JPH09500011A

JPH09500011A - Ｐ．ブルガリスからのコンドロイチナーゼｉ及びｉｉ遺伝子のクローニング及び発現

Info

Publication number: JPH09500011A
Application number: JP6524437A
Authority: JP
Inventors: ジョーゼフライアン，マイケル; マノハーカンドク，キラン; クリフォードティレイ，ブルース; アーノルドロトヴィン，ジェイソン
Original assignee: アメリカンサイアナミドカンパニー
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1997-01-07
Also published as: CA2161125A1; EP0702715A4; WO1994025567A1; AU6818394A; AU697156B2; EP0702715A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、図１に示すＮｓｉフラグメントに含まれるプロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）からの”コンドロイチナーゼＩ”と呼ばれるコンドロイチナーゼＡＢＣの主要タンパク質成分をエンコードするＤＮＡ配列に関する。また本発明は、Ｐ．ブルガリスからの”コンドロイチナーゼＩＩ”と呼ばれるコンドロイチナーゼＡＢＣの第２のタンパク質成分をエンコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列を含む遺伝子のクローニング及び発現、組換えコンドロイチナーゼＩ及びＩＩのアミノ酸配列、及び組換えコンドロイチナーゼＩまたはＩＩの単離、精製方法に関する。これらの方法は、Ｐ．ブルガリスから天然のコンドロイチナーゼＩを単離及び精製するために既に用いられている方法を組換え酵素用に修正して得られる方法より、極めて高い収率及び純度を与える。図１参照。

Description

【発明の詳細な説明】Ｐ．ブルガリスからのコンドロイチナーゼＩ及びＩＩ遺伝子のクローニング及び発現発明の分野本発明は、”コンドロイチナーゼＩ”と呼ばれるプロテウス・ブルガリス(Pro teus vulgaris)（Ｐ．ブルガリス(P．vulgaris)）からのコンドロイチナーゼＡＢＣの主要タンパク質成分をエンコードするＤＮＡ配列に関する。また本発明は、”コンドロイチナーゼＩＩ”と呼ばれるＰ．ブルガリスからのコンドロイチナーゼＡＢＣの主要タンパク質成分をエンコードするＤＮＡ配列に関する。さらに本発明は、これらのＤＮＡ配列を含む遺伝子のクローニング及び発現、及びこれらのＤＮＡ配列によってエンコードされる組換えコンドロイチナーゼＩ及びＩＩこそのアミノ酸配列にも関する。さらに本発明は、”コンドロイチナーゼＩ”と呼ばれる、プロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）からのコンドロイチナーゼＡＢＣの、組換え的に(recom binantry)発現された主要タンパク質成分の単離及び精製方法に関する。また本発明は、”コンドロイチナーゼＩＩ”と呼ばれる、Ｐ．ブルガリスからのコンドロイチナーゼＡＢＣの、組換え的に(recombinantry)発現された第二のタンパク質成分の単離及び精製方法に関する。これらの方法は、Ｐ．ブルガリスから天然の(native)コンドロイチナーゼＩを単離及び精製するために既に用いられている方法を組換え酵素用に修正して得られる方法より、極めて高い収率及び純度を与える。発明の背景コンドロイチナーゼは細菌を起源とする酵素であり、脱出椎間板の軟骨を、その円板のコラーゲン成分の安定化を損なわずに溶解させる価値を有すると記載されている。コンドロイチナーゼの例としては、細菌Ｐ．ブルガリスによって産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣ、及びＡ．アウレセンス(A．aurescens)によって産生されるコンドロイチナーゼＡＣがある。コンドロイチナーゼは、タンパク質−多糖類複合体において、タンパク質コアを分解すること無く、多糖類側鎖を分解することによって機能する。ヤマガタ等(Yamagata et al.)は、Ｐ．ブルガリスの抽出液から、酵素コンドロイチナーゼＡＢＣを精製することを開示している（参考文献１）。この酵素は、グリコサミノグリカンであるコンドロイチン−４−硫酸、デルマタン硫酸及びコンドロイチン−６−硫酸（各々、コンドロイチンＡ、Ｂ及びＣとも呼ばれる）を、ｐＨ８において、コンドロイチンまたはヒアルロン酸より速く選択的に分解する。しかし、この酵素は、ケラト硫酸、ヘパリンまたはヘパリチン酸を攻撃しない。キクチ等(Kikuchi et al.)は、コンドロイチナーゼＡＢＣのようなグリコサミノグリカン分解性酵素の精製を開示しており、酵素を含む溶液を、不溶性の多糖類キャリア上に吸着させ、そのキャリアから個々の酵素を脱着させることによって機能化させている（２）。ブラウン(Brown)は、コンドロイチナーゼＡＢＣを含む溶液の有効量を、椎間円板の隙間に注射することにより、ヒトを含む哺乳類における椎間円板の置き換えの治療方法を開示している（３）。このコンドロイチナーゼＡＢＣは、Ｐ．ブルガリスのちゅうしゅつえきから単離され精製されている。この天然の酵素物質は、ヘルニア様脊髄円板のような軟骨を溶解させる機能がある。特にこの酵素は、プロテオグリカン及び任意に分散されたコラーゲン線維を含む髄核の選択的な化学的髄核分解を生ずる。ヘイグマン(Hageman)は、硝子体切除術につけ加えて、哺乳類の眼の神経網膜、線毛上皮及び後ろのレンズ表面から、選択的かつ完全に、眼の硝子体、エピレチナル(epiretinal)膜または線維細胞状膜を取り出す(disinsersion)ための眼の硝子体切除法を開示している。これは、特に硝子体網膜の接着部位に局在したコンドロイチン表面プロテオグリカンを分裂させ分解する酵素の有効量を眼に投与し、前記硝子体及び／またはエピレチナル膜を完全に取り出すことによる（４）。この酵素は、コンドロイチナーゼＡＢＣのような、プロテアーゼ無しのグリコサミノグリカナーゼであってもよい。ヘイグマンは、生化学工業株式会社(Seika gaku Kogyo Co.，Ltd.)、東京、日本から得たコンドロイチナーゼＡＢＣを使用している。この生化学工業の材料からコンドロイチナーゼＡＢＣを単離し精製するとき、硝子体切除法でのコンドロイチナーゼの有効な調製と、コンドロイチナーゼＡＢＣの主要タンパク質成分より僅かに大きな（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による見かけの分子量を持つ第２のタンパク質の存在との間に相関があることを特記する。この第２のタンパク質は、ここで、”コンドロイチナーゼＩＩ”とし、コンドロイチナーゼＡＢＣの主要タンパク質成分は、”コンドロイチナーゼＩ”と呼ぶ。これらのコンドロイチナーゼＩ及びＩＩタンパク質は、中性ｐＨにおいて塩基性タンパク質であり、８．３０−８．４５に類似の等電点を持つ。天然の酵素のコンドロイチンＩ及びＩＩの形態を別々に精製することにより、硝子体切除手術において有効なのは、これらのタンパク質各々ではなく、それらの組み合わせであることがわかった。天然の酵素のコンドロイチナーゼＩ及びＩＩ形態の１日の使用は、天然の源泉 (sources)から得られる少量の酵素に限られる。天然の形態の酵素の産生及び精製は、Ｐ．ブルガリスの発酵を用いて行われるが、その発酵では、その基質がこれらの形態の酵素の産生を開始させるインデューサー(inducer)として使用される。低レベルの合成、インデューサー（コンドロイチン硫酸）のコスト及び入手可能性、及びＰ．ブルガリスの便宜主義的病原学的性質を含む要因を組み合わせた結果、産天然のより有効な方法の要求が生じていた。さらに、従来の技術で産生された天然の形態の酵素は、細菌抽出液中に存在するプロテアーゼによる分解を受ける。従って、これら２つの形態の酵素を医療用途のために正確に見積もり食させるべく、コンタミナント(contaminant)を含まない純粋な物質の信頼できる供給が要求されている。また、コンタミナントを含まないコンドロイチナーゼＩ及びＩＩ酵素の信頼できる供給物を単離し精製する方法も必要とされている。発明の要旨従って、本発明の目的は、現在の非−組換え細菌発酵及び抽出技術を用いたのでは容易に達成できない量のコンドロイチナーゼＩ及びコンドロイチナーゼＩＩを賛成することにある。本発明の更なる目的は、コンドロイチナーゼＩ及びコンドロイチナーゼＩＩを、各々が、酵素を分解してその活性の低下を生ずるプロテアーゼを実質的に含まない形態で産生することである。これらの目的は、存在している問題に対する代替的アプローチを通して、これら２つの形態の酵素の大規模な細菌発酵によって達成される。コンドロイチナーゼＩ及びコンドロイチナーゼＩＩ別々に、この酵素をエンコードする遺伝子をクローン化し、異種の宿主中で高いレベルで発現される。好ましい実施態様では、本発明は、コンドロイチナーゼＩでは、Ｐ．ブルガリス遺伝子をクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で酵素を高レベルで発現させ、同様に、コンドロイチナーゼＩＩでは、Ｐ．ブルガリス遺伝子をクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で酵素を高レベルで発現させることを目指している。本発明は、コンドロイチナーゼＩをエンコードする配列からなるＰ．ブルガリスの単離し精製したＤＮＡフラグメントを提供する。また本発明は、以下のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされたＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントを提供する。（ａ）シグナルペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ（配列番号）：２、アミノ酸１− １０２１）を持つコンドロイチナーゼＩ酵素またはその生物学的等価物（例えば、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１１９−３１８１の番号のヌクレオチド、及び（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１１９−３１８１の番号のヌクレオチドによってエンコードされ、開始コドンの直上流側の３つのヌクレオチドは変化している（ＳＥＱＩＤＮＯ３：、ヌクレオチド１１６−１１８）。）（ｂ）シグナルペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸２５−１０２１）を持つ成熟したコンドロイチナーゼＩ酵素またはその生物学的等価物（例えば、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１９１−３１８１の番号のヌクレオチド、及び（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１９１−３１８１の番号のヌクレオチドによってエンコードされ、開始コドンの直上流側の３つのヌクレオチドは変化している（ＳＥＱＩＤＮＯ３：、ヌクレオチド１１６−１１８）。）（ｃ）シグナルペプチドをエンコードする配列が、その酵素のアミノ末端にメチオニンを付加した配列で置換された成熟コンドロイチナーゼＩ酵素（ＳＥＱＩＤＮＯ：５、アミノ酸２４−１０２１）またはその生物学的等価物（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の１８８−３１８１の番号のヌクレオチドによってエンコードされたもの）。組換えコンドロイチナーゼＩは、上記の配列のひとつを含むＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントで宿主細胞を形質転換し、その宿主細胞を、酵素が宿主細胞によって発現できる条件下で培養することによって産生される。また本発明は、コンドロイチナーゼＩＩをエンコードする配列からなるＰ．ブルガリスの単離し精製したＤＮＡフラグメントを提供する。また本発明は、以下のアミノ酸配列をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされたＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントを提供する。（ａ）シグナルペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸１−１０１３）を持つコンドロイチナーゼＩＩ酵素またはその生物学的等価物（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３２３８−６２７６の番号のヌクレオチドによってエンコードされたもの）。（ｂ）成熟コンドロイチナーゼＩＩ酵素（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸２４−１０１３）またはその生物学的等価物（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３３０７−６２７６の番号のヌクレオチドによってエンコードされたもの）。組換えコンドロイチナーゼＩＩは、上記の配列のひとつを含むＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントで宿主細胞を形質転換し、その宿主細胞を、酵素が宿主細胞によって発現できる条件下で培養することによって産生される。本発明のさらなる目的は、組換え的に発現されるＰ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩ酵素の単離及び精製方法を提供することにある。本発明の特別な目的は、Ｐ．ブルガリスから天然のコンドロイチナーゼＩを単離及び精製するために既に用いられている方法を組換え酵素用に修正して得られる方法より、極めて高い収率及び純度の組換えコンドロイチナーゼＩ酵素を与える方法を提供することにある。これらの目的は、コンドロイチナーゼＩ酵素について、ここに記載しクレームする２つの方法のいずれかを通して達成される。第１の方法は次の工程からなる。（ａ）組換えコンドロイチナーゼＩを発現する宿主細胞をホモジェナイズ(hom ogeniz)することによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーション(diafiltration)を施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、そして、（ｅ）酵素をカラムから放出させることのできる溶媒で、カチオン交換カラムに結合した酵素を溶離させる。第２の方法では、直前で述べた第１の方法の工程（ｂ）に先立って、以下の工程を実施する。（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく。本発明のさらなる目的は、組換え的に発現されるＰ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩＩ酵素の単離及び精製方法を提供することにある。本発明の付加的な目的は、Ｐ．ブルガリスから天然のコンドロイチナーゼＩを単離及び精製するために既に用いられている方法を組換え酵素用に修正して得られる方法より、極めて高い収率及び純度の組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素を与える方法を提供することにある。これらの目的は、コンドロイチナーゼＩＩ酵素について、ここに記載しクレームする２つの方法のいずれかを通して達成される。第１の方法は次の工程からなる。（ａ）組換えコンドロイチナーゼＩＩを発現する宿主細胞をホモジェナイズすることによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーションを施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、（ｅ）硫酸コンドロイチン溶液を用いた親和性溶離により、カチオン交換カラムに結合した酵素を、その酵素が硫酸コンドロイチンとともに溶離するようにし、（ｆ）工程（ｅ）からの溶離液を、アニオン交換樹脂−含有カラムに入れて硫酸コンドロイチンがカラムに結合するように、溶媒で酵素を溶離し、（ｇ）工程（ｆ）からの溶離液を濃縮し、約３７ｋＤのコンタミナントを含む上澄み液から酵素を結晶化させる。第２の方法では、直前で述べた第１の方法の工程（ｂ）に先立って、以下の工程を実施する。（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく工程を行う請求項２４記載の方法。本発明の方法を用いることにより、Ｐ．ブルガリスから天然のコンドロイチナーゼＩを単離及び精製するために既に用いられている方法を各組換え酵素用に修正して得られる方法より、極めて高い収率及び純度の各組換え酵素を得ることができる図面の簡単な説明図１は、ｐＩＢＩ２４のサブクローン化(subclone)された約１０キロベース(k ilobase)のＮｓｉフラグメントについての予備的制限マップ(preliminary restr iction map)を示す。このＮｓｉフラグメントは、コンドロイチナーゼＩをエンコードする完全な遺伝子とコンドロイチナーゼＩＩをエンコードする遺伝子の一部を含んでいる。制限部位は、それらのおよその位置で示した。制限部位は、以下に述べる構成において有効である。存在する他の制限部位は図には示さず、いくつかは下記の実施例１３において説明する。図２は、塩化ナトリウム勾配を用いたカチオン交換クロマトグラフィー・カラムからの組換えコンドロイチナーゼＩ酵素の溶離を示す。天然の酵素を精製するのに用いた方法を、ここでは、組換え酵素を精製するために使用した。図の左側の初期のフラクションはカラムに結合していない。それらは、コンドロイチナーゼＩ酵素活性の大部分を含んでいる。図の右側の酵素を含んだフラクションには、”溶離活性(eluted activity)”と記した。勾配(gradient)は、０．０から２．５ｍＭのＮａＣｌである。図３は、本発明の方法に従い、まず上澄み液をアニオン交換カラムに通した後、カチオン交換カラムからの組換えコンドロイチナーゼＩの溶離を示す。図の左側の初期のフラクションはカラムに結合しておらず、僅かなコンドロイチナーゼＩを含むだけである。図の右側の酵素を含むフラクションには、”溶離活性”と記した。勾配は、０．０から２．５ｍＭのＮａＣｌである。図４は、本発明の精製方法を用いる前及び用いた後の組換えコンドロイチナーゼＩ酵素のナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲルクロマトグラフィー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真において、レーン１は本発明の第１の実施態様の方法を用いて精製した酵素であり、レーン２は本発明の第２の実施態様を用いて精製した酵素であり、レーン３は、精製前の宿主細胞の上澄み液を示し、多くの他のタンパク質が存在している。レーン４は、以下の分子量の標準を示す：１４．４ｋＤ−リゾチーム；２１．５ｋＤ−トリプシンインヒビター；３１ｋＤ−カルボニックアンヒドラーゼ；４２．７ｋＤ−オボアルブミン；６６．２ｋＤ−ウシ血清アルブミン；９７．４ｋＤ−ホスホリラーゼＢ；１１６ｋＤ−ベーターガラクトシダーゼ；２００ｋＤ−ミオシン。レーン１及び２には、単一の鋭いバンドが見られる。図５は、本発明の方法を用いた精製のいくつかの段階における組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真において、レーン１は、ダイアフィルトレーション後の原上澄み液であり、レーン２は、アニオン交換樹脂−含有カラムを通した後の溶離液であり、レーン３は、カチオン交換樹脂−含有カラムを通した溶離の後の酵素であり、レーン４は、第２のアニオン交換樹脂−含有カラムを通した後の溶離液であり、レーン５は、図４について記載したものと同じ分子量の標準及び６．５ｋＤのアプロチニン(aprotinin)を示す。レーン６は、約３７ｋＤのコンタミナントを示すためにオーバーロード)した以外はレーン４と同じである。レーン７は、コンドロイチナーゼＩＩ酵素の結晶化後の上澄み液中の３７ｋＤコンタミナントである。レーン８は、結晶の第１の洗浄液であり、レーン９は、結晶の第２の洗浄液である。レーン１０は、水中に再溶解した後の洗浄した結晶中の酵素である。発明の詳細な説明予備的な実験において、Ｅ．ｃｏｌｉは、唯一の炭素源としてコンドロイチナーゼＩによって産生される加水分解物を用いることできないことが示され、この遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおけるその発現を選択することによってクローン化することはできないことが示唆された。本出願に引き継がれた他のアプローチでは、コンドロイチナーゼＩ酵素をエンコードするＤＮＡフラグメントを同定する物理的方法を用いた。この方法は、Ｐ．ブルガリスの完全ゲノムからなる遺伝子バンクをともに形成する個々のクローンを用いたハイブリダイゼーション適当にラベルされたプローブを用いて達成される。このプローブそのものは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生成される（５）。この方法では、Ｐ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡは変性され、（コンドロイチナーゼＩ遺伝子のブラケット(b racket)部分を指向した）オリゴヌクレオチドはアニールされ、ＤＮＡ合成はインビトロで実施される。オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるこの変性、アニール、及びＤＮＡ合成のサイクルを多数回（例えば３０回）繰り返すことにより、設計した生成物（２つのオリゴヌクレオチドの間に位置するＤＮＡフラグメント）の収率は、各サイクルごとに指数的に増大する。適当なオリゴヌクレオチドの推定のヌクレオチド配列は、Ｐ．ブルガリス細菌から精製されたタンパク質から導かれる入手可能なアミノ酸配列情報から構成される。ひとたびこれが行われると、ＰＣＲで生成されたＤＮＡフラグメントはクローン化され、そのＤＮＡ配列は、それがコンドロイチナーゼＩ遺伝子の一部であることを証明するために決定される。次いで、それはラベルされ、遺伝子バンクのどのメンバーが実際にコンドロイチナーゼＩ遺伝子を含んでいるかを示すプローブとして用いられる。引き続く制限マッピング(mapping)及びサザンハイブリダイゼーション(Southern hybridization)により、その位置が、約４０００の塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片に狭められる。これに引き続き、サンガーのチェインターミネーター法(Sanger dideoky chain termination method)（６）によって、遺伝子中の正確な位置が明らかにされ、遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける高レベル発現システムにおくのに用いられた引き続く操作(manipulation)をガイドする。Ｐ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩ遺伝子を発現する組換えプラスミドを含むこのＥ．ｃｏｌｉ株を用いて実施された１０リットルのスケールの発酵により、約６００単位／ｍｌ（１．２ｍｇ／ｍｌと同じ）の最大のコンドロイチナーゼＩタイターが産生される。この収率は、２単位／ｍｌ以上のタイターが得られる天然のＰ．ブルガリス発酵プロセスの収率をはるかに凌ぐものである。コンドロイチナーゼＩ遺伝子のクローニング及び発現プロセスは、以下の一連の工程にまとめることができる。１）Ｐ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡの単離及びコスミド遺伝子バンクの構成。２）ハイブリダイゼーション・プローブとして用いるためのコンドロイチナーゼＩ遺伝子の本物の断片を産生することを指向してＰＣＲ実験すること。３）コンドロイチナーゼの少なくとも一部を同定するためのコロニーハイブリダイゼーション研究。４）コンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置を、集合的に、より正確にクローン化されたＤＮＡに合わせる制限マッピング、サザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列分析、コンドロイチナーゼＩ酵素検定。５）正確なコーディング領域及びコンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置を明らかにするためのＤＮＡ配列分析。６）Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＰ．ブルガリスの調整された高レベルの発現を導く部位−特異的突然変異誘発、関連したマニピュレーション、及び遺伝子工学。これら６つの工程は、後記の実施例１−７で特に詳細に説明する。これらの工程の原理は以下の通りである。第１の工程ではゲノミックＤＮＡが得られる。ＤＮＡは、Ｐ．ブルガリス発酵に含まれるタンパク質及び他の物質から分離される。ゲノミックＤＮＡの研究は、ＤＮＡのフラグメントをコスミドベクターに挿入することによって促進される。ゲノミックＤＮＡは、Ｓａｕ３Ａのような適当な制限エンドヌクレアーゼによって消化され、コスミドベクターにリゲート(ligat e)される。Ｐ．ブルガリスＤＮＡフラグメントを含むパッケージされた組換えコスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株のような適当な細菌宿主株に導き、得られた培地を成長させて遺伝子を発現させる。遺伝子バンクは、アンピシリン、カナマイシン耐性のようなマーカーを含むように、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の存在のための遺伝子バンクのスクリーニングにおける助けとなるように処理される。出願人等は、天然のコンドロイチナーゼＩ酵素のアミノ酸配列分析を行った。酵素のサンプルはＰ．ブルガリスの発酵によって作製した。サンプルは、生化学工業（株）から得ることもできる。アミノ酸配列情報は、コンドロイチナーゼＩ遺伝子のスクリーニングにおいて用いるオリゴヌクレオチドの設計に用いられる。第２の工程では、ＰＣＲで用いられるオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドの第１のセットは、その遺伝子コードの最小の縮重を持つヘプタペプチドをエンコードするように設計される。コンドロイチナーゼＩ酵素のアミノ末端に近接した７つのアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸１９−２５）は、５１２の異なるヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６、実施例２参照）によってエンコードされうる。可能な配列の数は、５’末端における特定のヌクレオチドを選択することによって３２に減少する。なぜならば、ＰＣＲプライマーにおける不一致(mismatch)は、プライマーの３’末端におけるよりも５’末端における方が重大ではないことが観察されたからである。３２プライマーのプール(pool)の配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７−１４に詳述した。出願人等は、約１１０ｋＤのコンドロイチナーゼＩ酵素が、１８，０００ＭＷ（”１８ｋＤ”）のフラグメントと約９０，０００ＭＷ（”９０ｋＤ”）フラグメントとに、タンパク質分解的に切断されることを発見した。さらに、この１８ｋＤフラグメントは、処理によって、シアノゲンブロミド(cyanogen bromide)とトリプシンとに分裂する。これら多くのフラグメントは、ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーの付加的なセットの設計に用いられる。１８ｋＤフラグメント中の７つのアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１１４−１２０）は、５１２の異なるヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１５、実施例２参照）でエンコードされうる。相補的鎖は、同じ数の可能な配列を有する（ＳＥＱＩＤＮＯ１６、実施例２参照）。オリゴヌクレオチドの第１のセットについての上記の基準を用いて、可能な配列数は１２８に減少する。それらの配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７−２４に詳述する。 ”９０ｋＤ”フラグメントのアミノ末端に近接して位置する６つのアミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ２のアミノ酸１６５−１７０）は、多くの異なるヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５及び２６、実施例２参照）によってエンコードされうる。相補的鎖は、同じ数の可能な配列を有する（ＳＥＱＩＤＮＯ２７、実施例２参照）。オリゴヌクレオチドの第１のセットについての上記の基準を用いて、可能な配列数は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９−３６に詳述する配列に減少する。ＰＣＲ増殖は、これらの２４のオリゴヌクレオチド混合物を用いて行われる。最も効果的な増殖は、電気泳動ゲル上の不連続なバンドとして観察された。約５００及び３５０の塩基対（ｂｐ）の大きさの生成物が得られた。約３５０ｂｐの生成物は、約５００ｂｐの生成物のサブフラグメントである。約５００ｂｐの生成物を単離し、実施例２で説明する連続的クローニング法を行って、４５５ｂｐのＰＣＲ生成物として単離した。この４５５ｂｐは、配列分析され、天然のコンドロイチナーゼＩ酵素から得られる配列と事実上一致するアミノ酸配列に翻訳された。１つのアミノ酸が異なる配列；引き続く実験により、４５５ｂｐフラグメントのヌクレオチド及びアミノ酸配列は正しいが、天然のアミノ酸配列の同定が誤っていることが明らかにされた。第３の工程では、ＰＣＲ増殖フラグメントが、コンドロイチナーゼＩ遺伝子を含む第１の工程で調製されたコスミド遺伝子バンクを同定するためのプローブとして用いられる。ＰＣＲフラグメントは、変性され、例えばジゴキシゲニンでラベルしたｄＵＴＰ（ベーリンガー−マンハイム(Boehringer-Mannheim)、インディアナポリス、ＩＮ）でラベルした。次いでこのコスミド遺伝子バンクを、細菌株の感染に用いた。得られたクローンは溶解し、それらのＤＮＡをラベル化されたプローブでコロニーハイブリダイゼーションを施した後、ジゴキシゲニンでラベルした物質に対するアルカリ性ホスファターゼ複合抗体に晒した。陽性の(pos itive)クローンは可視化され集められて、選択した媒質中で成長させた。第４の工程では、サザンハイブリダイゼーション（８）及び制限マッピングが、個々のクローン中のコンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置を決めるために用いられる。上述のＰＣＲ−生成フラグメントが、制限酵素により第１に消化されフラクショネート(fractionate)されるＰ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。第２のＰＣＲ増殖では、上記のオリゴヌクレオチドのいくつかが、プライマーとして用いられる。結果は、プローブにコンドロイチナーゼＩ遺伝子の一部が、いくつかの大きなＤＮＡフラグメントに運ばれていることを示している。これらの大きなＤＮＡフラグメントは、消化されて個々のフラグメントを生成し、これらは単離され、サザンハイブリダイゼーションによってコンドロイチナーゼＩ配列の存在を試験され、次いで適当なベクター中にサブクローン化される。実施例３に用いたクローン化方法を詳述する。制限マップは、設計した配列を運ぶフラグメントの部分の同定において助けとなるように作製した。さらに、酵素の活性が、コンドロイチン硫酸Ｃからの不飽和ジサッカライドの放出を２３２ｎｍで測定することに基づいているインビトロのコンドロイチナーゼＩ検定が、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の配置及び配向を助けるために、いくつかのサンプルに対して実施される。これらの方法の結果は、より大きな１０ｋｂＮｓｉＩフラグメントの４．２ｋｂＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、全コンドロイチナーゼＩ遺伝子を含むことを示唆している。第５の工程では、上述の４．２ｋｂフラグメントがＤＮＡ配列分析を受ける。得られたＤＮＡ配列は、３９８０ヌクレオチドの長さである（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）。ＤＮＡ配列の推定アミノ酸配列への翻訳は、１０２１アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）をエンコードする連続的読み取り枠（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ヌクレオチド１１９−３１８１）を明らかにした。また、アミノ酸配列の分析は、２４残基シグナル配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１−２４）、それに続く９９７残基成熟（処理済み）コンドロイチナーゼＩ酵素（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸２５−１０２１）を明らかにした。シグナル配列は、後−翻訳(post-translation)処理工程のコンプレックス・シリーズに必要とされ、宿主細胞からのタンパク質の分泌をもたらす。シグナル配列は、分泌されるべきタンパク質のアミノ−末端からなる。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特定のプロテアーゼによって切断される。 ”１８ｋＤ”及び”９０ｋＤ”フラグメントは、互いに隣接して見い出され、 ”１８ｋＤ”フラグメントは成熟したタンパク質の最初の１５７アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸２５−１８１）からなり、”９０ｋＤ”フラグメントは成熟タンパク質の残りの８４０アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ１８２−１０２１）からなる。本発明のコンドロイチナーゼＩ酵素は、確立された組換えＤＮＡ法を用いて発現される。好ましい宿主生物は、細菌、ウイルス、酵母、昆虫または哺乳類細胞列、及び他の従来からの生物を含んでいる。宿主細胞は、コンドロイチナーゼＩ酵素をエンコードする精製し単離したＤＮＡフラグメントを含むプラスミドで形質転換される。次いで宿主細胞を、その宿主細胞によって酵素が発現されるような条件下で培養する。第６の工程では、遺伝子は、唯一の制限部位を導くために、部位を指向した突然変異誘発を受ける。これらにより、遺伝子は正確な読み取り枠の中で発現システム中に移動し、コンドロイチナーゼＩ酵素の高レベルでの発現をもたらす。そのような好ましい宿主細胞は、細菌Ｅ．ｃｏｌｉである。後記の実施例６に詳細に述べるように、２つの異なる構造体が調製される。第１のものでは、開始コドンの直上流側の３つのヌクレオチドが、突然変異誘発ヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）を用いて変化する（ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ヌクレオチド１１６−１１８）。得られる構造体によってエンコードされるコーディング領域(coding resion)及びアミノ酸配列は変化せず、シグナル配列は保存される（ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ヌクレオチド１１９−３１８１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２）。本発明の好ましい実施態様では、第２の構造体が用いられる。この第２の構造体では、部位を指向した突然変異誘発は、シグナル配列と成熟タンパク質の出発点との結合において行われる。天然の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ヌクレオチド１８５−１９０）と６つのヌクレオチドが異なる突然変異誘発オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）が用いられた。これらの配列の違いは、（ａ）シグナル配列の欠失、及び（ｂ）アミノ末端におけるメチオニン残基の付加をもたらし、９９８アミノ酸のタンパク質となる（ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ヌクレオチド１８８−３１８１；ＳＥＱＩＤＮＯ：５）。シグナル配列が無い場合、酵素は分泌されない。幸いなことに、それは細胞内に不溶性の封入体として残らない。しかし、少なくともいくつかの酵素は、可溶活性酵素として細胞内に産生される。酵素はホモジェナイズすることによって抽出されるが、それは細胞を溶解させ、それによって酵素を上澄み液中に放出する。シグナル配列が存在していても多くの酵素が分泌されない。これは、この発現システムが非常に高い収率を与えるので、宿主細胞の分泌能力を越えてしまうためと考えられる。後述の実施例７で述べるように、シグナル配列を欠く遺伝子は、適当な発現ベクターに挿入される。そのようなベクターのひとつは、ｐＥＴ−９Ａ（９；ノバゲン(Novagen)、マディソン(Madison)、ＷＩ）であり、それはＥ．ｃｏｌｉバクテリオファージＴ７の成分から導かれる。得られる組換えプラスミドは、ｐＴＭ４９−６と称される。次いでこのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉＢ株ＢＬ２１／（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（１０；ノバゲン）といった適当な発現宿主細胞を形質転換するために用いられる。組換えプラスミドｐＴＭ４９−６を持つこのＥ．ｃｏｌｉＢ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのサンプルは、出願人によって、１９９３年２月４日に、米国、メリーランド２０８５２、ロックビル、パークロウンドライブ(Parklawn Drive) １２３０１の、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に供託され、ＡＴＣＣアクセス番号６９２３４で登録された。供託された宿主細胞を用いたコンドロイチナーゼＩ酵素の発現は、天然の（非 −組換えの）Ｐ．ブルガリスを入れた同じサイズの発酵容器で可能な酵素の量の約３００倍の酵素を産生した。コンドロイチナーゼＩ酵素の発現の後、宿主細胞からの上澄み液は、酵素を単離し精製するために処理される。組換えコンドロイチナーゼＩ酵素を単離し精製するための最初の試みは、高い収率で精製酵素を得ることができなかった。Ｐ．ブルガリスの発酵培地から天然のコンドロイチナーゼＩを単離し精製するための従来の方法は、組換え物質には好ましくないことがわかった。天然の酵素は、Ｐ．ブルガリスの培地の発酵によって産生される。媒質から細菌細胞がまず回収され、バッファー中に再懸濁される。細胞懸濁液はホモジェナイズされて細菌細胞が溶解される。次いで、バイオアクリル（トーソー・ハース (Toso Haas)、フィラデルフィア、ＰＡ）のような荷電粒子が添加されて、ホモジェナイゼーション工程からＤＮＡ、凝集体、及びデブリス(debris)が除かれる。次に、この溶液を硫酸アンモニウムの４０％飽和として、望まないタンパク質を析出させる。コンドロイチナーゼＩは溶液中に残る。この溶液を濾過し、残存物(retentate)を洗浄してほとんどの酵素を回収した。濾液は濃縮し硫酸塩でダイアフィルトレーションして塩を取り除いた。コンドロイチナーゼＩを含む濾液は、硫酸セルロースカラムを用いて、カチオン交換クロマトグラフィーを行った。ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウムで、９８％以上のコンドロイチナーゼＩがカラムに結合した。次に、天然のコンドロイチナーゼＩを、塩化ナトリウムの勾配を用いて溶離した。溶離した酵素は、アニオン交換及び疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーといった付加的なクロマトグラフィーを行った。これらすべての方法により、コンドロイチナーゼＩが９０−９７％の純度で得られた。純度のレベルは、まずＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことによって測定した。タンパク質はクマシーブルーで染色し、脱色し、そしてゲル上のレーン(lane)に波長６００ｎｍのレーザービームを走査させた。純度は、そのバンドによる全吸収の百分率で表した。しかし、天然のタンパク質の収率は、せいぜい２５−３５％である。収率は、最終的に精製した生成物に残っている活性として測定し、出発時の活性（これを１００％とする）に対する百分率で表した。また、酵素の活性は、コンドロイチン硫酸Ｃからの不飽和ジサッカライドの放出を２３２ｎｍで測定することに基づいている。この精製法も、１１０，０００ダルトン(dalton)（１１０ｋＤ）のコンドロイチナーゼＩタンパク質を、９０ｋＤ及び１８ｋＤのフラグメントに大規模に切断した。それにもかかわらず、２つのフラグメントは非−共有結合を残しており、コンドロイチナーゼＩ活性を示した。この方法を、コンドロイチナーゼＩをエンコードする組換えプラスミドを含む溶解した宿主細胞からのホモジェネートに繰り返した場合、かなり悪い結果が得られた。ｐＨ７．２、２０ｍＭリン酸ナトリウムの標準緊縮条件において、１０％未満のコンドロイチナーゼＩがカチオン交換カラムに結合しているだけであった。ｐＨ６．８、５ｍＭリン酸塩という低い緊縮結合条件下で、１バッチ(batch) の物質で６０−９０％という増大した結合が観察された。しかし、ＮａＣｌ勾配での組換えタンパク質の溶離では、鋭いピークではなく広い活性ピークしか得られない（図２参照）。このことは、生成物が不均一であることを示している。さらに、連続発酵のバッチでは、低い緊縮条件下でも組換え酵素はあまり結合しない（１−４０％）。これらのバッチのほとんどは、結合性が悪いために最後まで処理しなかった。従って、それらの全回収量は定量化できない。これらの結果に基づいて、組換えコンドロイチナーゼＩ酵素は、天然の酵素に比較して塩基性が弱く、その塩基性は、バッチ間及びバッチ内でも変化すると結論できる。天然の酵素を単離し精製するために用いられる方法が、組換え酵素に対しては好ましくないのは明らかである。その方法は、高コストで低収率のタンパク質しか産生しない。さらに、大きなバッチでは、多量の窒素含有化合物（硫酸アンモニウム）を含む多量の廃棄溶媒が出る。これは、環境的見地から好ましくない。そこで、これらの悪い結果を説明し、改善された単離及び精製方法の基礎を提供するための仮説が発展した。コンドロイチナーゼＩ酵素は、中性ｐＨにおいて塩基性であることが知られている。従って、酵素の表面は全体として正電荷が過剰であると仮定される。この仮説とは無関係に、酵素の組換え発現において、宿主細胞は、小さな負に荷電した分子を含むか精製するものと考えられる。これらの負に荷電した分子が酵素に結合し、それによって酵素上の正電荷の数が減少する。これらの負に荷電した分子が、酵素をコピュリファイ(copurify)するのに十分な高い親和性で結合すると、それらは、イオン交換カラムにおける酵素の挙動を変化させる可能性がある。この仮説は、以下に述べるデータによって支持される。一般に、カチオン交換樹脂は、高いｐＨよりも低いｐＨにおいて、よりよくタンパク質と結合する。よって、塩基性がそれほど強くなく、従って高いｐＨで結合しないタンパク質は、低いｐＨでの操作を実行することによってカチオン交換体に結合するようにすることができる。ｐＨ７．２において、天然の酵素は完全にカチオン交換樹脂に結合する。しかし、組換えで導かれた酵素は、負に荷電した分子の結合によるその低い塩基性のために、あまり結合しない（１０％未満）。この酵素は、ｐＨ６．８で低いリン酸塩濃度（２０ｍＭではなく５ｍＭ）を用いることによって７０％まで結合させることが可能であるが、不均一性及び低収率という大きな問題が残っている。確かに、ひとつの発酵では７０％の結合レベルが得られたが、典型的には、ｐＨ６．８でも非常に低い（１０％未満）。この結合レベルは、発酵のバッチによって極端に変動する。この仮説及び問題の可能な解決手段を次に試験した。コンドロイチダーゼＩに負に荷電した分子が非共有結合で付着し、塩基性を低下させているならば、強くて高容量のアニオン交換樹脂を用いて、これらの好ましくない分子を取り除くことが可能である。負に荷電した分子を除去することにより、酵素の塩基性が回復するはずである。そうすれば、酵素はカチオン交換樹脂に結合し、そこから、純粋な形で高収率で溶離させることができる。実験によると、このアプローチは、組換え的に発現されたコンドロイチダーゼＩ酵素を単離し精製する上で直面している問題の解決をもたらす。下記で議論するように、コンドロイチダーゼＩは、２つの形態で組換え的に発現される。この酵素はシグナルペプチドで発現され、次いで切断されて成熟酵素を生成する。この酵素はシグナルペプチド無しでも発現され、直接的に成熟酵素を生成する。ここで議論する本発明の２つの実施態様は、酵素のこれらの形態のいずれを精製するのにも好適である。本発明のこの態様の第１の実施態様では、組換えコンドロイチダーゼＩ酵素を発現する宿主細胞が、ホモジェナイゼーションによって溶解し、酵素を上澄み液中に放出する。この上澄み液は、塩及び他の小さな分子を取り除くためにダイアフィルトレーションを施される。しかし、このステップでは、自由であり、負に荷電した分子の形態で結合していないものだけが取り除かれる。これらの荷電した化学種の結合形態は、上澄み液を、強くて高容量のアニオン交換樹脂−含有カラムに通すことによって取り除かれる。そのような樹脂の一例は、マクロプレップ^TM・ハイＱ樹脂(Macro-Prep^TM High Q resin)（バイオ−ラド(Bio-Rad)、メルビル(Melville)、Ｎ．Ｙ．）である。他の強力で高容量のアニオン交換カラムも好適である。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）リガンドを持つ弱いアニオン交換体でもよいが、あまり効果的ではない。同様に、低容量樹脂でもよいが、やはり有効ではない。負に荷電した分子はカラムに結合するが、酵素はカラムを通り抜ける。また、いくつかの無関係で好ましくないタンパク質もカラムに結合することがわかった。次に、アニオン交換カラムからの溶離液は、直接カチオン交換樹脂−含有カラムに入れられる。そのような樹脂の例として、Ｓ−セファロース^TM(S-Sepharose^TM )（ファーマシア(Pharmacia)、ピスカタウェイ(Piscataway)、Ｎ．Ｊ．）及びマクロプレップ・ハイＳ（バイオ−ラド）が挙げられる。これら２つの樹脂の各々を含むカラムは、カチオン交換を促進するために、それらに結合するＳＯ₃ ^-リガンドを有している。他のカチオン交換カラムも好ましい。酵素はカラムに結合し、このカラムから酵素を放出することのできる溶媒で溶離される。溶離には、溶液の導電性を向上させる任意の塩が好ましい。そのような塩の例は、ナトリウム塩、及びカリウム塩及びアンモニウム塩を含む。適当な濃度の塩化ナトリウム水溶液が好ましい。２００ｍＭの塩化ナトリウムを用いた溶離のステップとして、０から２５０ｍＭの塩化ナトリウムのような勾配が許容される。塩化ナトリウム勾配溶離において、鋭いピークが観察された（図３）。従来の方法に比較した酵素収率の向上が非常に顕著であった。組換えコンドロイチナーゼＩ酵素は、９９％の純度で、８０−９０％の収率で回収された。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのバンドを走査することによって測定した。ゲルの展開には４−２０％勾配のアクリルアミドを用いた。ゲルの各レーンでのバンドは、上述の方法を用いて走査した。これらの改良は、酵素のカチオン交換カラムへの結合性の増大と直接関連しており、それは、最初にアニオン交換カラムを通した結果である。比較実験において、カチオン交換カラムのみを用いた場合、酵素の１％しかカラムに結合しなかった。しかし、まずアニオン交換カラムを用いると、９５％以上の酵素がカラムに結合した。本発明の第１の実施態様で得られた高い純度と収率は、大きなスケールでのコンドロイチナーゼＩ酵素の製造を実現に近づける。本発明のこの態様の第２の実施態様では、第１の実施態様のダイアフィルトレーション工程の前に２つの付加的工程が挿入される。上澄み液は、設計した酵素が析出するように酸性溶液で処理される。ペレットを回収し、アルカリ性溶液中に溶解して酵素を再び塩基性環境にする。次いでこの溶液をダイアフィルトレーションにかけ、本発明の第１の実施態様の引き続く工程を行う。本発明の第２の実施態様についての比較実験において、カチオン交換カラムのみを用いた場合、５％の酵素しかカラムに結合しない。しかし、最初にアニオン交換カラムを用いたときは、実質的に１００％の酵素がカラムに結合した。この第２の実施態様は、本発明の第１の実施態様に匹敵する純度と収率で酵素を提供する。酸による析出は、可溶で残っているタンパク質を取り除くが、これらのタンパク質は、引き続くカチオン及びアニオン交換工程では（小さなカラムを用いても）取り除くことができない。この酸析出工程の利点は、溶解後のサンプル容量が元の容量の約２０％に減少するので、大きなスケールでもより容易に取り扱うことができることである。しかし、この第２の実施態様における酸析出及びアルカリ溶解工程は、第２の実施態様が第１の実施態様より時間を消費することを意味している。製造スケールでは、第２の実施態様による純度及び収率の僅かな向上より、単純な方法で高純度のコンドロイチナーゼＩを高収率で与える第１の実施態様の方が優っているかもしれない。本発明の２つの実施態様のさらなる利点は、酵素が９０ｋＤと１８ｋＤのフラグメントに切断されることが避けられることである。本発明の２つの実施態様で産生した高純度の酵素を図４に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル写真には単一の鋭いピークが見られる。レーン１は第１の実施態様の方法を用いた酵素であり、レーン２は第２の実施態様の方法を用いた酵素である。（第３のレーンは精製前の宿主細胞からの上澄み液を示し、他の多くのタンパク質が存在している。レーン４は分子量標準物質を示している。）天然のコンドロイチナーゼＩ遺伝子配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）またはシグナル配列を含む修飾したコンドロイチナーゼＩ遺伝子配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を従来の遺伝子工学技術を用いて再生するために、ＡＴＣＣに供託された物質もここに開示した配列とともに用いられる。コンドロイチン硫酸で感染した後のＰ．ブルガリスにおける天然のコンドロイチナーゼＩ酵素の産生は、高収率の酵素を提供せず、酵素は、存在する全タンパク質の約０．１％である。シグナル配列を欠く組換え構造体をＥ．ｃｏｌｉで用いたとき、全タンパク質の約１５％がコンドロイチナーゼＩ酵素である。コンドロイチナーゼＩ遺伝子について記載した３つのＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２、及び３）に加えて、さらに本発明は、余分な遺伝子コードによって、酵素をエンコードする配列と生物学的に等価なＤＮＡ配列からなる。即ち、これらの他のＤＮＡ配列は、ここで説明したものとは異なるヌクレオチド配列によって特徴づけられるが、ここで説明したＤＮＡ配列によってエンコードされるものと同じアミノ酸配列を持つ酵素をエンコードする。特に、本発明は、これらのＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３または４の配列と十分に重複しているので、サンブルーク等(Sambrook et al.)（１１）に開示されているような標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、それらによるハイブリダイゼーションを可能にし、それによって生物学的に活性な酵素が産生される。また本発明は、コンドロイチナーゼＩ酵素とは異なるが、酵素について記載したもの（ＳＥＱＩＤＮＯ：２及び５）と生物学的に等価なアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ配列からなる。それらの配列が、酵素配列からの僅かな欠失またはその保存的置換によってのみ異なり、その配列の三次元構造が酵素の三次元構造を実質的に変化させないようならば、そのようなアミノ酸配列は、酵素のアミノ酸配列と生物学的に等価であると言われる。例えば、アミノ酸アラニン、親水性アミノ酸のコドンは、グリシンのようなより親水性の低い残基、またはバリン、ロイシン、イソロイシンのようなより親水性の高い残基をエンコードするコドンに置換してもよい。同様に、グルタミン酸に対するアスパルチン酸のような負に荷電した残基を他の残基に、アルギニンに対するリシンのような正に荷電した残基を他の残基に置換する変化、及び、ハイドロパシックインデックス(hydropathic index)の類似に基づく変化も、生物学的に等価な生成物を提供すると予想される。タンパク質分子のＮ−末端またはＣ −末端部分の変化をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性は変化させないと予想される。提案した各々の修飾は、当業者の日常業務の範囲内であり、エンコードされた生成物の生物学的活性の保持で定義される。従って、”コンドロイチナーゼＩ遺伝子”または”コンドロイチナーゼＩ酵素”という用語が、明細書及び請求の範囲において用いられているが、それらは、生物学的に等価なタンパク質を産生するすべての修飾物及び変形物を含むものと理解される。コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のクローニング及び発現の出発点は、Ｐ．ブルガリスから得た天然の成熟したコンドロイチナーゼＩＩタンパク質の部分的アミノ酸配列である。成熟した天然のコンドロイチナーゼＩＩタンパク質のＮ−末端配列は、以下の２２アミノ酸を含むことがわかった。Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ− Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸１−２２）コンドロイチナーゼＩ遺伝子をエンコードする領域について上で決定したヌクレオチド配列は、さらに、翻訳停止コドンを越える約８００塩基対を含む（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９、ヌクレオチド３１８５−３９８０）。この領域の検査により、ヌクレオチド３３０７と３３７２の間の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９）が、天然のコンドロイチナーゼＩＩの最初の２２アミノ酸と同じ順序の同じ２２のアミノ酸をエンコードする。さらに、ＡＴＧ開始コドン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９、ヌクレオチド３２３８−３２４０）は、この領域の上流側で、枠内に見い出され、この遺伝子が、コンドロイチダーゼＩＩをエクスポートするための２３アミノ酸のシグナルペプチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸１−２３）で発現されることを示している。シャイン・ダルガーノ配列（ＡＧＧＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９、ヌクレオチド３２２５−３２２８）は、開始コドンの上流に見られ、ｐ．ブルガリスのコンドロイチナーゼ酵素の１１０ｋＤ及び１１２ｋＤ形態がともに単一のメッセンジャーＲＮＡの一部として発現されることを示唆している。このＡＴＧから始まるコーディング配列は、元々はＳＥＱＩＤＮＯ：１に続いていないと見られていた。これは、終止コドン（ＴＡＡ）が、３６０７−３６０９と決定された塩基対における枠内に存在すると考えられたからである。しかし、配列データを再検討した結果、１つの残基が見落とされ、最初に決定された３５９３と３５９４のヌクレオチドの間にＴを挿入しなければならないことが明らかになった。この変化はＳＥＱＩＤＮＯ：３９の末端まで延長された読み取り枠を修復する（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９は、ヌクレオチド３５９４として挿入されたＴを含む）。（よって、塩基対３６０８−３６１０における塩基対における３つの塩基ＴＡＡは、正しく番号付けされており、終止コドンを構成しない。）この情報が明らかになったので、Ｐ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のクローニング及び発現は、３つの工程で実施される。第１の工程では、Ｎ −末端配列が知られているので、部位−特異的突然変異誘発が施される。これは、この遺伝子をコンドロイチナーゼＩ遺伝子に用いた（上述の）Ｔ７ベースの設計した発現ベクターｐＥＴ９Ａ中に、結局は直接配置するために必要である。突然変異誘発した塩基は、コーディング領域の上流である（ＡＴ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１及び３９、塩基対３２３５及び３２３６）は、ＣＡ配列に置換される）。第２の工程は、第１の工程と平行して行うことができるが、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＣ−末端コーディング領域を含むことになる適当なＤＮＡフラグメントの同定、単離及びＤＮＡ配列分析を含む。得られるＤＮＡ配列情報は、１０００と見積もられる全コンドロイチナーゼＩＩタンパク質のうちの約２２０のアミノ酸を説明するのに十分である。従って、誤ったコーディング配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の末端を越えて、あと２４００塩基対延長される。第３の工程は、開始コドンをＮｄｅＩ部位の一部として含み、それに続いてコーディング領域の下流にＢａｍＨＩ部位を含むように修飾されたコンドロイチナーゼＩＩの完全な遺伝子のアセンブリ(assembly)を含む。これにより、さらに修飾すること無しに、この遺伝子をｐＥＴ９Ａ発現ベクター（ノバゲン、マディソン、ＷＩ）中に挿入することが可能になる。全体的にアセンブルされた遺伝子の配列分析により、ヌクレオチド３２３８− ３２４０に開始コドンが存在し、このコドンが、ヌクレオチド３２３８−３３０６におけるシグナルペプチドのコーディング領域、ヌクレオチド３３０７−６２７６における成熟タンパク質のコーディング領域、及びヌクレオチド６２７７− ６２７９の終止の出発点を表していることが確認された（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）。この配列を翻訳すると１０１３のアミノ酸となり、その最初の２３のアミノ酸はシグナルペプチドであり、２４−１０１３の番号の残基において、９９０のアミノ酸が成熟コンドロイチナーゼＩＩタンパク質を構成する（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）。この構成において、シグナルペプチドは保持されるので、発現された遺伝子は、処理されて分泌され、Ｎ−末端にロイシン残基を持つ成熟した天然の酵素構造体を産生する。後述の実施例１３で述べるように、コンドロイチナーゼＩＩタンパク質をエンコードする遺伝子は、ｐＥＴ９Ａに挿入され、得られた組換えプラスミドをＬＰ² １３５９と称する。次いでこのプラスミドは、（コンドロイチナーゼＩ遺伝子の発現にも用いた）Ｅ．ｃｏｌｉＢ株ＢＬ２１／（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳといった適当な発現宿主細胞を形質転換するために用いられる。組換えプラスミドＬＰ²１３５９を持つＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳであるＴＤ１１２と称されるＥ．ｃｏｌｉＢ株のこのサンプルは、出願人によって、１９９４年４月６日に、米国、メリーランド２０８５２、ロックビル、パークロウンドライブ１２３０１の、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに供託され、ＡＴＣＣアクセス番号６９５９８で登録された。供託された宿主細胞を用いたコンドロイチナーゼＩＩ酵素の発現は、天然の（非−組換えの）Ｐ．ブルガリスを入れた同じサイズの発酵容器で可能な酵素の量の約２５倍の酵素を産生した。コンドロイチナーゼＩ酵素の発現の後、宿主細胞からの上澄み液は、酵素を単離し精製するために処理される。２つのタンパク質が実質的に同じ等電点と類似の分子量を持っているので、組換えコンドロイチダーゼＩタンパク質を単離し精製するための上述した第１の方法は、組換えコンドロイチナーゼＩＩタンパク質を単離し精製するために修正され、以下に述べるように修飾される。方法の修正の必要性は、組換えコンドロイチナーゼＩＩタンパク質が、組換えコンドロイチナーゼＩタンパク質の約数分の一倍のレベルで発現されるという事実に基づいている。従って、最終的にコンドロイチナーゼＩタンパク質に匹敵する純度でコンドロイチナーゼＩＩ生成物を得るためには、より強力で選択的な解決策が必要である。コンドロイチダーゼＩＩタンパク質に対する方法の最初の数工程は、コンドロイチナーゼＩタンパク質を単離、精製するのに用いた工程と同じである。最初に、コンドロイチナーゼＩＩ酵素を発現する宿主細胞をホモジェナイゼーションによって溶解し、酵素を上澄み液中に放出する。この上澄み液は、塩及び他の小さな分子を取り除くためにダイアフィルトレーションを施される。しかし、このステップでは、自由であり、負に荷電した分子の形態で結合していないものだけが取り除かれる。これらの荷電した化学種の結合形態は、上澄み液を、強くて高容量のアニオン交換樹脂−含有カラムに通すことによって取り除かれる。そのような樹脂の一例は、マクロプレップ^TM・ハイＱ樹脂（バイオ−ラド、メルビル、Ｎ．Ｙ．）である。他の強力で高容量のアニオン交換カラムも好適である。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）リガンドを持つ弱いアニオン交換体でもよいが、あまり効果的ではない。同様に、低容量樹脂でもよいが、やはり有効ではない。負に荷電した分子はカラムに結合するが、酵素はカラムを通り抜ける。また、いくつかの無関係で好ましくないタンパク質もカラムに結合することがわかった。次に、アニオン交換カラムからの溶離液は、直接カチオン交換樹脂−含有カラムに入れられる。そのような樹脂の例として、Ｓ−セファロース^TM（ファーマシア、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）及びマクロプレップ・ハイＳ（バイオ−ラド）が挙げられる。これら２つの樹脂の各々を含むカラムは、カチオン交換を促進するために、それらに結合するＳＯ₃ ^-リガンドを有している。他のカチオン交換カラムも好ましい。酵素はカラムに結合するが、混ざったタンパク質の大部分はカラムに結合しない。この時点で、方法はコンドロイチナーゼＩタンパク質に用いた方法から離れる。カチオン交換カラムから酵素を放出できる非−特異的な塩溶液でタンパク質を溶離するのではなく、コンドロイチン硫酸を含む溶液を用いて特異的に溶離する。この方法は、正に荷電したコンドロイチナーゼＩＩタンパク質が、負に荷電したコンドロイチン硫酸に対して有する親和性を利用している。この親和性は、正と負との相互作用のみによって説明される親和性より大きい。これは、抗原−抗体、リガンド−レセプター、補因子−タンパク質、及び阻害剤／活性剤−タンパク質といった高い親和性を持つ他の特異的な生物学的相互作用と同様の、酵素− 基質相互作用である。従って、コンドロイチン硫酸は、負に荷電した樹脂から酵素を溶離させることができる。一方、樹脂−酵素相互作用は、単純な正と負の相互作用である。親和性溶離クロマトグラフィーは、イオン−交換クロマトグラフィーと同じ程度に簡単に行えるが、塩による溶離とは異なって溶離が特異的である。よって、親和性クロマトグラフィー（特異性）、及びイオン−交換クロマトグラフィー（低コスト、容易な操作、再使用性）の両方の利点を有している。他の利点は、溶離液が低導電性（塩溶液の約５％）であることであり、塩を用いたときのようなダイアフィルトレーション／透析工程を経ずに、さらなるイオン−交換クロマトグラフィーを行うことが可能になる。このことは、コンドロイチナーゼＩタンパク質の方法では思いつかないことである。なぜならば、純粋なコンドロイチナーゼＩタンパク質を得るためには、さらなるイオン−交換クロマトグラフィーが必要とされないからである。組換えコンドロイチナーゼＩの精製方法を用いない他の理由がある。コンドロイチナーゼＩの塩溶離精製法を用いて得たコンドロイチナーゼＩＩが不安定であり、４℃でも１週間でかなりの分解が生ずることである。一方、親和性溶離を用いて得たコンドロイチナーゼＩＩは安定である。安定性におけるこの相違の理由はわかっていない。しかし、塩溶離によって得たコンドロイチナーゼＩは安定である。次に、カチオン交換カラムをリン酸バッファーで洗浄し、結合していないタンパク質を溶離させる。続いてほう酸バッファーで弱く結合した汚染タンパク質を溶離し、樹脂のｐＨを基質、コンドロイチン硫酸、を用いてコンドロイチナーゼＩＩタンパク質を溶離するのに最適な値まで上昇させる。次いで、ｐＨ９．０の調整したコンドロイチン硫酸水溶液を用いて、鋭いピーク（６５％回収）及び約９５％の高純度で、コンドロイチナーゼＩＩを溶離した。１％の濃度のコンドロイチン硫酸を用いた。この溶液の勾配も使用できる。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチナーゼＩＩに対して、カラムの樹脂に対するよりも強い親和性を持っているので、このコンドロイチン硫酸もタンパク質とともに溶離される。このことは、コンドロイチン硫酸を認識するタンパク質のみが溶離されるので好ましいが、コンドロイチン硫酸をコンドロイチナーゼＩＩから分離する工程がさらに必要とされることを意味している。この分離工程において、溶離液は中性ｐＨに調整され、マクロ−プレップ^TMハイＱ樹脂のようなアニオン交換樹脂−含有カラムに入れられる。カラムは、リン酸バッファーで洗浄される。コンドロイチン硫酸はカラムに結合するが、コンドロイチナーゼＩＩは、９５％以上の回収率で非結合プールをに流れ込む。この時点で、唯一の僅かなコンタミナントである約３７ｋＤを除いては、タンパク質は純粋である。このコンタミナントは、コンドロイチナーゼＩＩタンパク質の分解生成物であると思われる。このコンタミナントは、結晶化工程によって効率的に取り除かれる。アニオン交換カラムからの溶離液は、濃縮され、４℃程度の低温に数日維持されて、純粋なコンドロイチナーゼＩＩが結晶化される。上澄み液は３７ｋＤコンタミナントを含んでいる。遠心分離によって結晶をペレット状にし、３７ｋＤのコンタミナントを含む上澄み液をピペットで除去する。洗浄した結晶は、９９％以上の純度のコンドロイチナーゼＩＩタンパク質からなる。コンドロイチナーゼＩＩタンパク質に関する本発明のこの態様の第２の実施態様では、第１の実施態様のダイアフィルトレーション工程の前に２つの付加的工程が挿入される。上澄み液は、望まれる酵素が析出するように酸性溶液で処理される。ペレットを回収し、アルカリ性溶液中に溶解して酵素を再び塩基性環境にする。次いでこの溶液をダイアフィルトレーションにかけ、本発明の第１の実施態様の引き続く工程を行う。酸による析出は、可溶で残っているタンパク質を取り除くが、これらのタンパク質は、引き続くカチオン及びアニオン交換工程では（小さなカラムを用いても）取り除くことができない。この酸析出工程の利点は、溶解後のサンプル容量が元の容量に比較して減少するので、大きなスケールでもより容易に取り扱うことができることである。しかし、この第２の実施態様における酸析出及びアルカリ溶解工程は、第２の実施態様が第１の実施態様より時間を消費することを意味している。製造スケールでは、第２の実施態様による純度及び収率の僅かな向上より、単純な方法で高純度のコンドロイチナーゼＩＩを高収率で与える第１の実施態様の方が優っているかもしれない。コンドロイチン硫酸で感染した後のＰ．ブルガリスにおける天然のコンドロイチナーゼＩＩ酵素の産生は、高収率の酵素を提供せず、酵素は、存在する全タンパク質の約０．１％である。組換え構造体をＥ．ｃｏｌｉで用いたとき、全タンパク質の約２．５％がコンドロイチナーゼＩＩ酵素である。コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子について記載したＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）に加えて、さらに本発明は、余分な遺伝子コードによって、酵素をエンコードする配列と生物学的に等価なＤＮＡ配列からなる。即ち、これらの他のＤＮＡ配列は、ここで説明したものとは異なるヌクレオチド配列によって特徴づけられるが、ここで説明したＤＮＡ配列によってエンコードされるものと同じアミノ酸配列を持つ酵素をエンコードする。特に、本発明は、これらのＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の配列と十分に重複しているので、サンブルーク等（１１）に開示されているような標準的な高緊縮サザンハイブリダイゼーション条件下で、それらによるハイブリダイゼーションを可能にし、それによって生物学的に活性な酵素が産生される。また本発明は、コンドロイチナーゼＩＩ酵素とは異なるが、酵素について記載したもの（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）と生物学的に等価なアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ配列からなる。それらの配列が、酵素配列からの僅かな欠失またはその保存的置換によってのみ異なり、その配列の三次元構造が酵素の三次元構造を実質的に変化させないようならば、そのようなアミノ酸配列は、酵素のアミノ酸配列と生物学的に等価であると言われる。例えば、アミノ酸アラニン、親水性アミノ酸のコドンは、グリシンのようなより親水性の低い残基、またはバリン、ロイシン、イソロイシンのようなより親水性の高い残基をエンコードするコドンに置換してもよい。同様に、グルタミン酸に対するアスパルチン酸のような負に荷電した残基を他の残基に、アルギニンに対するリシンのような正に荷電した残基を他の残基に置換する変化、及び、ハイドロパシックインデックスの類似に基づく変化も、生物学的に等価な生成物を提供すると予想される。タンパク質分子のＮ−末端またはＣ−末端部分の変化をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性は変化させないと予想される。提案した各々の修飾は、当業者の日常業務の範囲内であり、エンコードされた生成物の生物学的活性の保持で定義される。従って、”コンドロイチナーゼＩ遺伝子”または”コンドロイチナーゼＩ酵素”という用語が、明細書及び請求の範囲において用いられているが、それらは、生物学的に等価なタンパク質を産生するすべての修飾物及び変形物を含むものと理解される。もし望むならば、当業者は、２つの供託物からのＤＮＡの断片を、例えばＨｉｎｄＩＩＩ部位においてともにリゲートし、コンドロイチナーゼＩのコーディング配列の上流のＴ７プロモーターの制御下で、コンドロイチナーゼＩ及びコンドロイチナーゼＩＩの両方を発現させてもよい。本発明をさらに良く理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は例示することのみを目的とし、本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例標準的な分子生物学の技術を、サンブルーク等のプロトコールに従って利用した。実施例１Ｐ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡの単離及びＥ．ｃｏｌｉにおけるコスミドバンクの構成大きなスケール（１０００リットル）のＰ．ブルガリスの発酵の２つの３５ｍｌのアリコート（Ａ及びＢと称する）を得て遠心分離した。両方のペレットを４ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム(lysozyme)を含む０．０５Ｍグルコース−０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ−０．０１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）の７ｍｌに再懸濁させた。３７℃で３０分間インキュベートした後、７ｍｌの１％ＳＤＳ−０．１６ＭＥＤＴＡ−０．０２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８）をサンプル”Ａ”に添加し、さらに３７℃ でインキュベートを続けた。最初のリゾチーム処理の後、サンプル”Ｂ”は遠心分離し、細胞ペレットを、４０μｇ／ｍｌのＤＮＡａｓｅ無しのＲＮＡａｓｅを含む０．０５Ｍグルコース −０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ−０．０１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）の７ｍｌに取り込み、この再懸濁物に７ｍｌの１％ＳＤＳ−０．１６ＭＥＤＴＡ−０．０２ＭＮａＣｌ（ｐＨ８）を添加した。最後に、両方のサンプルに、プロテイナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）を、最終濃度が１００ μｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で終夜インキュベーションを続けた。次の日、サンプルを等容（１４ｍｌ）の平衡したフェノールで抽出し、次いで７ｍｌのフェノールで２回抽出し、７ｍｌのクロロホルムを添加して混合し、最後に遠心分離して２相を分離した。ＤＮＡは、１／４容量の５Ｍ酢酸アンモニウムと０．６容量のイソプロパノールを加えて析出させて遠心分離した。ペレットにしたＤＮＡを７０％（容量／容量）エタノールでリンスし、真空乾燥して、１ｍｌのＴＥ（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ−０．０１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。２６０ｎｍでの紫外線吸収で決定したところ、サンプル”Ａ”の核酸濃度は１．２ｍｇ／ｍｌであり、サンプル”Ｂ”では１．３ｍｇ／ｍｌであった。コスミドベクターへの挿入に適したサイズ（約２５−３５キロベース（ｋｂ））の断片を生ずるゲノミックＤＮＡのフラグメンテーション(fragmentation)は、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いた部分的消化によって行った。２つの０．２ｍｌの反応を用意し（一方は調製(preparation)”Ａ”、他方は調製” ＢからのＤＮＡ”）、各々は、１００μｇのＰ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡ、０．１ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＭｇＣｌ₂、０．０１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び８０単位の酵素Ｓａｕ３Ａを含んでいる。３７℃でインキュベートを行い、適当な時間（５、６、７、８、９、１０、１１及び２０分）に、２５μｌのアリコートを取り出して２５μｌの０．２ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加えた。個々のサンプルは７０℃に加熱し、寒天ゲルでのサイズ分布分析のために１０μｌを取り出した。調製”Ａ”の５分間のＳａｕ３Ａ消化で得たサンプル、及び調製”Ｂ”の６分間で得たサンプルを、後の実験に使用した。各々の場合において、選択した部分的消化の（４μｌ、約２μｇ）のアリコートを、コスミドベクターＤＮＡの適当な”左”及び”右”の腕に、０．０６６Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１ＭのＭｇＣｌ₂、０．００１ＭのＡＴＰ、及び４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（製造者（ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs)、ベバリー(Beverly)、ＭＡ）によって決定された単位）を含む１０μｌの反応物中で、各々約１μｇ及び２μｇを用いてリゲートした。１１℃で終夜インキュベートした。コスミドの”左”及び”右”腕は、適当なサイズにされたＰ．ブルガリスＤＮＡの断片とリゲートしたとき、約３５−５０ｋｂの組換え分子からなるＤＮＡフラグメントである。両方の腕は、次の工程のパッケージング酵素に認識される”コス(cos)”部位を有している。さらに、両方の腕は、複製の基及びｐＩＢＩ２４（インターナショナル・バイオケミカル・インク(International Biochemical Inc.)、ニューヘブン(New Haven )、ＣＴ）のアンピシリン耐性機能を有している。上記の各々のリガーゼ反応は、λパッケージング抽出（パッカゲン(Packagene^TM )、プロメガ社(Promega Corp.)の登録商標、マディソン、ＷＩ）の１つの管に添加され、室温で２時間反応が行われるが、その時点で、０．５ｍｌのＰＤＢ（０．１ＭのＮａＣｌ−０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）−００１ＭのＭｇＣｌ₂）及び引き続いて０．０５ｍｌのクロロホルムが添加される。従って、パッケージされたＤＮＡの各管は、Ｐ．ブルガリスのゲノミック遺伝子バンクである。この構成方法は、感染粒子のプールを生ずる（即ち、λ相のヘッドが約２５から３５ｋｂのＰ．ブルガリスＤＮＡに結合したコスミドベクターで満たされている）ので、可能なクローン化は、パッケージされた物質のアリコートを適当な敏感なＥ．ｃｏｌｉ宿主株に吸着させることによって定量化され、発芽後生育の後、混合物を選択した媒質にプレーティング(plating)した。例えば、２０−１０−５媒質で生育したＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ１５６２（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）の終夜培地を、新鮮な媒質（１％のマルトースを加えた２０−１０−５）中で１：２０に希釈し、３７℃で３時間生育した。次いで細胞（１ｍｌ）を遠心分離し、ＰＤＢ（０．２ｍｌ）で再懸濁し、０．０２ｍｌの適当な遺伝子バンクを添加した。３７℃で２０分間吸着させた後、サンプルを２０−１０−５媒質で２ｍｌに希釈し、３７℃で３０分生育した。次いで、培地を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０−１０− ５プレートに広げ、３７℃で終夜インキュベートした後にコロニーを数えた。その結果、ＰＶ１−ＧＢ及びＰＶ２ＧＢと称する２つのサンプル中に、約６８，０００及び９５，０００の感染粒子（可能なコスミドクローン）があることが示され、これらのサンプルは、各々Ｐ．ブルガリスゲノミックＤＮＡの”Ａ”及び” Ｂ”の調製に対応する。さらに、上記のように、２つの異なるコスミドベクターを用いて４つのＰ．ブルガリス遺伝子バンクを調製した。これらの２つのコスミドは、上記のベクターとは異なり、一方では、アンピシリン耐性ではなくカナマイシン耐性決定因子を用い、他方では、ｐＩＢＩ２４ではなくｐＢＲ３２２（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）の複製機能を用いた。これら４つの”ライブラリー”は、Ｌ１９７４、Ｌ１９７５、Ｌ１９７６及びＬ１９７７と称し、各々、約１８，０００（ａｍｐ^r）、３４，０００（ａｍｐ^r）、１３，０００（ｋａｎ^r ）及び１５，０００（ｋａｎ^r）の成分を含む。これら６つの遺伝子バンク各々のアリコートは、Ｐ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩ遺伝子の存在についてスクリーンされた（以下参照）。実施例２ハイブリダイゼーションプローブとして用いるためのコンドロイチナーゼＩ遺伝子の本物の断片を産生することを目指したＰＣＲ実験ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（５）は、オリゴヌクレオチドプライマー間にあるＤＮＡ配列を幾何学的に増殖させることができ、それは、インビトロでＤＮＡポリメラーゼによって延長されうる。これらの実験に用いられる酵素はＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（サーマスアクアチクス(Thermus aquaticusを起源として単離されたもの）であり、それは耐熱性が高く、９４℃で行われるＤＮＡ変性の繰り返し工程でも生き残れるので好ましい。この方法を有効に利用するためには、用いるオリゴヌクレオチドは、標的配列即ちＰ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子にできるだけ近い配列を持っている必要がある。その配列の近似は、限られた入手可能なアミノ酸配列データから導かれる。遺伝子コードの縮重による配列の不確定性を最小にするために（与えられたアミノ酸は６つまでのコドンでエンコードされうる）、最初の近似は、最小の縮重を含むアミノ酸配列を選択することである。例えば、Ｐ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子のアミノ末端配列には、以下の一連のアミノ酸が存在する。Ｈｉｓ-Ｐｈｅ-Ａｌａ-Ｇｌｎ-Ａｓｎ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸４３−４９）。このアミノ酸配列は、５’-ＣＡＹ-ＴＴＹ-ＧＣＮ-ＣＡＲ-ＡＡＹ-ＡＡＹ-ＣＣＮ-３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）で表される５１２の異なるヌクレオチド配列でエンコードされうる。ここで、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）、Ｙはピリミジン（ＣまたはＴ）を表し、Ｎは、この位置において、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣ）の任意のひとつが、示されたアミノ酸配列をエンコードできるヌクレオチド配列を構成することを示している。ひとつの可能なアプローチは、以下に示される全部で５１２の異なるヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物を合成することであろう。このような混合物をＰＤＲに用いることは有効であるが、他のアプローチは、各々がヌクレオチド配列の相対的に小さいセットからなる多数のオリゴヌクレオチド混合物を用いることである。これをさらに簡単にするために、ＰＣＲプライマーにおける不一致のヌクレオチドは、プライマーの３’−末端より５’−末端のほうが連続性が低いという観察（７）の利点を取り入れた。これらの基準を用いて、８つのヌクレオチドのセット（各々は４つの唯一の配列からなる）を設計した。ここで、ヌクレオチドの個々のセットは以下の配列を持つ。これらのプールのうちのひとつは、（３−末端から数えて）最初の１１のヌクレオチドに完全に一致する。さらに、４つのヌクレオチドのこのプール内では、最初の１４ヌクレオチドが完全に一致する。このことは、コンドロイチナーゼＩ遺伝子に無関係なＰＣＲ生成物を生じさせる不完全な一致を見分ける緊縮アニール条件を用いることを可能にするので重要である。これらのＰＣＲ実験で用いられるべきオリゴヌクレオチドを設計する上での更なる補助は、Ｐ．ブルガリスの１１０ｋＤコンドロイチナーゼ酵素が、タンパク質分解的切断に過敏な領域を残した構造を有しているという観察結果によってもたらされる。この加水分解の結果によると、通常約１１０ｋＤのタンパク質が、１８ｋＤ及び妬く９０ｋＤの２つの優勢な断片に分裂する。”１１０ｋＤ”のタンパク質及び”１８ｋＤ”フラグメントのアミノ−末端配列は同一であったが、 ”９０ｋＤ”は異なることがわかった。 ”１８ｋＤ”ペプチドは、シアノゲンブロミド及びトリプシンでの処理でさらに分割され、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドを設計するためのさらに多くの情報を与える。”１８ｋＤ”及び”９０ｋＤ”領域からのこの情報は、これらのアミノ酸配列の位置が互いに関連し、元のタンパク質のＮ−末端配列が良好に決定されることからも価値がある。実際に、”１１０ｋＤ”及び”９０ｋＤ”本体のＮ −末端をエンコードする領域間のヌクレオチド間隔は、約４００−５００ｂｐと予想される。さらに考慮した後、オリゴヌクレオチドのプールのさらに２つのセットを設計した。最初の８つのオリゴヌクレオチドは１本のオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズし、インビトロＤＮＡ合成の間に、それらは”９０ｋＤ”Ｎ−末端コーディング配列に延長される。さらに、 ”１８ｋＤ”ペプチド内及び”９０ｋＤ”ペプチドのＮ−末端からのアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドは、アニールされてＰ．ブルガリスの相補的ＤＮＡ鎖となるように、インビトロで元のタンパク質のＮ−末端をエンコードする領域に延長するように設計しなければならない。この方法で、オリゴヌクレオチドは、コンドロイチナーゼＩ遺伝子のＮ−末端領域をエンコードするＰ．ブルガリス染色体の領域を有効に”ブラケット(brack et)”する。ＰＣＲ方法論が、このブラケットした領域を増殖する非常に大きな可能性を提供するのは意味のないことである。理論では、３０回のＰＣＲサイクルで、このＤＮＡセグメント(segment)のコピーが１０億単位で増加される。このことは、テンプレートとしてのＰ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡの使用量が非常に少なくても、可能性として、マイクログラム量の合成生成物を産生することができ、それらは容易に可視化され、単離されてクローニングされる。上記の論理を用いて、オリゴヌクレオチド混合物が、”１８ｋＤ”ペプチド内に見られる次のアミノ酸配列に基づいて設計された。Ｇｌｕ-Ａｌａ-Ｇｌｎ-Ａｌａ-Ｇｌｙ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１３８−１４４）。このヘプタペプチドは、以下のヌクレオチド配列でエンコードされる。従って、相補的鎖は以下の配列を持っている。上述の８つのオリゴヌクレオチドの最初のセットにたいするのと同様の基準を用いて、さらに８つのオリゴヌクレオチドのセット（１６の唯一の配列からなる）を設計した。ここで、オリゴヌクレオチドの個々のセットは以下の配列を持つ。上記のオリゴヌクレオチド１−８とは異なり、配列交換(permutation)の数を減少させるため、オリゴヌクレオチド９−１６の５’末端からひとつの塩基を取り除いた。この場合、ひとつのプールが、３’−末端において最初の８つのヌクレオチドと完全に一致するが、この同じプールの５０％は、コンドロイチナーゼＩをエンコードするＰ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡと完全に一致する１１−ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチド混合物の第３のセットについて、”９０ｋＤ”ペプチドのＮ−末端アミノ酸配列の一部として得られた以下のアミノ酸配列を用いた。Ｇｌｙ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ｖａｌ-Ａｓｐ-Ｓｅｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１８９−１９４）。このヘキサペプチドは、下記のヌクレオチド配列によってエンコードされる。またはこの配列の補体は、下記の通りである。またはこれらの可能な配列は、下記のオリゴヌクレオチド混合物を用いて表される。上記のオリゴヌクレオチド１−８とは異なり、配列交換の数を減少させるため、オリゴヌクレオチド１７−２４の５’末端からひとつの塩基を取り除いた。この場合、ひとつのオリゴヌクレオチド混合物は、その成分の半分が最初の８つのヌクレオチドと３’−末端において完全に一致し、プールのオリゴヌクレオチドの１／４が、３’−末端において１１のヌクレオチドと完全に一致する。これらの２４のオリゴヌクレオチド混合物は、バイオシンセシス・インク(Bio synthesis Inc.)（デントン(Denton)、ＴＸ）から、十分に保護を外し、精製し、親油化したサンプルとして購入した。各場合（オリゴヌクレオチド＃２０を除く）において、５Ｏ．Ｄ．単位の合成ＤＮＡを得た。これを０．５ｍｌの水に再懸濁し、マイクロリットル当たり５０−６０ピコモル(pmoles)のオリゴヌクレオチドを含む溶液を作製した。残りのサンプル（オリゴ留暮れ落ち度＃２０）は、１５Ｏ．Ｄ．を含み、１ｍｌの水に再懸濁して約９０pmole／μｌの溶液を得た。典型的な５０μｌのＰＣＲ反応は、テンプレートとして約２０ｎｇのＰ．ブルガリスのゲノミックＤＮＡ；各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂；０．０１％のゲラチン；２．５単位のＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ^T ^M ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー／セタス(Perkin-Elmer/Cetus)、ノルウォーク(Norwalk)、ＣＴ）；及び５０ピコモルの試験すべき各オリゴヌクレオチドプールを含んでいる。反応は、無機オイル（プラウフ(Plough)）をかぶせて、パーキン−エルマー／セタスのサーマルサイクラー^TM(Thermalcycler^TM)内でインキュベートした。各サイクルで、方法は、テンプレートＤＮＡを９４℃で１．２５分間変性し、オリゴヌクレオチドプライマーを、変性したテンプレートに６０℃または６２℃ で１分間アニールし、これらのプライマーを７２℃で２．２５分間ＤＮＡ合成を通して延長するようにプログラムされた。実験的増殖において、そのようなサイクルを３０回行った。生成物は、アリコートを、約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む４％ＮｕＳｉｅｖｅ^TM（ＦＭＣバイオケミカルス(FMC BioChem icals)、ロックランド(Rockland)、ＭＥ）ＧＴＧゲルに、全強度または半強度のトリス−ホウ酸またはトリス−酢酸バッファーを用いて走らせることによって分析した。これらのゲルは、通常は終夜に渡って約１Ｖ／ｃｍで走らせ、赤色フィルター及びポラロイドタイプ５７フィルムを用いて長波長ＵＶトランスイルミネーター(transilluminator)上で写真に撮る。ＰＣＲ実験は、オリゴヌクレオチド＃１−８（コンドロイチナーゼＩの”１１０ｋＤ”アミノ−末端配列から導かれたもの）、プール＃９−１６（”１８ｋＤ ”フラグメント内に含まれるペプチド配列から導かれたもの）、及びプール＃１７−２４（”９０ｋＤ”フラグメントのアミノ−末端配列から導かれたもの）の間のペアワイズ(pairwise)の組み合わせを試験した。観察された最も有効な増殖は、オリゴヌクレオチドプール＃４と＃１８との間、＃４と＃９、１０、１１または１２との間であった。一般に、これらのプールと１つのヌクレオチドが異なる他のプールも同じ増殖を産生する。２つのヌクレオチドが異なると、実質的に生成物が見られなかった。しかし、そのような差別化を促進するためにアニール温度をわざと６０−６２℃に維持することを記憶しておくのは重要である。オリゴヌクレオチドプール＃４及び＃１８を用いたＰＣＲ増殖は、ＮｕＳｉｅｖｅ^TM寒天ゲルで３０から７００ｂｐの範囲に広がるサイズ標準物質（ＭＳＰ− １で消化されたｐＢＲ３２２（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ））との相対で見積もると約５００ｂｐである生成物を産生した。プール＃９、１０、１１または１２と組み合わせたオリゴヌクレオチドプール＃４を使用して得た生成物は、約３５０ｂｐの長さであった。さらに、寒天ゲルから単離した大きな生成物を、１０００倍に希釈し、プライマーとして約３５０ｂｐの生成物を産生するオリゴヌクレオチドプール＃４及及び＃９を採用した第２のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。即ち、小さなＰＣＲ生成物は、大きな生成物から合成され、これらの配列がすべてＰ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩから導かれたときに予想されるものと一致した。このことは、ゲノムの設定した領域が増殖されことを示している。大きなＰＣＲ生成物は、キアテックス^TM(Quiatex^TM)抽出法を用い、製造者の指示（キアゲン(Quiagen)、チャットワース(Chatworth)、ＣＡ）に従って寒天ゲルから単離した。次いで単離したＤＮＡに”フィル−イン(fill-in)”反応（１１）を施し、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼが、テンプレートと無関係な反応でＤＮＡの３’末端に付加しがちな余分に突出したアデニン残基を取り除いた（１２）。単離したＤＮＡはＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、ＰＤＲ生成物の５ ’−末端にリン酸部位を付加して、ベクターＤＮＡと結合するようにした。これらの処理の後、ＰＣＲ生成物は、ＰｓｔＩによって最初に連続的に消化されるポリリンカー（ＩＢＩ、ニュー・ヘブン、ＣＴ）を含む高度のコピーベクターであるｐＩＢＩ２４にリゲートし、”フィルド−イン(filled-in)”して、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム）で処理した。ひとたびＰＣＲ生成物がｐＩＢＩ２４にクローニングされれば、プラスミドに運ばれるポリリンカー内の制限部位によって、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして取り除かれる。このフラグメントは、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの両方によって切断され、ホスファターゼ処理された後、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９（１３；ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）の両方にクローン化される。これらの構造体に対応する１本鎖ＤＮＡが単離され、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)（フォスター・シティー(Foster City)、ＣＡ）装置及びＴａｇ配列キットを用いたＤＮＡ配列分析を施される。結果は、大きなＰＣＲ生成物が４５５ｂｐの長さであることを示す。予想したとおり、フラグメントの末端はプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドプールから導かれた。ＤＮＡ配列は、例えば、１２残基オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１３３−１４４）を含む天然のコンドロイチナーゼＩタンパク質自身のアミノ酸配列分析によって得られたデータと一致する（ひとつの予想を下に示す）中断していないアミノ酸配列に翻訳された。ＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸７１−７８）から導かれる８残基のオリゴヌクレオチドも、先に配列分析した天然のタンパク質のトリプシン消化とシアノゲンブロミド処理の組み合わせから導かれたオリゴヌクレオチドと一致する。２つの配列の間の唯一の食い違いは、成熟したタンパク質のアミノ酸残基＃１６２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１８６）においてであり、ここではＤＮＡ配列がアルギニンをコードするが、天然のタンパク質配列はロイシンを示す。一つのヌクレオチドの変更がロイシンコドン（ＣＴＴ）をアルギニンコドン（ＣＧＴ）に変化させるので、初期の解釈では、これは、インビトロ増殖工程の間にＴａｇＤＮＡポリメラーゼによる完全な取り込みの正確さが欠けることから生ずることを示唆している。しかし（下記参照）、後の結果は、天然の酵素の分析によって得られるアミノ酸配列ではなく、ＤＮＡ配列が正しいことを示している。これらの結果は、実際に、”１８ｋＤ”及び”９０ｋＤ”フラグメントは、コンドロイチダーゼＩタンパク質の隣接する断片であることを示し、それは主に、成熟タンパク質の残基＃１５７（Ｇｌｎ）と＃１５８（Ａｓｐ）の間（ＳＥＱＩＤＮＯ：２、アミノ酸１８１と１８２の間）で、（おそらく混ざったプロテアーゼによって）切断されたものである。上記のすべての情報は、ＰＣＲ増殖によって生成されたクローン化されたＤＮＡ（少なくともオリゴヌクレオチドプライマーによってブランケットされた部分）が、本物のＰ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩ遺伝子の一部を表し、従って、元の遺伝子を持つコスミドクローンを同定するためのプローブとして用いることができるという解釈を支持している。カルボキシル−末端のアミノ酸配列から導かれるプライマーに結合したタンパク質のアミノ−末端から導かれるオリゴヌクレオチドプライマーを採用することによって、ＰＣＲ増殖を用いて注目しているタンパク質をコーディングする遺伝子全部を単離するのは可能であり、（それによって遺伝子バンクの構成及び下記の他の工程の多くが避けられる）が、このアプローチには、問題が生じうる。Ｐ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩの場合、その問題とは、（１）配列分析されるタンパク質は、いずれかの末端で処理されない（例えば、分泌されたタンパク質では真実でないらしい）、（２）ＰＣＲ反応中のＴａｇＤＮＡポリメラーゼによって表される正確さの欠如、及び（３）増殖されるべきＤＮＡのブラケットされた領域が大きく、（約１１０ｋＤの見かけの分子量から推定して）約３０００ｂｐと予想されることを含む。従って、遺伝子バンクを構成するアプローチを選択した。実施例３ラベルされたプローブの生成、コロニーハイブリダイゼーション及びＰ．ブルガリス遺伝子バンク起源の陽性のコスミドクローンの同定Ｐ.ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子のアミノ-末端コード部分付近の４５５ｂｐに相当するクローン化ＰＣＲ生成物を、制限エンコヌクレアーゼＳａｌＩでの消化によりクローン化されるプラスミドＤＮＡから放出した。これは、一つのＳａｌＩ部位がポリリンカー配列中に存在し、第２のＳａｌＩ部位がクローン化ＰＣＲ増幅生成物中に存在することの結果である（第２のＳａｌＩ部位がオリゴヌクレオチドプール＃１８のヌクレオチド配列の５’末端付近より誘導されることは偶然である；実際のところ、Ｐ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子中にＳａｌＩそのものの認識部位はない）。約２６０μgのプラスミドＤＮＡの総量をＳａｌＩとともに消化し、生成物をＮｕＳｉｅｖｅ^TM ＧＴＧアガロースゲル上での電気泳動により分離した。目的の約４５０ｂｐのフラグメントは、キアテックス^TM抽出プロトコールを用いて単離した。この後、該フラグメントは５〜１５分間、９５〜１００℃に加熱して変性させ、続いてすばやく冷却した。この後、変性されたフラグメントを２００μl反応中、ジゴキシゲニンラベルしたＤＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）でラベルした。上記実施例１に記載の６つのＰ．ブルガリスのコスミド遺伝子バンクを、上述のＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ１５６２を感染させるために用い、総計約１０，０００のコロニーが適切に選択された寒天培地上に得られた。これらのコロニーは、第３の選択的寒天培地と同様に選択的アガー上の２枚のナイロン膜上に（総計５０の寒天培地上に）レプリカプリントした。一晩の保温の後、フィルター上のコロニーを、１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び０．５ＭのＮａＯＨで、各５〜３０分間連続的に処理することによって溶解した。この溶解したコロニー起源の細胞は、１Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で（２回）飽和させたシート上に置き、８０℃での真空乾燥に先立ち、２×標準のクエン酸食塩水で飽和させた紙の上に置くことによって中性化した。この後、溶解したコロニー起源のＤＮＡを膜上に固定した。上記フィルタを、フィルター当たり少なくとも１０ｍｌの０．０５ＭのトリスＨＣｌ、０．５〜１ＭのＮａＣｌ／０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、０．１％のＳＤＳ及び０．０５mg/mlのプロテイナーゼＫを用い、攪拌しつつ、１〜３時間該フィルターを４２℃に保つことによって洗浄した。該フィルターを、２×のＳＳＣで洗い流し、ハイブリダイゼーションバッファーとともに６５℃で１〜３時間保温することによってプレ-ハイブリダイズした。上記フィルターを、上述のジゴキシゲニン-ラベルしたプローブ（ハイブリダイゼーション溶液中０．５〜５０ｎｇ／ｍｌ）を用い、６５〜６８℃にて一晩ハイブリダイズした。上記のハイブリダイズしたフィルターをＳＳＣ及びＳＤＳで洗浄し、ブロッキング試薬（ＤＮＡラベル及び検出キットの成分＃１１、非放射性、ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）で再ブロックし、アルカリ性ホスファターゼに結合したポリクローナルヒッジ抗-ジゴキシゲニンＦａｂフラグメントにさらした。ＢＣＩＰ（ブロモ-クロロ-インドリル-ホスフェート）及びＮＢＴ（ニトロ-ブルー・テトラゾリウム）の存在下での抗体-ラベルしたフィルターの保温により、クローンが陽性であることが明らかになった。コロニー内に望ましいＤＮＡフラグメントが存在していると、このハイブリダイゼーション過程の後、フィルターに濃い紫褐色のスポットが生じる。約４時間の後、展開したフィルターをテンプレートとして用いて、選別した総計１１７のクローンが選択的媒体に選択された。これらクローンの各少量（１０ｍｌ）の培地（“ミニプレップ（Miniprep） ”）を、選択的媒質中で成長させ、キアゲンにより供給される物質及びプロトコールを用いてプラスミドＤＮＡを単離した。実施例４個々のクローン内のコンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置を特定するために用いられる、制限マッピング及びサザンハイブリダイゼーション数多くの試みが、更なる研究のために特定のコスミドクローンの選別を導いている。その一つは、同一のＰＣＲ-発生フラグメントを、多くの制限酵素により消化され、ナイロン膜への移送に先立ってアガロースゲル上で分別したＰ．ブルガリスゲノミックＤＮＡに対するプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーション（８）を行なうことである。このヌクレオチド類似体をＰＣＲ増幅に含むことにより、プローブをジゴシキゲニン-ＤＵＴＰでラベルした。この反応においては、前ＰＣＲ増幅（Ｐ．ブルガリスゲノミックＤＮＡをテンプレートとして用いたもの）のゲル-精製生成物は、１０，０００倍に希釈され、第２のＰＣＲ増幅においてテンプレートとして供される。この反応により０．５ｍｌ混合物が構成され、これを１０の個別チューブに分配し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドプール＃２及び＃１０（上記参照）を用いて上述のように２５サイクルに増幅した。デオキシリボ核酸トリホスファートの正常補体を、製造者（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）から入手のジゴシキゲニン-ＤＵＴＰでラベルした混合物と置き換え、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰとｄＧＴＰ、６５μM dＴＴＰと３５μｌジゴキシゲニン-d ＵＴＰの各々が１００μＭの最終濃縮物を得た。製造者の勧めにしたがって該反応物をプールし、沈澱させた。再懸濁させた生成物のアリコートをゲル電気泳動によって試験したところ、約３００〜約４００に、上述の、“より小さい”ＰＣＲ生成物に予想される長さでシングルバンドを示した。高度に粘性なＰ．ブルガリウスゲノミＤＮＡの調製にて遭遇する問題を避けるために、ＤＮＡ（約５μl）を消化のために様々な制限酵素とともに大体積（０．３５ml）に希釈した。このＤＮＡをアガロースゲル上での精留に先立ちエタノール析出によって濃縮し、ナイロン膜に移送した。これらの実験で得られたデータは、コンドロイチナーゼＩ遺伝子（少なくとも、上述のプローブにより表されるＮ-末端コード部分とハイブリダイゼーションする部分）が、約２８００ｂｐのＢｓｔＹＩフラグメント、５４００ｂｐのＥｃｏＲＶフラグメント、及びＮｓｉＩ、ＢｑｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びｓｔｙＩにより発生する大型の（約１０ｋｂと同等またはより大きな）ＤＮＡフラグメント上に導かれることを示している。多数のハイブリダイゼーションコスミドクローンの大容積の培地（５００ｍｌ）を成長させ、プラスミドＤＮＡをコンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置をマッピングするためにこれらの培地から単離した。該遺伝子のＤＮＡの占める割合は、各コスミド内に担持されるＰ．ブルガリスＤＮＡの約１０％にすぎないと予想された。これらのクローンの多くがＢｓｔＹＩ及びＮｓｉＩとともに消化され、生成物はアガロースゲル上で分別された。この後各フラグメントは単離され、サザンハイブリッドによりコンドロイチナーゼＩ配列の存在の有無を試験し、適切なベクター中にサブクローンした。これらのフラグメントのうち２つは、特に興味深い。第１に、約２８００ｂｐのＢｓｔＹＩフラグメントは、＃２及び＃４５と示されるものを含む、多数のコスミドクローン中に観察された。これら２つのコスミドクローンより単離されるＤＮＡは、ＬＰ²７５１及びＬＰ²７６０と称される。ＬＰ²７６０の場合、約２８００ｂｐのＢｓｔＹＩフラグメントは他のＢｓｔＹＩフラグメントからよく分離され、したがってｐＴ６６０−３と称される他のベクター中に、より容易にサブクローン化される。ｐＴ６６０−３と称されるプラスミドはｐＢＲ３２２の誘導体であり、ＤＮＡが、テトラサイクリン耐性（約ｂｐ８０）のためのプロモータの直下流の点からＰｖｕＩＩ部分（約ｂｐ２０７０）までが欠失され、ＢａｍＨＩリンカーで置換されている。同様に、約１０ｋｂのＮｓｉＩフラグメント（上述のコンドロイチナーゼプローブでハイブリダイズする）は、ＬＰ²７５１上で行なわれる消化から容易に単離される。これら２つのフラグメントは、“２８００ｂｐのＢｓｔＹＩ”フラグメント及び“１０ｋｂのＮｓｉＩ”フラグメントと呼ばれる。２８００ｂｐのＢＳｔＹＩフラグメントは十分に小さいために、このＤＮＡの小片上での第２の制限酵素消化を許容し、ＤＮＡ配列評価のために適切なフラグメントを得ることができる。このことは、プローブがどのように誘導されるかによって、ハイブリダイゼーション実験がコンドロイチナーゼＩ遺伝子Ｎ末端コード領域を同定するために行われることから重要である。しかしながら、この行程は残りの遺伝子がどちらの側に位置するのか示すものではない。完全な遺伝子に予測されるサイズ（３０００ｂｐより大）と比較した、プローブの相対的サイズ（５００ｂｐより小）が与えられているが、これを考慮するのはつまらないことである。しかしながら、ヌクレオチド配列は、いずれの方向で遺伝子が“読まれる”のか、完全な遺伝子を得るためにはいずれの制限フラグメントがクローンされるべきなのかを明白に示している。サブクローンされた２８００ｂＰのＢＳｔＹＩフラグメントは、２つの内部ＥｃｏＲＶ部分を含み、このことは生じるフラグメントがＤＮＡ配列分析のために十分小さいことを示唆している。しかしながら、ＥｃｏＲＶ部分は２８００ｂｐのＢｓｔＹＩフラグメント内に対称に配置され；各ＥｃｏＲＶ部分は、それらの間に約４００ｂｐに等しい間隔を有して、一端から約１２００ｂｐにある。サブクローンしたフラグメントは、ベクター内に唯一の制限部分が存在するという利点を生かすことによって非対称に消化される。このように、２８００ｂｐのＢｓｔＹＩフラグメントの“半分”が物理的に識別され、サザンハイブリダイゼーションによってコンドロイチナーゼＩのＮ末端コード領域を含む“端部”が確認された。これがいったんなされたので、約１２００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントである適切な一片が、初めにＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩ双方で消化され、続いてウシの腸のアルカリンホスファターゼで処理された、Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９双方のベクターにサブクローンされた。これらのサブクローンより誘導されるＤＮＡ配列には、その読まれる方向と同様にコンドロイチナーゼＩ遺伝子の位置を明白に確定する様々な特徴が表れた。この配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド１９１）においてヌクレオチド＃１８３から始めると、コード領域はＰ．ブルガリスのあらかじめ同定されたアミノ酸の最初の３０に適合することが観察された。この配列の前に、予め分析されたＥ．ｃｏｌｉ遺伝子起源の、対応する配列モチーフに相似であることから、他にも多くの特徴を識別することができた。これらの特徴は下記のものを含む：（１）プロモータの共通“−３５”領域と、６のうち３の位置で適合するヌクレオチド３２-３７（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド４０-４５）、１７ヌクレオチド空間の後、プロモータの“−１０”領域（共通“−１０”領域と、７のうち６の位置で適合する）；（２）推定される“シャイン-ダルガーノ”配列がヌクレオチド９８-１０３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド１０６-１１１）の間で注目され；また（３）ヌクレオチド１１１-１１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド１１９-１２１）に、フレーム中ＡＴＧ開始コドンがあり、これによりＰ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ酵素が、おそらくタンパク質が内部膜を渡って移送されるように除去される、２４のアミノ酸シグナル配列で合成されることが示される。（このポリリンカー中に通常存在するＰＳｔＩ部分の代わりにＮｓｉＩ制限部分を含むために最初に修正されるｐＩＢＩ２４誘導体に）サブクローンされた第２のフラグメントは、約１０ｋｂのＮｓｉＩフラグメントである。ＥｃｏＲＶをもつこの約１４ｋｂの組み替え分子（ｐＩＢＩ２４における約１０ｋｂのＮｓｉフラグメント）は、約９ｋｂ、２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、及び０．４ｋｂの４つのフラグメントを産生する。Ｎ-末端アミノ酸配列より誘導されるプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション分析は、関連のコンドロイチナーゼ遺伝子配列が、最大のフラグメント（約９ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメント）内に含まれることを示した。２．９ｋｂ（内部ＥｃｏＲＶ認識部位をもたないｐＩＢＩ２４のサイズ）よりも大きいフラグメントが他にないことから、この約９ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントは、Ｐ.ブルガリスＤＮＡと同様にベクターを含まねばならない。このＮｓｉＩ及びＥｃｏＲＶをもつ組み替え分子の２重消化(double digestion)により、ｐＩＢＩ２４ベクターが２．９ｋｂフラグメントとして放出され；これはまた、約４．５ｋｂ、２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、１．０ｋｂ及び０．４ｋｂのフラグメントを産生する。これらのことから（上記の、約０．４kbで分離された２つの内部ＥｃｏＲＶ部位を有する２．８ｋｂのＢｓｔＹＩフラグメントに与えられた情報も併せて）、最初の制限マップが構築された。ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩとの２重消化により、４．１ｋｂ、２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、２．０ｋｂ、１．３ｋｂ、１．１ｋｂ及び０．４ｋｂのフラグメントを放出した。これらのフラグメントのうち３つ（２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、及び０．４ｋｂ）は明らかに、ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されていないＥｃｏＲＶフラグメントであった。再度、ベクター（４．１kb）よりも大きい唯一のフラグメントは、このフラグメントがｐＩＢＩ２４（２．９kb）を含むことを示した。約２．０ｋｂのフラグメントはコンドロイチナーゼプローブとハイブリダイゼーションし、それによってＨｉｎｄＩＩＩ部位のひとつを配置するのに役立つのである。ポリリンカー中に一つのＨｉｎｄＩＩＩ部位があることから、推論により最後のＨｉｎｄＩＩＩ部位も配置されるようにすることができる。ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩをもつ、クローン化された約１０ｋｂのＮｓｉＩフラグメントの２重消化は、６つのフラグメント（約４．２ｋｂ、３．５ｋｂ、２．３ｋｂ、２．１ｋｂ、１ｋｂ、及び０．４ｋｂのもの）を産生し、これは２つのＥｃｏＲＩ部位の存在を示し、その一つはポリリンカー中に、他の一つはクローン化したＰ．ブルガリスＤＮＡ中にあることを示した。サザンハイブリダイゼーションにより、この２重消化での約４．２ｋｂのバンドが、コンドロイチナーゼIのＮ末端コード配列を含むことが明らかになった。この情報を上記のデータに加えることにより、ｐＩＢＩ２４中でのサブクローン化された約１０ｋｂのＮＳｉＩフラグメントのための予備制限マップが得られた（図１）。コンドロイチナーゼＩ遺伝子の配置及び配向をさらに支持するために、イン・ビトロにおいて、酵素の活性を２３２ｎｍにおける硫酸コンドロイチンＣ起源の不飽和二糖の放出によって測定することに基づくコンドロイチナーゼＩ検定を、少数の標本に行った。ある場合には、ＬＰ²７５１（コロニーハイブリダイゼーションより選択されるコスミドＤＮＡを担持するＥＲ１５６２）を調製するために用いた一晩培養のアリコートが、コンドロイチナーゼ０．１２単位／ｍｌを発現することが判った。さらに、ＥｃｏＲＶ-欠失構造（以下に説明する）のひとつを、アンピシリンの存在下で一晩培養した。その後この培地を、ｐＩＢＩ２４中に存在するｌａｃプロモータからの転写のレベルを増大することが期待されるイソプロピル-ベータ-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の有または無の条件下で、新鮮な選択的媒体に接種した。検定では、ＩＰＴＧ誘導なしでコンドロイチナーゼ０．２９単位／ｍｌ、ＩＰＴＧ誘導ありで０．３６単位／ｍｌ、ＥｃｏＲＶ欠失の後でさえも遺伝子は依然として損なわれておらず、ｌａｃ-プロモータのものと同一の方向に配向していることが考えられる。上記の議論におけるフラグメントのサイズがおおよそのものである（特に、ポリリンカー中でＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩの間の約１ｋｂの領域及びＥｃｏＲＶ部位に最も近いもの；さらに他にも小ＥｃｏＲＶフラグメントでマッピングされていないものがある可能性もある）にも関わらず、総体的に約４．２ｋｂのＥｃｏＲＶ-ＥｃｏＲＩフラグメントがコンドロイチナーゼＩ遺伝子全体を含んでいることを示唆している。制限マッピングを促進するために、ｐＩＢＩ２４（ＬＰ²７７６）中にクローン化した約１０ｋｂのＮｓｉＩフラグメントを用いることによりＥｃｏＲＶ欠失を構築した。このＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化しウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理し、アガロースゲル上で分別した。最大の（約１０ｋｂ）フラグメントをゲルより抽出し、リン酸化ＥｃｏａＲＩリンカーの存在下で連結した。次に、生じた構造体（ＬＰ²７８６）をＥｃｏＲＩで消化し、３つのフラグメントを得た。ｐＩＢＩ２４-含有物から完全に分離していないにも関わらず、ゲルからの抽出の後、より小さなフラグメント、約９５％均一で、約４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントが得られた。このＥｃｏＲＩフラグメントは、この後、ＤＮＡ配列分析に用いられた。実施例５約４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ配列分析ｐＩＢＩ２４中にクローンした約１０ｋｂのＮｓｉＩフラグメントを、ＥｃｏＲＶで消化し（上述のように）、ＥｃｏＲＩリンカーの存在下で連結させた。この構造体の最終結果は、このＤＮＡのサブクローンした一片からＰ．ブルガリスＤＮＡの約５ｋｂの欠失及びこれに続く他のＥｃｏＲＩ部位の分子内への導入であった。この“ＥｃｏＲＶ欠失”構造体（ＬＰ²７８６）の１００μｇを、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で分別した。目的の約４．２ｋｂのフラグメントをゲルより溶離し、沈澱させ、上述した１５０μｌのＴＥ中に再懸濁させた。この物質の３分の１が自身と連結し（ポリマー化）、加熱によるＤＮＡ配列の破壊の後に、ＤＮＡを超音波にかけて、ＤＮＡ配列分析に適当なランダムな小片を発生させた。端部はＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ“クレノー・フラグメント（klen ow fragment）”（１０；ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）によって仲介される“フィル−イン（fill-in）”反応において平滑にし、連結してＳｍａＩ-cutとし、Ｍ１３ｍｐ１９をホスファターゼ化した。この組み替えＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ雄株ＭＶ１１９０を変態させ、得られたファージプラーク５００をＳＭバッファー（NaCl，100mM； MgSO₄，8mM；トリス -HCl，pH7.4，50mMおよび0.01%ゼラチン）に取り込んで、少量（１０ｍｌ以下）の培地の感染のための原料とし、これを一本鎖のテンプレートＤＮＡの単離に用いた。ＤＮＡ配列は、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光ラベルしたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、昇温して行った。データは、モデル３７０ＡＤＮＡ配列分析システム(Model 370A DNA sequencing system)（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)，フォスター・シティ(Foster City)，ＣＡ）を使用して採集した。配列編集、オーバーラップ決定及び共通配列の派生は、ウィスコンシン大学の遺伝子コンピューターグループ(Genetics Computer Group at the University of Wisconsin)（１４）より入手したコンピュータープログラムのコレクションを用いて行った。このＥｃｏＲＩフラグメントの、生じたＤＮＡ配列は、単位（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）あたりヌクレオチド３９８０であった。Ｎ末端コード配列に近いＥｃｏＲＩ部位が、この部位に連結するリンカーから誘導されることは注目に値する；これは、Ｐ．ブルガリス染色体には存在しないからである。実際のところこの位置は、クローン化したコスミドＤＮＡ中では、ＥｃｏＲＶ部位であった。一般的なアミノ酸配列へのＤＮＡ配列の翻訳は、１０２１アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）の連続的な開放読み取りフレームで、２４残基シグナル配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２，アミノ酸１〜２４）を伴い、成熟した（処理された）コンドロイチナーゼＩタンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：２，アミノ酸２５− １０２１）のための９９７残基コード化配列がさらに続くものである。この配列の、上述のプログラムを用いたコンピューター分析では、未精製のタンパク質は分子量１１５，０９０．９４、精製した“１１０ＫＤ”（輸送された）タンパク質は分子量１１２，５０７．８２、最初の１５７のアミノ酸（“１８kD”フラグメント）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２，アミノ酸２５−１８１）は１７，５０３．４３及び残りの８４０のアミノ酸（“９０ｋＤ”フラグメント）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２，アミノ酸１８２−１０２１）は９５，０２２．４０及び２４-残基シグナル配列は分子量２６０１．１４が推定された。アミノ酸組成物の注目すべき特徴の一つとして、タンパク質がどの時点でも再度折りたたまれねばならないとすると、システインのないことは重大である。ヌクレオチド配列においては、唯一のＳｐｈＩ制限部位が、遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド３４１４−３４１９）の端部の向こう側、約２３０ｂｐに位置することが上記されており、これはＥ．ｃｏｌｉ中で高い水準でコンドロイチナーゼを発現するという総合的な目的を達成するために遺伝子の構造鈍感動作を許容するように操作することのできる唯一の標的部位を表す。ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）には２つの認識部位があるが、その一つ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド２７０２−２７０７）はＥ．ｃｏｌｉｄａｍ認識配列（ＧＡＴＣ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド２７０１−２７０４）内にはめ込まれている。ｄａｍ-エンコードした酵素により起こるアデニンメチル化は、ＣｌａＩによるこの部位の切断を遮断し；したがって、実際に“唯一の(uniqu e)”ＣｌａＩ部位（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ヌクレオチド４９７−５０２）ができ、これは下記のような適切な部位-特異的な突然変異誘発を行った後に、コンドロイチナーゼＩ遺伝子を再構築するために用いた。実施例６クローン化したＰ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子の部位-特異的突然変異誘発採用した部位-特異的な突然変異誘発法は、カンネル(Kunkel)（１５）に基づき、バイオ−ラド、メルビル、Ｎ．Ｙ．(Muta-Gene^TM In Vitro Mutagenesis Ki t)より購入した物質を用いるものである。この方法では、突然変異誘発をする目的のＤＮＡは、まず適切なＭ１３誘導したベクターにクローン化する。この場合、用いる組み替え分子（上述のように約１２００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをクローン化したＭ１３ｍｐ１９）は、コンドロイチナーゼＩ遺伝子のＮ-末端コード領域を取り囲む。この組み替えファージは、ｄｕｔ及びｕｎｇ対立遺伝子を担持する雄株であるＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＣＪ２３６（バイオ −ラド製）中で複製される。これら２つの突然変異の組み合わせ、ｄｕｔ（ＤＵＴＰａｓｅ）及びｕｎｇ（ウラシル-Ｎ-グリコシラーゼ）は、この器官で合成されたＤＮＡ中で、チミンよりもむしろウラシルの残基の結合を生じた。ＣＪ２３６上に増殖の後、１本鎖のテンプレートが単離され、適切な突然変異の合成オリゴヌクレオチドがこのＤＮＡにアニールされる。このオリゴヌクレオチドは、組み替え分子全体を複写するＴ７ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとしてはたらく。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、突然変異性オリゴヌクレオチドの最初の残基とイン・ビトロで加えられた最後の残基との間のニックをシールするために用いられる。ゆえに新たに合成されたＤＮＡ（好ましい塩基交換を含む）は、テンプレートＤＮＡがウラシルを含む一方で、これを含まない。非突然変異体（ｄｕｔ及びｕｎｇ対立遺伝子に対して）Ｅ．ｃｏｌｉ雄株の形質転換により、主に、ウラシル-含有のテンプレート鎖の不活性化の結果としてイン・ビトロにて合成される突然変異鎖から誘導されるファージ子孫が得られる。この特定の場合には、４つの再懸濁させたプラーク（そのアリコートが、コンドロイチナーゼＩ遺伝子のＮ-末端コード領域を確定し、推定される翻訳開始部位（上記参照）の他の１１０ｂｐの“上流”を含んだＤＮＡ配列のために用いられた）が、雄の宿主株ＣＪ２３６（ｄｕｔｕｎｇ）を感染させるために用いられた。個別のプラークを、ファージ希釈バッファー（ＰＤＢ）０．５ｍｌに選び取った。各形質転換から一つ選ばれたプラークは、ログフェーズ（log phase）ＣＪ２３６と６．５時間培養した感染培地に吸収させた。細胞は、遠心分離によってペレット化し、上澄み液は５５℃に３０分間加熱し、４℃にて保存した。各上澄み液１００ｍｌから単鎖ＤＮＡを単離し、ＴＥ総体積１０ｍｌ中に再懸濁させた。部位特定突然変異の目標は、この遺伝子の端部を変性させ、これが、正確に高水準Ｅ．ｃｏｌｉ発現系中に移動されるようにすることである。選択された標的ベクター（ｐＥＴ９−Ａ；上記参照）は、バクテリオファージＴ７中に存在する遺伝調節成分から誘導されるものである。この系には、下流ＢａｍＨＩ部位とともに翻訳開始コドンを含み、これらが一緒に、遺伝子が直接的で一方向にの挿入され、発現すべきタンパク質のエンコードをする、唯一のＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）がある。これら２つの部位には、Ｔ７-特定プロモータ配列が先行し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともにはたらく転写ターミネーターが後に続く。よってこれら２つの制限部位（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）は、Ｐ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩのためのクローン化遺伝子中に導入された。ＮｄｅＩ部位（ＡＴＧ開始コドンを含む）を導入するために、ラベル配列と同様、第２の構造体においては成熟したタンパク質（それによってラベル配列を消去する）のためのコード化配列の、どちらにも優先して、２つの合成オリゴヌクレオチドが設計され、合成された（バイオシンセシス、インク(BioSynthesis，I nc.)、デントン(Denton)、ＴＸ）。第１としては、選定オリゴヌクレオチド＃２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）がラベル配列を維持し、その一方で第２の＃２６（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）がラベル配列を消去し、成熟したコンドロイチナーゼＩタンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：５，アミノ酸ナンバー１））を直接発現させる。推定される開始コドンを含む天然の配列が、下記の（１）に表され、発ガン性のオリゴヌクレオチド＃２５（開始コドンのすぐ上流の３つのヌクレオチドで異なる）が、（２）に表される：ラベル配列が消去された構造体のために、ラベル配列の接合点及び成熟タンパク質の開始点（ライン３）において、突然変異誘発オリゴヌクレオチド＃２６（ライン４）（開始コドンの配置を含む、６つのヌクレオチドによって異なる）を用いて部位-特定突然変異誘発が行われた：ライン３中の下線を引いたＧＣＣは、Ｐ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩの成熟し、処理された形態のためのＮ-末端アミノ酸であるアラニンのためのコドンに相当する。これらのオリゴヌクレオチドを使用するためには、これらの５’-末端をリン酸化する必要がある。したがって、オリゴヌクレオチド＃２５（５Ｏ．Ｄ．単位）をＴＥ０．５ml中に再懸濁させ、また、オリゴヌクレオチド＃２６（これも５Ｏ．Ｄ．単位）をＴＥ０．６５ｍｌ中に再懸濁させ、約２０ｎＭ、すなわち２０ｐｍｐｌｅ／μｌの原液を得た。各ヌクレオチドの３ナノモル（原液１５０μｌ）に、１０xのリガーゼ塩（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）：０．５Ｍのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１ＭのＭｇＣｌ₂、０．２Ｍのジチオトレイトール、１０ｍＭのＡＡＴＰ、ウシの血清アルブミン０．５mg/m l）、０．１Ｍのジチオトレイトール３５μl、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス）１０μｌ（１００単位）を含む３５μｌ分離（０．３５ｍｌ）反応にてキナーゼ処理を施し、ＴＥ１２０μｌで増量した。この反応は、３７℃にて４０分間温置し、７０℃にて２０分間酵素を不活性化した。テンプレートＤＮＡ（上述の調製５μl）及びリン酸化突然変異誘発プライマー（約２ｐｍｐｌｅ）を、トリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、ＭｇＣｌ₂２ｍＭ、及びＮａＣｌ５０ｍＭを含む２０μｌ体積中にアニールした。この標本をパーキン-エルマー／セタスサーマルサイクラー（Perkin-Elmer/Cetus Thermalcycler ）中で、７０℃に４５分間加熱した。その後この標本を７０℃から２５℃にまで４５分間かけて徐々に冷却した。アニールした混合物を氷上におき、以下の成分を加えた：１０xの合成バッファー（バイオ−ラド）２μｌ：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを各５ｍＭ；ジチオトレイトール２０ｍＭ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（６単位）２μｌ及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（１単位）１μｌ。これらの反応は、それぞれ０℃（氷上）、１１℃、２５℃にて５分間、最後に３７℃にて３０分間インキュベートした。１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ−１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）７５μｌを加えて反応を止め、−２０℃にて静置した。突然変異誘発ＤＮＡが溶解した後、これをＥ．ｃｏｌｉの雄株ＭＶ１１９０（ｄｕｔ⁺ ｕｎｇ⁺）を形質転換するために用いた。得られた個々のプラークを選択し、１本鎖のＤＮＡを単離し配列した。望ましい配列変化が導入されたこれらの場合に再懸濁したプラークの他のアリコートを用いてＭＶ１１９０株を感染させたが、この場合は、組み替えＤＮＡの細胞内の２重鎖複製形態を、上記のミニ -プレップ操作を用いて感染した細胞ペレットから単離した。実施例７部位-特異的に突然変異誘発されたコンドロイチナーゼＩ遺伝子の再構築及びＥ．ｃｏｌｉにおけるその高レベル発現実施例６は、ＮｄｅＩ部位を創製する部位-特異的突然変異誘発が、直ちにラベル配列を行なうこと、また、成熟し、処理されたＰ．ブルガリスコンドロイチナーゼＩ遺伝子上に見られるＮ-末端アラニンをコード化するトリプレットに隣接してＮｄｅＩ部位を配置する第２の構造体を説明した。いずれの場合も、ＮｄｅＩ認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）のＡＴＧ配列は、タンパク質（ラベル配列の有無に関わらず）のための翻訳開始コドンとして機能することができる。構築された場所であるＭ１３ベクターから、これらのオルタレーション（alte ration）を完全なコンドロイチナーゼＩ遺伝子に転移させるために、単離した複製形態をＫｐｎＩ及びＣｌａＩで消化した。ＫｐｎＩ部位は、Ｍ１３ｍｐ１９ポリリンカーの一部であり、ＣｌａＩ部位は、コンドロイチナーゼＩ遺伝子のクローンしたフラグメントの末端から、約４９０ｂｐであることが判明した。得られた制限消化生成物は、１／２ X トリス-アセタートバッファー（ＴＡＥ）に流れ込む４％ＮｕＳｉｅｖｅ^TMＧＴＧアガロースゲル上で分離した。キアテックス^T ^M を用い、適切な、約５００ｂｐのバンドをゲルより抽出した。同様に、コンドロイチナーゼＩ遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡ（ＬＰ²７８６）もまた、ＫｐｎＩ及びＣｌａＩで消化した後、１／２ × ＴＡＥに流れ込む０．８％アガロースゲル上で分離した。この場合は、ＫｐｎＩ部位は、ｐＩＢＩ２４のポリリンカーの一部であり、ＣｌａＩ部位は、上述のものに相当する。（上記のように、コンドロイチナーゼＩ遺伝子中には第２のＣｌａＩ部位があるが、この部位は明らかにｄａｍメチル化により遮断されているために、ＣｌａＩによって切断されない。部位-特異的突然変異誘発及びコンドロイチナーゼＩ遺伝子の再構築は、全ヌクレオチド配列が確認される前に行われた。）ｐＩＢＩ２４のベクターを含む約７ｋｂのフラグメント及びコンドロイチナーゼＩ遺伝子の大フラグメントを、電気溶出（１１）によりアガロースゲルから単離し、続いてエタノール沈澱を行った。この７ｋｂのフラグメントを、ウシの腸のアルカリンホスファターゼで処理し、まずフェノール-クロロホルムで、次いでクロロホルムで抽出し、エタノールで２度沈澱させ、最後にＴＥ０．１mlで再懸濁させた。２つの単離したＮ-末端エンコード化フラグメント（一方はラベル配列をもち、一方はもたない、２つの部位-特異的突然変異誘発配列を含む、２つの約５００ｂｐＫｐｎｉ-ＣｌａＩ部分）はそれぞれ、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の残部及びｐＩＢＩ２４のベクターを取り囲む約７kbのフラグメントに結合していた。Ｅ．ｃｏｌｉ株２９４を形質転換させるために、リガーゼ反応を用い、アンピシリン耐性誘導体が得られた。再構築されたＤＮＡ内のこの制限部位の存在を確認するために、ＤＮＡを小（１０ml）培地より単離し、ＮｄｅＩで消化した。（明かな）Ｐ．ブルガリスプロモータ及びリボソーム結合部位を除去するために、変性したコンドロイチナーゼＩ遺伝子を約４．５ｋｂのＮｄｅＩ-ＮｓｉＩフラグメントとして単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ部位が最初に充填した（filled-in）ｐＢＲ３２２変異体中にサブクローンし、脱リン酸化し、最後にリン酸化ＮｓｉＩリンンカー（ニュー・イングランド・バイオラブス）を挿入した。ＮｓｉＩ部位（ＡＴＧＣＡＴ）をｐＢＲ３２２中に配置するために用いたリンカーの配列（ＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡ）はまた、ＳｐｈＩ部位（ＧＣＡＴＧＣ）を含む。後に用いる独特の制限部位を導入するため、また、サブクローンしたＮｄｅＩ-ＮｓｉＩフラグメント起源の外部の非-コード化ＤＮＡを平滑断面にするためには、コンドロイチナーゼＩ遺伝子を含む約４５００ｂｐのＮｄｅＩ-ＮｓｉＩセグメントを含有するプラスミド（それぞれがラベル配列を保持する２つのクローン［ＬＰ²８６１及びＬＰ²８６３］及びラベル配列が欠失された２つ［ＬＰ²８６５及びＬＰ²８６７］の例である）を、まずＳｐｈＩで消化し、末端をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの”クレノー（Klenow）”フラグメント（１１）で ”充填し”、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル（１／２X ＴＡＥ中、０．８％）上で分離した。適切なバンド（約５２００bp）を、キアテックス^TM を用いて溶離した後、ウシのアルカリンホスファターゼで処理した。フェノール -クロロホルムによるこの酵素の除去及びクロロホルムの抽出の後、ＤＮＡを２度沈澱させ、最後にＴＥ０．１mlで再懸濁させた。このＤＮＡは、リン酸化ＢａｍＨＩリンカー及びＥ．ｃｏｌｉ株２９４を形質転換するために用いた混合物の存在下で結合した。各４構築起源の６つの代表的なアンピシリン耐性コロニーを、小（１０ml）培地中で培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで試験した、２４クローン起源のＤＮＡの消化は、ＢａｍＨＩ部位を含み、同時にコンドロイチナーゼＩ遺伝子を含む、約３４００ｂｐのＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩフラグメントを放出することを示す。１７のクローン（ラベル配列のあるもの８、ないもの９）が、キアテックス^TM を用いたアガロースゲルから抽出された、望ましいフラグメントを与えた。これらの約３．４ｋｂのＮｄｅＩ-Ｂａｍ-ＨＩコンドロイチナーゼＩ遺伝子- 含有フラグメント（ラベル配列のあるもの、ないものいずれも）を、高レベル発現系を構築するために用いた。用いた発現ベクターｐＥＴ-９Ａ（９；ノバゲン）は、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージＴ７の構成分子から誘導された。これはＣｏｌＥ１プラスミドより誘導される複製の起源、カナマイシン耐性決定基、またＴ７遺伝子１０の転写及び翻訳開始決定基を含む。この遺伝子の自然発生翻訳開始コドンは、ＮｄｅＩ部位の一部である。この領域には、唯一のＢａｍＨＩ部位及びＴ７転写ターミネーターが続く。この発現ベクターの標本を制限酵素ＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩで消化し、ウシの腸のアルカリンホスファターゼで脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。各コンドロイチナーゼＩ遺伝子フラグメント（ラベル配列のあるもの、ないものいずれも）を、発現ベクターフラグメントに結合させた。得られた組み替えＤＮＡ混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ-１２宿主、ＨＭＳ１７４（ノバゲン）を、形質転換するために用いた。得られたカナマイシン耐性コロニーを小スケール（１０ｍｌ）中で培養し、プラスミドＤＮＡを単離し、推測される構造を確認した。これらの構造体の標本を、発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（１０）を形質転換するために用いた。このＥ．ｃｏｌｉＢ株は、ＣｏｌＥ１-適合性プラスミドｐＬｙｓＳと同じく、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体内に集積されるラムダ相上で、ｌａｃ制御下にある（すなわちラクトースもしくはＩＰＴＧのいずれによっても誘発される）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持する。ＣｏｌＥ１- 適合性プラスミドｐＬｙｓＳの複製子はクロラムフェニコールへの耐性をはっきりと示し、“サイレント(Silent)”配向（テトラサイクリン耐性遺伝子に対して反対の方向を読む）にてｐＡＣＹＣ１８４（ＡＴＣＣ３７０３３．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、ＭＤ）のテトラサイクリン耐性決定因子中に挿入されるリゾチーム遺伝子を含む。Ｔ７リゾチームは、この構築中、比較的に低い水準で発現し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（１６）の阻害剤としてを与えられ、それによって遺伝子の基底-水準発現が過剰に発現することを最小限にしているものである。ｐＥＴ９-Ａ中、コンドロイチナーゼＩ遺伝子（ラベル配列が保持され、実施例６（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に記載の、部位-指示された突然変異誘発に属する）を担持しているＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳの誘導体は、ＬＬ２０８４、ＬＬ２０８５、ＬＬ２０８６及びＬＬ２０８７と称される。これらにはコンドロイチナーゼＩ酵素の発現を求める試験は行わない。未変性のコンドロイチナーゼＩ遺伝子（ラベル配列が保持された）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、これは部位を指向した突然変異誘発に属さないものであるが、これを異なる発現宿主に挿入した。コンドロイチナーゼＩ酵素の発現が達成された。実施例６（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）に記載の、ｐＥＴ９-Ａに挿入された、部位を指向した突然変異誘発に属するラベル-欠失コンドロイチナーゼＩ遺伝子を担持するＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳの誘導体の一つを、ＬＬ２０８８と称し、試験し、これを用いて親細胞バンクを確立した。ｐＥＴ９-Ａへの遺伝子の挿入により、ｐＴＭ４９−６と称されるプラスミドを得た。プラスミドｐＴＭ４９−６を担持するＥ．ｃｏｌｉＢ株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳの標本は、沈殿した株ＡＴＣＣ６９２３４を構成する。この沈殿した株の一晩の培養は、カナマイシン４０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌの存在下で、３０℃にて行った。この培養のアリコート０．５mlを用いて、同水準のカナマイシン及びクロラムフェニコールに加えて、トリプトン２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、及びデキストロース１０ｇ／ｌで増補したＭ９塩（１７）を含む栄養豊富な“発現”培地１００mlを接種した。上記培養を適切な密度（Ａ₆₀₀で１の値）にまで行った後、最後の１ｍＭの濃縮液にＩＰＴＧを加えることによってコンドロイチナーゼＩ発現を誘発した。３時間後に、標本を採取し、遠心分離し、分析に先立って、細胞ペレットをドライアイス上で冷凍した。冷凍したペレットをバッファー中に溶解し、再懸濁させて超音波をかけた。５６単位／ｍｌの値が得られ（元来の培地の体積と比較すれば）、これはこの発現系が機能性であることを示している。高い細胞密度での制御条件の下での、続く１０リットルの発酵により、コンドロイチナーゼＩの約６００単位／ｍｌの最大値が得られた。これは、元来の未変性Ｐ．ブルガリスの、発酵を経ての本質的な改善を表し、これまではコンドロイチナーゼＩを、２単位／ｍｌより高いレベルでは発現しなかったものである。実施例８組換え酵素に適合するような天然のコンドロイチナーゼＩ酵素の単離および精製方法天然の酵素を、Ｐ．ブルガリスの培養物を発酵して生成した。細菌細胞を培養液から回収し、バッファーに再懸濁した。次いで、この細胞懸濁液を細菌細胞が溶菌するようにホモジェナイズした。次いで、５０ｐｐｍのバイオアクリル（Bi oacryl）（トーソー・ハース、フィラデルフィア、ＰＡ）等の帯電粒子を、ＤＮＡ、凝集体および砕片を除去するために添加した。次いで、この溶液を４０％飽和硫酸アンモニウムとし、望ましくないタンパク質を沈澱除去した。コンドロイチナーゼＩは、溶液中に残存している。次いで、この溶液を０．２２ミクロンＳＰ２４０フィルター（アミコン(Amico n)、ビバリー(Beverly)、ＭＡ）を用いてろ過し、この残存物を９倍容量の４０％硫酸アンモニウム溶液を用いて洗浄し、前記酵素のほとんどを回収した。このろ過液を濃縮し、３０ｋＤフィルターを用いてリン酸ナトリウムバッファーでディアフィルトレーションして塩類および小さい分子を除去した。コンドロイチナーゼＩを含むろ過液を、セルファイン^TM（Cellufine^TM）セルローススルファートカラム（チッソ社(Chisso Corporation)、アミコン提供）を用いたカチオン交換クロマトグラフィーにかけた。ｐＨ７．２、２０ｍＭリン酸ナトリウムで、９８％以上のコンドロイチナーゼＩがこのカラムに結合した。次いで天然のコンドロイチナーゼＩを、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーにおける０〜２５０ｍＭ塩化ナトリウム勾配を用いてこのカラムから溶出した。溶出された酵素に、アニオン交換および疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー等のさらなるクロマトグラフィー段階を行った。これらの全工程の末に、コンドロイチナーゼＩをＳＤＳ-ＰＡＧＥ調査によるところの９０−９７％の純度で得た（上記参照）。しかしながら、天然のタンパク質の収率は、上述したように、たったの２５−３５％であった。この方法も、約１１０ｋＤのコンドロイチナーゼＩタンパク質を９０ｋＤと１８ｋＤの断片に分割する結果となった。それにも関わらず、これら二つの断片は、非イオン的な結合を有し、コンドロイチナーゼＩ活性を表した。この工程を、コンドロイチナーゼＩをコードする組換えプラスミドを有する溶菌された宿主細胞で繰り返したところ、非常に乏しい結果が得られた。ｐＨ７．２、２０ｍＭリン酸ナトリウムの標準的な厳密条件下で、１０％未満のコンドロイチナーゼＩがカチオン交換カラムに結合した。ｐＨ６．８、５ｍＭリン酸というより厳密性の低い結合条件下では、一群の物質との結合が６０−９０％に改良されることが観察された。しかしながら、ＮａＣｌ勾配を用いた組換えタンパク質の溶出は、鋭いピークより広い活性のピークを与えた（図２参照）。これは、産物が不均一（ヘテロジニアス）であることを示している。さらに、後の発酵群では、組換え酵素は、前記のより厳密性の低い結合条件下でさえも不十分な結合を示した（１−４０％）。不十分に結合した一群は完全に処理されなかったので、全体的な回収量は定量しなかった。実施例９本発明に係る組換えコンドロイチナーゼＩの単離および精製のための第一の方法第一段階として、組換えコンドロイチナーゼＩ酵素を発現する宿主細胞をホモジェナイズして細胞を溶菌した。これにより酵素が上清中に放出される。本発明の一つの態様では、この上清を塩類および他の小さい分子を除去するためにダイアフィルトレーションする。適切なフィルターの例としては、アミコン（ビバリー、ＭＡ）社製の螺旋状の傷を備えた３０ｋＤのフィルターがある。しかしながら、この段階では、負に帯電した分子の結合形態ではなく遊離形態のものを除去するだけである。これらの帯電した種の結合形態のものは、この上清を強力で高い容量のアニオン交換樹脂含有カラムを通すことによって除かれる。このような樹脂の例には、マクロプレップ^TMハイＱ樹脂（バイオ−ラド、メルビル、Ｎ．Ｙ．）がある。他の強力で高い容量のアニオン交換樹脂含有カラムも適している。負に帯電した分子はこのカラムに結合するが、前記酵素はこのカラムを通過する。また、無関係の、所望でないタンパク質もこのカラムに結合してしまうことがわかった。次いで、アニオン交換カラムからの溶出物を、カチオン交換樹脂含有カラムに直接添加した。このような樹脂の例は、Ｓ-セファロース^TM（ファーマシア、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）およびマクロプレップ^TMハイＳ（バイオ−ラド）がある。これら二つの樹脂含有カラムは、それぞれカチオンの交換を促進するための結合したＳＯ₃−リガンドを有する。他のカチオン交換カラムも適切である。この酵素をカラムに結合させ、カラムから酵素を遊離することができる溶液で溶出した。溶液の導電性を増加するあらゆる塩が、溶出に適切である。このような塩類の例としては、ナトリウム塩類、カリウム塩類およびアンモニウム塩類が含まれる。適切な濃度の塩化ナトリウム水溶液が適切である。０〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム等の勾配、２００ｍＭの塩化ナトリウムを用いた一段階の溶出が好ましい。鋭いピークが、塩化ナトリウム勾配溶出でみられた（図３）。従来の方法を越えた酵素収量の改善が得られた。組換えコンドロイチナーゼＩ酵素を、９９％の純度、８０−９０％の収率で回収した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルでバンドを調べて測定した。アクリルアミドの４−２０％勾配をゲルの改良に使用した。このゲルの各レーンのバンドを、上述の方法を用いて調べた。これらの改善は、アニオン交換カラムを最初に用いた結果として起こる、カチオン交換カラムへの酵素の結合を増大させることに直接的に関わるものである。比較実験では、カチオン交換カラムのみを用いた場合、たったの１％の酵素がカラムに結合した。しかしながら、アニオン交換カラムを最初に用いた場合には、９５％以上の酵素がカラムに結合した。実施例１０本発明に係る組換えコンドロイチナーゼＩの単離および精製のための第二の方法本発明のこの態様の第二の実施態様では、さらに二つの段階を、第一の実施態様のダイアフィルトレーション段階の前に挿入する。この上清を１Ｍ酢酸等の酸性溶液で処理し、上清を最終的にｐＨ４．５にして、所望の酵素を沈降させる。この沈降物を５０００ｘｇ、２０分で遠心して得る。この沈降物を２０−３０ｍＭのＮａＯＨ等のアルカリ溶液に溶解し、最終的にｐＨ９．８にした。次いでこの溶液にダイアフィルトレーションおよび本発明の第一の実施態様の次なる工程を行った。本発明の第二の実施態様に係る比較実験では、カチオン交換カラムのみを用いた場合に、たった５％の酵素がカラムに結合しただけだった。しかしながら、アニオン交換カラムを最初に用いた場合には、本質的に１００％の酵素がカラムに結合した。第二の実施態様は、本発明の第一の実施態様に匹敵する酵素純度および収量を与えた。酸沈降は、溶けたままのタンパク質を除去することができる；しかしながら、これらのタンパク質は、いずれにしろ次のカチオンおよびアニオン交換段階によって除去される（しかしながら、より小さいカラムを使用する）。酸沈降段階の利点は、試料容積を溶解後の元の容積の約２０％に減少し、これによって大規模でより簡単に扱うことができることである。しかしながら、第二実施態様の付加的な酸沈降およびアルカリ溶解の段階は、第二実施態様が第一実施態様よりも浪費的であることを意味する。製造規模では、第二実施態様で得られた純度および収率の可能な改善は、さらに高純度の酵素を高い収率で与える、第一の実施態様のより簡単な方法によって与えられる。本発明の二つの実施態様によって得られた高純度の組換え酵素は、図４に示されている。単一の鋭いバンドがＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルの写真に見られる：レーン１は、第一の実施態様の方法を用いた酵素；レーン２は、第二の実施態様の方法を用いた酵素；レーン３は、精製前の宿主細胞からの上清を示す−−多くの他のタンパク質が存在する；およびレーン４は、分子量の標準（スタンダード）を示す。実施例１１コンドロイチナーゼＩＩのＮ末端をコードする断片の部位特異的突然変異誘発コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子の場合にとられた試みは、天然のＡＴＧ開始コドンをＮｄｅＩ部位に埋め込むような修飾を行うことである。これにより、Ｎ末端にロイシン残基を有する完全な天然の酵素構造を産出するように、発現された遺伝子が処理および分泌されるような、シグナルペプチドが保持された構成物が得られる。突然変異した塩基は、コード領域の上流である。この部位特異的変異に用いた方法は、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の発現用に上述した方法であって、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ^TMインビトロ変異誘発キットバージョン２（バイオ−ラド、メルビル、Ｎ．Ｙ．）を用いたカンネル(Kunkel)（１５）の研究に基づいている。この方法では、突然変異誘発される標的ＤＮＡを、最初に適切なＭ１３−誘導ベクターにクローン化して一本鎖ＤＮＡを作製する。この組換えファージを、Ｅ．Ｃｏｌｉ宿主株ＣＪ２３６（バイオ−ラド）のｄｕｔおよびｕｎｇ対立遺伝子を有する雄株に複製する。これら二つの突然変異、ｄｕｔ（ｄｕＴＰアーゼ）とｕｎｇ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ）の組み合わせは、この生物体で合成されたＤＮＡにチミン残基よりもウラシル残基を取り込む。一本鎖の鋳型は、ＣＪ２３６における増殖後に単離され、適切な突然変異誘発性の合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）をこのＤＮＡにアニールした。このオリゴヌクレオチドは、完全な組換え分子をコピーするＴ７ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして働く。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、変異原性オリゴヌクレオチドの第一残基とインビトロで添加された最後の残基との間の切れ目を塞ぐために用いた。このため、鋳型のＤＮＡ（天然の配列を有する）はウラシルを含むが、新しく合成されたＤＮＡ（所望の塩基変化を含む）はウラシルを含まない。非変異型の形質転換体（ｕｎｇとｄｕｔ対立遺伝子に関する）雄株Ｅ．Ｃｏｌｉは、ウラシル含有鋳型鎖の不活性化の結果としてインビトロで合成された突然変異鎖から主に誘導されたファージの子孫を生じた。この特別な場合では、突然変異誘発用にクローン化される断片は、ヌクレオチド２９４３〜３９８０の間の領域にわたるＭｕｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片である（ＳＥＱＩＤＮＯ１および３９）。この断片を得るために切断されたＤＮＡは、ＬＰ²７８３と称する。このプラスミドは、ＥｃｏＲＩリンカーよりむしろＨｉｎｄIIIリンカーがＬＰ²７７６のＥｃｏＲＶ欠失部に挿入されること以外は、ＬＰ² ７８６（実施例４に記載）と同じ方法で構成される。正常なポリリンカーをプラスミドベクターｐＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）に見られるもので置換したＭ１３ｍｐ１９誘導体、ＬＰ²９４１の唯一のＥｃｏＲＩ部位に前記ＭｕｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片を連結する。ＭｕｎＩ切断によって産生された４塩基の張り出し部は、ＥｃｏＲＩ部位に連結され得るが、得られた組換え配列は他の酵素で切断されない。ＥｃｏＲＩ切断したＬＰ²９４１も、ゲル精製および使用の前に子ウシ腸のアルカリホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）で脱リン酸化した。連結されたＤＮＡ混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ雄株のＭＶ１１９０を感染するために用いて、得られたプラークを０．５ｍｌのＳＭバッファーに採取し、拡散してファージを溶出させた。これらを１０ｍｌのＭＶ１１９０の培養液を感染するのに用いて一晩生育させた。この培養液を遠心し、この沈降物を組換えウイルスの二本鎖複製形態の単離に用いた。対応するファージ粒子を含む上清を、必要時まで冷蔵して保存した。ポリリンカー内に一方の部位が、また先のＭｕｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片内に対称的（aymmetrically）に位置した部位（ＳＥＱＩＤＮＯ：１および３９、ヌクレオチド３３２６−３３３１）に第二の部位があるため、クローン化された断片の配向は、ＨｉｎｄIIIで複製形態のＤＮＡを切断することにより決定された。所望の配向が同定されたら、対応するファージを含む上清を、連続的に希釈し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＪ２３６の感染に使用し、上述のように採取および溶出された単一のプラークを得るためにプレートした。これらの一つをＣＪ２３６の感染に使用し、別の１０ｍｌの培養物を生育し、一本鎖ＤＮＡをファージを含む上清からキアテックス^TMカラムおよび製造者がすすめる物質および方法（キアゲン、チャットワース、ＣＡ）を用いて単離し、最後に０．０１ｍｌの体積に再懸濁した。実際の部位特異的突然変異誘発の前の鋳型および鎖におけるウラシル残基の蓄積を最大にするために組換えファージをＣＪ２３６（ｄｕｔ^-ｕｎｇ^-）で二回生育した。用いられた変異誘発オリゴヌクレオチドは、バイオ−シンセシス(Bio-synthes is)（デントン(Denton)、TX）から得られたもので、以下の配列を有する：この配列は、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のリーダー配列と考えられる出発点において、所望のＮｄｅＩ配列（ＣＡＴＡＴＧ）を形成するＣＡ配列によってＡＴ配列（塩基対３２３５および３２３６）が置換されていることでＳＥＱＩＤＮＯ：１および３９の対応する領域とは異なる。１ＯＤユニット（光学密度単位）のこのオリゴヌクレオチドを０．４６ｍｌのＴＥ７．４（０．０１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．８−０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶かし、約６ｐｍｏｌ／μｌのオリゴヌクレオチド濃度を得た。３００ピコモルのこのオリゴヌクレオチドを、０．０５ＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．０１ＭのＭｇＣｌ₂、０．０２Ｍのジチオトレイトール、０．００１ＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび１００ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス）を含む０．１ｍｌの反応溶液で、３７ ℃で、３０分間リン酸化し、酵素を不活性化するために７５℃で２０分間インキュベートした。次いで、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを、約３ｐｍｏｌ／ μｌの濃度で−２０℃に冷凍保存した。部位特異的突然変異誘発のために、１０μｌ体積の０．０２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．００２ＭＭｇＣｌ₂、０．０５ＭＮａＣｌ中で、１μｌ（３ｐｍｏｌ）の変異誘発オリゴヌクレオチドを先に調製した６μｌの一本鎖ＤＮＡと混合した。このオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡサーマル・サイクラー(Thermal CyclerTM)（パーキン-エルマー(Perkin-Elmer) セタス／ノルウォーク(Cetus/No rwalk)、CT）で、最初に試料を７０℃で５分間インキュベートし、次いでこの試料を２５℃で４５分間以上冷却することによって前記オリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールした。２０℃まで冷却する前にこの試料をさらに５分間２５℃に保ち、最後にアイスバスに移した。次いで、１μｌの１０Ｘ合成バッファー（バイオ−ラド；０．００５Ｍの各種ｄＮＴＰ、０．０１ＭのＡＴＰ、０．１ＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０５ＭのＭｇＣｌ₂、０．０２ＭのＤＴＴを含む）を添加した後にアニールされたプライマーを伸長した。１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（３ユニット／μｌＢｉｏ−Ｒａｄ）および１μｌのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（０．５ユニット／μｌバイオ−ラド）。インビトロでのＤＮＡ合成を、５分間氷上で、１０分間１１ ℃で、および氷上に移す前に３０分間３７℃で行った。この試料を、雄株のＥ．ｃｏｌｉ宿主ＭＶ１１９０（ｄｕｔ⁺ｕｎｇ⁺）に直接形質転換するのに使用して、部位特異的突然変異誘発ファージを含む得られたプラークを得て、上記のように採取および溶出した。これらのファージ貯蔵物の分注物をＭＶ１１９０の１０ｍｌの培養物を感染するために使用し、一晩生育させた。培養液を遠心し、組換えファージの複製型をキアテックス^TMカラムおよび製造者が推奨する方法（キアゲン、タットワース、CA）を用いて単離した。単離されたＤＮＡを０．１ｍｌのＴＥ７．４に再懸濁した。これらのＤＮＡ試料のそれぞれの一部をＮｄｅＩで最初に切断すると、少なくとも４つが新規のＮｄｅＩ部位を獲得したらしいことがわかり、部位特異的突然変異誘発が成功したことが示された。その結果、これら４つのクローンのより大量の試料（それぞれ０．０４ｍｌ）をＮｄｅＩおよびＥ．ｃｏｌｉで切断し、トリス−酢酸−ＥＤＴＡバッファー中で行った１．４％アガロースゲルで分画した。所望の約７４０塩基対断片がそれぞれの場合で観察され、このバンドを各パターンから切りだした。次いで、四つの試料を連結し、キアテックス^TM樹脂および製造者の推薦するバッファーを用いて（キアゲン、チャットワース、CA）ゲルから抽出し、０．０５ｍｌのＴＥ、ｐＨ７．４に再懸濁した。コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のクローン化されたＰ．ブルガリス遺伝子の単離された部位特異的突然変異誘発Ｎ末端コーディング領域を、プラスミドｐＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、MA）の（脱リン酸化された）唯一のＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位間にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株２９４の形質転換後、ここの形質転換体から誘導された１０ｍｌの培養液を生育し、上述のように組換えプラスミドＤＮＡを単離した。陽性のクローンの一つのＤＮＡ試料を、ｍ＃１５−５７１２と称した。この試料は、実施例１２に記載するコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＣ末端コード領域に連結される修飾されたＮ末端領域を示す。実施例１２コンドロイチナーゼＩＩのＣ末端領域をコードする断片の単離、特徴決定およびＤＮＡ配列分析ＳＥＱＩＤＮＯ：３９に含まれるＤＮＡ配列は、コンドロイチナーゼＩＩがコンドロイチナーゼＩに対する領域の下流の領域にコードされていることを示した。この情報は、ＬＰ²７５１と称されるコスミドクローンから独創的にサブクローニングされたＰ．ブルガリスの１０キロベースのＮｓｉＩ断片の一部から得られた。ＤＮＡ配列決定と図１の制限地図とを組み合わせることにより、コンドロイチナーゼＩＩコード領域は、Ｐ．ブルガリス誘導ＤＮＡ内のＥｃｏＲＩ部位の“左”から始まって、図１に示された断片の“右”端のＮｓｉＩ部位へと続くことが示された。それゆえ、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＣ末端コード配列を含む適切な断片を見つけるには“右”に伸ばすべきである。ＬＰ²７５１の切断が、約２０ｋｂ、１３ｋｂ、および１０ｋｂの三つのＥｃｏＲＩ断片を示し、ＬＰ²７５１内に三つのＥｃｏＲＩ部位があることを示した。クローニング部位を囲む二つのＥｃｏＲＩ部位があるため、結果として、このクローンのクローン化されたＰ．ブルガリスＤＮＡ内に一つのＥｃｏＲＩ部位が存在する。さらに、約１３ｋｂの断片は、それ自身コスミドベクターのサイズに適合することから、この唯一のＥｃｏＲＩ部位は、上記の約２０ｋｂと約１０ｋｂの断片間に存在する。コンドロイチナーゼＩの完全なコード領域およびコンドロイチナーゼＩＩのＮ末端コード領域が、両方とも約１０ｋｂのＮｓｉＩ断片に含まれることがわかっていることから、クローン化された１０ｋｂのＮｓｉＩ（ＬＰ² ７７０と称される組換えプラスミドに存在する）と上記の約２０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片および約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片のゲル精製試料との間で得られたパターンを比較する制限切断により、これらのＥｃｏＲＩ断片のどちらがコンドロイチナーゼＩをコードする配列を含むか、またこれから推量して、どちらがコンドロイチナーゼＩＩのＣ末端コード配列を有するかが示唆された。従って、ＬＰ² ７５１と称される元のコスミドクローンを切断して８〜１０の断片を与えることが出願人によってわかっている制限酵素、ＡｆｌIII、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、およびＨｉｎｄIIIを用いて切断した。サブクローニングされた約１０ｋｂのＮｓｉＩ断片（ＬＰ²７７０）と、個々にゲル精製された約２０ｋｂのＥｃｏＲＩおよび約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有する組換え分子を上記の各酵素で切断し、比較する断片のパターンを得た。この切断から、約２０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片とＬＰ²７７０のパターンが、共通に多数の断片を有することを示した。このことから、コンドロイチナーゼＩ遺伝子およびコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＮ末端コード領域が大きい方のＥｃｏＲＩ断片に含まれ、従ってコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＣ末端コード領域が約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に存在することが示された。約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｌａｃｐｏ△ ｐＮＥＢ１９３と称されるｐＮＥＢ１９３の誘導体（ニュー・イングランド・バイオラブス、ベバリー、ＭＡ）の唯一のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。このベクターは、親の分子のｐＮＥＢ１９３と比較して二つの欠失部を有する。第一の欠失は、唯一のＮｄｅＩとＥｃｏＲＩとの間の配列を除去し、ＥｃｏＲＩ部位は保持するが、ＮｄｅＩ部位（および二つのＰｖｕＩＩ部位の一方）を除去したものである。第二の欠失は、ポリリンカーの他端におけるＨｉｎｄIII部位と（今や唯一の）ＰｖｕＩＩ部位との間の領域を除去し、ＨｉｎｄIII部位を維持するが、ＰｖｕＩＩ部位を除去するものである。ベクターｌａｃｐｏ△ ｐＮＥＢ１９３にサブクローニングされた約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有する組換えＤＮＡ分子をＬＰ²１２６３と称する。ＬＰ²１２６３内の１１２ｋＤのＣ末端コード領域の配向を制限酵素地図で決定した。結果は、この領域がＥｃｏＲＩ部位（“左”端に定義された）からポリリンカーの他端のＨｉｎｄIII部位に進むように配置されていることを示した。同様に、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｃＩおよびＮｄｅＩの唯一の制限部位が、約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の“左”端から約２．６、４．６、５．８および８．５ｋｂに見られた。このためＳｍａＩを用いたＬＰ²１２６３の切断は、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子の欠けている領域をコードするのに十分な約２．６ｋｂを残して、クローン化されたＰ．ブルガリスのＤＮＡ内の部位からポリリンカー領域内の第二の部位までの約７．４ｋｂの下流領域を削除した。また、この構成物は、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のコード領域の下流のＢａｍＨＩ部位（ポリリンカーに存在）も“配置”する。ＥｃｏＲＩ部位からこの遺伝子の終止コドンまで（または、おそらくはわずかに越えたところ）のコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子を有するこの組換えＤＮＡ分子を、ｍ＃２５−５７１２と称する。ＤＮＡ配列分析を、ＬＰ²１２６３から誘導された約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片で行い、コンドロイチナーゼＩＩの完全な遺伝子を組み立てた後に完了した。この断片のＤＮＡ配列決定用の物質および方法は、コンドロイチナーゼＩの遺伝子を含む約４ｋｂの断片に対して使用したのと本質的に同じものであった。ＤＮＡを自己連結し、次いで超音波処理および制限酵素Ｓａｕ３ＡまたはＭｓｅＩを用いた部分切断により重合ＤＮＡを断片化することによって、この約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片からランダムな断片を誘導した。これらの断片を最後にＭ１３誘導ベクターにクローン化し、一本鎖組換え分子を上記の標準的なプロトコールに従って配列決定した。最後に、二セットの配列データを用いて、ＥｃｏＲＩで切断されて得られた約２０ｋｂと約１０ｋｂの二つのＰ．ブルガリス断片の間の接合点であるＥｃｏＲＩ部位を含むことが予想される約３００塩基対のＢｃｌＩ断片が同定された。この小さい断片を、以下に記載する構成に使用される前記接合点を通るヌクレオチド配列を確かめるために両方向で配列決定した。実施例１３コンドロイチナーゼＩＩの完全な部位特異的突然変異誘発された遺伝子の組み立てＤＮＡ配列決定中に、ｍ＃２５−５７１２と称される分子をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断した。これにより、約２．６ｋｂのＤＮＡ断片が放出された。同様に、ｍ＃１５−５７１２と称される構成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いで脱リン酸化してゲル電気泳動によって精製した。それゆえ、後の分子は、ＡＴＧ開始コドン（今や部位特異的突然変異誘発物からのＮｄｅＩ部位の一部として存在する）からＥｃｏＲＩ部位までのコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のＮ末端コード領域を有する。これらの二つの断片を連結し、この混合物をＥ．ｃｏｌｉ株２９４を形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、陽性のクローンを同定した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた制限切断により、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９、ＢａｍＨＩ部位を含むポリリンカーから誘導された１４ヌクレオチドが連結された、ヌクレオチド３２３５−６５１８）をコードする所望の断片が得られた。次いで、この断片を、コンドロイチナーゼＩ遺伝子の発現で記載した発現ベクターｐＥＴ９Ａ（ノバゲン、マディソン、ＷＩ）に連結した。コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子のコード領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９のヌクレオチド３２３８−６２７６を含み、これは１０１３アミノ酸（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）をコードする。この領域のヌクレオチド３２３８−３３０６は２３アミノ酸のシグナルペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸１−２３）をコードするが、ヌクレオチド３３０７−６２７６は完全な９９０アミノ酸のコンドロイチナーゼＩＩタンパク質（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０、アミノ酸２４−１０１３）をコードする。両方のコンドロイチナーゼ遺伝子にわたる領域およびこれらの横に位置する配列の４つの酵素を用いた制限分析は、以下の制限部位を示した。さらに、Ｓａｕ３ＡＩを用いた制限分析は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９におけるものを含む部位、すなわちヌクレオチド２１２、６０２、８９０、１０４２、１１８１、１２４１、１４４２、１５０５、１７４６、２３３０、２３６３、２７０１、２７０５、２９２０、３６９７、３７０８、３７４５、３８６８、４０８７、４８００、４８７２、５５６５、５６３５、５８６０、６０５８および６４６７の多重性（multiplicity）を示した。この実験で得られた組換え分子の一つ（ｐＥＴ９Ａに挿入されたコンドロイチナーゼＩＩ遺伝子）を大規模（０．５リットル）で生育し、コンドロイチナーゼＩＩ遺伝子を含む発現システムを単離し、ＬＰ²１３５９と称した。このＤＮＡの画分をコンドロイチナーゼＩ遺伝子の発現で記載した発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを形質転換するために使用した。得られた株をＴＤ１１２と称し、大規模発酵およびコンドロイチナーゼＩＩ酵素の単離に使用した。コンドロイチナーゼＩＩタンパク質を発現するプラスミドを有するこのＥ．ｃｏｌｉ株で行った１０リットル規模の発酵により、約０．３ｍｇ／ｍｌという最大のコンドロイチナーゼＩＩ力価が得られ、これは天然のＰ．ブルガリスのコンドロイチナーゼＩＩ発酵工程で得られる約０．０１２ｍｇ／ｍｌの約２５倍であった。実施例１４本発明に係る組換えコンドロイチナーゼＩＩの単離および精製のための第一の方法この方法の開始部分は、組換えコンドロイチナーゼＩ酵素に用いられたものと同様である。第一段階として、組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素を発現する宿主細胞をホモジェナイズして細胞を溶菌した。これにより酵素が上清中に放出された。本発明の一つの態様では、この上清を塩類および他の小さい分子を除去するためにダイアフィルトレーションする。適切なフィルターの例としては、アミコン（ベバリー、ＭＡ）社製の螺旋状の傷を備えた３０ｋＤのフィルターがある。しかしながら、この段階では、負に帯電した分子の結合形態ではなく遊離形態のものを除去するだけである。これらの帯電した種の結合形態のものは、この上清（図５のレーン１に示されたＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル参照）を強力で高い容量のアニオン交換樹脂含有カラムを通すことによって除かれる。このような樹脂の例には、マクロプレップ^TMハイＱ樹脂（バイオ−ラド、メルビル、N.Y.）がある。他の強力で高い容量のアニオン交換樹脂含有カラムも適している。負に帯電した分子はこのカラムに結合するが、前記酵素は、このカラムを通過し、この酵素を約９０％回収した。また、無関係の、所望でないタンパク質もこのカラムに結合することがわかった。次いで、アニオン交換カラムからの溶出物（図５、レーン２）を、カチオン交換樹脂含有カラムに直接添加した。このような樹脂の例は、Ｓ-セファロース^TM （ファーマシア、ピスカタウェイ、N.J.）およびマクロプレップ^TMハイＳ（バイオ−ラド）がある。これら二つの樹脂含有カラムは、それぞれカチオンの交換を促進するために結合したＳＯ₃ ^-リガンドを有する。他のカチオン交換カラムも適切である。この酵素はカラムに結合するが、混入タンパク質のかなりの部分が結合しないで溶出した。ここで、この方法は、コンドロイチナーゼＩタンパク質に用いた方法から分岐する。カチオン交換カラムから酵素を放出することができる非特異的な塩溶液でタンパク質を溶出する代わりに、コンドロイチン硫酸を含む溶液を用いた特異的な溶出を行う。１％濃度のコンドロイチン硫酸を使用したが、この溶液の勾配も好ましい。組換えコンドロイチナーゼＩＩタンパク質は、組換えコンドロイチナーゼＩタンパク質より約数倍低いレベルで発現するため、特異的なコンドロイチン硫酸溶液が、非特異的な塩溶液より好ましい；それゆえ、コンドロイチナーゼＩタンパク質で得られた純度と同じ純度の最終コンドロイチナーゼＩＩ生成物を得るには、より強力かつ選択的な溶液が必要である。次いで、結合していないタンパク質を溶出するために、カチオン交換カラムをｐＨ７．０のリン酸バッファーで洗浄し、ゆるく結合した混入タンパク質を溶出するため、および基質すなわちコンドロイチン硫酸を用いたコンドロイチナーゼＩＩタンパク質の最適な溶出に必要とされるｐＨまで樹脂のｐＨを上げるために、ｐＨ８．５のホウ酸塩バッファーで洗浄する。次いで、ｐＨ９．０に調節された１％のコンドロイチン硫酸水溶液を、鋭いピーク（６５％を回収）および約９５％という高純度（図５、レーン３）でコンドロイチナーゼＩＩタンパク質を溶出するために使用した。しかしながら、コンドロイチン硫酸はコンドロイチナーゼＩＩタンパク質に親和性を有しており、これはカラムの樹脂に対する親和性より強力であるため、コンドロイチン硫酸は前記タンパク質と共に溶出してしまう。これは、コンドロイチン硫酸を認識するタンパク質のみが溶出することを確証するもので望ましいことであるが、コンドロイチナーゼＩＩタンパク質からコンドロイチン硫酸を分離するためにさらなる段階が必要であることをも意味する。この分離段階では、溶出液をｐＨ７．０に調節し、マクロプレップ^TMハイＱ樹脂等のアニオン交換樹脂含有カラムに添加した。このカラムをｐＨ６．８の２０ｍＭのリン酸バッファーで洗浄した。コンドロイチン=スルファートはカラムに結合するが、コンドロイチナーゼＩＩタンパク質は、９５％以上の回収率で非結合プールへと流出した。ここで、このタンパク質は、約３７ｋＤの単一の微量混入物がある以外は純粋であった（図５、レーン４および６）。この混入物は、コンドロイチナーゼＩＩタンパク質の崩壊産物のようである。この混入物は、結晶化（crytallization）段階で効果的に除去された。アニオン交換カラムからのこの溶出液を１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質となるように、３０ｋＤのカットオフ（cutoff）を備えたアミコン攪拌細胞を用いて濃縮した。この溶液を数日間４℃で保存し、純粋なコンドロイチナーゼＩＩタンパク質を結晶化した。この上清は、３７ｋＤの混入物を含有する（図５、レーン７）。遠心により結晶を沈降させ、３７ｋＤの混入物を有する上清をピペッティングにより除き、結晶を水で二度洗浄した。最初の洗浄後、ある程度の混入物が残ったが（図５、レーン８）、二回目の洗浄後にはコンドロイチナーゼＩＩタンパク質のみが観察された（図５、レーン９）。洗浄した結晶は、水に再度溶解され、ＳＤＳ- ＰＡＧＥで単一のタンパク質のバンドを表し、９９％以上の純度を備えていた（図５、レーン１０）。実施例１５本発明に係る組換えコンドロイチナーゼＩＩの単離および精製のための第二の方法本発明のこの態様の第二の実施態様では、さらに二つの段階を、コンドロイチナーゼＩＩ酵素の精製方法における第一の実施態様のダイアフィルトレーション段階の前に挿入する。この上清を１Ｍ酢酸等の酸性溶液で処理し、上清を最終ｐＨ４．５にして、所望の酵素を沈降させる。この沈降物を５０００ｘｇ、２０分で遠心して得る。この沈降物を２０−３０ｍＭのＮａＯＨ等のアルカリ溶液に溶解し、最終ｐＨ９．８にした。次いでこの溶液にダイアフィルトレーションおよび本発明におけるこの態様の第一の実施態様の次なる工程を行った。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月３０日【補正内容】請求の範囲１．コンドロイチナーゼＩ酵素をエンコードする配列からなるプロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）の精製し単離したＤＮＡフラグメント。２．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。３．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１１９−３１８１の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１１９−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項２記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。４．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の２５−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。５．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１９１−３１８１の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１９１−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項４記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。６．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：５の２４−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。７．前記フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の１８８−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項６記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。８．コンドロイチナーゼＩＩ酵素をエンコードする配列からなるプロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）の精製し単離したＤＮＡフラグメント。９．フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の１−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、あるいは（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の２４−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。１０．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３２３８−６２７６の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３３０７−６２７６の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項９記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。１１．（ａ）請求項１または（ｂ）請求項８の配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントを含むプラスミド。１２．前記プラスミドが、ｐＴＭ４９−６と称するもの、またはＬＰ²１３５９と称するものである請求項１１記載のプラスミド。１３．請求項１１のプラスミドで形質転換された宿主細胞。１４．前記プラスミドが、ｐＴＭ４９−６と称するもの（ＡＴＣＣ６９２３４）、またはＬＰ²１３５９と称するもの（ＡＴＣＣ６９５９８）である請求項１３記載の宿主細胞。１５．精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩ酵素。１６．アミノ酸配列が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の２５−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、または、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５の２４−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物で表される請求項１５記載のコンドロイチナーゼＩ酵素。１７．精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素。１８．アミノ酸配列が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の１−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、または、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の２４−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物で表される請求項１７記載のコンドロイチナーゼＩ酵素。１９．宿主細胞を請求項１１（ａ）のプラスミドで形質転換し、その宿主細胞によって前記酵素を発現させる条件下で宿主細胞を培養することからなるコンドロイチナーゼＩ酵素の製造方法。２０．宿主細胞を請求項１１（ｂ）のプラスミドで形質転換し、その宿主細胞によって前記酵素を発現させる条件下で宿主細胞を培養することからなるコンドロイチナーゼＩＩ酵素の製造方法。２１．（ａ）宿主細胞をホモジェナイズすることによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーションを施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、（ｅ）酵素をカラムから放出させることのできる溶媒で、カチオン交換カラムに結合した酵素を溶離させる工程からなる宿主細胞からのプロテウス・ブルガリスの組換えコンドロイチナーゼＩ酵素の精製及び単離方法。２２．前記工程（ｂ）に先立って、（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく工程を行う請求項２１記載の方法。２３．請求項２１の方法または請求項２２の方法で精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩ酵素。２４．（ａ）宿主細胞をホモジェナイズすることによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーションを施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、（ｅ）硫酸コンドロイチン溶液を用いた親和性溶離により、カチオン交換カラムに結合した酵素を、その酵素が硫酸コンドロイチンとともに溶離するようにし、（ｆ）工程（ｅ）からの溶離液を、アニオン交換樹脂−含有カラムに入れて、硫酸コンドロイチンがカラムに結合するように、溶媒で酵素を溶離し、（ｇ）工程（ｆ）からの溶離液を濃縮し、約３７ｋＤのコンタミナントを含む上澄み液から酵素を結晶化させる工程からなる宿主細胞からのプロテウス・ブルガリスの組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素の精製及び単離方法。２５．前記工程（ｂ）に先立って、（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく工程を行う請求項２４記載の方法。２６．請求項２４の方法または請求項２５の方法で精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ティレイ，ブルースクリフォードアメリカ合衆国ペンシルヴァニア 18326 クレスコボックス 27 アールアール２ (72)発明者ロトヴィン，ジェイソンアーノルドアメリカ合衆国ニュージャージー 07083 ユニオンルーズヴェルトアヴェニュー 985

Claims

【特許請求の範囲】１．コンドロイチナーゼＩ酵素をエンコードする配列からなるプロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）の精製し単離したＤＮＡフラグメント。２．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされた配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。３．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１１９−３１８１の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１１９−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項２記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。４．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の２５−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされた配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。５．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１の１９１−３１８１の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の１９１−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項４記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。６．フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：５の２４−１０２１の番号のアミノ酸配列またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされた配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。７．前記フラグメントが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の１８８−３１８１の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項６記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。８．コンドロイチナーゼＩＩ酵素をエンコードする配列からなるプロテウス・ブルガリス（Ｐ．ブルガリス）の精製し単離したＤＮＡフラグメント。９．フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の１−１０１３の番号のアミノ酸、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の２４−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物をエンコードする核酸配列でハイブリダイズされた配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメント。１０．前記フラグメントが、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３２３８−６２７６の番号のヌクレオチド、または（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３９の３３０７−６２７６の番号のヌクレオチドの配列を持つ請求項９記載の精製し単離したＤＮＡフラグメント。１１．（ａ）請求項１または（ｂ）請求項（８）の配列からなるＰ．ブルガリスの精製し単離したＤＮＡフラグメントを含むプラスミド。１２．前記プラスミドが、ｐＴＭ４９−６と称するもの、またはＬＰ²１３５９と称するものである請求項１１記載のプラスミド。１３．請求項１１のプラスミドで形質転換された宿主細胞。１４．前記プラスミドが、ｐＴＭ４９−６と称するもの（ＡＴＣＣ６９２３４）、またはＬＰ²１３５９と称するもの（ＡＴＣＣ６９５９８）である請求項１３記載の宿主細胞。１５．精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩ酵素。１６．アミノ酸配列が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の１−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の２５−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、または、（ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５の２４−１０２１の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物で表される請求項１５記載のコンドロイチナーゼＩ酵素。１７．精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素。１８．アミノ酸配列が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の１−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物、または、（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の２４−１０１３の番号のアミノ酸またはその生物学的等価物で表される請求項１７記載のコンドロイチナーゼＩ酵素。１９．宿主細胞を請求項１１（ａ）のプラスミドで形質転換し、その宿主細胞によって前記酵素を発現させる条件下で宿主細胞を培養することからなるコンドロイチナーゼＩ酵素の製造方法。２０．宿主細胞を請求項１１（ｂ）のプラスミドで形質転換し、その宿主細胞によって前記酵素を発現させる条件下で宿主細胞を培養することからなるコンドロイチナーゼＩＩ酵素の製造方法。２１．（ａ）宿主細胞をホモジェナイズすることによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーションを施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、（ｅ）酵素をカラムから放出させることのできる溶媒で、カチオン交換カラムに結合した酵素を溶離させる工程からなる宿主細胞からのプロテウス・ブルガリスの組換えコンドロイチナーゼＩ酵素の精製及び単離方法。２２．前記工程（ｂ）に先立って、（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく工程を行う請求項２１記載の方法。２３．請求項２１の方法または請求項２２の方法で精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩ酵素。２４．（ａ）宿主細胞をホモジェナイズすることによって溶解させ、酵素を上澄み液中に放出し、（ｂ）上澄み液にダイアフィルトレーションを施して塩及び他の小さな分子を取り除き、（ｃ）上澄み液をアニオン交換樹脂−含有カラムに通し、（ｄ）工程（ｃ）からの溶離液を、カチオン交換樹脂−含有カラムに入れて、溶離液中の酵素をカチオン交換カラムに結合させ、（ｅ）硫酸コンドロイチン溶液を用いた親和性溶離により、カチオン交換カラムに結合した酵素を、その酵素が硫酸コンドロイチンとともに溶離するようにし、（ｆ）工程（ｅ）からの溶離液を、アニオン交換樹脂−含有カラムに入れて、硫酸コンドロイチンがカラムに結合するように、溶媒で酵素を溶離し、（ｇ）工程（ｆ）からの溶離液を濃縮し、約３７ｋＤのコンタミナントを含む上澄み液から酵素を結晶化させる工程からなる宿主細胞からのプロテウス・ブルガリスの組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素の精製及び単離方法。２５．前記工程（ｂ）に先立って、（１）上澄み液を酸溶液で処理し、酵素を析出させ、（２）ペレットを回収した後、それをアルカリ溶液に溶解させて、酵素をアルカリ性環境におく工程を行う請求項２４記載の方法。２６．請求項２４の方法または請求項２５の方法で精製し単離した組換えコンドロイチナーゼＩＩ酵素。