schwangerschaft und unmittelbar nach der Geburt tritt ein Wechsel von freien zu gebundenen Formen von Protein S mit einem steilen Abfall der funktionellen Protein S Aktivität auf. Beim nephrotischen Syndrom steigt der Anteil an mit C4b Bindungsprotein komplexierten Protein S und die Mengen an freiem Protein S werden deutlich erniedrigt. Zusätzlich ist aus derzeit noch nicht ganz geklärten Gründen die spezifische Aktivität von freiem Protein S beim nephrotischen Syndrom deutlich erniedrigt. Beim systemischen Lupus erythematodes (SLE), bei dem die Komplementaktivierung vorkommt, wird erneut ein Wechsel von freiem zu gebundenem Protein S beobachtet. Jeder von diesen Krankheitszuständen ist mit einem häufigen Auftreten von Thromboembolismus verbunden. Der Wechsel von freiem zu gebundenem Protein S könnte dann einen Kontrollpunkt darstellen, an dem eine Entzündung oder andere physiologische Veränderungen direkt das hämostatische Gleichgewicht beeinflussen. Eine weniger drastische aber auch deutliche Abnahme von freiem, biologisch aktivem Protein S wurde auch bei disseminierter intravaskulärer Koagulation und bei Lebererkrankung beobachtet.
Obwohl das Binden von Protein S an das C4b Bindungsprotein die Protein S Aktivität aufhebt, dürfte der Komplex die C4b Bindungsproteinaktivität nicht verlieren. Es verleitet jedoch zu der Spekulation, daß das Protein S mit seinen zur Verankerung dieses Proteins in Phospholipiddoppelschichtzellmembranen geschaffenen gamma-Carboxyglutaminsäureresten zum Transport für das C4b Bindungsprotein zu Membranstellen der Komplementherunterregulation dienen könnte.
Das Protein S wurde sowohl aus Plasma vom Menschen wie auch aus Plasma vom Rind isoliert. Das Protein S vom Rind besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einem ermittelten Molekulargewicht von 64 kD. Im Gegensatz dazu besitzt humanes Protein S ein scheinbares Molekulargewicht von 69-85 kD. Obwohl Methoden zur Isolierung des Protein S aus dem Plasma verfügbar sind, war bis zu dieser Erfindung wenig über die primäre oder sekundäre Struktur von Protein S bekannt. Trotz des Protein S betreffenden Informationsmangels kann die biologische und potentielle therapeutische Bedeutung von Protein S aus klinischen Beobachtungen gefolgert werden. Derzeit erhältliche Information zeigt, daß die erbliche Protein S Defizienz eine übliche Störung sein könnte. Die Protein S defizienten Patienten sind für venöse thrombotische Krankheiten in einem relativ jungen Alter prädisponiert. Die Heterozygoten sind für oberflächliche Thrombophlebitis, eine Thrombose der tiefen Venen und eine pulmonale Embolie gefährdet. Falls die schwerwiegenden Konsequenzen einer Protein S Defizienz gegeben sind, würde es äußerst vorteilhaft sein, das Gen für humanes Protein S zur Verwendung als wertvolle Ergänzung der antithrombotischen Therapie zu klonieren und zu exprimieren.

Definitionen

ApR - der ampicillinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
ep - ein DNA Segment, das den frühen SV40 Promotor des T- Antigen (A) Gens, die T-Antigenbindungsstellen und den SV40 Replikationsursprung enthält
Expressionsvektor - jeder rekombinante DNA Klonierungsvektor, in den ein Promotor eingebaut und zur Transkriptionssteuerung eines gewünschten Gens positioniert wurde
Humanes Protein S - ein Vorläuferpolypeptid, einschließlich Zwischenformen, wie Proprotein S, Decarboxyprotein S, nicht glycosyliertes Protein S und reifes Protein, wobei alle Formen des Proteins Protein S Aktivität zeigen
HmR - der hygromycinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
IVS - eine ein Intron kodierende DNA, auch intervenierende Sequenz genannt
NeoR - der neomycinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
Ori - ein Replikationsursprung eines Plasmids
pA - eine ein Polyadenylierungssignal kodierende DNA Sequenz
Promotor - eine DNA Sequenz, die die Transkription von DNA in RNA steuert
Protein S Aktivität - jede Eigenschaft von humanem Protein S, die für die biologische Funktion oder Antihuman-Protein-S- Antikörperbindungsaktivität verantwortlich ist
Replikon - eine DNA Sequenz, die die autonome Replikation eines Plasmids oder eines anderen Vektors kontrolliert oder erlaubt
Strukturgen - jede DNA Sequenz, die ein funktionelles Polypetid, einschließlich Translationsstartsignalen und Translationsstopsignalen kodiert
TcR - der tetracyclinresistente Phänotyp oder das diesen verleihende Gen
Translationsaktivierungssequenz - jede DNA Sequenz, einschließlich der, die eine Ribosomenbindungsstelle und ein Translationsstartcodon, wie 5'-ATG-3', kodiert, die für die Translation eines mRNA Transkripts in ein Peptid oder Polypeptid sorgt Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA Verbindungen und rekombinante DNA Expressionsvektoren, die einen Polypeptidvorläufer für humane Protein S Aktivität kodieren. Die Vektoren erlauben eine Expression der neuen DNA Verbindungen in eukaryontischen Wirtszellen. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind. Humane, für Protein S kodierende, Leber cDNA wurde kloniert und sequenziert. Die cDNA Sequenz besteht aus einer kodierenden Region für einen 676 Aminosäuren umfassenden Vorläufer, der von 5'- und 3'-nichtkodierenden Segmenten flankiert ist. Die kodierende Region kodiert ein 41 Aminosäuren umfassendes Signalpeptid, 635 Aminosäuren, die dem reifen Protein entsprechen und ein Stopcodon. Ein Ziel der Erfindung ist demnach die Bereitstellung der DNA Sequenz, die für humanes Protein S und dessen Vorläufer kodiert.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist demnach die Bereitstellung der Primärstruktur des Proteins, das humane Protein S Aktivität besitzt.
Ein zusätzliches Ziel der Erfindungist die Bereitstellung eines Plasmids, das ein, einen humanen Protein S Vorläufer kodierendes Gen enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pShd.
Die Fig. 2 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pHHS-IIa. Die in Klammern angegebene PstI Restriktionsschnittstelle wird nicht wiederhergestellt.
Die Fig. 3 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKE1.
Die Fig. 4 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKneol.
Die Fig. 5 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2cat.
Die Fig. 6 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPcat.
Die Fig. 7 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBLcat.
Die Fig. 8 ist ein Fließschema, das die Konstruktion von Plasmid pL133 zeigt.
Die Fig. 9 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC.
Die Fig. 10 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC4.
Die Fig. 11 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2hyg.
Die Fig. 12 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChyg1.
Die Fig. 13 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChd1.
Die Fig. 14 ist eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid phd.
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinantes, humanes Protein S, das mittels einer doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure, die ein Polypeptid mit humaner Protein S Aktivität kodiert, hergestellt wird. Die gesamte Aminosäuresequenz des humanen Protein S Vorläufers wie auch der kodierende Strang, der ein Polypeptid mit humaner Protein S Aktivität kodierenden DNA, ist im folgenden dargestellt.
Die Aminosäuresequenz des Protein S Vorläufers basiert auf der cDNA Sequenz. Der Vorläufer besteht schematisch aus sieben getrennten Domänen und einer unbekannten Region. Diese Regionen werden durch die folgenden ungefähren Aminosäuregrenzen (AS) zusammengefaßt: Ein Signalpeptid (AS -41 bis -1), ein gamma- Carboxyglutamat (Gla) Segment (AS 1-37), eine Linkerregion (AS 38- 73), vier epidermale Wachstumsfaktordomänen (AS 74-121, 122-165, 166-207, 208-248) und eine unbekannte Region (AS 249-635). Die Numerierung der Aminosäurereste basiert auf der Benennung des aminoterminalen Rests des reifen Proteins als +1 (Rest Nummer 42 in der oben gezeigten Vorläuferproteinsequenz). Die Erfindung liefert weiterhin rekombinante Plasmide, die ein Gen enthalten, das humanes Protein S kodiert und Mikroorganismen oder Zellinien, die durch diese Plasmide transformiert sind.
Die erfindungsgemäßen DNA Verbindungen leiten sich von einem einzelnen cDNA Klon ab, der aus humaner Leber mRNA hergestellt wurde, die das gesamte Gen einschließlich beider 5' und 3' nichtkodierender Sequenzen für den humanen Protein S Vorläufer kodiert.
Anfänglich wird eine cDNA Genbank in einem Lambda (λ) gt11 Expressionsvektor (lac5 nin5 cI857 S100) nach dem von Young und Davis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194-1198 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die in Lambda gt11 konstruierte rekombinante humane Leber cDNA Genbank wurde von den Clontech Laboratories, Inc., 922 Industrial Avenue, Palo Alto, California 94303 bezogen. Diese Genbank wird mittels herkömmlicher Verfahren mit polyklonalen Antikörpern gescreent, die in einer Ziege gegen humanes Protein S gebildet wurden. Ungefähr 2·10&sup6; einzelne Rekombinanten werden in der Form von Phagenplaques auf einem Rasen von Escherichia coli Y1090 gescreent. E. coli Y1090 ist bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 37197 erhältlich.
Um sich gegen die Möglichkeit zu schützen, daß das Fusionsprotein für den Wirt toxisch sein könnte, wird die Plaquebildung ohne die Expression vom Promotor des lacZ Gens durch Inkubation der Platten bei 42ºC ausgelöst. Nachdem die Anzahl der infizierten Zellen um die Plaques herum groß ist, wird die lacZ-gesteuerte Genexpression durch die Zugabe von Isopropylthio-β-galaktosid (IPTG) induziert. Dies wird erreicht, indem man eine IPTG-getränkte Nitrocellulosefilterscheibe über den Rasen legt. Nach einer Inkubationszeit werden die Nitrocellulosefilter mit dem daran gebundenen Protein gewaschen, mit dem primären Antikörper, dem biotinylierten sekundären Antikörper, gefolgt von einem Avidin- Peroxidasekonjugat, behandelt. Die positiven Kolonien werden durch eine Farbreaktion identifiziert, wenn sie Wasserstoffperoxyd ausgesetzt werden.
Die identifizierten Positiven werden gepickt und bei einer Dichte von 5000 Plaques pro Platte erneut getestet. Einige der positiven Plaques werden gepickt und bei einer Dichte von 400 Plaques pro Platte erneut gescreent. Unter Verwendung der isolierten Plaques des letzten Screenings werden große Mengen an gereinigter Phagen DNA isoliert.
Der anfänglich unternommene Schritt, um die in den Phagenklonen eingebaute cDNA zu kartieren, ist, die Größe(n) des (der) EcoRI Fragments (Fragmente) zu bestimmen. Bei der Konstruktion der Genbank werden die cDNA Fragmente mit künstlichen EcoRI Linkern ligiert und in eine EcoRI Einzelschnittstelle im Lambda gt11 Molekül inseriert. Der Verdau eines rekombinanten Phagen DNA Moleküls mit EcoRI würde die zwei Lambda "Arme" erzeugen (19,6 und 24,1 kb) und alle anderen Fragmente, die dadurch hergestellt werden, entsprechen der inserierten DNA. (Wenn die DNA Sequenz des Inserts keine interne EcoRI Schnittstelle enthält, dann wird nur ein EcoRI Fragment erzeugt. Dementsprechend ergeben ein oder mehrere interne EcoRI Schnittstellen zwei oder mehr zusätzliche EcoRI Fragmente). Demnach wird die gereinigte Phagen DNA mit EcoRI verdaut und durch Elektrophorese entweder auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel oder auf einem 1,0%igen Agarosegel aufgetrennt. Einer der größten Klone, als 1-1 bezeichnet, enthält zwei EcoRI Fragmente von 1,8 kb und 0,8 kb. Die von diesem Klon isolierten EcoRI Fragmente werden anschließend in Plasmid pBR322 subkloniert und zur Transformation von E. coli RR1 Zellen verwendet.
Nach der Transformation und der Plasmididentifizierung wird die Plasmid DNA zur Präparation für die DNA Sequenzierung amplifiziert und gereinigt. Die subklonierten DNA Fragmente von den als pLHS-21 und pLHS-22 bezeichneten Klonen werden gemäß der Beschreibung von Maxam und Gilbert, 1980, Methods in Enzymology 61 : 497 sequenziert.
Die Lokalisierung der einzelnen DNA Sequenzen innerhalb der durch EcoRI erzeugten Restriktionsfragmente wird durch Southern Transferanalyse erreicht. Zwei unabhängige, gemischte Sonden, die unten in Tabelle 1 beschrieben sind, werden zum Hybridisierungsverfahren verwendet. Diese Sonden werden chemisch entweder mittels eines Systhec 1450A DNA Synthesizers (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, MN 55421) oder eines ABS 380A DNA Synthesizers (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) synthetisiert. Es sind im Fachgebiet viele DNA synthetisierende Geräte bekannt und können zur Herstellung der Fragmente verwendet werden. Zusätzlich können die Fragmente auch herkömmlich im wesentlichen gemäß den Verfahren von ltakura et al., 1977, Science 198 : 1056 und Crea et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 : 5765 hergestellt werden.

Tabelle 1

Sonde 80: 23mer/128 Kombinationen
Sonde 81: 20mer/64 Kombinationen
Die Sonde 80 entspricht den Aminosäureresten 83-90 von einer der EGF Domänen der Aminosäuresequenz des Rinds, die von J. Stenflo (10. Internationaler Kongress über Thrombose und Hämostase, San Diego, California, Juli, 1985) vorgestellt wurde. Die Sonde 81 basiert auch auf der Rindersequenz und entspricht den carboxyterminalen Aminosäureresten 628-634. Diese zwei Sonden hybridisieren stark mit dem subklonierten 1,8 kb EcoRI Fragment.
Nachdem man die Sequenzdaten einmal erhalten hat, zeigt sich, daß die vollständige kodierende Sequenz von Protein S, besonders am 5' Ende des Moleküls, nicht in den Klonen der Lambda gt11 Genbank vorkommt. Daher wird eine zweite Genbank verwendet, um die fehlende Sequenz zu erzeugen. Auf der sequenzierten DNA basierend, werden zwei unten in Tabelle 2 als 21 und 22 bezeichnete Sonden von identifizierten Lambda gt11 Klonen abgeleitet.

Tabelle 2

Sonde 22 HinfI
Sonde 21 HincII
Die Sonde 22 entspricht einer 3' untranslatierten Region des Moleküls und wird zur Lokalisierung der 3' Regionen der cDNA verwendet. Im Gegensatz dazu wird die einer Region des 5' Endes des Moleküls entsprechende Sonde 21 zur Lokalisierung des 5' kodierenden Teils des Moleküls verwendet. Diese Sonden werden radioaktiv markiert und zur Untersuchung der cDNA Genbank verwendet. Nach der Hybridisierung werden einige Positive mittels Restriktionskartierung, Southern Hybridisierung und DNA Sequenzierung identifiziert. Ein als pHHS-IIa bezeichneter Klon enthält die dem vollständigen Protein S Vorläufer, wie auch den 5' und 3' nicht-kodierenden Segmenten entsprechende Sequenzen.
Das Plasmid pHHS-IIa enthält 3,3 kb der der Boten RNA (mRNA) entsprechenden cDNA, die deutlich größer ist als die Größe von 2,5 kb, über die von Stenflo 1985 berichtet wurde. Eine Northern Analyse, sowohl von Leber mRNA vom Rind als auch vom Menschen mit humanen cDNA Sonden, zeigt, daß die RNA Arten sich in einer Weise unterscheiden, die mit der Größe der cDNA übereinstimmt.
Das Plasmid pHHS-IIa kann konventionell aus E. coli K12 RR1/pHHS-IIa isoliert werden, einem Stamm, der hinterlegt und so zum Teil der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois wurde. Eine Kultur von E. coli K12 RR1/pHHS-IIa kann vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18071 erhalten werden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pHHS-IIa ist in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt.
Alternativ dazu können die spezifischen erfindungsgemäßen DNA Sequenzen chemisch unter Verwendung eines DNA Synthesizers, wie vorher beschrieben, synthetisiert werden. Trotz der relativ großen Größe des Protein S Gens können mehr als 1000 Desoxynukleotide enthaltende doppelsträngige DNA Segmente heute verhältnismäßig einfach mit Hilfe dieser "Genmaschinen" erzeugt werden (siehe M. H. Caruthers, 1985, Science 230 : 281).
Es kann eine Vielzahl an rekombinanten DNA Expressionsvektoren konstruiert werden, die die Protein S Aktivität kodierende DNA enthalten. Viele Säugetierwirtszellen besitzen die notwendige zelluläre Maschinerie zur Erkennung und korrekten Prozessierung des am Aminoterminus von humanem Protein S vorhandenen Signalpeptids. Einige Säugetierwirtszellen liefern auch die posttranslationalen Modifikationen, wie Glycosylierung, gamma-Carboxylierung und β-Hydroxylierung, wie sie bei im Blutplasma vorhandenem humanem Protein S beobachtet werden. Für die Transformation von eukaryontischen Wirtzellen existiert eine große Vielzahl an Vektoren, und durch die unten beispielhaft aufgeführten bestimmten Vektoren soll der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränkt werden.
Zwei Bestandteile der vorliegenden Erfindung verwenden Vektoren vom pSV2 Typ als Ausgangsmaterial zur Konstruktion von eukaryontischen Expressionsvektoren. Die Vektoren vom pSV2 Typ enthalten Segmente des SV40 Genoms, das aus einer definierten eukaryontischen Tanskriptionseinheit besteht: einem Promotor (ep), einer intervenierenden Sequenz (IVS) und einer Polyadenylierungsstelle (pA). In Abwesenheit des SV40 T-Antigens transformieren Vektoren vom pSV2 Typ Säugetier- und andere eukaryontische Wirtszellen durch Integration in die chromosomale DNA der Wirtszelle. Im Fachgebiet sind ein Vielzahl an Plasmidvektoren vom pSV2 Typ bekannt (siehe Eukaryotic Viral Vektors, herausgegeben von Gluzman, publiziert durch die Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York, 1982), wie die Plasmide pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr und pSV2-(3-Globin, worin der SV40 Promotor die Transkription eines inserierten Gens steuert. Diese Vektoren sind entweder von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland oder von dem vorher genannten NRRL erhältlich.
Die Aminosäurereste -41 bis -18 am Aminoterminus von humanem Protein S könnten als Signalpeptid fungieren, um die Sekretion von Protein S von der Leber in den Blutstrom zu steuern. Diese Reste sind nicht im reifen Protein S vorhanden. Die Reste -17 bis -1 des humanem Protein S Vorläufers, die wahrscheinlich das Propeptid des humanen Protein S umfassen, werden ebenfalls während der Prozessierung und Aktivierung des Proteins entfernt und dürften für die korrekte Faltung und Modifikation des Moleküls verantwortlich sein. Obwohl es hierin nicht extra beispielhaft aufgeführt ist, umfaßt die vorliegende Erfindung auch Protein S Derivate wie "Proprotein S". Die vorliegenden DNA Verbindungen können durch Deletion des den Aminoterminus und die Reste -41 bis -18 des humanen Protein S Vorläufers kodierenden Teils leicht modifiziert werden, um das daraus resultierende Derivat zu exprimieren.
Fachleute sehen sofort, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Expression eines bestimmten Protein S Derivats in eukaryontischen Wirtszellen beschränkt ist. In der Regel prozessieren Prokaryonten eukaryontische Signalpeptide nicht effizient und es wäre daher etwas ineffizient, den signalpeptidkodierenden Teil des Gens für den humanen Protein S Vorläufer in Prokayonten zu exprimieren. Obwohl es nicht extra beispielhaft aufgeführt ist, gehört zur vorliegenden Erfindung auch die Fusion einer DNA, die ein prokaryontisches Signalpeptid kodiert, mit der erfindungsgemäßen, die Protein S Aktivität kodierenden DNA zur Expression und Sekretion der Protein S Aktivität in Prokaryonten.
Brauchbare Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungs gemäßen Expressionsvektoren beinhalten Expressionsvektoren, in denen der BK Virusenhancer (Enh) in Gegenwart eines unmittelbar frühen Genprodukts eines großen DNA Virus verwendet wird, um die Transkription eines rekombinanten Gens in eukaryontischen Wirtszellen zu steigern. Daher sind solche Vektoren zur Expression des erfindungsgemäßen Protein S kodierenden Gens brauchbar. Die Konstruktion dieser Vektoren ist in den Beispielen 8-17 im Detail beschrieben. Ein kurzer Überblick über ihre Konstruktion folgt gleich.
Das BK Virus (ATCC VR-837) kann gekauft oder leicht in großen Mengen isoliert werden, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist. Alternativ dazu, ist es auch bequem, die BK Virus DNA auf einen Plasmidklonierungsvektor zu klonieren und den rekombinanten Vektor als Quelle der BK Virus DNA Sequenzen zu verwenden. Demnach wird die BK Virus DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten, das aufgrund der Anwesenheit von nur einer EcoRI Schnittstelle im BK Genom eine lineare BK DNA bildet. Das Plasmid pUC8 (erhältlich von den Bethesda Research Laboratories (BRL), P.O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877) wird ebenfalls mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und linearisiert, und die EcoRI-geschnittene Plasmid pUC 8 DNA wird mit der EcoRI geschnittenen BK Virus DNA unter Bildung der Plasmide pBKE1 und pBKE2 ligiert, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der BK Virus DNA unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKE1 ist in Fig. 3 der Zeichnungen dargestellt. Die Konstruktion der Plasmide pBKE1 und pBKE2 ist in Beispiel 9 beschrieben.
Das virale BK Genom wurde auch mit einem Teil von Plasmid pdBPV-MMTneo kombiniert, um die Plasmide pBKneo1 und pBKneo2 zu konstruieren. Das Plasmid pdBPV-MMTneo, etwa 15 kb groß und von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37224 erhältlich, enthält das Replikon und das β-Lactamasegen vom Plasmid pBR322, den Metallothioninpromotor der Maus (MMTpro), der zur Expression eines Strukturgens positioniert wurde, das ein Neomycinresistenz-verleihendes Gen kodiert, und etwa 8 kb der Rinderpapillomavirus (BPV) DNA. Das Plasmid pdBPV-MMTneo kann mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut werden, um zwei Fragmente zu erzeugen: Das 8 kb Fragment, das die BPV DNA enthält und ein 7 kb Fragment, das die anderen oben beschriebenen Sequenzen enthält. Das BK Virus hat nur eine BamHI Restriktionsschnittstelle und die Plasmide pBKneo1 und pBKneo2 werden durch Ligation des 7 kb BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pdBPV-MMTneo mit der durch BamHI linearisierten BK Virus DNA konstruiert. Die Konstruktion der Plasmide pBKneo1 und pBKneo2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der BK Virus DNA unterscheiden, ist in Beispiel 10 beschrieben, und eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKneo1 ist in Fig. 4 der Zeichnungen dargestellt.
Ein zusätzlicher Vektor, der als Ausgangsmaterial zur Konstruktion der vorliegenden Expressionsvektoren brauchbar ist, ist das als pBLcat bezeichnete Plasmid. Dieses Plasmid enthält die BK Enhancersequenz in Serie mit dem späten Promotor des humanen Adenovirus Typ 2 (Ad2LP), der zur Expressionssteuerung des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Enzyms (CAT) positioniert ist. Das Plasmid pSV2cat dient als leicht zugängliche Quelle des CAT Gens und kann von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 37155 erhalten werden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2cat ist in Fig. 5 der Zeichnungen dargestellt. Die DNA des humanen Adenovirus Typ 2 ist im Handel erhältlich und kann auch von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC VR-2 bezogen werden.
Kurz gesagt wird das Plasmid pBLcat durch Ligation des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments der DNA des humanen Adenovirus Typ 2, das den späten Promotor enthält, mit stumpfendigen BclI Linkern ligiert, die nur an das PvuII Ende des AccI-PvuII Restriktionsfragments angehängt werden. Das entstehende Fragment wird dann mit dem 4,51 kb AccI-StuI Restriktionsfragment von Plasmid pSV2cat unter Bildung eines als Zwischenstufe benötigten Plasmids pLPcat ligiert, für das eine Restriktions- und Funktionskarte in Fig. 6 der Zeichnungen dargestellt ist. Das gewünschte Plasmid pBLcat wird aus Plasmid pLPcat durch Ligation des Replikationsursprungs- und Enhancer-enthaltenden 1,28 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments der BK Virus DNA mit dem 4,81 kb AccI-StuI Restriktionsfragment von Plasmid pLPcat konstruiert. Eine Restriktions- und Funktionskarte des entstehenden Plasmids pBLcat ist in Fig. 7 der Zeichnungen dargestellt. Die Konstruktion von Plasmid pBLcat ist in Beispiel 11 eingehend beschrieben.
Das Plasmid pBLcat ist eine leicht zugängliche Quelle einer "Kassette" mit dem BK Enhancer und spätem Adenovirus Promotor, die ein 870 bp HindIII Restriktionsfragment ist, das bequem in einen eukaryontischen Expressionsvektor inseriert werden kann, um die Expression eines Produkts zu steigern, das von diesem Vektor kodiert wird.
Beispielsweise wurde die Kassette mit dem BK Enhancer und spätem Adenovirus Promotor zur Verbesserung der Expression von humanem Protein C durch Ligation der Kassette in das Plasmid pL133 verwendet. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pL133 ist in Fig. 8 der Zeichnungen dargestellt.
Das Plasmid pL133 ist auch ein bequemer Expressionsvektor zur Expression von Protein S. Dieses Plasmid kann mit dem Restriktionsenzym BclI (zur Deletion des Protein C Gen enthaltenden Fragments) verdaut werden und mit Klenow behandelt werden, um ein lineares Fragment mit stumpfen Enden zu erzeugen. Das gesamte auf einem 2,7 kb FnuDII-EcoRV Restriktionsfragment enthaltene Protein S Gen kann dann mit dem Klenow-behandelten BclI Vektorfragment unter Bildung eines Protein S Expressionsvektors ligiert werden. Das Plasmid pL133, dessen Konstruktion in Beispiel 12 angegeben ist, wird auch als ein als Zwischenstufe benötigter Vektor zur Konstruktion von zusätzlichen Expressionsvektoren verwendet. Daher wird das Plasmid mit dem Restriktionsenzym HindIII verdaut und dann mit dem 0,87 kb HindIII Restriktionsfragment von Plasmid pBLcat unter Bildung des Plasmids pLPC ligiert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC ist in Fig. 9 der Zeichnungen dargestellt, und die Konstruktion von Plasmid pLPC ist in Beispiel 13 eingehend beschrieben.
Das Plasmid pLPC enthält, wie Plasmid pL133, den Enhancer, die frühen und späten Promotoren, die T-Antigenbindungsstellen und den Replikationsursprung von SV40. Diese Elemente liegen auf der SV40 DNA nahe zusammen und sind schwer zu schildern. Das Binden des T-Antigens an die T-Antigenbindungsstellen, das für die SV40 Replikation notwendig ist, fördert die Transkription vom späten SV40 Promotor und hat überraschenderweise einen ähnlichen Effekt auf die frühen und späten Promotoren von BK. Da das große Ausmaß der T-Antigen-gesteuerten Replikation eines Plasmids, das den SV40 Replikationsursprung enthält, für die Wirtszelle im allgemeinen letal ist, werden weder das Plasmid pLPC noch das Plasmid pL133 stabil als episomale (extrachromosomale) Elemente in Gegenwart des SV40 T Antigens gehalten und die zwei Plasmide müssen deswegen in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrieren, um stabil gehalten werden zu können.
Um ein Derivat von Plasmid pLPC zu konstruieren, das als stabil gehaltenes Element in einer transformierten eukaryontischen Zelle existieren kann, wird das gesamte BK Genom als EcoRI- linearisiertes Restriktionsfragment in die EcoRI Einzelschnittstelle von Plasmid pLPC inseriert. Diese Insertion bildet zwei als pLPC4 und pLPC5 bezeichnete Plasmide, die sich nur in Bezug auf das BK EcoRI Fragment unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC4 ist in Fig. 10 der Zeichnungen dargestellt, und die Konstruktion der Plasmide pLPC4 und pLPC5 ist in Beispiel 11 weitergehend beschrieben.
Die episomale Beibehaltung eines rekombinanten DNA Expressionsvektors wird nicht immer gegenüber der Integration in das Chromosom der Wirtszelle bevorzugt. Aufgrund der Abwesenheit eines selektionierbaren Markers, der in eukaryontischen Wirtzellen funktionsfähig ist, ist jedoch die Identifizierung von stabilen, eukaryontischen Transformanden von Plasmid pLPC schwierig, bis das Plasmid pLPC mit einem anderen Plasmid cotransformiert wird, das einen selektionierbaren Marker enthält. Aus diesem Grund wurde das Plasmid pLPC modifiziert, um abgeleitete Plasmide herzustellen, die in eukaryotischen Wirtzellen selektionierbar sind.
Dies wird durch Ligation von Plasmid pLPC mit einem Teil von Plasmid pSV2hyg ausgeführt, einem Plasmid, das ein Hygromycinresistenz-verleihendes Gen enthält. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2hyg, das vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18039 erhalten werden kann, ist in Fig. 11 der Zeichnungen dargestellt. Das Plasmid pSV2hyg wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und das 2,5 kb BamHI Restriktionsfragment, das das gesamte Hygromycinresistenz-verleihende Gen enthält, wird isoliert, mit Klenow Enzym behandelt (dem großen Fragment, das durch Subtilisinspaltung der E. coli DNA Polymerase I hergestellt wird) und dann mit dem Klenow-behandelten, 5,82 kb NdeI- StuI Restriktionsfragment von Plasmid pLPC unter Bildung der Plasmide pLPchyg1 und pLPChyg2 ligiert. Die Plasmide pLPChyg1 und pLPChyg2 unterscheiden sich nur in Bezug auf die Orientierung des Hygromycinresistenz-verleihenden Gens. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChyg1 ist in Fig. 12 der Zeichnungen dargestellt, und die Konstruktionsvorschrift für die Plasmide pLPChyg1 und pLPChyg2 ist in Beispiel 15 beschrieben.
Das Plasmid pLPChyg1 wird modifiziert, um ein Dihydrofolatreduktase (dhfr) Gen einzuführen. Das dhfr-Gen ist ist ein selektionierbarer Marker in dhfr-negativen Zellen und kann zur Erhöhung der Kopiezahl eines DNA Segments durch Aussetzen der Wirtszelle gegenüber steigenden Mengen Methotrexat verwendet werden. Das dhfr-Gen wird vom Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) erhalten. Die Verwendung eines bestimmten dhfr-Gens ist nicht entscheidend für die Konstruktion der vorliegenden Vektoren.
Nach der Isolierung wird das dhfr-Gen-enthaltende, 1,9 kb BamHI Restriktionsfragment mit Klenow Enzym behandelt und in das partial-EcoRI-verdaute Plasmid pLPChyg1 unter Bildung der Plasmide pLPChd1 und pLPchd2 inseriert. Das Plasmid pLPChyg1 enthält zwei EcoRI Restriktionsschnittstellen, eine im Hygromycinresistenz-verleihenden Gen und eine in den von Plasmid pBR322 abgeleiteten Sequenzen. Das das dhfr-Gen enthaltende Fragment wird in die EcoRI Schnittstelle unter Bildung der Plasmide pLPChd1 und pLPChd2 inseriert, die in den von pBR322 abgeleiteten Sequenzen von Plasmid pLPChyg1 liegt. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChd1 ist in Fig. 13 der Zeichnungen dargestellt. Die Konstruktion der Plasmide pLPChd1 und pLPChd2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung des dhfr-Gen-enthaltenden DNA Segments unterscheiden, ist in Beispiel 16 beschrieben.
Das Plasmid pLPChd1 wird modifiziert, um Plasmid phd zu bilden, ein Plasmid, das sowohl die Kassette mit dem BK Enhancer und den späten Adenoviruspromotor, als auch die Hygromycinresistenz-verleihenden und dhfr-Gene enthält. Um das Plasmid phd zu konstruieren, wird das Plasmid pLPChd1 aus dam&supmin; E. coli Wirtszellen präpariert, mit dem Restriktionsenzym BclI verdaut und rezirkularisiert, was die, humanes Protein C kodierende, DNA deletiert. Das Plasmid phd enthält eine BclI Einzelschnittstelle, die sehr geeignet zur Insertion jeder gewünschten Sequenz positioniert ist, die vom erfindungsgemäßen BK Enhancer-späten Adenoviruspromotor aus exprimiert werden soll. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid phd ist in Fig. 14 der Zeichnungen dargestellt, und die Konstruktionsvorschrift für das Plasmid phd ist in Beispiel 17 beschrieben.
Schließlich wird das erfindungsgemäße Plasmid pShd durch Ligation des 2,7 kb Protein 5-enthaltenden FnuDII-EcoRV Restriktionsfragments des Plasmids pHHS-IIa mit dem BclI-verdauten, Klenow-behandelten Plasmid phd konstruiert. Der entstehende Expressionsvektor verwendet die BK Enhancer-später Adenoviruspromotor Kassette, um die Expression von humanem Protein S zu steuern.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann wie oben beschrieben durch einfaches Ersetzen des Protein C Gens, das durch BclI Restriktionsstellen im Plasmid pL133 gebunden ist (die dann mit Klenow behandelt werden) durch das von Plasmid pHHS- IIa isolierte 2,7 kb FnuDII-EcoRV Restriktionsfragment konstruiert werden. Der entstehende Expressionsvektor verwendet den frühen SV40 Promotor, um die Expression von humanem Protein S zu steuern. Beide Protein S Expressionsvektoren sind für die Herstellung von humanem Protein S brauchbar.
Es ist zu erwarten, daß Protein S eine wertvolle Ergänzung in einigen Bereichen der antithrombotischen Therapie werden kann. Der eindeutigste Bereich ist die heterozygote Protein S Defizienz, die, wie schon vorher erwähnt, eine ziemlich große Anzahl von Patienten mit wiederkehrender Thrombose der tiefen Venenpulmonaler Embolie betrifft. Es wird angestrebt, daß Protein S solchen Patienten während akuter thrombotischer Ereignisse durch intravenöse Infusionen verabreicht wird. Es ist ebenfalls zu erwarten, daß Protein S bei der Therapie von erworbener Protein S Defizienz brauchbar sein wird, die bis jetzt während der Schwangerschaft, SLE und beim nephrotischen Syndrom gefunden wurde. Es ist nicht ohne Grund zu erwarten, daß die Liste an Krankheitszuständen mit erworbener Protein S Defizienz anwachsen wird, um viele akute und chronische entzündliche Zustände wie auch Autoimmunkrankheiten und Krebs zu erfassen. Die benötigte Dosis kann mit Zuverlässigkeit nur in vorklinischen und klinischen Versuchen festgestellt werden und die folgenden Berechnungen sollten nur als Versuch betrachtet werden. Der normale Spiegel an Gesamtprotein S im Plasma beträgt 30 ug/ml und der normale Spiegel an freiem Protein S beträgt 10-15 ug/ml. Möchte man die zirkulierenden Mengen an Protein S in einem Patienten um 5-10 ug/ml anheben, müßten 30-60 mg intravenös verabreicht werden, vorausgesetzt, daß das Verteilungsvolumen von Protein S ähnlich dem von Faktor IX ist. Die biologische Halbwertszeit von Protein S wurde beim Menschen mit 4}-48 Stunden bestimmt. Daher würden wahrscheinlich Infusionen alle 36-48 Stunden ausreichen, um einen Patienten während der akuten Phasen der Krankheit zu versorgen.
Es existiert die Möglichkeit, daß Protein S eine wichtige Funktion als Bindungshilfe für das C4b-Bindungsprotein auf Membranoberflächen an Stellen spielt, an denen Komplementaktivierung stattfindet. Sollte sich diese Hypothese als richtig erweisen, könnte die therapeutische Rolle von Protein S um viele Krankheitszustände erweitert werden, bei denen die Komplementaktivierung ein wichtiger pathogener Faktor ist, einschließlich eines weiten Feldes an Autoimmunkrankheiten und Infektionskrankheiten.
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert. Die Beispiele beschreiben die zur Isolation und Identifizierung des genetischen, humanes Protein S kodierenden Materials verwendeten Verfahren, wie auch die zur chemischen Synthese des humane Protein S Aktivität kodierenden Gens verfügbaren Verfahren. Die zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendeten Verfahren sind ebenfalls beschrieben. Erklärungen der Verfahren werden geliefert, wo sie geeignet erscheinen.

Beispiel 1

Screening und Identifizierung von Lambda gt11 Phagen, die ein Protein exprimieren das mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanes Protein S reagiert

Die spezielle in der vorliegenden Erfindung verwendete Lambda gt11 Genbank ist kommerziell von den Clontech Laboratories, Inc., 922-Industrial Ave., Palo Alto, California 94303 erhältlich. Die Lambda gt11 Genbank wird aus humaner Leber cDNA erzeugt und hat einen Umfang von 5·10&sup5; Plaques. Diese Genbank wird verdünnt und etwa 200 000 Phagen werden auf jede von zehn 150 mm Platten ausplattiert, die TY Agar enthalten (10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 15 g Agar pro Liter). Das unten beschriebene, zum Screening verwendete Verfahren war im wesentlichen das vom Hersteller. Direkt nachdem die Phagen ausplattiert wurden, werden die Platten bei 42ºC für 3,5 Stunden inkubiert. Jede Platte wird mit einem Nitrocellulosefilter bedeckt, der mit 10 mM IPTG gesättigt ist und dann für 16 Stunden auf 37ºC gebracht. Die Platten werden für mindestens 15 Minuten auf 4ºC gekühlt, bevor die Filter mit Indiatinte markiert werden und in einen Waschpuffer TBST (50 mM Tris-HCl pH = 719, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) überführt werden. Die Filter werden dreimal mit je 5 Minuten pro Waschvorgang in 200 ml dieses Puffers gewaschen. Alle Waschschritte und Reaktionen werden bei Raumtemperatur ausgeführt. Um die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Nitrocellulose zu reduzieren, werden die Filter dann mit 20%igem Kälberserum in TBST für 30 Minuten behandelt und wie vorher gewaschen. Die erste Antikörperreaktion verwendet einen polyklonalen Antikörper, der in der Ziege gegen humanes Protein S erzeugt wurde. Diese Antikörper können mittels mehrerer herkömmlicher Techniken einschließlich der in Methods in Enzymology 104 : 381-387 isoliert werden. Nach einer Stunde Inkubation mit dem primären Antikörper werden die Filter erneut gewaschen und dann mit einem biotinyliertem sekundären Antikörper (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA 94010) für 30 Minuten behandelt. Die Filter werden gewaschen und in avidinkonjugierten Meerrettichperoxidasekomplex enthaltendes TBST für 30 Minuten überführt. Für den letzten Waschschritt wird nur TBS verwendet -- das Tween 20 wird weggelassen. Die Peroxidasesubstratlösung wird durch Mischen von 3 mg/ml 4- Chlornaphthol in Methanol mit TBS plus 0,01 M Imidazol hergestellt. Drei Prozent Wasserstoffperoxyd werden zu 1/250 Volumen gegeben und die Lösung wird umgehend auf die Filter gegeben. Die Farbreaktion ("positive" Plaques werden purpurrot) ist innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen.
Wenn einmal positive Plaques identifiziert worden sind, wird der entsprechende Bereich der Originalplatte entfernt, zu sterilem Lambdaverdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM MgSO&sub4;) gegeben und bei 4ºC mit einigen Tropfen Chloroform gelagert. Später werden diese Phagen in einer Dichte von etwa 5 000 Plaques pro 100 mm Platte ausplattiert und mit dem selben Verfahren gescreent. Die positiven Plaques werden einer dritten Screeningrunde bei einer Dichte von etwa 100 Plaques pro 100 mm Platte unterzogen und isolierte Plaques werden gesammelt und wie vorher gelagert.

Beispiel 2

Kartieren und Subklonieren der cDNA Region des gereinigten Phagen

Große Mengen an gereinigter Phagen DNA werden wie folgt mittels der Plattenlysattechnik (Davis, Botstein und Roth, 1980, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbour Laboratories) isoliert. Zehn 150 mm Platten werden jeweils mit E. coli ausplattiert, die mit etwa 106 plaquegereinigten Phagen infiziert sind. Beinahe konfluente Lyse wird nach vier Stunden bei 42ºC erreicht. An dieser Stelle werden die Platten für eine Stunde bei 4ºC gekühlt, mit 10 ml 0ºC kaltem Lambdaverdünnungspuffer überschwemmt und bei 4ºC über Nacht gelagert. Der Puffer wird am nächsten Morgen sorgfältig entfernt und mit einigen Tropfen Chloroform behandelt, um etwaige verbleibende Zellen zu lysieren. Die Phagenpartikel werden aus dem Überstand durch Zentrifugation bei 20 000 Upm für 3 Stunden bei 18ºC entfernt und das Pellet wird in 1 ml Lambdaverdünnungspuffer resuspendiert. Die Phagenpartikel werden mittels Cäsiumchloridgradienten weiter gereinigt: Die 1 ml Phagenprobe wird auf einen Stufengradienten mit 1 ml Lösung I (5 M CsCl, 10 mM MgSO&sub4;&sub1; 0,1 mM Na&sub2;EDTA, 10 mM Tris pH = 8,0) und 3 ml Lösung II (3 M CsCl, 10 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM Na&sub2;EDTA) aufgebracht. Nach 60 Minuten bei 30 000 Upm (18ºC) wird eine den Phagenpartikeln entsprechende, schwache blaue Bande an der Interphase sichtbar. Mittels einer Spritze und einer Nadel werden 0,5 ml der Lösung an der Interphase entfernt. An dieser Stelle kann, falls erforderlich, ein zweiter Gradient durchgeführt werden.
Um die Phagen DNA aus der Proteinhülle freizusetzen, wird ein gleiches Volumen an deionisierten Formamid mit jeder Probe gemischt und bei Raumtemperatur für mehr als 30 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird mit 0,5 ml Wasser verdünnt, und die DNA wird mit zwei Volumen Ethanol bei Raumtemperatur gefällt. Die DNA wird für 10 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert, das Pellet wird mit 5 ml 68%igem Ethanol (-20ºC) gewaschen, getrocknet und in 500 ul TE (10 mM Tris-HCl pH = 8,0 und 1 mM EDTA) resuspendiert. Es kann eine Menge an 200-1000 ug an Gesamtphagen DNA gewonnen werden.
Die Phagen DNA von jedem der sechs positiven Klone wird getestet, um die Größe(n) des (der) EcoRI Fragments (Fragmente) zu bestimmen, die aus dem cDNA Insert entstehen. Etwa 50 ug gereinigte DNA werden in einem Volumen von 200 ul für 90 Minuten bei 37ºC verdaut, die 20 ul 10fach EcoRI Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl) und 50 Einheiten EcoRI enthalten. Alle hierin erwähnten Enzymeinheiten beziehen sich auf die Einheiten-Definitionen der New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915, obwohl die tatsächliche Enzymquelle unterschiedlich sein kann. Die Proben werden mit Ethanol gefällt und dann durch Elektrophorese entweder auf einem 3,5%igem Polyacrylamidgel (29:1, Acrylamid:Bis-Acrylamid) oder auf einem 1,0%igen Agarosegel zusammen mit geeigneten im Handel erhältlichen Größenmarkern aufgetrennt. Die DNA wird mittels Ethidiumbromid sichtbargemacht und die Größe jeder Bande aufgrund ihrer Wanderung im Gel errechnet. Ähnliche Verdaus werden mittels XmnI, SstI und KpnI ausgeführt, um die Größe des Inserts und die Orientierung der Fragmente zu verifizieren. Einer der größten Klone, als 1-1 bezeichnet, enthielt EcoRI Fragmente mit 1,8 und 0,8 kb, wodurch sich eine Gesamtinsertgröße von 2,6 kb ergibt.
Die ersten Subklone wurden aus EcoRI Verdaus von Klon 1-1 erzeugt. Etwa 50 ug Phagen DNA werden wie oben beschrieben mit EcoRI zur anschließenden Ligation mit 100 ng EcoRI-verdautem dephosphoryliertem pBR322 verdaut.
Die Ligation wird in einem Gesamtvolumen von 20 ul einfachem Ligasepuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM DTT, 1 mM ATP) mit 400 Units der Ligase bei 15ºC über Nacht ausgeführt. Die käuflich von Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg MD 20877 erhältlichen E. coli RR1 Zellen werden gemäß dem von den Bethesda Research Laboratories bereitgestellten Protokoll zur Transformation verwendet und die transformierten Zellen werden auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltenden TY Platten selektioniert. Die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Plasmid DNA wird von 12 zufällig ausgewählten Klonen isoliert und mit EcoRI verdaut, um die Größe der subklonierten Fragmente zu bestimmen. Die erwarteten 1,8 und 0,8 kb Fragmente werden einzeln in pBR322 subkloniert und die entstehenden Plasmide jeweils als pLHS- 22 und pLHS-21 bezeichnet. Große Mengen an DNA werden als Vorbereitung zur DNA Sequenzierung mittels Chloramphenicolamplifizierung in Minimalmedium gefolgt von einer alkalischen Lyse gereinigt, wie es bei Maniatis, Fritsch und Sambrook, 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories beschrieben ist.

Beispiel 3

Isolation des 1,8 kb EcoRI Restriktionsfragments von Plasmid pLHS-22

Fünfzig ug des Plasmids pLHS-22 in 60 ul H&sub2;O werden mit 20 ul 10fach EcoRI Reaktionspuffer und 120 ul Wasser gemischt. Dieses Gemisch wird mit 50 Einheiten EcoRI bei 37ºC verdaut, bis der Verdau vollständig ist. Die EcoRI-verdaute DNA wird durch Elektrophorese auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, bis die 1,8 kb Bande von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist. Das Gel wird dann in einer verdünnten Ethidiumbromidlösung gefärbt, so daß die Banden mit ultraviolettem Licht sichtbar gemacht werden können.
Der das 1,8 kb EcoRI Restriktionsfragment enthaltende Bereich wird aus dem Gel ausgeschnitten, in ein Probenröhrchen gegeben und in kleine Stücke gebrochen. Ein ml Extraktionspuffer (500 mM NH&sub4;OAc, 10 mM MgOAc, 1 mM EDTA und 1% SDS) wird in das das Fragment enthaltende Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das Acrylamid wird durch Zentrifugation entfernt und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Das Acrylamid wird einmal mit 200 ul Extraktionspuffer gewaschen, erneut zentrifugiert, die Überstände werden vereinigt und durch einen Stopfen Glaswolle gedrückt, um etwaige verbleibende Verunreinigungen zu entfernen. Die DNA wird mit zwei Volumen Ethanol gefällt, gut gemischt und für 10 bis 30 Minuten in einem Trockeneis-Ethanolbad gehalten. Die DNA wird durch Zentrifugation gewonnen.
Etwa 15 ug des 1,8 kb EcoRI Restriktionsfragments werden durch dieses Verfahren gewonnen. Das gereinigte Fragment wird in 10 ul TE Puffer resuspendiert und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 4

Sequenzierungsstrategie der für humanes Protein S kodierenden cDNA

Die DNA Sequenz der für humanes Protein S kodierenden cDNA wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung des Maxam und Gilbert Protokolls bestimmt (Methods in Enzymology, 1980).

Beispiel 5

Southern Analyse der Protein S Subklone

Die Plasmid DNA wird von mehreren der in pBR322 subklonierten Protein S EcoRI Fragmente präpariert (in Beispiel 3 beschrieben), einschließlich der 1,8 und 0,8 kb Fragmente des Phagen 1-1. Die DNAs werden mit EcoRI wie in Beispiel 2 beschrieben verdaut und durch Elektrophorese auf einem 1,0%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Bedingungen bei der Herstellung des Gels, dem tatsächlichen Transfer und der Hybridisierung entsprechen im wesentlichen der Beschreibung von Smith und Summers, 1980, Anal Biochem, 109 : 123-129. Zwei unabhängige, gemischte Sonden, die in Tabelle 1 beschrieben sind, werden für die Hybridisierung verwendet. Wie vorher erwähnt, ist die erste Sonde Nr. 80 von der von J. Stenflo vorgestellten Rinderaminosäuresequenz abgeleitet. Diese Sonde entspricht den Aminosäuren Nr. 83-90 in einer der EGF Domänen des Moleküls vom Rind. Die ebenfalls auf der Sequenz vom Rind basierende Sonde 81 entspricht dem carboxyterminalen Aminosäuren Nr. 628-634. Das 1,8 kb EcoRI Fragment des Phagen 1-1 hybridisiert stark mit beiden dieser Sonden.

Beispiel 6

Kultivierung von E. coli K12 RR1/pHHS-IIa und Isolierung des Plasmids pHHS-IIa

A. Kultivierung von E. coli K12 RR1/pHHS-IIa

Fünf ml LB-Medium (10 g Pepton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt) werden mit einer Kultur von E. coli RRI/pHHS-IIa (NRRL B- 18071) beimpft und in einem belüftenden Schüttler bei 37ºC für etwa 16 Stunden inkubiert. Eine kleine Menge dieser Kultur wird auf einer 15 ug/ml Tetracyclin enthaltenden LB-Agarplatte ausgestrichen und bei 37ºC für etwa 16 Stunden wachsen gelassen. Eine Einzelkolonie wird in 5 ml 15 ug/ml Tetracyclin enthaltendes LB- Medium geimpft und unter Schütteln für etwa 16 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen.
Diese Kultur wird dann verwendet, um einen Liter 12 ug/ml Tetracyclin enthaltendes LB-Medium zu beimpfen und in einem belüftenden Schüttler bei 37ºC bis zu einer optischen Dichte (O.D.) bei 590 nm von 0,6 Absorptionseinheiten wachsen zu lassen und zu diesem Zeitpunkt werden 250 mg Chloramphenicol zu der Kultur zu geben. Die Inkubation wird für etwa 16 Stunden fortgesetzt, die Chloramphenicolzugabe hemmt die Proteinsynthese und hemmt daher die weitere Zellteilung, aber erlaubt die Fortsetzung der Plasmidreplikation.

B. Isolierung von Plasmid pHHS-IIa

Die in Beispiel 6A hergestellte Kultur wird in einem Sorvall GSA Rotor (DuPont Co., Instrument Produkts, Biomedical Division, Newton, CN 06470) bei 6 000 Upm für 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der entstehende Überstand wird verworfen. Das Zellpellet wird für mindestens zwei Stunden bei -20ºC eingefroren und dann aufgetaut. Das aufgetaute Zellpellet wird in 6,25 ml einer 25%igen Saccharose/SO mM Tris-HCl pH = 8 Lösung resuspendiert. Nach Zugabe und Mischen von 1,5 ml 10 mg/ml Lysozymlösung und 1,25 ml 0,5 M EDTA pH = 8,0 wird die Lösung für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Zehn ml der Lyselösung (0,1% Triton X-100, 0, 125 M EDTA pH = 8, 50 mM Tris pH = 8 ) werden zu den lysozymbehandelten Zellen gegeben, gemischt und die entstehende Lösung wird auf Eis für weitere 10 Minuten inkubiert.
Das Zelldebris wird aus der Lösung durch Zentrifugation bei 19 000 Upm für 30 Minuten in einem 5534 Rotor (Sorvall) entfernt. Das Volumen der Lösung wird mit TE auf 30 ml eingestellt und dann werden 28,9 g CsCl und 3,75 ml einer 10 mg/ml Ethidiumbromidlösung zugegeben und die Lösung wird in einen Vti50 Ultrazentrifugenrotorröhrchen (Beckman, Lincolnwood, IL 60646) dekantiert. Nach dem Zuschmelzen des Röhrchens wird die Lösung in einem Vti50 Rotor bei 49 000 Upm für 16 Stunden zentrifugiert. Die entstehende Plasmidbande wird, unter ultraviolettem Licht sichtbargemacht, isoliert. Das Ethidiumbromid wird mit TE-gesättigtem Isobutanol extrahiert und die Lösung mit 3 Volumen H&sub2;O verdünnt. Ein Vierzigstel Volumen 2,0 M NaOAc pH = 5 und zwei Volumen Ethanol werden zur Lösung gegeben, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei -20ºC. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifugation der Lösung in einem 5534 Rotor (Sorvall) für 30 Minuten bei 10 000 Upm pelletiert. Die DNA wird in 5 ml 0,3 M NaOAc resuspendiert. Zu dieser Lösung werden 10 ml Ethanol gegeben und die Lösung wird über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die Plasmid DNA wird, wie direkt darüber geschildert, pelletiert.
Das durch dieses Verfahren erhaltene 1 ug an Plasmid pHHS- IIa DNA wird in 1 ml TE Puffer resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pHHS-IIa ist in Fig. 2 der Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 7

Untersuchung der humanen Leber cDNA Genbank

Da dem Phagenklon 1-1 sowohl am 5' als auch am 3' Ende des Moleküls DNA Sequenzen fehlten, war es notwendig erneut nach Klonen zu screenen, die eine zusätzliche Sequenz enthalten. Für diesen Schritt wird eine unterschiedliche humane Leber cDNA Genbank verwendet. Diese Genbank, die den Vektor pBR322 verwendet, ist an anderer Stelle beschrieben (R. J. Beckmann et al., Nuc. Acid Res. 13 : 5233, 1985). Auf die bekannte DNA Sequenz basierend werden zwei Sonden isoliert und mit 21 und 22 bezeichnet. Die jeweilige Sequenz ist in Tabelle 2 angegeben. Die zu einem Bereich des 5' Endes homologe Sonde 21 besteht aus einem 110 bp Fragment, das durch die Erkennungssequenzen für HincII und HindIII gebunden ist. Die Sonde 22 entspricht einem 3' untranslatierten Bereich des Moleküls und ist ein durch die Erkennungsstellen für HinfI und EcoRI gebundenes 130 bp Fragment. Diese Sonden werden radioaktiv markiert und zur Untersuchung der cDNA Genbank mittels Standardtechniken (Maniatis, et al., 1982) verwendet. Die Sonden werden hybridisiert, bei 68ºC gewaschen und alle Filter doppelt angefertigt. Einige Positive werden durch dieses Verfahren identifiziert. Mittels Restriktionsenzymkartierung, Southern Hybridisierung und DNA Sequenzierung wird ein als pHHS-IIa bezeichneter Klon identifiziert, der die vollständige kodierende Region des Protein S Vorläufers enthält.

Beispiel 8

Präparation der BK Virus DNA

Das BK Virus erhält man von der American Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC VR-837. Das Virus wird in gefriergetrockneter Form geliefert und in Hank's ausgeglichener Salzlösung (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072) in einem Titer von etwa 10&sup5; plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml resuspendiert. Als Wirt der Wahl zur Präparation der BK Virus DNA werden primäre humane embryonale Nierenzellen (PHEK) verwendet, die von den Flow Laboratories, Inc., 7655 Old Springhouse Road, McLean, VA 22101 unter der Katalognummer 0-100 oder von M.A. Bioprodukts unter der Katalognummer 70-151 erhalten werden können.
Etwa fünf, eine geschlossene Schicht von etwa 10&sup6; PHEK Zellen enthaltende, 75 mm² Polystyrolflaschen werden zur Viruserzeugung verwendet. Etwa 1 ml des BK Virus wird in einem Titer von 10&sup5; PFU/ml zu jeder Flasche gegeben, die dann bei 37ºC für eine Stunde inkubiert wird, bevor frisches Kulturmedium (Delbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, mit 10% zugesetztem fetalem Rinderserum) zugegeben wird und die infizierten Zellen werden bei 37ºC für 10- 14 Tage, oder bis die volle cytopathogene Wirkung des Virus festgestellt wird, inkubiert. Diese cytopathogene Wirkung ist von Zellinie zu Zellinie und von Virus zu Virus unterschiedlich, aber besteht normalerweise aus sich abkugelnden, verklumpenden und sich vom Boden der Kulturflasche ablösenden Zellen.
Das Virus wird aus den Zellen durch drei Gefrier-Auftau-Zyklen frei gesetzt und der Zelldebris wird durch Zentrifugation bei 5000xg entfernt. Das in einem Liter Überstandflüssigkeit befindliche Virus wird durch die Zugabe von 100 g PEG-6000, eine Inkubation der Lösung für 24 Stunden und eine Zentrifugation bei 5000xg für 20 Minuten gefällt und geerntet. Das Pellet wird in 1/100stel des ursprünglichen Volumens 0,1fachem SSC Puffer (einfach SSC = 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA und 50 mM Tris-HCl pH = 7,8) resuspendiert. Die Virussuspension wird auf ein, 15 ml einer gesättigten Lösung von KBr enthaltendes, Röhrchen aufgebracht, das dann bei 75 000xg für 3 Stunden zentrifugiert wird. Zwei Banden sind in der KBr Lösung nach der Zentrifugation sichtbar. Die untere Bande, die das vollständige Virion enthält, wird gewonnen und auf einer Sephadex G-50 Säule mittels TE als Elutionspuffer entsalzt.
Natriumdodecylsulfat (SDS) wird zu der von der Säule erhaltenen Lösung an gereinigten Virionen in einer Konzentration von 1% gegeben, Pronase wird in einer Konzentration von 100 ug/ml zugegeben, und die Lösung wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Dann wird Cäsiumchlorid in einer Dichte von 1,56 g/ml zur Lösung gegeben und Ethidiumbromid wird in einer Endkonzentration von 100 ug/ml zur Lösung gegeben. Die Lösung wird in einem Sorvall 865 Rotor oder ähnlichem Vertikalrotor bei 260 000xg für 24 Stunden zentrifigiert. Nach der Zentrifugation wird die Virus DNA Bande isoliert und fünf Mal mit Isoamylalkohol extrahiert, der mit 100 mM Tris-HCl pH = 7,8 gesättigt ist. Die Lösung der BK Virus DNA wird dann gegen TE Puffer dialysiert, bis das 260 nm/280 nm Absorptionsverhältnis der DNA zwischen 1,75 und 1,90 liegt. Die DNA wird durch Einstellen der NaCl Konzentration auf 0,15 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Inkubation der Lösung bei -70ºC für mindestens 2 Stunden und Zentrifugation der Lösung bei 12 000xg für 10 Minuten gefällt. Das entstehende Pellet an BK Virus DNA wird in TE Puffer in einer Konzentration von 1 mg/ml suspendiert.

Beispiel 9

Konstruktion der Plasmide pBKE1 und pBKE2

Etwa 1 ug der in Beispiel 8 präparierten BK Virus DNA in einem ul TE Puffer wird in 2 ul 10fach EcoRI Puffer (1,0 M Tris- HCl pH = 7,5, 0,5 M NaCl, 50 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA) und 15 ul H&sub2;O gelöst. Etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI werden zu der DNA Lösung gegeben, und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert.
Etwa 1 ug Plasmid pUC8 (erhältlich von Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854) in 1 ul TE Puffer wird mit EcoRI im wesentlichen gemäß dem zur Herstellung der EcoRI-verdauten BK Virus DNA verwendeten Verfahren verdaut. Die EcoRI-verdaute Plasmid pUC8 DNA wird in 100 ul TE Puffer verdünnt, 0,06 Einheiten alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm werden zu der Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung wird auf einen Gehalt an einfachem SET (5 mM Tris-HCl pH = 7,8, 5 mM EDTA und 150 mM NaCl), 0,3 M NaOAc und 0,5% SDS gebracht und dann bei 65ºC für 45 Minuten inkubiert. Die Phosphatasebehandlung verhindert die Selbstligation der pUC8 DNA.
Die EcoRI-verdaute BK Virus DNA und die Plasmid pUC8 DNA werden zuerst mit gepuffertem Phenol und dann mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird durch Einstellen der NaCl Konzentration jeder DNA Lösung auf 0,25 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Inkubation der entstehenden Gemische in einem Trockeneis-Ethanolbad für 5 Minuten und Zentrifugation der DNA zur Pelletierung gewonnen. Die Überstände werden verworfen und die DNA Pellets werden mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 10 ul bzw. 30 ul TE Puffer für die BK bzw. Plasmid pUC8 Proben resuspendiert.
Etwa 3 ul H&sub2;O und 1 ul 10fach Ligasepuffer werden zu einem Gemisch an 2 ul EcoRI-verdauter BK Virus DNA und 1 ul der EcoRI- verdauten Plasmid pUC8 DNA gegeben. Ein ul ( 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase wird zu der DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus den gewünschten Plasmiden pBKE1 und pBKE2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der inserierten BK Virus DNA unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKE1 ist in Fig. 3 der Zeichnungen dargestellt.
Eine 50 ml Kultur von E. coli K12 JM103, erhältlich von Pharmacia P-L Biochemicals wird in LB-Medium bis zu einer optischen Dichte bei 650 Nanometer (O.D.&sub6;&sub5;&sub0;) von ungefähr 0,4 Absorptionseinheiten gezogen. Die Kultur wird für zehn Minuten auf Eis gekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird in 25 ml kaltem 100 mM MgCl&sub2; resuspendiert und für 25 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und das Pellet wird in 2,5 ml kaltem 100 mM CaCl&sub2; resuspendiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation sind die Zellen zur Aufnahme transformierender DNA kompetent. Dieses Verfahren wird in den folgenden Beispielen verwendet, die die Verwendung von kompetenten Zellen erfordern.
Zweihundert ul dieser Zellsuspension werden mit der oben hergestellten, ligierten DNA gemischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Am Ende dieser Zeitspanne werden die Zellen für 2 Minuten in ein Wasserbad bei 42ºC gestellt und dann für weitere 10 Minuten auf das Eis zurückgestellt. Die Zellen werden zentrifugiert, in einem ml LB-Medium resuspendiert und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert.
Teile dieses Zellgemisches werden auf LB-Agarplatten (LB- Medium mit 15 Gramm Agar pro Liter) ausplattiert, die 100 ug/ml Ampicillin, 40 ug/ml X-Gal und 40 ug/ml IPTG enthalten. Die Platten werden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Kolonien, die ein Plasmid ohne ein Insert enthalten, wie E. coli K12 JM103/pUC8, erscheinen auf diesen Platten blau. Kolonien, die ein Plasmid mit einem Insert enthalten, wie E. coli K12 JM103/pBKE1, sind weiß. Es werden einige weiße Kolonien ausgewählt und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA auf das Vorkommen des 5,2 kb EcoRI Restriktionsfragments des BK Virus gescreent. Die Plasmid DNA wird von den E. coli K12 JM103/pBKE1 und E. coli K12 JM103/pBKE2 Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren zur Isolierung der Plasmid DNA erhalten, das im folgenden Beispiel beschrieben ist, obwohl das Verfahren in einem kleineren Maßstab ausgeführt wird und die CsCl Gradientenschritte ausgelassen werden, wenn die Plasmid DNA nur zur Restriktionsanalyse isoliert wird.

Beispiel 10

Konstruktion der Plasmide pBKneo1 und pBKneo2

E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo Zellen werden in lyophilisierter Form von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37224 erhalten. Die lyophilisierten Zellen werden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert, um Isolate von Einzelkolonien zu erhalten.
Ein Liter 50 ug/ml Ampicillin enthaltendes LB-Medium wird mit einer Kolonie von E. coli K12 HB101/pdBPV-MMTneo beimpft und in einem belüftenden Schüttler bei 37ºC inkubiert, bis die O.D.&sub5;&sub9;&sub0; 1 Absorptionseinheit beträgt, zu welchem Zeitpunkt dann 150 mg Chloramphenicol zur Kultur gegeben werden. Die Inkubation wird für 16 Stunden fortgesetzt, die Chloramphenicolzugabe hemmt die Proteinsynthese und hemmt daher die weitere Zellteilung, aber erlaubt die Fortsetzung der Plasmidreplikation.
Die Kultur wird in einem Sorvall GSA Rotor (DuPont Co., Instrument Produkts, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) bei 6 000 Upm für 5 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der entstehende Überstand wird verworfen und das Zellpellet wird in 40 ml TES Puffer (10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM NaCl und 1 mM EDTA) gewaschen und dann erneut pelletiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet wird in einem Trockeneis-Ethanolbad eingefroren und wieder aufgetaut. Das aufgetaute Zellpellet wird in 10 ml einer 25%igen Saccharoselösung mit 50 mM EDTA resuspendiert. Etwa 1 ml einer 5 mg/ml Lysozymlösung, 3 ml 0,25 M EDTA pH = 8,0 und 100 ul 10 mg/ml RNAse A werden zu der Lösung gegeben, die dann für 15 Minuten auf Eis inkubiert wird. Drei ml der Lyselösung (hergestellt durch Mischen von 3 ml 10% Triton X-100, 75 ml 0,25 M EDTA pH = 8,0, 15 ml 1 M Tris-HCl pH = 8,0 und 7 ml Wasser) werden zu den lysozymbehandelten Zellen gegeben, gemischt und die entstehende Lösung wird für weitere 15 Minuten auf Eis inkubiert.
Die lysierten Zellen werden in einem Trockeneis-Ethanolbad eingefroren und dann aufgetaut.
Das Zelldebris wird aus der Lösung durch Zentrifugation bei 25 000 Upm für 40 Minuten in einem SW27 Rotor (Beckman, 7360 N. Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646) und durch Extraktion mit gepuffertem Phenol entfernt. Etwa 30,44 g CsCl und 1 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden zu dem Zellextrakt gegeben und das Volumen der Lösung wird mit TES Puffer auf 40 ml gebracht. Die Lösung wird in ein Vti50 Ultrazentrifugenröhrchen (Beckman) dekantiert, das dann zugeschmolzen und in einem Vti50 Rotor bei 42 000 Upm für -16 Stunden zentrifugiert wird. Die entstehende, mit ultraviolettem Licht sichtbargemachte, Plasmidbande wird isoliert und dann in ein Ti75 Röhrchen und einen Ti75 Rotor (Beckman) gegeben und bei 50 000 Upm für 16 Stunden zentrifugiert. Alle notwendigen Volumenangleichungen werden mittels 0,761 g/ml CsCl enthaltendem TES durchgeführt. Die Plasmidbande wird erneut isoliert, mit salzgesättigtem Isopropanol zur Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert und 1 : 3 mit TES Puffer verdünnt. Zwei Volumen Ethanol werden dann zur Lösung gegeben, die dann über Nacht bei -20ºC inkubiert wird. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifugation der Lösung in einem 5534 Rotor (Sorvall) für 15 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert.
Das 1 mg der durch dieses Verfahren erhaltenen Plasmid pdBPV-MMTneo DNA wird in 1 ml TE Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Das vorhergehende Plasmidisolierungverfahren wird im allgemeinen während der folgenden Beispiele verwendet, wenn große Mengen an sehr sauberer Plasmid DNA erforderlich sind. Das Verfahren kann modifiziert werden, um schnell eine kleinere, weniger saubere Menge an DNA zu erhalten, wie sie benötigt wird, wenn Transformanden auf das Vorkommen eines bestimmten Plasmids gescreent werden, durch Verwendung von nur etwa 5 ml kultivierter Zellen, Lysieren der Zellen in einer geeignet verringerten Menge Lysepuffer und Ersetzen der Zentrifugationsschritte durch Phenol- und Chloroformextraktionen.
Etwa 5 ug (5 ul) der oben präparierten Plasmid pdBPV-MMTneo DNA und 5 ug (5 ul) der in Beispiel 8 präparierten BK Virus DNA werden jeweils bei 37ºC für 2 Stunden in einer 2 ul 10fach BamHI Puffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9, 60 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA), 1 ul Restriktionsenzym BamHI und 7 ul H&sub2;O enthaltenden Lösung verdaut. Die Reaktion wird durch eine Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform gestoppt. Jede BamHI-verdaute DNA wird dann gefällt, zentrifugiert und in 5 ul H&sub2;O resuspendiert.
Etwa 1 ul 10fach Ligasepuffer wird zum Gemisch von BamHI- verdauter Plasmid pdBPV-MMTneo (1 ul) und BamHI-verdauter BK Virus DNA (1 ul) gegeben. Nachdem 1 ul (-1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase und 6 ul H&sub2;O zu dem DNA Gemisch gegeben wurden, wird die entstehende Reaktion bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus den gewünschten Plasmiden pBKneo1 und pBKneo2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der BK Virus DNA unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBKneol ist in Fig. 4 der Zeichnungen dargestellt.
Die E. coli K12 HB101 Zellen sind in lyophilisierter Form vom NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-15626 erhältlich. Die E. coli K12 HB101 Zellen werden kultiviert, zur Transformation kompetent gemacht und mit der oben präparierten, ligierten DNA transformiert. Die transformierten Zellen werden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten ausplattiert. Die E. coli K12 HB101/pBKneo1 und E. coli K12 HB101/pBKneo2 Transformanden werden durch ihren ampicillinresistenten Phänotyp und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert.

Beispiel 11

Konstruktion von Plasmid pBLcat

A. Konstruktion des als Zwischenstufe benötigten Plasmids pLPcat

Die Virionen DNA von Adenovirus 2 (Ad2) ist ein doppelsträngiges, lineares Molekül mit einer Größe von etwa 35, 94 kb. Der späte Ad2 Promotor kann auf einem -0,316 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment des Adenovirusgenoms isoliert werden, wobei dieses 0,32 kb Restriktionsfragment der Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 5755 und 6071 des Ad2 Genoms entspricht. Um das gewünschte 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment zu isolieren, wird die Ad2 DNA zuerst mit dem Restriktionsenzym BalI verdaut und das 2, 4 kb Ball Restriktionsfragment, das die gesamte Sequenz des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments enthält, wird isoliert. Dann wird das 2,4 kb BalI Restriktionsfragment mit AccI und PvuII verdaut, um das gewünschte Fragment zu erhalten.
Etwa 50 ug Ad2 DNA (erhältlich von BRL) werden in 80 ul H&sub2;O und 10 ul 10fach BalI Puffer (100 mM Tris-HCl pH = 7,6, 120 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT und 1 mg/ml RSA) gelöst. Etwa 10 ul ( 20 Einheiten) des Restriktionsenzyms BalI werden zu der Ad2 DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 4 Stunden inkubiert.
Die BalI-verdaute DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis die Restriktionsfragmente gut getrennt sind. Die Sichtbarmachung der DNA nach der Elektrophorese wird durch Färben des Gels in einer verdünnten Lösung (0,5 ug/ml) Ethidiumbromid und durch Aussetzen des angefärbten Gels gegenüber langwelligem, ultraviolettem Licht (UV) erreicht. Ein Verfahren, DNA aus Agarose zu isolieren ist folgendes. Ein kleiner Schlitz wird im Gel vor dem gewünschten Fragment gemacht und ein kleines Stück NA-45 DEAE Membran Schleicher und Schuell, Keene, NH 03431) wird in jeden Schlitz gesteckt. Nach weiterer Elektrophorese bindet die DNA nichtkovalent an die DEAE Membran. Nachdem das gewünschte Fragment an die DEAE Membran gebunden ist, wird die Membran entfernt und mit Niedrigsalzpuffer (100 mM KCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl pH - 8,0) gewaschen. Als nächstes wird die Membran in ein kleines Röhrchen gesteckt, in Hochsalzpuffer (1 M NaCl, 0,1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl pH = 8) getaucht und dann bei 65ºC für eine Stunde inkubiert, um die DNA vom DEAE Papier zu entfernen. Nach der 65ºC Inkubation wird der Inkubationspuffer gesammelt und die Membran wird mit Hochsalzpuffer gewaschen. Die Hochsalzwaschlösung wird mit dem Hochsalzinkubationspuffer vereinigt.
Das Volumen der Hochsalz-DNA-Lösung wird so eingestellt, daß die NaCl Konzentration 0,25 M beträgt und dann werden drei Volumen kalter, absoluter Ethanol zu der Lösung gegeben. Die entstehende Lösung wird gemischt und bei -70ºC für 10-20 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird dann bei 15 000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert. Nach einer weiteren Fällung zur Entfernung des restlichen Salzes wird das DNA Pellet mit Ethanol gewaschen, getrocknet, in 20 ul TE Puffer resuspendiert und enthält etwa 3 ug des gewünschten Restriktionsfragments von Ad2. Das erhaltene gereinigte Fragment wird in 10 ul TE Puffer gelöst.
Etwa 6 ul H&sub2;O und 2 ul 10fach AccI Puffer (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,5, 60 mM MgCl&sub2;, 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA) werden zu der Lösung des 2,4 kb BalI Restriktionsfragments von Ad2 gegeben. Nach der Zugabe von etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym AccI zu der DNA Lösung wird die Reaktion bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach dem AccI Verdau wird die DNA durch Ethanolfällung gesammelt und in 16 ul H&sub2;O und 2 ul 10fach PvuII Puffer (600 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,5, 60 mM MgCl&sub2;&sub1; 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA) resuspendiert. Nach der Zugabe von etwa 2 ul (etwa 10 Einheiten) Restriktionsenzym PvuII zur DNA Lösung wird die Reaktion bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert.
Das AccI-PvuII-verdaute, 2,4 kb BalI Restriktionsfragment von Ad2 wird auf ein 6%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment, das den späten Ad2 Promotor enthält, von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist. Das Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels UV Licht betrachtet, und der Teil des Gels, der das 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragment enthält, wird aus dem Gel ausgeschnitten, zerkleinert und über Nacht bei Raumtemperatur in 250 ul Extraktionspuffer getränkt. Am folgenden Morgen wird das Gemisch zentrifugiert und das Pellet wird verworfen. Die DNA im Überstand wird mit Ethanol gefällt, etwa 2 ug tRNA werden zugegeben, um eine vollständige Fällung des gewünschten Fragments sicherzustellen. Etwa 0,2 ug des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments werden erhalten und in 7 ul H&sub2;O suspendiert.
Etwa 0,25 ug (in 0,5 ul) BclI Linker (5'-CTGATCAG-3', erhältlich von New England Biolabs), werden phosphoryliert und zur Ligation durch das folgende Verfahren vorbereitet. Vier ul Linker ( 2 ug) werden in 20, 15 ul H&sub2;O und 5 ul 10fach Kinasepuffer (500 mM Tris-HCl pH = 7,6 und 100 mM MgCl&sub2;) gelöst, bei 90ºC für zwei Minuten inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Fünf ul [gamma-³²P]-ATP (-20ºCi), 2,5 ul 1 M DTT und 5 ul Polynukleotidkinase ( 10 Einheiten) werden zu dem Gemisch gegeben, das dann bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert wird. Dann werden 3,35 ul 0,01 M ATP und 5 ul Kinase zugegeben und die Reaktion wird für weitere 30 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Das radioaktive ATP hilft festzustellen, ob die Linker mit der Ziel-DNA ligiert haben.
Die phosphorylierten Linker werden zu der Lösung des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments gegeben, bevor 1 ul ( 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase und 1 ul 10fach Ligasepuffer zur DNA Lösung gegeben werden. Die entstehende Reaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die BclI Linker können nur mit dem PvuII Ende des AccI-PvuII Restriktionsfragments ligieren. Eine DNA Sequenzierung zeigte später, daß vier BclI Linker an das PvuII Ende des AccI- PvuII Restriktionsfragments angehängt wurden. Diese zusätzlichen BclI Linker können durch BclI Verdau und Religation entfernt werden, die zusätzlichen BclI Linker wurden jedoch nicht entfernt, da die Linker das korrekte Funktionieren der Vektoren nicht beeinflussen.
Die E. coli K12 HB101/pSV2cat Zellen werden in lyophilisierter Form von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 37155 erhalten und die Plasmid pSV2cat DNA wird aus diesen Zellen isoliert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2cat ist in Fig. 5 der Zeichnungen dargestellt. Etwa 1 mg der Plasmid pSV2cat DNA wird erhalten und in 1 ml TE Puffer gelöst. Etwa 3 ug (3 ul) der Plasmid pSV2cat DNA werden zu 2 ul 10fach AccI Puffer und 16 ul H&sub2;O gegeben und dann werden 3 ul (etwa 9 Einheiten) Restriktionsenzym AccI zur pSV2cat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI-verdaute Plasmid pSV2cat DNA wird dann mit dem Restriktionsenzym StuI durch Zugabe von 3 ul 10fach StuI Puffer (1,0 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH = 8,0, 100 mM MgCl&sub2;, 60 mM DTT und 1 mg/ml RSA), 5 ul H&sub2;O und etwa 2 ul (etwa 10 Einheiten Restriktionsenzym StuI verdaut. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion des Reaktionsgemisches einmal mit Phenol und dann zweimal mit Chloroform beendet. Etwa 0, 5 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 20 ul TE Puffer gelöst.
Etwa 4 ul der AccI-StuI-verdauten Plasmid pSV2cat DNA werden mit etwa 7 ul des 0,32 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments von Ad2 (mit angehängten BclI Linkern) gemischt und nach der Zugabe von 3 ul 10fach Ligasepuffer, 15 ul H&sub2;O und 2 ul (etwa 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase wird die Reaktion bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPcat, einem Plasmid, das den späten Ad2 Promotor zur Transkriptionssteuerung und daher Expression des Chloramphenicol- Acetyltransferasegens positioniert enthält. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPcat ist in Fig. 6 der Zeichnungen dargestellt.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 Zellen verwendet und die transformierten Zellen werden auf 50 ug/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agar ausplattiert, und die Restriktionsanalyse der Plasmid DNA wird zur Identifizierung der E. coli K12 HB101/pLPcat Transformanden verwendet. Die Plasmid pLPcat DNA wird dann von den Transformanden isoliert und für anschließende Vektorkonstruktionen verwendet.

B. Abschließende Konstruktion von Plasmid pBLcat

Etwa 88 ug Plasmid pBKneo1 DNA in 50 ul TE Puffer werden zu 7,5 ul 10fach AccI Puffer, 30 ul H&sub2;O und 15 ul (etwa 75 Einheiten) Restriktionsenzym AccI gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI-verdaute BK Virus DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und das 1,4 kb Fragment, das den BK Enhancer enthält, wird von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt. Das 1,4 kb AccI Restriktionsfragment wird dann im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren isoliert. Etwa 5 ug des Fragments werden in 5 ul 10fach PvuII Puffer, 45 ul H&sub2;O und 5 ul (etwa 25 Einheiten) Restriktionsenzym PvuII resuspendiert und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die PvuII-verdaute DNA wird dann im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 isoliert und zur Ligation vorbereitet. Etwa 2 ug des gewünschten 1,28 kb AccI-PvuII Fragments werden erhalten und in 5 ul TE Puffer gelöst.
Etwa 1 ug Plasmid pLPcat DNA wird in 5 ul 10fach AccI Puffer und 40 ul H&sub2;O gelöst. Etwa 5 ul ( 25 Einheiten) Restriktionsenzym AccI werden zur Plasmid pLPcat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC inkubiert. Die AccI-verdaute Plasmid pLPcat DNA wird mit Ethanol gefällt und in 5 ul 10fach StuI Puffer, 40 ul H&sub2;O und 5 ul (etwa 25 Einheiten) Restriktionsenzym StuI resuspendiert und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die AccI-StuI-verdaute Plasmid pLPcat DNA wird einige Male mit Ethanol gefällt, um das 4,81 kb AccI-StuI Restriktionsfragment, das den E. coli Replikationsursprung und den späten Ad2 Promotor enthält, von dem anderen Produkt des Verdaus, einem etwa 16 bp großem Restriktionsfragment zu trennen. Etwa 1 ug des gewünschten 4,81 kb Restriktionsfragments werden erhalten und in 20 ul TE Puffer gelöst.
Die 5 ul des 4,81 kb AccI-StuI Restriktionsfragments von Plasmid pLPcat werden zu 5 ul des 1,28 kb AccI-PvuII Restriktionsfragments des BK Virus gegeben. Nach der Zugabe von 3 ul 10fach Ligasepuffer, 15 ul H&sub2;O und 2 ul (etwa 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase zum DNA Gemisch wird die entstehende Reaktion über Nacht bei 16ºC inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pBLcat. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pBL- cat ist in Fig. 7 der Zeichnungen dargestellt.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 Zellen verwendet und die E. coli K12 HB101/pBLcat Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert. Als nächstes wird die pBLcat DNA zur Verwendung in weiteren Vektorkonstruktionen präpariert.

Beispiel 12

Konstruktion von Plasmid pL133

A. Konstruktion des als Zwischenstufe benötigten Plasmids pSV2- HPC8

Das Plasmid pHC7 enthält eine DNA Sequenz, die humanes Protein C kodiert. Ein Liter 15 ug/ml enthaltendes LB-Medium wird mit einer Kultur von E. coli K12 RR1/pHC7 (NRRL B-15926) beimpft und die Plasmid pHC7 DNA wird im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 isoliert und gereinigt. Etwa 1 mg der Plasmid pHC7 DNA wird durch dieses Verfahren erhalten, in 1 ml TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pHC7 ist in Fig. 8 der Zeichnungen dargestellt.
Fünfzig ul dieser Plasmid pHC7 DNA werden mit 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BanI, 10 ul 10fach BanI Reaktionspuffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9, 60 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA) und 35 ul H&sub2;O gemischt und bis zur Vollständigkeit des Verdaus inkubiert. Die BanI-verdaute Plasmid pHC7 DNA wird dann auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, bis das 1,25 kb BanI Restriktionsfragment von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist. Der das 1,25 kb BanI Restriktionsfragment enthaltende Teil des Gels wird gemäß der Beschreibung von Beispiel 3 isoliert.
Ungefähr 8 ug des 1,25 kb BanI Restriktionsfragments werden durch dieses Verfahren erhalten. Das gereinigte Fragment wird in 10 ml TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert. Das BanI Restriktionsfragment muß durch die Anfügung eines Linkers modifiziert werden, um das Plasmid pSV2-HPC8 zu konstruieren. Die zur Konstruktion des Linkers verwendeten DNA Fragmente werden entweder mittels eines Systec 1450A DNA Synthesizers oder eines ABS 380A DNA Synthesizers synthetisiert.
Fünfhundert Picomol jedes Einzelstrangs des Linkers werden in 20 ul Reaktionspuffer phosphoryliert, der 15 Einheiten ( 0,5 ul) T4 Polynukleotidkinase, 2 ul 10fach Ligasepuffer, 10 ul 500 uM ATP und 7,5 ul H&sub2;O enthält. Die Kinasereaktion wird bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und die Reaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 100ºC beendet. Um die Vollständigkeit der Phosphorylierung sicherzustellen, wird die Reaktion auf Eis gekühlt, 2 ul 0,2 M Dithiothreit, 2,5 ul 5 mM ATP und 15 Einheiten T4 Polynukleotidkinase werden zum Reaktionsgemisch gegeben und vermischt und das Reaktionsgemisch wird für weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch eine weitere zehnminütige Inkubation bei 100ºC gestoppt und dann auf Eis gekühlt.
Obwohl sie getrennt phosphoryliert wurden, werden die zwei Einzelstränge des DNA Linkers nach der Phosphorylierungsreaktion zusammengemischt. Um die zwei Stränge zusammenzufügen, wird das Phosphorylierungsreaktionsgemisch für 10 Minuten in einem Wasserbad mit 150 ml Wasser bei 100ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wird das Wasserbad abgestellt und man läßt es auf Raumtemperatur abkühlen, ein Vorgang, der etwa 3 Stunden dauert. Das Wasserbad, das immer noch das Röhrchen der phosphorylierten DNA enthält, wird dann über Nacht bei 4ºC inkubiert. Dieses Verfahren fügt die beiden Einzelstränge zusammen. Der konstruierte Linker besitzt die folgende Struktur:
Der Linker wird bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert.
Die 8 ug des 1,25 kb BanI Fragments werden zu 50 ul Linker ( 500 Picomol), 1 ul T4 DNA Ligase ( 500 Einheiten), 10 ul 10fach Ligasepuffer und 29 ul H&sub2;O gegeben, mit diesen vermischt und die entstehende Reaktion wird bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Ligationsreaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. Die DNA wird durch Zugabe von NaOAc bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Kühlung in einem Trockeneis-Ethanolbad und anschließende Zentrifugation der Lösung pelletiert.
Das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach ApaI Reaktionspuffer (60 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 60 mM MgCl&sub2; und 60 mM 2- Mercaptoethanol), 5 ul (-50 Einheiten) Restriktionsenzym ApaI und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Die Reaktion wird gestoppt und die DNA wie oben pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Nach dem HindIII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 3,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und das gewünschte 1,23 kb HindIII-ApaI Restriktionsfragment wird isoliert. Ungefähr 5 ug des gewünschten Fragments werden erhalten, in 10 ul TE Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert.
Fünfzig ul der Plasmid pHC7 DNA werden mit 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym PstI, 10 ul 10fach PstI Reaktionspuffer (1,0 M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml RSA) und 35 ul H&sub2;O gemischt und bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die PstI-verdaute Plasmid pHC7 DNA wird dann auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und das gewünschte 0,88 kb Fragment wird im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gereinigt. Ungefähr 5 ug des gewünschten Fragments werden erhalten, in 10 ul TE Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert.
Die 5 ug des 0,88 kb PstI Fragments werden zu 50 ul des folgenden Linkers gegeben und mit diesem vermischt, der auf einem automatisierten DNA Synthesizer hergestellt wurde:
Etwa 1 ul T4 DNA Ligase ( 10 Einheiten), 10 ul 10fach Ligasepuffer und 29 ul H&sub2;O werden zum DNA Gemisch gegeben und die entstehende Ligationsreaktion wird bei 4ºC über Nacht inkubiert.
Die Ligationsreaktion wird durch eine zehnminütige Inkubation bei 65ºC gestoppt. Nach der Fällung der ligierten DNA wird das DNA Pellet in 10 ul 10fach ApaI Reaktionspuffer, 5 ul (-50 Einheiten) Restriktionsenzym ApaI und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für zwei Stunden bei 37ºC stehengelassen. Die Reaktion wird dann gestoppt und die DNA erneut pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach BglII Reaktionspuffer (1 M NaCl, 100 mM Tris- HCl pH = 7, 4, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml RSA), 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 3,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen, um das gewünschte 0,19 kb ApaI-BglII Restriktionsfragment zu isolieren. Ungefähr 1 ug des gewünschten Fragments wird erhalten, in 10 ul TE Puffer suspendiert und bei -20ºC gelagert.
Ungefähr 10 ug Plasmid pSV2gpt DNA (ATCC 37145) werden in 10 ul 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für zwei Stunden bei 37ºC stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf 0,25 M NaOAc gebracht und nach der Zugabe von zwei Volumen Ethanol und einer Inkubation in einem Trockeneis-Ethanolbad wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach BglII Puffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird für 2 Stunden bei 37ºC stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt. Das Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt, unter ultraviolettem Licht betrachtet und die das gewünschte 5,1 kb HindIII-BglII Fragment enthaltende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, in einen Dialyseschlauch gebracht und die Elektrophorese wird fortgesetzt, bis die DNA aus der Agarose herausgekommen ist. Der die DNA enthaltende Puffer aus dem Dialyseschlauch wird mit Phenol und CHCl&sub3; extrahiert und dann wird die DNA gefällt. Das Pellet wird in 10 ul TE Puffer suspendiert und besteht aus 5 ug des gewünschten 5,1 kb HindIII-BglII Restriktionsfragments von Plasmid pSV2gpt.
Zwei ul des 1,23 HindIII-ApaI Restriktionsfragments, 3 ul des 0,19 kb ApaI-BglII Fragments und 2 ul des 5,1 kb HindIII- BglII Fragments werden zusammengemischt und dann mit 10 ul 10fach Ligasepuffer, 1 ul T4 DNA Ligase ( 500 Einheiten) und 82 ul H&sub2;O bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pSV2-HPC8 und eine Restriktions- und Funktionskarte des Plasmids ist in Fig. 8 der Zeichnungen dargestellt.
E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210) Zellen werden zur Transformation kompetent gemacht und die oben präparierte DNA wird zur Transformation der Zellen verwendet. Teile des Transformationsgemisches werden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltende LB-Agarplatten ausplattiert. Die Platten werden dann bei 37ºC inkubiert. Die E. coli K12 RR1/pSV2-HPC8 Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA verifiziert.

B. Abschließende Konstruktion von Plasmid pL133

Fünfzig ug von Plasmid pSV2-HPC8 werden in 10 ul 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert. Nach dem HindIII Verdau wird die DNA gefällt und das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach SalI Reaktionspuffer (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,9, 60 mM Mgcl&sub2;, 60 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml RSA), 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI und 85 ul H&sub2;O gelöst. Die entstehende SalI Reaktionsmischung wird für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das HindIII-SalI-verdaute Plasmid pSV2-HPC8 wird auf ein 3,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das gewünschte 0,29 kb HindIII-SalI Restriktionsfragment von den anderen Produkten der Reaktion abgetrennt ist. Das gewünschte Fragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 2 ug des Fragments werden erhalten und in 10 ul TE Puffer gelöst.
Fünfzig ug Plasmid pSV2-HPC8 werden in 10 ul 10fach BglII Reaktionspuffer, 5 ul (50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach dem BglII Verdau wird die DNA gefällt und das DNA Pellet wird in 10 ul 10fach SalI Reaktionspuffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym SalI und 85 ul H&sub2;O gelöst. Das entstehende SalI Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das SalI-BglII-verdaute Plasmid pSV2-HPC8 wird auf ein 3,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das gewünschte 1,15 kb SalI-BglII Restriktionsfragment von den anderen Reaktionsprodukten abgetrennt ist. Das 1,15 kb Sall- BglII Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 8 ug des Fragments werden erhalten und in 10 ul TE Puffer gelöst.
Ungefähr 10 ug der Plasmid pSV2-β-Globin DNA (NRRL B-15928) werden in 10 ul 10fach HindIII Reaktionspuffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf 0,25 M NaOAc gebracht und nach der Zugabe von zwei Volumen Ethanol und der Inkubation in einem Trockeneis- Ethanolbad wird die DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das HindIII-verdaute Plasmid pSV2-β-Globin wird in 10 ul 10fach BglII Puffer, 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BglII und 85 ul H&sub2;O gelöst und die Reaktion wird bei 37ºC für zwei Stunden stehengelassen. Nach dem BglII Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt. Das gewünschte 4,2 kb HindIII-BglII Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert, etwa 5 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 10 ul TE Puffer suspendiert.
Zwei ul des 0,29 kb HindIII-SalI Fragments von Plasmid pSV2-HPC8, 2 ul des 1,15 kb SalI-BglII Fragments von Plasmid pSV2-HPC8 und 2 ul des 4,2 kb HindIII-BglII Fragments von Plasmid pSV2-β-Globin werden zusammengemischt und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 12A ligiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pL133 und die Fig. 8 stellt mittels Fließschema die Konstruktion von Plasmid pL133 aus den während dies es Beispiels beschriebenen, verschiedenen Ausgangsmaterialien dar. Die gewünschten E. coli K12 RR1/pL133 Transformanden werden hergestellt und die Plasmid DNA wird zur Verwendung bei der Konstruktion von Plasmid pLPC isoliert.

Beispiel 13

Konstruktion von Plasmid pLPC

Etwa 20 ug Plasmid pBLcat DNA werden in 10 ul 10fach HindIII Puffer und 80 ul H&sub2;O gelöst. Etwa 10 ul (-100 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII werden zu der Plasmid pBLcat DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die HindIII-verdaute Plasmid pBLcat DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis das 0,87 kb HindIII Restriktionsfragment, das den BK Enhancer und den späten Ad2 Promotor enthält, von den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt ist, dann wird das 0,87 kb Fragment isoliert und zur Ligation im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 vorbereitet. Etwa 2 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 5 ul TE Puffer gelöst.
Etwa 1,5 ug Plasmid pL133 DNA wird in 2 ul 10fach HindIII Puffer und 16 ul H&sub2;O gelöst. Etwa 1 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym HindIII wird zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wird dann auf 100 ul mit TE Puffer verdünnt und mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 behandelt. Die HindIII-verdaute Plasmid pL133 DNA wird zwei Mal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10 ul TE Puffer resuspendiert.
Etwa 5 ul des 0,87 kb HindIII Restriktionsfragments von Plasmid pBLcat werden zu den 1,5 ul des HindIII-verdauten Plasmids pL133 gegeben und dann werden 1 ul 10fach Ligasepuffer, 1 ul ( 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase und 1,5 ul H&sub2;O zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pLPC.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 verwendet. Die transformierten Zellen werden auf Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert und die Plasmid DNA der ampicillinresistenten Transformanden wird durch Restriktionsanalyse untersucht, um die E. coli K12 HB101/pLPC Transformanden zu identifizieren. Das 0,87 kb HindIII Restriktionsfragment, das den BK Enhancer und den späten Ad2 Promotor kodiert, kann in beiden Orientierungen in das HindIII-verdaute Plasmid pBLcat inserieren, wobei nur eine davon das Plasmid pLPC ergibt. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC ist in Fig. 9 der Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 14

Konstruktion der Plasmide pLPC4 und pLPC5

Etwa 1 ug (1 ul) der in Beispiel 8 präparierten BK Virus DNA und 1 ug von Plasmid pLPC (1 ul) werden in 2 ul 10fach EcoRI Puffer und 14 ul H&sub2;O gelöst. Etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI werden zur DNA Lösung gegeben die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Das EcoRI-verdaute Gemisch von BK Virus DNA und Plasmid pLPC DNA wird einmal mit gepuffertem Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Dann wird die DNA durch Einstellen der NaCl Konzentration auf 0,25 M, Zugabe von zwei Volumen Ethanol, Inkubation der Lösung in einem Trockeneis- Ethanolbad für 2 Minuten und Zentrifugation der Lösung, um die DNA zu pelletieren, gewonnen. Der Überstand wird verworfen und das DNA Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 12 ul TE Puffer resuspendiert.
Etwa 13 ul H&sub2;O und 3 ul 10fach Ligasepuffer werden zu dem EcoRI-verdauten Gemisch von BK Virus DNA und Plasmid pLPC DNA gegeben. Zwei ul ( 1 000 Einheiten) T4 DNA Ligase werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC für 2 Stunden inkubiert. Die ligierte DNA, die aus den gewünschten Plasmiden pLPC4 und pLPC5 besteht, die sich nur in Bezug auf die Orientierung der inserierten BK Virus DNA unterscheiden, wird zur Transformation von kompetenten E. coli K12 HB101 Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert. Die E. coli K12 HB101/pLPC4 und E. coli K12 HB101/pLPC5 Transformanden werden durch ihren ampicillinresistenten Phänotyp und durch Restriktionsnanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPC4 ist in Fig. 10 der Zeichnungen dargestellt.

Beispiel 15

Konstruktion der Plasmide pLPChyg1 und pLPChvg2

E. coli K12 RR1/pSV2hyg Zellen erhält man von dem NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18039. Die Plasmid pSV2hyg DNA wird aus den Zellen im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 erhalten. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pSV2hyg ist in Fig. 11 der Zeichnungen dargestellt.
Etwa 10 ug (in 10 ul TE Puffer) Plasmid pSV2hyg werden zu 2 ul 10fach BamHI Puffer und 6 ul H&sub2;O gegeben. Etwa 2 ul (etwa 20 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird zuerst mit Phenol und dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die BamHI-verdaute Plasmid pSV2hyg DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen, um das 2,5 kb Restriktionsfragment zu isolieren, das das Hygromycinresistenzgen enthält.
Etwa 5 ul 10fach Klenowpuffer (0,2 mM von jedem der vier dNTPs, 0,5 M Tris-HCl pH =7,8, 50 mM MgCl&sub2;&sub1; 0,1 M 2-Mercaptoethanol und 100 ug/ml RSA) und 35 ul H&sub2;O werden zur BamHI-verdauten Plasmid pSV2hyg DNA Lösung gegeben und dann werden etwa 25 Einheiten Klenowenzym (etwa 5 ul, wie von BRL angeboten) zu dem DNA Gemisch gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Klenow-behandelte, BamHI-verdaute Plasmid pSV2hyg DNA wird einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Etwa 2 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 5 ul TE Puffer suspendiert.
Etwa 10 ug (10 ul) Plasmid pLPC DNA werden zu 2 ul 10fach StuI Puffer und 6 ul H&sub2;O gegeben. Etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym StuI werden zur DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die StuI- verdaute Plasmid pLPC DNA wird mit Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 2 ul 10fach NdeI Puffer (1,5 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl pH = 7,8, 70 mM MgCl&sub2;, 60 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml RSA) und 16 ul H&sub2;O resuspendiert. Etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym NdeI werden zur NdeI-verdauten DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert.
Die NdeI-StuI-verdaute Plasmid pLPC DNA wird mit Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 5 ul 10fach Klenowpuffer und 40 ul H&sub2;O resuspendiert. Etwa 5 ul ( 25 Einheiten) Klenowenzym werden zu der DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach der Klenowreaktion wird das Reaktionsgemisch auf ein Agarosegel aufgetragen und das 5,82 kb NdeI-StuI Restriktionsfragment wird aus dem Gel isoliert. Etwa 5 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 5 ul TE Puffer suspendiert.
Etwa 2 ul des 2,5 kb Klenow-behandelten BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pSV2hyg werden mit etwa 1 ul des 5,82 kb Klenow-behandelten NdeI-StuI Restriktionsfragments von Plasmid pLPC gemischt und etwa 3 ul 10fach Ligasepuffer, 2 ul T4 DNA Ligase ( 1 000 Einheiten), 1 ul T4 RNA Ligase ( 1 Einheit) und 14 ul H&sub2;O werden zur DNA Lösung gegeben. Die entstehende Reaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert.Die ligierte DNA besteht aus den gewünschten Plasmiden pLPChyg1 und pLPChyg2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung des 2,5 kb Klenow-behandelten BamHI Restriktionsfragments von Plasmid pSV2hyg unterscheiden. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChyg1 ist in Fig. 12 der Zeichnungen dargestellt. Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 HB101 verwendet und die gewünschten E. coli K12 HB101/pLPChyg1 und E. coli K12 HB101/pLPChyg2 Transformanden werden auf Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert und durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert.

Beispiel 16

Konstruktion der Plasmide pLPChd1 und pLPChd2

Etwa 20 ug von Plasmid pSV2-dhfr (ATCC 37146) in 20 ul TE Puffer werden zu 10 ul 10fach BamHI Puffer und 60 ul H&sub2;O gegeben. Etwa 10 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym BamHI werden zugegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die BamHI-verdaute Plasmid DNA wird dann mit Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 5 ul 10fach Klenowpuffer, 45 ul H&sub2;O und 2 ul ( 100 Einheiten) Klenowenzym resuspendiert. Die Reaktion wird bei 16ºC für 30 Minuten inkubiert und dann wird das Reaktionsgemisch auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis die Produkte des Verdaus klar getrennt sind. Das 1,9 kb Klenow-behandelte BamHI Restriktionsfragment, das das dhfr Gen enthält, wird aus dem Gel isoliert und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 zur Ligation vorbereitet. Etwa 4 ug des gewünschten Fragments werden erhalten und in 5 ul TE Puffer suspendiert.
Etwa 200 ug von Plasmid pLPChyg1 in 100 ul TE Puffer werden zu 15 ul 10fach EcoRI Puffer und 30 ul H&sub2;O gegeben. Etwa 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRI werden zu der Plasmid pLPChyg1 DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert. Die kurze Reaktionszeit wird gewählt, um einen partiellen EcoRI Verdau herzustellen. Das Plasmid pLPChyg1 hat zwei EcoRI Restriktionsschnittstellen, wobei eine in der kodierenden Sequenz des Hygromycinresistenz (HmR) verleihenden Gens liegt und man wünscht das dhfr-Gen enthaltende Restriktionsfragment in die EcoRI Schnittstelle von Plasmid pLPChyg1 zu inserieren, die nicht im HmR Gen liegt. Die partiell EcoRI-verdaute Plasmid pLPChyg1 DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen, bis die einfach geschnittene Plasmid pLPChyg1 DNA von der ungeschnittenen Plasmid DNA und den anderen Produkten des Verdaus abgetrennt worden ist. Die einfach geschnittene DNA wird aus dem Gel isoliert und im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 zur Ligation vorbereitet. Etwa 2 ug des einfach EcoRI geschnittenen Plasmids pLPChyg1 werden erhalten und in 25 ul TE Puffer suspendiert. Zu dieser Probe werden etwa 5 ul ( 25 Einheiten) Klenowenzym, 5 ul 10fach Klenowpuffer und 40 ul H&sub2;O gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC für 60 Minuten inkubiert. Die Klenow-behandelte, partiell EcoRI geschnittene DNA wird zweimal mit Phenol und dann einmal mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 25 ul TE Puffer resuspendiert.
Etwa 5 ul des 1,9 kb Klenow-behandelten BamHI Restriktionsfragments, das das dhfr-Gen enthält, und etwa 5 ul der einfach EcoRI-geschnittenen Plasmid pLPChyg1 DNA werden zusammengemischt und 1 ul 10fach Ligasepuffer, 5 ul H&sub2;O, 1 ul ( 500 Einheiten) T4 DNA Ligase und 1 ul ( 2 Einheiten) T4 RNA Ligase werden zum DNA Gemisch gegeben und die entstehende Reaktion wird über Nacht bei 16ºC inkubiert. Die ligierte DNA enthält die gewünschten Plasmide pLPChd1 und pLPChd2, die sich nur in Bezug auf die Orientierung des dhfr-Gen enthaltenden 1,9 kb Fragments unterscheiden.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von kompetenten E. coli K12 HB101 Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert und die ampicillinresistenten Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA analysiert, um die E. coli K12 HB101/pLPchd1 und E. coli K12 HB101/pLPChd2 Transformanden zu identifizieren. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid pLPChd1 ist in Fig. 13 der Zeichnungen dargestellt. Die Plasmid pLPChd1 DNA und die Plasmid pLPChd2 DNA wird anschließend aus den passenden Transformanden isoliert.

Beispiel 17

Konstruktion von Plasmid phd

Um das Plasmid phd zu konstruieren, ist es notwendig, die als Ausgangsmaterial zur Konstruktion von Plasmid phd verwendete Plasmid pLPChd1 DNA aus E. coli Wirtszellen zu isolieren, denen eine Adeninmethylase fehlt, wie die durch das dam-Gen kodierte, dessen Produkt den Adeninrest in der Sequenz 5'-GATC-3' methyliert. E. coli K12 GM48 (NRRL B-15725) fehlt eine funktionelle dam-Methylase und ist so ein geeigneter Wirt zur Präparation der als Ausgangsmaterial zur Konstruktion von Plasmid phd verwendeten Plasmid pLPChd1 DNA.
Die E. coli K12 GM48 Zellen werden angezogen, zur Transformation kompetent gemacht und das Plasmid pLPChyg1 wird zur Transformation der E. coli K12 GM48 Zellen verwendet. Die transformierten Zellen werden auf Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert und wenn die ampicillinresistenten E. coli K12 GM48/pLPChd1 Transformanden Kolonien bilden, wird eine solche Kolonie zur Präparation der Plasmid pLPChd1 DNA verwendet. Es wird etwa 1 mg der Plasmid pLPChd1 DNA erhalten und in etwa 1 ml TE Puffer gelöst.
Etwa 2 ug der Plasmid pLPchd1 DNA in 2 ul TE Puffer werden zu 2 ul 10fach BclI Puffer (750 mM KCl, 60 mM Tris-HCl pH = 7,4, 100 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mg/ml RSA) und 14 ul H&sub2;O gegeben. Etwa 2 ul ( 10 Einheiten) Restriktionsenzym BclI werden zu der Plasmid pLPChd1 DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 50ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Extraktion des Gemisches einmal mit Phenol und zweimal mit Chloroform gestoppt.
Etwa 1 ul der BclI-verdauten Plasmid pLPChd1 DNA wird zu 1 ul 10fach Ligasepuffer, 8 ul H&sub2;O und 1 ul ( 500 Einheiten ) T4 DNA Ligase gegeben. Die Ligationsreaktion wird bei 16ºC über Nacht inkubiert und die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid phd. Das Plasmid phd resultiert aus der Deletion der zusätzlichen, während der Konstruktion von Plasmid pLPcat angehängten BclI Linker und der zwei angrenzenden BclI Restriktionsfragmente mit einer Gesamtgröße von etwa 1,45 kb von Plasmid pLPChd1. Eine Restriktions- und Funktionskarte von Plasmid phd ist in Fig. 14 der Zeichnungen dargestellt. Das Plasmid phd erleichtert die Expression jeder DNA Sequenz vom erfindungsgemäßen BK Virus Enhancer-späten Adenoviruspromotor aus, da die zu exprimierende DNA, wie humanes Protein S, leicht in die richtige Position zur Expression an der BclI Einzelschnittstelle auf Plasmid phd inseriert werden kann.
Die ligierte DNA wird zur Transformation von E. coli K12 GM48 verwendet und die transformierten Zellen werden auf Ampicillin enthaltenden LB-Agar ausplattiert. Die ampicillinresistenten E. coli K12 GM48/phd Transformanden werden durch Restriktionsanalyse ihrer Plasmid DNA identifiziert.

Beispiel 18

Konstruktion von Human-Protein S Expressionsvektoren

A. Konstruktion von Plasmid pShd

Etwa 2 ug Plasmid phd DNA in 2 ul TE Puffer werden mit Restriktionsenzym BclI im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Beispiel 17 verdaut. Die BclI-verdaute Plasmid DNA wird mit Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 5 ul 10fach Klenowpuffer und 40 ul H&sub2;O resuspendiert. Etwa 5 ul (-25 Einheiten) Klenowenzym werden zu der DNA Lösung gegeben und die entstehende Reaktion wird bei 16ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach der Klenowreaktion wird das Reaktionsgemisch auf ein Agarosegel aufgetragen und das Vektorfragment aus dem Gel isoliert. Es werden etwa 0, 5 ug des gewünschten Fragments erhalten und in 10 ul TE Puffer suspendiert.
Ungefähr 20 ug Plasmid pHHS-IIa DNA werden in 10 ul 10fach FnuDII Reaktionspuffer, 10 ul ( 20 Einheiten) Restriktionsenzym FnuDII und 80 ul H&sub2;O gelöst und das Reaktionsgemisch wird für zwei Stunden bei 37ºC stehengelassen. Die Reaktion wird durch Zugabe von NaCl auf 50 mM und 5 ul ( 50 Einheiten) Restriktionsenzym EcoRV eingestellt. Die entstehende Reaktion wird bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nach dem EcoRV Verdau wird das Reaktionsgemisch auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen, um das gewünschte 2,7 kb FnuDII-EcoRV Restriktionsfragment zu isolieren. Es werden ungefähr 10 ug des Fragments erhalten und in 50 ul TE Puffer suspendiert.
Etwa 5 ul des BclI-verdauten Plasmids phd werden mit etwa 2 ul des 2,7 kb FnuDII-EcoRV Restriktionsfragments im wesentlichen gemäß der Beschreibung der vorhergehenden Beispiele ligiert, außer daß 0,4 Einheiten RNA Ligase (BRL) zu der Ligationsreaktion gegeben werden. Die ligierte DNA besteht aus dem gewünschten Plasmid pShd und eine Restriktions- und Funktionskarte des Plasmids ist in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt.
E. coli K12 HB101 Zellen werden zur Transformation kompetent gemacht und die oben hergestellte, ligierte DNA wird zur Transformation der Zellen verwendet. Teile des Transformationsgemisches werden auf Ampicillin enthaltendem LB-Agar ausplattiert. Die ampicillinresistenten E. coli K12 HB101/pShd Transformanden werden durch Restriktionsanalyse identifiziert.
Sollte jemand ein Fragment zu isolieren wünschen, das nur die für Protein S kodierende Sequenz enthält, können alternativ dazu die zusätzlichen Basenpaare vom 5'-Ende des Moleküls entfernt werden, um ein Molekül herzustellen, das mit dem ATG Startcodon beginnt. Dazu kann lineare DNA mit einer BAL 31 Nuklease genannten Exonuklease verdaut werden, die beide Molekül enden angreift und das Molekül mit einer vorhersagbaren Geschwindigkeit zunehmend verkürzt. Demnach werden 5 ug von Plasmid pHHS-IIa mit 5 Einheiten FnuDII in 100 ul 6 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 6 uM MgCl&sub2; und 6 uM 2-Mercaptoethanol verdaut. Nach einer Ethanolfällung werden die DNA Fragmente auf einem 3,5%igen Polyacrylamidgel durch Elektrophorese aufgetrennt und das 2,7 kb Fragment wird wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert. Das Fragment wird nun für den Verdau mit BAL 31 vorbereitet. Die Reaktionsbedingungen sind folgende: 5 ug DNA werden in 50 ul 0,5 M NaCl, 12,5 mM CaCl&sub2;, 12,5 mM MgCl&sub2;, 20 mM Tris-HCl pH = 8,0 und 1 mM EDTA pH = 8,0 gelöst. Eine Einheit BAL 31 wird zugegeben und die Reaktion wird für 30 Sekunden bei 30ºC laufengelassen. Nach einer Ethanolfällung wird die DNA jetzt mit T4 DNA Polymerase behandelt, um etwaige von der Wirkung der BAL 31 übriggebliebene verkürzte Enden aufzufüllen. Die DNA wird in 19 ul Reaktionspuffer (16,6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,67 M Tris-HCl pH = 8,8, 0,67 mM MgCl&sub2;, 1 M 2-Mercaptoethanol und 6,7 uM EDTA) resuspendiert. Dazu wird 1 ul in 50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 mg/ml RSA und 10 mM 2-Mercaptoethanol 1 zu 10 verdünnte T4 DNA Polymerase (0,5 Einheiten) gegeben. Die Reaktion wird vor der Zugabe von 1 ul eines dNTP Gemisches bei 37ºC für 10 Minuten inkubiert, das 2 mM jedes dNTPs enthält. Die Reaktion läuft bei 37ºC für weitere 10 Minuten vor einer Ethanolfällung weiter. Dieses Fragment ist nun zur Ligation mit jedem stumpfendigen Vektor bereit. Unter diesen Bedingungen entfernt die BAL 31 etwa 25 Basenpaare/Minute/Ende. Nach Ligation, Transformation in einen E. coli Wirt und anschließender DNA Isolierung von unabhängigen Klonen kann man die DNA Sequenzierung benützen, um zu bestimmen, welcher Klon die exakt gewünschte Sequenz enthält.
Das Plasmid pHHS-IIa enthält auch zusätzliche nicht-kodierende DNA Sequenzen am 3'-Ende, einschließlich des natürlichen Stop-Codons TAA, das unmittelbar dem letzten Nukleotidtriplett der kodierenden Sequenz folgt. Diese Sequenzen können wie folgt entfernt werden: 5 ug des intakten Plasmids werden vollständig in 100 ul einfachem FnuDII Reaktionspuffer verdaut, der 5 Einheiten FnuDII enthält. Die DNA wird in Ethanol gefällt und zentrifugiert. Das Pellet wird getrocknet und in 10 ul einfachem EcoRI Reaktionspuffer resuspendiert, der 5 Einheiten EcoRI enthält. Nach 90 Minuten bei 37ºC wird die DNA erneut in Ethanol gefällt und auf ein 3, 5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Produkte werden durch Elektrophorese getrennt und die 2030 bp große Bande wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, extrahiert. Da die EcoRI Schnittstelle nur ein Basenpaar vom natürlichen Stopcodon entfernt ist und der Verdau mit EcoRI nur den anfänglichen G Rest beläßt, ist es notwendig, die verbleibenden Basen der EcoRI Schnittstelle, den T Rest und das Stop-Codon zu ersetzen. Daher wird ein Linker für diesen Zweck entworfen und kann durch jede Standardtechnik synthetisiert werden:
Dieser Linker enthält die natürliche Sequenz und baut ein zusätzliches Stop-Codon im Leserahmen ein, um die Termination an dieser Stelle sicherzustellen. Zusätzlich enthält dieser Linker einen CTAG Überhang, der mit BamHI, BglII oder BclI Enden kompatibel ist. In einer Ligation mit drei Stücken können diese Fragmente mit jedem Vektor ligiert werden, der ein stumpfes Ende zusammen mit einem BamHI, BglII oder BclI Ende enthält.

B. Transformation

Das unten beschriebene Transformationsverfahren betrifft 293-Zellen als Wirtszellinie, jedoch ist das Verfahren im allgemeinen auf die meisten eukaryontischen Zellinien anwendbar. 293- Zellen werden von der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 1573 in einer eine geschlossene Schicht von etwa 5,5·10&sup6; Zellen enthaltenden 25 mm² Kulturflasche in Eagle's Minimum Essential Medium mit 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum erhalten. Die Kulturflasche wird bei 37ºC inkubiert und das Medium zwei Mal pro Woche gewechselt. Die Zellen werden durch Entfernen des Mediums, Waschen mit Hank's ausgeglichener Salzelösung (Gibco), Zugabe von 0,25% Trypsin für 1-2 Minuten, Waschen mit frischem Medium, Ansaugen und Einfüllen in neue Kulturflaschen mit einem Subkultivierungsverhältnis von 1 : 5 oder 1 : 10 subkultiviert.
Einen Tag vor der Transformation werden die Zellen in einer Dichte von 0,7·10&sup6; Zellen pro Platte aus gebracht. Das Medium wird 4 Stunden vor der Transformation gewechselt. Sterile, ethanolgefällte Plasmid DNA wird in TE Puffer gelöst zur Herstellung einer 2fach DNA-CaCl&sub2; Lösung verwendet, die 40 ug/ml DNA und 250 mM CaCl&sub2; enthält. 2fach HBS wird hergestellt, das 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1, 5 mM Natriumphosphat enthält, mit einem auf 7,05-7,15 eingestellten pH. Die 2fache DNA-CaCl&sub2; Lösung wird tropfenweise zu einem gleichen Volumen sterilem 2fach HBS gegeben. Eine sterile Einmilliliterplastikpipette mit einem Baumwollstopfen wird in das 2fach HBS enthaltende Mischungsröhrchen eingebracht und Blasen werden durch Hineinblasen eingebracht während die DNA zugegeben wird. Das Calciumphosphat-DNA Präzipitat kann sich für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln bilden.
Das Präzipitat wird dann durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Plastikpipette gemischt und ein ml (pro Platte) Präzipitat wird direkt in 10 ml des Wachstumsmediums gegeben, das die Empfängerzellen bedeckt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wird das Medium durch 10% fetales Rinderserum enthaltendes DMEM ersetzt und die Zellen werden 72 Stunden inkubiert, bevor der Selektionsdruck angelegt wird. Für Transformanden, die rekombinantes humanes Protein S exprimieren, enthält das Wachstumsmedium 1 bis 10 ug/ml Vitamin K, einen Cofaktor, der zur gamma-Carboxylierung des Proteins benötigt wird.
Hygromycin wird in einer Endkonzentration von etwa 200 ug/ml zum Wachstumsmedium gegeben. Die Zellen werden dann bei 37ºC für 2-4 Wochen unter Austauschen des Mediums in 3 bis 4 Tages Intervallen inkubiert. Die entstehenden hygromycinresistenten Kolonien werden in einzelne Kulturflaschen zur Charakterisierung gegeben. 293-Zellen sind dhfr positiv, so daß 293-Transformanden, die Plasmide mit dem dhfr Gen enthalten, nicht allein auf der Grundlage des dhfr-positiven Phänotyps selektiert werden, welcher die Fähigkeit zum Wachstum in Medien vermittelt, denen Hypoxanthin und Thymin fehlen. Zellinien, denen ein funktionelles dhfr-Gen fehlt und die mit dhfr-enthaltenden Plasmiden transformiert werden, können auf der Grundlage des dhfr positiven Phänotyps selektiert werden.
Die Verwendung des Dihydrofolatreduktasegens als selektionierbarer Marker zur Einführung eines Gens oder Plasmids in eine dhfr-defiziente Zellinie und die anschließende Verwendung von Methotrexat zur Vervielfachung der Kopiezahl des Plasmids ist in der Literatur gut bekannt. Obwohl die Verwendung von dhfr als selektionierbarer und amplifizierbarer Marker in dhfr-bildenden Zellen nicht gut untersucht ist, würde der Beleg in der Literatur nahelegen, daß dhfr als selektionierbarer Marker in dhfr-bildenden Zellen und zur Genvervielfältigung verwendet werden kann. Die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die verwendeten Marker beschränkt. Darüberhinaus können amplifizierbare Marker verwendet werden, wie Methallothioningene, Adenosindesaminasegene oder Vertreter der Familie der multigenen Resistenz, beispielhaft vom P-Glycoprotein vertreten.
Obwohl die vorhergehende Erfindung im Detail und durch Verdeutlichungen und Beispiele zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, ist es ersichtlich, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure, die humanes Protein S kodiert, wobei der kodierende Strang folgender ist:

worin R' für

steht,

A für Desoxyadenyl steht,

G für Desoxyguanyl steht,

C für Desoxycytidyl steht und

T für Thymidyl steht.

2. Doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure, die ein Polypeptid mit humaner Protein S Aktivität kodiert, wobei der kodierende Strang folgender ist:

worin

A für Desoxyadenyl steht,

G für Desoxyguanyl steht,

C für Desoxycytidyl steht und

T für Thymidyl steht.

3. Rekombinanter DNA Vektor, der die doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Vektor nach Anspruch 3, welcher Plasmid pShd ist, hergestellt durch Ligation des 2,7 kb Protein S-enthaltenden FnuDII-EcoRV Restriktionsfragments von Plasmid pHHS-IIa (NRRL B-18071) mit dem BclI-verdauten Klenow-behandelten Plasmid phd (wie in Fig. 14 gezeigt).

5. Vektor nach Anspruch 3' welcher Plasmid pHHS-IIa (NRRL B-18071) ist.

6. Escherichia coli Zellen, die mit dem Vektor nach Anspruch 3, 4 oder 5 transformiert sind.

7. Zellkultur, die mit dem Vektor nach Anspruch 3 oder 4 transformiert ist.

8. Kultur nach Anspruch 7, worin die Zellen humane Nierenzellen 293 sind.

9. Verfahren zur Herstellung von humanem Protein S, gekennzeichnet durch Kultivieren der Kultur nach Anspruch 7 oder 8 unter Bedingungen, die die Expression von humanem Protein S und die Gewinnung des exprimierten Proteins erlauben.

10. Durch das Verfahren nach Anspruch 9 hergestelltes Protein S.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die durch das Verfahren nach Anspruch 9 hergestelltes humanes Protein S im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, die zur parenteralen Verabreichung geeignet ist.