JP2640623B2 - ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法 - Google Patents
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法Info
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- JP2640623B2 JP2640623B2 JP6128860A JP12886094A JP2640623B2 JP 2640623 B2 JP2640623 B2 JP 2640623B2 JP 6128860 A JP6128860 A JP 6128860A JP 12886094 A JP12886094 A JP 12886094A JP 2640623 B2 JP2640623 B2 JP 2640623B2
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- tdt
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（以下、TdT と略す）
をコードしているDNA を含むバキュロウイルスベクタ
ー、そのバキュロウイルスベクターによって形質転換さ
れた昆虫細胞に関し、さらにその昆虫細胞によりTdT を
製造する方法、及び粗製TdT に特定の処理を組み合わせ
ることによって精製されたTdT を得る方法を提供するこ
とを目的とする。
クレオチジルトランスフェラーゼ（以下、TdT と略す）
をコードしているDNA を含むバキュロウイルスベクタ
ー、そのバキュロウイルスベクターによって形質転換さ
れた昆虫細胞に関し、さらにその昆虫細胞によりTdT を
製造する方法、及び粗製TdT に特定の処理を組み合わせ
ることによって精製されたTdT を得る方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】TdT は、DNA の3'末端にデオキシヌクレ
オチドを転移させる酵素である。本酵素は、動物の胸腺
等に存在する。中でも、子牛胸腺由来のTdT は古くから
単離・精製が行われており、詳細な性質が明らかにされ
ている。例えば、精製方法はM.E. Gottesman and E. S.
Canellakis, J. Biol. Chem., Vol. 241, p. 4339-435
2, 1966に記載されている。本酵素は、遺伝子工学の分
野において、DNA の標識に用いられている。特に、合成
DNA 等の短鎖DNA の標識に使用する酵素として重要であ
る。さらに、ベクタープライマー法によるcDNAのクロー
ニングにも広く使用されている。従来、TdT を製造する
方法としては、天然のTdT を子牛の胸腺から分離精製す
る方法が主に用いられてきた。さらに、遺伝子操作の技
法を用いてCOS7細胞で生産した例（O. Koiwai et al.,
Ncleic Acids Res., Vol. 14, p. 5777-5792, 1986）が
知られているが、その収量は、極めて低く放射性標識で
検出できる程度の量であった。
オチドを転移させる酵素である。本酵素は、動物の胸腺
等に存在する。中でも、子牛胸腺由来のTdT は古くから
単離・精製が行われており、詳細な性質が明らかにされ
ている。例えば、精製方法はM.E. Gottesman and E. S.
Canellakis, J. Biol. Chem., Vol. 241, p. 4339-435
2, 1966に記載されている。本酵素は、遺伝子工学の分
野において、DNA の標識に用いられている。特に、合成
DNA 等の短鎖DNA の標識に使用する酵素として重要であ
る。さらに、ベクタープライマー法によるcDNAのクロー
ニングにも広く使用されている。従来、TdT を製造する
方法としては、天然のTdT を子牛の胸腺から分離精製す
る方法が主に用いられてきた。さらに、遺伝子操作の技
法を用いてCOS7細胞で生産した例（O. Koiwai et al.,
Ncleic Acids Res., Vol. 14, p. 5777-5792, 1986）が
知られているが、その収量は、極めて低く放射性標識で
検出できる程度の量であった。
【０００３】子牛胸腺から分離精製されたTdT は、精製
過程においてタンパク質分解酵素により分解しやすい。
さらに、原料が動物臓器であるため、遺伝子工学用試薬
として供給する場合に、製品の均質性、安定性を保つこ
とが非常に困難であった。また、原料となる新鮮な子牛
胸腺を、特に国内では、大量に入手することが困難であ
った。遺伝子工学関連の実験技術の進歩により、従来、
放射性同位元素を用いなければ充分な検出感度が得られ
なかったDNA 標識実験、中でも合成DNA 標識実験が、ビ
オチン等の非放射性標識で行なえるようになってきた。
この際に、最もよく用いられている手法がTdT を用いて
非放射性標識デオキシヌクレオチドを導入する方法であ
る。非放射性標識で、放射性標識により近い検出感度の
試験を実現するためには、標識効率が高い高純度のTdT
が要求されているが、従来の子牛胸腺から分離精製する
方法では、安定して、このような高純度のTdT を供給す
ることは、技術的な面からも、コストの面からも難しい
のが現状である。
過程においてタンパク質分解酵素により分解しやすい。
さらに、原料が動物臓器であるため、遺伝子工学用試薬
として供給する場合に、製品の均質性、安定性を保つこ
とが非常に困難であった。また、原料となる新鮮な子牛
胸腺を、特に国内では、大量に入手することが困難であ
った。遺伝子工学関連の実験技術の進歩により、従来、
放射性同位元素を用いなければ充分な検出感度が得られ
なかったDNA 標識実験、中でも合成DNA 標識実験が、ビ
オチン等の非放射性標識で行なえるようになってきた。
この際に、最もよく用いられている手法がTdT を用いて
非放射性標識デオキシヌクレオチドを導入する方法であ
る。非放射性標識で、放射性標識により近い検出感度の
試験を実現するためには、標識効率が高い高純度のTdT
が要求されているが、従来の子牛胸腺から分離精製する
方法では、安定して、このような高純度のTdT を供給す
ることは、技術的な面からも、コストの面からも難しい
のが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、TdT をコードしているDNA を含むバキュロウイルス
ベクター、及びそのバキュロウイルスベクターによって
形質転換された昆虫細胞を提供し、さらに該昆虫細胞を
培養することにより、簡便に且つ安定して、高収率で高
純度のTdT を製造する方法を提供することにある。
は、TdT をコードしているDNA を含むバキュロウイルス
ベクター、及びそのバキュロウイルスベクターによって
形質転換された昆虫細胞を提供し、さらに該昆虫細胞を
培養することにより、簡便に且つ安定して、高収率で高
純度のTdT を製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】一般に、哺乳動物起源の
酵素遺伝子を、他の生物において、酵素活性を保持した
状態で高発現させることは、極めて難しい。個々の酵素
遺伝子とそれを発現させる宿主の組み合わせは多数存在
するが、効率良く、しかも酵素活性を保持した状態で発
現される組み合わせを見出すのは容易ではない。また、
組換え生産された酵素タンパク質の精製法としては、従
来の天然の酵素の精製法が最適の方法ではないため、精
製法を新たに検討する必要もある。
酵素遺伝子を、他の生物において、酵素活性を保持した
状態で高発現させることは、極めて難しい。個々の酵素
遺伝子とそれを発現させる宿主の組み合わせは多数存在
するが、効率良く、しかも酵素活性を保持した状態で発
現される組み合わせを見出すのは容易ではない。また、
組換え生産された酵素タンパク質の精製法としては、従
来の天然の酵素の精製法が最適の方法ではないため、精
製法を新たに検討する必要もある。
【０００６】本発明者らは鋭意研究した結果、TdT をコ
ードしているDNA を含有するバキュロウイルスベクター
を用いて昆虫細胞で発現させると、意外にも酵素活性を
保持した組換えTdT を大量に生産することが可能になる
こと、また、その粗製TdT を陰イオン交換処理及びヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーによって短時間
で、高収率で高純度TdT を得ることが可能であることを
見出して、本発明を完成させるに至った。従って本発明
は、TdT をコードするDNA を含むバキュロウイルスベク
ターに関する。本発明はさらに、該バキュロウイルスベ
クターにより形質転換された昆虫細胞に関する。本発明
はまた、上記形質転換昆虫細胞を培養することによるTd
T の製造方法であって、さらに上記方法において粗製の
TdT を陰イオン交換処理及びヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーによって精製するTdT の製造方法を提供
する。
ードしているDNA を含有するバキュロウイルスベクター
を用いて昆虫細胞で発現させると、意外にも酵素活性を
保持した組換えTdT を大量に生産することが可能になる
こと、また、その粗製TdT を陰イオン交換処理及びヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーによって短時間
で、高収率で高純度TdT を得ることが可能であることを
見出して、本発明を完成させるに至った。従って本発明
は、TdT をコードするDNA を含むバキュロウイルスベク
ターに関する。本発明はさらに、該バキュロウイルスベ
クターにより形質転換された昆虫細胞に関する。本発明
はまた、上記形質転換昆虫細胞を培養することによるTd
T の製造方法であって、さらに上記方法において粗製の
TdT を陰イオン交換処理及びヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィーによって精製するTdT の製造方法を提供
する。
【０００７】従来、昆虫細胞の組換え生産システムを利
用した組換えTdT の生産は知られていなかった。本明細
書中においてTdT という用語は、牛の天然のTdT を包含
するあらゆる哺乳動物起源のTdT を意味すると共に、遺
伝子組換えにより作られる変異TdT も含まれるものとす
る。TdT をコードしているDNA とは、天然のTdT のアミ
ノ酸配列、例えば牛TdT についてはO. Koiwai et al.,
Ncleic Acids Res., Vol. 14, p. 5777-5792, 1986を参
照、をコードするように作製されたcDNAを包含するDNA
を意味する。本発明で使用するTdT をコードしているDN
A の具体例として、牛TdT cDNAが挙げられる。上記TdT
をコードしているDNA を昆虫細胞を宿主として発現させ
るために、バキュロウイルス、トランスファーベクター
及び昆虫細胞宿主を使用することができる。バキュロウ
イルスとしてはBombyx mori NPV （BmNPV)、Autograha
californica NPV(AcNPV)、あるいは合成ウイルスBacPAK
6 、Blue-Bac等が、トランスファーベクターとしてはpA
cYM1、pAc373、pVL941、p89B310、pBE273、pAc360、pBa
cPAK8、pBacPAK9等が、また昆虫細胞宿主としてはSpodo
ptera frugiperda 、Bombyx mori がそれぞれ用いられ
る。これらを用いて、TdT をコードしているDNA を含む
バキュロウイルスベクター（以下、組換えバキュロウイ
ルスともいう）を作製する方法、組換えバキュロウイル
スによって昆虫細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方
法、及び昆虫細胞の培養については、従来の昆虫細胞を
用いた組換え生産システムの手順を用いることができ
る。とりわけ、松浦善治, バキュロウイルスベクターを
用いた遺伝子発現, 蛋白質核酸酵素, Vol. 37, No. 3,
p. 211-222, 1992、藤井陽一, バキュロウイルスの発現
システム, 蛋白質核酸酵素, Vol. 37, No. 14, p. 2701
-2706, 1992 等の文献が参考になる。
用した組換えTdT の生産は知られていなかった。本明細
書中においてTdT という用語は、牛の天然のTdT を包含
するあらゆる哺乳動物起源のTdT を意味すると共に、遺
伝子組換えにより作られる変異TdT も含まれるものとす
る。TdT をコードしているDNA とは、天然のTdT のアミ
ノ酸配列、例えば牛TdT についてはO. Koiwai et al.,
Ncleic Acids Res., Vol. 14, p. 5777-5792, 1986を参
照、をコードするように作製されたcDNAを包含するDNA
を意味する。本発明で使用するTdT をコードしているDN
A の具体例として、牛TdT cDNAが挙げられる。上記TdT
をコードしているDNA を昆虫細胞を宿主として発現させ
るために、バキュロウイルス、トランスファーベクター
及び昆虫細胞宿主を使用することができる。バキュロウ
イルスとしてはBombyx mori NPV （BmNPV)、Autograha
californica NPV(AcNPV)、あるいは合成ウイルスBacPAK
6 、Blue-Bac等が、トランスファーベクターとしてはpA
cYM1、pAc373、pVL941、p89B310、pBE273、pAc360、pBa
cPAK8、pBacPAK9等が、また昆虫細胞宿主としてはSpodo
ptera frugiperda 、Bombyx mori がそれぞれ用いられ
る。これらを用いて、TdT をコードしているDNA を含む
バキュロウイルスベクター（以下、組換えバキュロウイ
ルスともいう）を作製する方法、組換えバキュロウイル
スによって昆虫細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方
法、及び昆虫細胞の培養については、従来の昆虫細胞を
用いた組換え生産システムの手順を用いることができ
る。とりわけ、松浦善治, バキュロウイルスベクターを
用いた遺伝子発現, 蛋白質核酸酵素, Vol. 37, No. 3,
p. 211-222, 1992、藤井陽一, バキュロウイルスの発現
システム, 蛋白質核酸酵素, Vol. 37, No. 14, p. 2701
-2706, 1992 等の文献が参考になる。
【０００８】TdT を昆虫細胞で発現させた場合、培養液
あるいは昆虫細胞抽出物について、塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、電気泳動、限外濾過等の精製手段あるいは
これらを組み合わせて用いることによりTdT を精製する
ことができるが、中でも、陰イオン交換処理及びヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーを用いることが、Td
T をより高純度、高収率に精製することができるので有
利である。本発明で使用する陰イオン交換処理とは、Td
T が陰イオン交換担体に結合しにくい性質を利用して、
DNA 、タンパク質、多糖などの陰イオン交換担体に結合
しやすい不純物を分離する操作をいう。特に、陰イオン
交換担体としては、ジエチルアミノエチル基等を有した
担体が好適である。担体としてはセルロース、架橋ポリ
サッカライド等を用いることができる。例えば、DE52
（ワットマン社）、DEAE- セファロース（ファルマシア
社）等が挙げられる。この工程に供する粗製TdT の溶液
は、できるだけ低塩濃度に調製したものが望ましい。例
えば、50mMリン酸カリウム緩衝液等を使用する。
あるいは昆虫細胞抽出物について、塩析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、電気泳動、限外濾過等の精製手段あるいは
これらを組み合わせて用いることによりTdT を精製する
ことができるが、中でも、陰イオン交換処理及びヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィーを用いることが、Td
T をより高純度、高収率に精製することができるので有
利である。本発明で使用する陰イオン交換処理とは、Td
T が陰イオン交換担体に結合しにくい性質を利用して、
DNA 、タンパク質、多糖などの陰イオン交換担体に結合
しやすい不純物を分離する操作をいう。特に、陰イオン
交換担体としては、ジエチルアミノエチル基等を有した
担体が好適である。担体としてはセルロース、架橋ポリ
サッカライド等を用いることができる。例えば、DE52
（ワットマン社）、DEAE- セファロース（ファルマシア
社）等が挙げられる。この工程に供する粗製TdT の溶液
は、できるだけ低塩濃度に調製したものが望ましい。例
えば、50mMリン酸カリウム緩衝液等を使用する。
【０００９】ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
には、カラムクロマトグラフィー用に市販されているヒ
ドロキシアパタイトや高速液体クロマトグラフィー用ヒ
ドロキシアパタイトカラムなどを用いることができる。
例えば、カラムクロマト用ヒドロキシアパタイト（和光
純薬）、エコノパックカートリッジHTP （バイオラッド
社）等が挙げられる。この工程では、適当な緩衝液、例
えば50 mM リン酸カリウムでカラムを平衡化した後に、
平衡化に供した緩衝液と同様の塩濃度に調製した陰イオ
ン交換処理画分を吸着させ、塩濃度を上げること、例え
ば50 mM −300mM リン酸カリウム緩衝液の濃度勾配を
かけることにより溶出を行う。
には、カラムクロマトグラフィー用に市販されているヒ
ドロキシアパタイトや高速液体クロマトグラフィー用ヒ
ドロキシアパタイトカラムなどを用いることができる。
例えば、カラムクロマト用ヒドロキシアパタイト（和光
純薬）、エコノパックカートリッジHTP （バイオラッド
社）等が挙げられる。この工程では、適当な緩衝液、例
えば50 mM リン酸カリウムでカラムを平衡化した後に、
平衡化に供した緩衝液と同様の塩濃度に調製した陰イオ
ン交換処理画分を吸着させ、塩濃度を上げること、例え
ば50 mM −300mM リン酸カリウム緩衝液の濃度勾配を
かけることにより溶出を行う。
【００１０】TdT の活性測定は、以下の方法によった。
すなわち、２μl のサンプルを含む20μl の反応液[100
mM カコジル酸カリウム、２mM 塩化コバルト、200 μ
M ジチオスレイトール、1 mM dATP 、0.2 mM ジゴキシ
ゲニン-11-dUTP（ベーリンガー社）、１μg 合成DNA
（20塩基長）、pH7.2]を37℃、30分間インキュベートし
た後に、反応液１μl をナイロン・メンブレン（Hybond
-N、アマシャム社）にスポットした。このメンブレンを
紫外線照射した後に、TBST（50 mM Tris、150 mM塩化ナ
トリウム、0.05% Tween20 、pH7.6 ）-0.5% スキムミル
ク中にて30分間、室温でインキュベートし、未反応ジゴ
キシゲニン-11-dUTPの除去、ブロッキングを行なった。
次に、抗ジゴキシゲニン抗体アルカリホスファターゼ複
合体（ベーリンガー社）を含むTBST-0.5% スキムミルク
中にて30分間、室温でインキュベートした。TBSTで10分
間、３回洗浄した後に、酵素基質溶液（0.18 mg/ml 5-
ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート、0.33 m
g/ml ニトロブルーテトラゾリウム、100 mM Tris-HCl
、100 mM 塩化ナトリウム、50 mM 塩化マグネシウ
ム、pH9.5 ）を加えて15分間、室温で発色させ、発色の
強度を測定した。
すなわち、２μl のサンプルを含む20μl の反応液[100
mM カコジル酸カリウム、２mM 塩化コバルト、200 μ
M ジチオスレイトール、1 mM dATP 、0.2 mM ジゴキシ
ゲニン-11-dUTP（ベーリンガー社）、１μg 合成DNA
（20塩基長）、pH7.2]を37℃、30分間インキュベートし
た後に、反応液１μl をナイロン・メンブレン（Hybond
-N、アマシャム社）にスポットした。このメンブレンを
紫外線照射した後に、TBST（50 mM Tris、150 mM塩化ナ
トリウム、0.05% Tween20 、pH7.6 ）-0.5% スキムミル
ク中にて30分間、室温でインキュベートし、未反応ジゴ
キシゲニン-11-dUTPの除去、ブロッキングを行なった。
次に、抗ジゴキシゲニン抗体アルカリホスファターゼ複
合体（ベーリンガー社）を含むTBST-0.5% スキムミルク
中にて30分間、室温でインキュベートした。TBSTで10分
間、３回洗浄した後に、酵素基質溶液（0.18 mg/ml 5-
ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート、0.33 m
g/ml ニトロブルーテトラゾリウム、100 mM Tris-HCl
、100 mM 塩化ナトリウム、50 mM 塩化マグネシウ
ム、pH9.5 ）を加えて15分間、室温で発色させ、発色の
強度を測定した。
【００１１】以下に、実施例をあげ本発明を詳細に説明
する。
する。
【実施例】遺伝子操作の一般的手法は、実験書（Sambro
okら, Molecular cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harb
or Laboratory, 1992)及び試薬説明書記載の方法に従っ
た。 牛TdT 遺伝子を含むDNA 断片の単離 牛TdT 遺伝子は、公知の塩基配列を基に、ポリメラーゼ
・チェイン・リアクション法（以下、PCR 法）により、
市販子牛胸腺cDNAλファージライブラリー（クローンテ
ック社）から単離した。まず、市販子牛胸腺cDNAλファ
ージライブラリーより、全DNA を調製した。ライブラリ
ーファージ液に、20μg/mlプロテイナーゼK を加え、37
℃、30分間インキュベートした。これを、フェノール処
理した後に、エタノール沈殿したDNA を得た。次いで、
TdT 遺伝子の開始コドン上流の配列を持つプライマー１
（配列番号１）及び終止コドン下流の配列に相補するプ
ライマー２（配列番号２）をアプライドバイオシステム
ズ391 型DNA 合成装置を用いて合成した。この２種類の
プライマー、前述のDNA 、Taq ポリメラーゼ（パーキン
エルマー社）を用い、サーマルサイクラー9800型（パー
キンエルマー社）でPCR 反応を行なった。反応生成物は
0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約1.8kb のDNA 断
片をゲルから抽出しフェノール処理、エタノール沈殿
後、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造）で末端を平滑にし
た。これを、pUC118（宝酒造）のSmaI切断部位に挿入
し、プラスミドpTDT14を得た。塩基配列の確認は、キロ
シークエンス用ディレーションキット（宝酒造）を用い
て、キット説明書に準じて行なった。
okら, Molecular cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harb
or Laboratory, 1992)及び試薬説明書記載の方法に従っ
た。 牛TdT 遺伝子を含むDNA 断片の単離 牛TdT 遺伝子は、公知の塩基配列を基に、ポリメラーゼ
・チェイン・リアクション法（以下、PCR 法）により、
市販子牛胸腺cDNAλファージライブラリー（クローンテ
ック社）から単離した。まず、市販子牛胸腺cDNAλファ
ージライブラリーより、全DNA を調製した。ライブラリ
ーファージ液に、20μg/mlプロテイナーゼK を加え、37
℃、30分間インキュベートした。これを、フェノール処
理した後に、エタノール沈殿したDNA を得た。次いで、
TdT 遺伝子の開始コドン上流の配列を持つプライマー１
（配列番号１）及び終止コドン下流の配列に相補するプ
ライマー２（配列番号２）をアプライドバイオシステム
ズ391 型DNA 合成装置を用いて合成した。この２種類の
プライマー、前述のDNA 、Taq ポリメラーゼ（パーキン
エルマー社）を用い、サーマルサイクラー9800型（パー
キンエルマー社）でPCR 反応を行なった。反応生成物は
0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約1.8kb のDNA 断
片をゲルから抽出しフェノール処理、エタノール沈殿
後、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造）で末端を平滑にし
た。これを、pUC118（宝酒造）のSmaI切断部位に挿入
し、プラスミドpTDT14を得た。塩基配列の確認は、キロ
シークエンス用ディレーションキット（宝酒造）を用い
て、キット説明書に準じて行なった。
【００１２】BacPAK-TdTの作製 宿主ベクター系としては、PacPAKシステム（クローンテ
ック社）を使用した。pBacPAK9は大腸菌プラスミドベク
ターにバキュロウイルスDNA の一部を組み込んだもの
で、トランスファーベクターとして用いる。また、BacP
AK6 は、AcNPV 由来のウイルスDNA に大腸菌lacZ遺伝子
を組み込んだものである。TdT 遺伝子を導入したpBacPA
K9とBacPAK6 を昆虫細胞にコ−トランスフェクトするこ
とにより、相同組換えが起こり、TdT 遺伝子を持つ組換
えバキュロウイルスが得られる。この組換えウイルスを
昆虫細胞に感染させることにより、組換えTdT タンパク
質を得ることができる。TdT 遺伝子の開始コドン付近の
配列を持つプライマー３（配列番号３）と終止コドン付
近に相補する配列にKpnIリンカーを導入したプライマー
４（配列番号４）をDNA 合成機で合成し、これらとpTDT
14を用いてPCR 法により、TdT 遺伝子を増幅させた。反
応生成物を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約1.5k
b のDNA断片をゲルから抽出しフェノール処理、エタノ
ール沈殿後、T4 DNA ポリメラーゼ（宝酒造）で末端を
平滑にした。このDNA をKpnIで消化した後、再度アガロ
ース電気泳動で精製し、これをpBacPAK9のSmaI-KpnI 切
断部位に導入し、pBacPAK9-TdTを得た。以下の操作は、
BacPAKシステムの添付説明書に記載の通りに実施した。
Bsu36I処理したBacPAK6 DNA 及びpBacPAK9-TdT DNAをリ
ポフェクチン（BRL社）を用いて、培地を牛胎仔血清
（以下、FCS)を含まないグレース培地に置換したSf21細
胞にコ−トランスフェクトした。27℃、５時間放置した
後、培地を10%FCSを含むグレース培地に置換し、３日間
培養を行なった。この培養液上清を用い、プラークアッ
セイを行い、組換えバキュロウイルスを得た。得られた
ウイルスを再度プラークアッセイに供し、純化を行なっ
た。
ック社）を使用した。pBacPAK9は大腸菌プラスミドベク
ターにバキュロウイルスDNA の一部を組み込んだもの
で、トランスファーベクターとして用いる。また、BacP
AK6 は、AcNPV 由来のウイルスDNA に大腸菌lacZ遺伝子
を組み込んだものである。TdT 遺伝子を導入したpBacPA
K9とBacPAK6 を昆虫細胞にコ−トランスフェクトするこ
とにより、相同組換えが起こり、TdT 遺伝子を持つ組換
えバキュロウイルスが得られる。この組換えウイルスを
昆虫細胞に感染させることにより、組換えTdT タンパク
質を得ることができる。TdT 遺伝子の開始コドン付近の
配列を持つプライマー３（配列番号３）と終止コドン付
近に相補する配列にKpnIリンカーを導入したプライマー
４（配列番号４）をDNA 合成機で合成し、これらとpTDT
14を用いてPCR 法により、TdT 遺伝子を増幅させた。反
応生成物を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約1.5k
b のDNA断片をゲルから抽出しフェノール処理、エタノ
ール沈殿後、T4 DNA ポリメラーゼ（宝酒造）で末端を
平滑にした。このDNA をKpnIで消化した後、再度アガロ
ース電気泳動で精製し、これをpBacPAK9のSmaI-KpnI 切
断部位に導入し、pBacPAK9-TdTを得た。以下の操作は、
BacPAKシステムの添付説明書に記載の通りに実施した。
Bsu36I処理したBacPAK6 DNA 及びpBacPAK9-TdT DNAをリ
ポフェクチン（BRL社）を用いて、培地を牛胎仔血清
（以下、FCS)を含まないグレース培地に置換したSf21細
胞にコ−トランスフェクトした。27℃、５時間放置した
後、培地を10%FCSを含むグレース培地に置換し、３日間
培養を行なった。この培養液上清を用い、プラークアッ
セイを行い、組換えバキュロウイルスを得た。得られた
ウイルスを再度プラークアッセイに供し、純化を行なっ
た。
【００１３】TdT 遺伝子の発現 Sf21細胞を10% FCS を含むグレース培地を用いて、150
平方センチメートルの角型フラスコに８×106 個の細胞
を接種し、27℃、１夜培養した後に、上記で得た組換え
ウイルスをm.o.i.=10 で感染させた。27℃、４日間培養
した。
平方センチメートルの角型フラスコに８×106 個の細胞
を接種し、27℃、１夜培養した後に、上記で得た組換え
ウイルスをm.o.i.=10 で感染させた。27℃、４日間培養
した。
【００１４】組換えTdT の精製 上記の方法に従い培養した細胞を、2,000 r.p.m.で5分
間遠心分離した。得られた細胞を5 mlの50 mM リン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装
置（コスモバイオ社）で破砕した。次いで、破砕液を10
0,000 r.p.m.、30分間、超遠心分離し、上清を得た。得
られた上清のTdT 酵素活性を測定したところ、強い活性
が認められた。この画分を、DE52処理に供した。50 mM
リン酸カリウム緩衝液（pH7.0)で平衡化したDE52カラム
（直径15 mm 、長さ50 mm)に超音波破砕上清を通液し、
同緩衝液10 ml で洗浄、非吸着画分を得た。次いで、得
られた画分をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フィーに供した。50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0)
で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（エコノカラ
ムカートリッジHTP 1ml 、バイオラッド社）に0.5 ml/m
inの流速でDE52非吸着画分を吸着させた。同緩衝液、同
流速で10分間洗浄した後に、20分間の50mM−300 mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.0)のリニアグラジエントによる
溶出を行なった。250 mM付近に溶出した画分にTdT 酵素
活性が観察され、そのピーク画分を回収した（図１）。
得られた画分をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供し、クマーシーブリリアントブルーR-250 で染色した
ところ、TdT が単一のバンドとして検出された（図
２）。また、DNA 分解酵素、タンパク質分解酵素、ホス
ファターゼなどの活性は含まれず、遺伝子工学試薬とし
ても充分使用できる純度であった。
間遠心分離した。得られた細胞を5 mlの50 mM リン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装
置（コスモバイオ社）で破砕した。次いで、破砕液を10
0,000 r.p.m.、30分間、超遠心分離し、上清を得た。得
られた上清のTdT 酵素活性を測定したところ、強い活性
が認められた。この画分を、DE52処理に供した。50 mM
リン酸カリウム緩衝液（pH7.0)で平衡化したDE52カラム
（直径15 mm 、長さ50 mm)に超音波破砕上清を通液し、
同緩衝液10 ml で洗浄、非吸着画分を得た。次いで、得
られた画分をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラ
フィーに供した。50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0)
で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（エコノカラ
ムカートリッジHTP 1ml 、バイオラッド社）に0.5 ml/m
inの流速でDE52非吸着画分を吸着させた。同緩衝液、同
流速で10分間洗浄した後に、20分間の50mM−300 mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.0)のリニアグラジエントによる
溶出を行なった。250 mM付近に溶出した画分にTdT 酵素
活性が観察され、そのピーク画分を回収した（図１）。
得られた画分をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供し、クマーシーブリリアントブルーR-250 で染色した
ところ、TdT が単一のバンドとして検出された（図
２）。また、DNA 分解酵素、タンパク質分解酵素、ホス
ファターゼなどの活性は含まれず、遺伝子工学試薬とし
ても充分使用できる純度であった。
【００１５】
【発明の効果】TdT を各種動物の臓器から生産する方法
や他の組換え生産系と比較し、本発明の方法によれば簡
便に、且つ安定して高純度のTdT を大量生産することが
できる。
や他の組換え生産系と比較し、本発明の方法によれば簡
便に、且つ安定して高純度のTdT を大量生産することが
できる。
【００１６】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：牛TdT 遺伝子の開始コドン付近の配列を有
したPCR プライマー 配列 AGACCACTTG ATGGCACAGA CGAGGCAGCA 30
したPCR プライマー 配列 AGACCACTTG ATGGCACAGA CGAGGCAGCA 30
【００１７】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：牛TdT 遺伝子下流に相補する配列を有した
PCR プライマー 配列 ATTGCGAGTT CTACACATCA GTCCTGCAAA 30
PCR プライマー 配列 ATTGCGAGTT CTACACATCA GTCCTGCAAA 30
【００１８】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：牛TdT 遺伝子の開始コドン付近の配列を有
したPCR プライマー 配列 ATGGCACAGA CGAGGCAGCA TCAGCGTCTT 30
したPCR プライマー 配列 ATGGCACAGA CGAGGCAGCA TCAGCGTCTT 30
【００１９】配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：牛TdT 遺伝子の終始コドン付近に相補する
配列及びKpnIリンカーを有したPCR プライマー 配列 CCCAAGGTAC CAGCTTTCTC CTAAGCATTT CTTTCC 36
配列及びKpnIリンカーを有したPCR プライマー 配列 CCCAAGGTAC CAGCTTTCTC CTAAGCATTT CTTTCC 36
【図１】本発明により得られたTdT のヒドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフィー溶出パターンを示す図で
ある。
イトカラムクロマトグラフィー溶出パターンを示す図で
ある。
【図２】本発明の方法により精製したTdT のSDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動パターンを表わす図である。
クリルアミドゲル電気泳動パターンを表わす図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼをコードしているDNA を含むバキュロウ
イルスベクター。 - 【請求項２】 ターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼをコードしているDNA が牛ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼcDNAであるこ
とを特徴とする請求項１記載のバキュロウイルスベクタ
ー。 - 【請求項３】 請求項１記載のバキュロウイルスベクタ
ーによって形質転換された昆虫細胞。 - 【請求項４】 請求項２記載のバキュロウイルスベクタ
ーによって形質転換された昆虫細胞。 - 【請求項５】 請求項３記載の昆虫細胞を培養すること
を特徴とするターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼの製造方法。 - 【請求項６】 請求項４記載の昆虫細胞を培養すること
を特徴とするターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼの製造方法。 - 【請求項７】 粗製のターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを陰イオン交換処理及びヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーによって精製すること
を特徴とする請求項５または６記載のターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6128860A JP2640623B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6128860A JP2640623B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07327682A JPH07327682A (ja) | 1995-12-19 |
| JP2640623B2 true JP2640623B2 (ja) | 1997-08-13 |
Family
ID=14995165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6128860A Expired - Fee Related JP2640623B2 (ja) | 1994-06-10 | 1994-06-10 | ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2640623B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998006835A2 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | The Texas A & M University System | Modifying insect cell gylcosylation pathways with baculovirus expression vectors |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6037988A (ja) * | 1983-05-27 | 1985-02-27 | ザ、テキサス、エーエンドエム、ユニバーシティー、システム | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
-
1994
- 1994-06-10 JP JP6128860A patent/JP2640623B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6037988A (ja) * | 1983-05-27 | 1985-02-27 | ザ、テキサス、エーエンドエム、ユニバーシティー、システム | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07327682A (ja) | 1995-12-19 |
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