JP2008505661A - コンドロイチン分解酵素とその安定な製剤の精製法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コンドロイチン分解酵素を精製する方法は、前記酵素を細胞から抽出する工程と、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて前記粗細胞抽出物から前記コンドロイチン分解酵素を分離する工程と、ゲルろ過クロマトグラフィーにより不純物を除去する工程と、陰イオン交換膜によりエンドトキシンを除去して精製コンドロイチン分解酵素を生成する前記除去する工程とを有するものである。
【選択図】図12
Description
本出願書類は、2004年5月18日に出願された表題「コンドロイチン分解酵素の精製方法」の米国仮出願番号第60/572,030号、および2004年10月25日に出願された表題「cABCIの特性解析と製剤」の米国仮出願番号第60/621,882号に対して優先権を主張するものであり、その内容はこの参照により本願明細書に完全に組み込まれるものである。
多くのタンパク質はポリアニオン(pH>pl)またはポリカチオン(pH<pl)として分類される。最も一般的なイオン交換体のグループは、これだけに限らないが、ジメチルアンモニウムメチル(陰イオン)、ジエチルアミノエチル(陰イオン)、ジメチルアミノエチル(陰イオン)、カルボキシ(陽イオン)、カルボキシアルキル(陽イオン)、スフォイソブチル(sufoisobutyl)(陽イオン)、スルホアルキル(陽イオン)、スルホプロピル(陽イオン)、スルホエチル(陽イオン)を含む。
(i)トリトンX−114/PBSによる酵素抽出と細菌細胞沈殿物の超音波処理;
(ii)pH5.5、酢酸ナトリウム緩衝液でのSP陽イオン交換クロマトグラフィー;
(iii)pH5.5、酢酸ナトリウム緩衝液でのSephacryl S200ゲルろ過クロマトグラフィー;
(iv)エンドトキシンのQ陰イオン交換膜によるろ過とDNA除去;および
(v)揮発性緩衝液への透析(pH8.0での重炭酸アンモニウム)。状況に応じて、この工程の後に凍結乾燥、または他の緩衝液の濃縮、及び除去方法を行ってもよい(例えば、除菌後、適切な製剤に懸濁する)。
Claims (30)
- コンドロイチン分解酵素とリン酸緩衝液とを有する製剤であって、前記製剤は少なくとも約24時間安定であることを特徴とする製剤。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素は精製されているものである。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素は約24時間で少なくとも約50%の活性を保持するものである。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素は、コンドロイチン分解酵素ABCI、コンドロイチン分解酵素ABCII、コンドロイチン分解酵素AC、コンドロイチン分解酵素B、またはHya11、Hya12、Hya13、Hya14、およびPH20等のコンドロイチン分解酵素様活性を有する哺乳類酵素から成る群から選択されるものである。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素はコンドロイチン分解酵素ABCIである。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素はコンドロイチン分解酵素ACである。
- 請求項1記載の製剤において、前記リン酸緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液である。
- 請求項1記載の製剤において、前記リン酸ナトリウム緩衝液は約100mMの濃度である。
- 請求項1記載の製剤において、この製剤は、さらに、
酢酸ナトリウムを有するものである。 - 請求項1記載の製剤において、前記製剤は約7.4のpHである。
- 請求項1記載の製剤において、前記コンドロイチン分解酵素ABCIは配列ID番号:2のアミノ酸配列である。
- 基本的にコンドロイチン分解酵素と緩衝液とから成る製剤。
- コンドロイチン分解酵素を精製する方法であって、
前記細胞から前記コンドロイチン分解酵素を抽出する工程と、
抽出物から前記コンドロイチン分解酵素を分離する工程と、
汚染物質および不純物を除去する工程と、
エンドトキシンを除去する工程と
を有する方法。 - 請求項13記載の方法において、前記コンドロイチン分解酵素は遺伝子組み換えコンドロイチン分解酵素を有するものである。
- 請求項14記載の方法において、前記遺伝子組み換えコンドロイチン分解酵素は配列ID番号:2のアミノ酸配列である。
- 請求項13記載の方法において、前記抽出する工程は、細胞を界面活性剤を含む緩衝溶液に懸濁する工程を含むものである。
- 請求項16記載の方法において、前記界面活性剤はトリトンXである。
- 請求項13記載の方法において、前記抽出する工程は前記細胞を超音波処理する工程を含むものである。
- 請求項13記載の方法において、前記コンドロイチン分解酵素を分離する工程は陽イオン交換カラムを用いる工程を含むものである。
- 請求項13記載の方法において、前記汚染物質および不純物を除去する工程はゲルろ過カラムを用いる工程を含むものである。
- 請求項13記載の方法において、前記エンドトキシンを除去する工程は陰イオン交換カラムを用いる工程を含むものである。
- 請求項13記載の方法において、この方法は、さらに、
透析する工程を有するものである。 - 請求項22記載の方法において、前記透析する工程は揮発性緩衝液を用いる工程を含むものである。
- 請求項13記載の方法において、この方法は、さらに、
乾燥する工程を有するものである。 - 請求項24記載の方法において、前記乾燥する工程は凍結乾燥である。
- 請求項13記載の方法において、前記コンドロイチン分解酵素は、コンドロイチン分解酵素ABCI、コンドロイチン分解酵素ABCII、コンドロイチン分解酵素AC、コンドロイチン分解酵素B、またはHya11、Hya12、Hya13、Hya14、およびPH20等のコンドロイチン分解酵素様活性を有する哺乳類酵素から成る群から選択されるものである。
- 請求項13記載の方法において、前記コンドロイチン分解酵素はコンドロイチン分解酵素ABCIである。
- 請求項13記載の方法において、前記コンドロイチン分解酵素はコンドロイチン分解酵素ACである。
- 請求項13に従って精製されたコンドロイチン分解酵素。
- コンドロイチン分解酵素を精製する方法であって、
細胞から前記コンドロイチン分解酵素を抽出する工程と、
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる工程と、
ゲルろ過クロマトグラフィーを用いる工程と、
陰イオン交換ろ過を用いる工程と、
透析を用いる工程と
を有する方法。
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