JP2004113166A - ハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明はハロペルオキシダ−ゼの安定化を促進し、産業的応用に有用となる熱安定性の向上を目的とする。
【解決手段】ハロペルオキシダ−ゼ中に２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ、そのハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
【選択図】 図１
【解決手段】ハロペルオキシダ−ゼ中に２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ、そのハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化に関するものである。さらに詳しく述べると、本発明は、蛋白質のヨ−ド化反応、ステロイドのハロゲン化反応、ハロヒドリンの合成反応などのハロペルオキシダ−ゼ活性の加熱処理などによる低下を抑制する方法に関するものである。さらに本発明は、これらの活性低下を抑制する安定化方法による安定化ハロペルオキシダ−ゼの調製方法に関するものであり、その調製法によるハロペルオキシダ−ゼの提供に関するものでる。
【０００２】
【従来の技術】
自然界において、有機化合物にハロゲンを導入する反応の殆どは、ハロペルオキシダ−ゼを触媒として過酸化水素に依存していることが知られている。
【０００３】
【化１】
２ＡＨ ＋ ２Ｘ− ＋ Ｈ２Ｏ２ → ２ＡＸ ＋ ２Ｈ２Ｏ
（式中、ＡＨは親核性化合物、Ｘ−は、Ｃｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−のいずれかのハライドイオンである。）
【０００４】
１９８０年半ば、数種の微生物においても、クロラムフェニコ−ル、クロロテトラサイクリン、カルダリオマイシン、ピロ−ルニトリン等の有用な有機ハロゲン抗生物質の生産菌にハロペルオキシダ−ゼが検出され（大城ら、化学と生物、３２（１）、３５，１９９４、Ｐ．Ｄ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１６２６（１９６１），Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔａｌ，ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．，１７３，５，１９８４，Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１９１１，１９８５，Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｅｒ，３６８，１２２５，１９８７）、これらを含めた微生物由来のハロペルオキシダ−ゼの研究が盛んに行われている。
【０００５】
ハロペルオキシダ−ゼは、このように微生物において抗生物質の生産を触媒する酵素であることが知られているが、さらには当該酵素を用いて合成物質を基質にして種々の合成化合物を合成する研究が進められている。例えば、蛋白質のヨ−ド化反応（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０７，４４５，１９８３）、ステロイド等のハロゲン化反応（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，３７，４０５７，１９６８，Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８）、ハロヒドリンの合成反応（Ｊ．Ｇｅｉｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５，３６６，１９８３）等の触媒としての応用の範囲が広がりつつある。
【０００６】
一方、近年海洋環境中にも数多くの有機ハロゲンが存在し、中でも海藻中に極めて多種類のハロゲン化合物が含まれ、多くの海藻がハロペルオキシダ−ゼを生産していることが明らかになった。（Ｗ．Ｄ．Ｈｅｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１６，３４０，１９８０，Ｈ．Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２９６１，１９８５，Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１５，２７，１９８７）
これらの生理的意義は、海洋生態学の観点からのみならず、応用的観点からも非常に興味深いものである。ハロゲン化合物は抗菌性が強いため自己防御物質あるいは忌避物質として、海藻の生存戦略としての重要な意義を持っていると考えられる。また、生産されたハロゲン化合物が他の生物に対する情報伝達物質として働いている可能性についての研究も報告されてきている。例えば、ブロモメタンがウニやアワビなどの海洋性植食動物幼生の着底、変態誘起をする現象が見出されている。（Ｋ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉ．，６０，７９５−７９６，１９９４）
【０００７】
これら海藻由来のハロペルオキシダ−ゼについても、酵素科学的性質、遺伝子科学的情報、及び、蛋白質科学的性質が解明されてきており、遺伝子工学的なハロペルオキシダ−ゼの供給の可能性が報告されている。また、その酵素科学的性質の解析の中から、有機溶媒に対して安定性が高いという報告がなされている。（Ｅ．ｄｅ Ｂｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，３０，６０７，１９８７）しかしながら、その他の安定性についての解析及びさらなる安定性の向上についての検討はなされていないのが現状である。（Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５，特開昭６１−２４２５７７、Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８，Ｍ． Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８，特開平１０−２４８５８１、Ｔ．Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２，Ｄ．Ｊ．Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，２１，１９９３，Ｉｓｕｐｏｖ Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２９９，１０３５，２０００，Ｊ．Ｎ．Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１，５９，２００２，ＰＣＴ ＷＯ０１／５３４９４）
【０００８】
前述のように、ハロペルオキシダ−ゼは多くの有用なハロゲン化合物を製造する触媒として有用であるが、かかる目的を達成する為には、産業応用に耐え得る安定した酵素活性の発揮が期待される。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６１−２４２５７７
【００１０】
【特許文献２】特開平１０−２４８５８１
【００１１】
【特許文献３】ＰＣＴ ＷＯ０１／５３４９４
【００１２】
【非特許文献１】大城ら、化学と生物、３２（１）、３５，１９９４
【００１３】
【非特許文献２】Ｐ．Ｄ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１６２６（１９６１）
【００１４】
【非特許文献３】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．，１７３，５，１９８４
【００１５】
【非特許文献４】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１９１１，１９８５
【００１６】
【非特許文献５】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｅｒ，３６８，１２２５，１９８７
【００１７】
【非特許文献６】Ｗ．Ｄ．Ｈｅｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１６，３４０，１９８０
【００１８】
【非特許文献７】Ｈ．Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２９６１，１９８５
【００１９】
【非特許文献８】Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１５，２７，１９８７
【００２０】
【非特許文献９】Ｋ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ
Ｓｃｉ．，６０，７９５−７９６，１９９４
【００２１】
【非特許文献１０】Ｅ．ｄｅ Ｂｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，３０，６０７，１９８７
【００２２】
【非特許文献１１】Ｎ． Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５
【００２３】
【非特許文献１２】Ｎ． Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８
【００２４】
【非特許文献１３】Ｍ． Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８
【００２５】
【非特許文献１４】Ｔ． Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２
【００２６】
【非特許文献１５】Ｄ．Ｊ． Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，２１，１９９３
【００２７】
【非特許文献１６】Ｍ．Ｎ． Ｉｓｕｐｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２９９，１０３５，２０００
【００２８】
【非特許文献１７】Ｊ．Ｎ． Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１，５９，２００２
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な安定性を有するハロペルオキシダ−ゼ、及びそのようなハロペルオキシダ−ゼの安定化方法を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく海藻由来のハロペルオキシダ−ゼを精製取得し諸性質を検討してきた。さらには、その遺伝子構造を明らかにし組換え酵素を調製し、天然の海藻からの精製酵素との諸性質を比較検討した。（Ｏｈｓｈｉｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２）さらには、Ｘ線解析による本酵素の立体構造についても鋭意検討をした（大城ら、２００２年度日本農芸化学会大会（３月２７日））。
【００３１】
検討の結果、至適ｐＨ、至適温度、過酸化水素、およびＫＢｒに対する親和性、影響をうける阻害剤の種類は、ほぼ同一であったが、熱安定性については組換え酵素と自然界からの精製酵素が異なることを発見した。また、立体構造の解析の結果、酵素サブユニットあたり１分子のカルシウムが存在していることを明らかにした。（大城ら、２００２年度日本農芸化学会大会（３月２７日））すなわち、ハロペルオキシダ−ゼの熱安定性の向上には、カルシウムの分子内存在が関係していると考え、カルシウムを含む２価の金属カチオンを酵素分子内に存在させることにより酵素分子の構造が安定し酵素熱安定性が向上すると考えられた。そこで、カルシウムを含む２価の金属カチオンを酵素分子内に効率的に存在させる手段を講じることによって、ハロペルオキシダ−ゼの安定性を向上させうると考えた。
【００３２】
これらの研究の成果により、カルシウムを含む２価の金属カチオンがハロペルオキシダ−ゼ酵素分子内に効率的に存在していること、及びカルシウムを含む２価の金属カチオンをハロペルオキシダ−ゼに存在させる方法を見出し、活性の安定化を向上させることに成功し、これにより、本発明を完成した。
【００３３】
すなわち、上記目的は、自然界からの採取もしくは遺伝子工学的手法による組換え体調製物からの精製物に対して２価の金属カチオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を添加混合すること、もしくは、遺伝子工学的手法による組換え体調製物を、２価の金属カチオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を酵素分子内に１分子づつ含有できる程度に豊富な２価の金属カチオンを含有する培地中で培養することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法によって達成される。
【００３４】
本発明は以下のとおりである。
［１］ ２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ。
［２］ 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［３］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［４］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［５］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［６］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［７］ 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［８］ 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［７］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［９］ ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１０］ ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物が、水性媒体中で２価の金属カチオンを存在させることを特徴とする［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１１］ 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１２］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１３］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１４］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１５］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１６］ 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１７］ 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１６種である［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１８］ 該２価金属カチオンの濃度が１ｍＭ以上である［９］記載の安定化方法。
【００３６】
【発明実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化方法の一実施形態を以下の通りに説明する。
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼとは、下記式（化１）式のような反応を触媒する酵素であり海藻、微生物及び動植物に含有されるいかなる酵素であっても良い。
【００３８】
【化２】２ＡＨ ＋ ２Ｘ− ＋ Ｈ２Ｏ２ → ２ＡＸ ＋ ２Ｈ２Ｏ
（式中、ＡＨは親核性化合物、Ｘ−は、Ｃｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−のいずれかのハライドイオンである。）
【００３９】
これらのハロペルオキシダ−ゼを含有する海藻や微生物としては、褐色藻類であるＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ，Ｆｕｃｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ，Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ，Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ，Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ，紅色藻類であるＣｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ，Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ，Ｌａｕｒｅｎｃｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ，緑色藻類であるＰｅｎｉｃｉｌｌｕｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ，Ｕｌｖｅｌｌａ ｌｅｎｓなどやカビ類であるＣａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｖｅｒｃｕｌｌｏｓａ，Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ，細菌類であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ，放線菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓが代表的なものとして挙げられる。これらの中でも、活性発揮に寄与する補欠分子族としてバナジウムを配位するバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼが好ましい。
【００４０】
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼを調製する方法は、自然界から海藻を採取しそれから酵素を単離精製しても、遺伝子工学的にハロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子を有する組換え微生物を作成、培養し、培養菌体から酵素を単離精製しても良い。海藻類からの酵素の精製については、海藻を水で洗浄後、ミキサ−、ボ−ルミル、海砂などの機械的方法で破砕し、ｐＨ５〜８付近の適当な緩衝液でハロペルオキシダ−ゼを抽出する。ついで抽出液を濾過または遠心分離して、固形物を除去し、得られた粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせることにより調製される。これについては、Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５，特開昭６１−２４２５７７中に例が述べられている。また、遺伝子工学的な組換え菌体の作成については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年などの一般的な文献に記載されている方法に従い作成することが可能である。また、これらハロペルオキシダ−ゼの発現微生物作成例として、Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のハロペルオキシダ−ゼについては前記の文献に示されている。また、このように微生物発現系については、市販の原核細胞発現系や、真核細胞発現系を用いることも可能である。例としては、原核細胞発現系としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＢＡＤ発現システムシリ−ズやｐＥＴ ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯシステム（２００１−２００２ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ）、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（２００２−２００３ ＴＯＹＯＢＯ社カタログ）が挙げられる。また、真核細胞発現系としては、酵母を用いたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳｐＥＣＴＲＡＴＭ Ｓ．ｐｏｍｂｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（２００１−２００２ ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ）や、ＴａＫａＲａ社の酵母を用いたＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性酵母形質転換システムや、糸状菌を用いたＰｙｒｉｔｈｉａｍｉｎｅ耐性形質転換システム（２００２−２００３ ＴａＫａＲａ社バイオ総合カタログ）などが挙げられる。
【００４１】
そして、これら作成された組換え微生物からのハロペルオキシダ−ゼ酵素の調製は、微生物培養、培養菌体の回収、洗浄後、菌体破砕、得られた粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせることにより調製される。
【００４２】
このようにして調製された天然物から精製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液については、０．０１ｍＭから１０００ｍＭのＥＤＴＡなどの金属キレ−ト剤、好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭの濃度のを含んだＥＤＴＡなどの金属キレ−ト剤でｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜９の１〜１０００ｍＭのクエン酸−リン酸などの適当な緩衝液に対して２４時間程度透析する。これにより酵素内部に存在する金属イオンを除去し、次ぎにｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜９の１〜１０００ｍＭのクエン酸−リン酸などの適当な緩衝液で２４時間程度透析を行い、アポ酵素とする。このようにアポ化した酵素を０．００１から１０００ｍＭのバナジン酸及び０．００１から１０００ｍＭの様々な２価カチオン、好ましくは、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオン、より好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオと共に０〜１００℃好もしくは５から５０℃で１２時間程度充分に保温する。このようにして調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液を基質と反応させることにより安定化した酵素液を得る。
【００４３】
本発明において、ハロペルオキシダ−ゼ反応によるハロゲン化、ハロヒドリン化に使用される基質としては、目的とされる生成物の種類によって異なるが、蛋白質、芳香族化合物、脂肪族化合物が使用される。詳しくは、芳香族化合物として、フェノ−ル、アニソ−ル、シトシン、ウラシル、チオフェン、ピラゾ−ル、脂肪族化合物としては、アルケン類、アルキン類、シクロアルカン類およびベ−タケト酸類等が上げられる。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。
【００４４】
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼ反応は、ハライドイオンを基質とし、そのハライドイオンは、Ｃｌ−，Ｂｒ−，及びＩ−のいずれかが使用される。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。また、本反応におけるハロゲン化反応及びハロヒドリン化反応における基質である過酸化水素は、過不足無く供給されれば如何なる方法により供給されても良い。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。
【００４５】
また、本発明におけるハロペルオキシダ−ゼによる酸化反応は、基質及び生成する物質の性質に適したｐＨの範囲内で行われる。本発明において、上記ｐＨの範囲は、３〜１３好ましくは４〜１１、より好ましくは５から８である。これから、本発明において使用できる酵素を懸濁するための液は、上記ｐＨの範囲に入るものであれば使用できるが、代表例としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びトリス緩衝液が挙げられる。また、上記した緩衝液以外にも生理食塩水等の塩類溶液を使用してもよい。さらに、反応の間にｐＨが大きく変動しない場合、あるいはｐＨをコントロ−ルできる場合には、緩衝液を必ずしも使用する必要はない。
【００４６】
本発明における酵素の安定性を比較するための活性測定は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。好ましくは、２０μモルの臭化カリウム、２μｍｏｌの過酸化水素、６０ｎｍｏｌのモノクロロジメドンを含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．９８ｍｌと酵素調製液０．０２ｍｌを混合し、３０℃で反応させ、反応開始後、１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。対照として酵素溶液もしくは、過酸化水素を含まない系を用いて上記と同様に操作し、得られた吸光度の減少の差を求める。１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量とする。
【００４７】
本発明における酵素の安定性のうち熱安定性を比較測定するための酵素液の調製方法は、上記実施により調製した酵素調製液を、０℃〜１００℃の間で、１分間から６０分間、好ましくは５分間から３０分間、より好ましくは１０分間から２０分間、水浴もしくはブロックヒ−タ−により加熱処理を行うことである。さらに、種々の２価カチオンの存在の有無、加熱処理の実施、未実施による条件のことなる酵素液についての酵素活性を測定することにより、それぞれの酵素液の活性を測定する。
【００４８】
【実施例】
以下実施例をもって本発明をさらに具体的に説明する。本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例において組換え微生物の作成については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ エｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法に従った。
【００４９】
実施例１〜３
Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ ＲＮＡは、Ｘｉｎｇらの方法（Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４，６５０，１９８８）により単離した。鳥取県の白兎海岸の浅瀬において海藻Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａを採取し、使用まで−８０℃で保存した。凍結乾燥した海藻８．９ｇを液体窒素存在下でモ−タ−付き組織破壊装置にて破砕し４０ｍｌの２％ ＳＤＳ，１％２−メルカプトエタノ−ル、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２分間懸濁する。グアニジン塩酸を０．８Ｍになるように添加し激しく混合後、フェノ−ル／クロロフォルム、クロロフォルム抽出を行う。水層に塩化リチウムが３Ｍになるように添加し、ＲＮＡを沈殿させ、遠心分離により回収する。この沈殿を、０．８ｍｌの１％ ＳＤＳ，０．５％２−メルカプトエタノ−ル、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し最終濃度が０．５Ｍになるように酢酸カリウムを添加する。この調製液を再度、フェノ−ル／クロロフォルム、クロロフォルム抽出を行う。水層に塩化リチウムが３Ｍになるように添加し、ＲＮＡを沈殿させ、遠心分離により回収する。この沈殿を、１．２ｍｌの滅菌水に溶解することにより１．３ｍｇの全ＲＮＡが調製できた。この全ＲＮＡを鋳型として、Ｎ末端側にＮｄｅＩ制限酵素部位をもつプライマ− ＢＰ−１（５‘−ＴＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’）Ｃ末端側にＮｏｔＩ制限酵素部位をもつプライマ− ＢＰ−２（５‘−ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＴＴＣ−３’）を用いて、ＴａＫａＲａ社ＲＴ−ＰＣＲキットにより、Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子１．８ｋｂを増幅した。次に、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、この増幅したハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をアガロ−スゲルから切りだし精製した。ｐＥＴ２１−ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）プラスミドベクタ−およびこの精製断片を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩにより３７℃で１６時間処理した。そして、これらプラスミド及び精製断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ａ／ｂｐｏを作製した。
【００５０】
得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、その培養液１／１００容量を加えて、３７℃で振とう培養し、Ａ６００が０．５から１．０に上昇したときに、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を最終濃度１ｍＭになるように添加して、３７℃で１６時間２Ｌの三角フラスコ中で８００ｍｌのＬＢ培地を含む２Ｌの三角フラスコ中、３７℃１６時間培養後、１０、０００ｇで２０分間の遠心分離条件により集菌した。回収した培養菌体９４ｇ湿重量を１ｍＭバナジン酸を含有するトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）中に懸濁し超音波破砕した後、遠心上清を１２，０００ｇ３０分間の遠心分離条件で回収し粗酵素液とした。本粗酵素液を、５０ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）に懸濁し、１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析した。本透析液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（樹脂量５００ｍｌ、４．８ｘ２９．５ｃｍ）に流速１５０ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＮａＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）で洗浄後、０．３ＭＮａＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）で溶出を行った。回収した活性を含む画分は遠心型簡易濃縮装置（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）と遠心分離機（ＴＯＭＹ ＴＡ−６ ロ−タ−、３、０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮した。この精製濃縮した溶出液についてハロペルオキシダ−ゼ活性を試験したところ、活性が認められた（参考、Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８）。
【００５１】
また、上記に調製したＣｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ 構造遺伝子断片を、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ制限酵素部位をもつプライマ− ５‘ＢＰＯＢａｍ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣ−３’）Ｃ末端側にＸｂａＩ制限酵素部位をもつプライマ− ３‘ＢＰＯＸｂａ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡ−３’）を用いて、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲキットにより、増幅した。次に、ＳｅｐｈａｇｌａｓＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、この増幅したハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をアガロ−スゲルから切りだし精製した。この精製断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより３７℃で１６時間処理した。そして、これから、１．１ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片と０．７ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を作製した。次に、糸状菌クロロペルオキシダ−ゼの発現ベクタ−であるｐＴＮＴ１４（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３８２０−２３８２７，１９９９）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより３７℃で１６時間処理し、発現ベクタ−部分にＢＰＯ ０．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２０を作製した。この組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２０から、プラスミドの抽出を行い、制限酵素ＢａｍＨＩにより３７℃で１６時間処理した。発現ベクタ−部分にＢＰＯ １．１ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２８を作製した。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ１タ−ミネ−タ−領域０．３ｋｂ断片をプラスミドｐＰＩＣＺａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から、Ｎ末端側にＸｂａＩ制限酵素部位をもつプライマ− ５‘ＰＩＣＸｂａ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧ−３’）Ｃ末端側にＰｓｔＩ制限酵素部位をもつプライマ− ３‘ＰＩＣＰｓｔ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣ−３’）を用いて、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲキットにより、増幅した。
【００５２】
この増幅断片を、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、アガロ−スゲルから切りだし精製した。この精製断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩにより３７℃で１６時間処理した。組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２８から調製したプラスミドｐＴＮＴ２８を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩにより３７℃で１６時間処理したのち、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、アガロ−スゲルから切りだし精製した。
【００５３】
ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで制限酵素消化した発現ベクタ−ｐＴＮＴ２８にＸｂａＩ及びＰｓｔＩで制限酵素消化したＣＹＣ１タ−ミネ−タ−領域０．３ｋｂ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ３０を作製した。
【００５４】
得られたプラスミドｐＴＮＴ３０をＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１に定法により形質転換し酵母発現形質転換株Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を得た。（参考 Ｔ．Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２）
【００５５】
Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のブロモペルオキシダ−ゼの遺伝子を組み込んだプラスミドｐＴＮＴ３０をＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１（ＡＴＣＣ２０８２７５）に導入した酵母発現形質転換株Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を寒天２．０％を有する０．６７％Ｙｅａｓｔ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ ｗ／ｏＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，２％ Ｇｌｕｃｏｓｅ，５０μｇ／ｍｌ Ｌ−Ｌｅｕ、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−Ｔｒｐの培地組成を有する培地（以下ＹＧＬＴと称する）２０ｍｌの平板培地に画線接種し、３０℃で２日間静地培養した培養することにより種菌株を準備する。プレ−ト上の本Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を、３００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌのＹＧＬＴ培地に白金耳接種し、２日間、３０℃で振とう培養し前培養とする。さらに、２Ｌの坂口フラスコに最終濃度２．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２．５％Ｔｒｙｐｔｏｎｅの培地８００ｍｌに４０％Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １００ｍｌ及び前培養液 １００ｍｌを接種し、３０℃で２日間振とう培養し本培養として、増殖が定常期に入るように培養し、一定量の菌体を含む培養液を調製する。この様にして調製された培養液から遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）によって菌体を回収し、必要であれば、水、緩衝液または生理食塩水等で菌体を洗浄する。
【００５６】
以下のようにハロペルオキシダ−ゼを精製調製する。精製手順は全て４℃以下で行った。このようにして回収した菌体３６５ｇを、トリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）中に懸濁し、８００ｍｌとした。そして、懸濁液を直径０．４５〜０．５ｍｍのガラスビ−ズ４０〜１０００ｍｌ、好ましくは２００〜５００ｍｌを用いてＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ Ｂａｓｅｌ ５／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｔｙｐｅ ＫＤＬ−Ｓｐｅｃｉａｌ、容量６００ｍｌ、３、０００ｒｐｍ、流速２００ｍｌ／分、２℃）で処理した。菌体懸濁液がＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ容器に入ってから完全に出終わるまで１回とし、破砕液上清の２８０ｎｍの吸光度がほぼ一定になるまで処理を繰り返した。この菌体破砕液を４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、５〜２０分）し上清を無細胞抽出液とした。
【００５７】
無細胞抽出液を氷冷しながら、固体硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和にし、これを４℃で２時間攪拌して、４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。この上清に固体硫酸アンモニウムをさらに加えて６０％飽和にした。これを４℃で２時間攪拌して、４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。固体硫酸アンモニウム添加中は、１４％アンモニア水溶液を添加しｐＨを７．０に保持する。個体硫酸アンモニウム６０％飽和溶液を４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。そしてその沈殿物を５０ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）に懸濁し、１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析する。
【００５８】
固体硫酸アンモニウム６０％飽和溶液の遠心分離沈殿物のトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）懸濁物の透析処理後液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（樹脂量４９０ｍｌ、５ｘ２５ｃｍ）に流速１００ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＫＣｌ次いで０．３ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄後、０．４ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）でステップワイズ溶出を行った。回収した活性を含む画分は限外濾過装置（ＭＯＤＥＬ８２００、Ａｍｉｃｏｎ）と限外濾過膜（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）により濃縮後、この濃縮液を１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析した。
【００５９】
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム後透析処理を行ったハロペルオキシダ−ゼ溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（樹脂量２５ｍｌ、１．５ｘ１４ｃｍ）に流速１０ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＫＣｌ次いで０．３ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄後、０．４ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）でステップワイズ溶出を行った。回収した活性を含む画分は遠心型簡易濃縮装置（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）と遠心分離機（ＴＯＭＹ ＴＡ−６ ロ−タ−、３、０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮した。
【００６０】
また、海藻の酵素は、採取後、冷水にて洗浄し、紙タオルなどの間に挟み余分な水分を除去する。その後、５００ｍｇの海藻あたり４０メッシュの海砂を加えて冷却化で破砕して、４ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で抽出した。その後の操作は、塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせ組換え微生物からの調製と同様に調製した。
【００６１】
このようにして調製した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素液及び組換え微生物由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素液を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだｐＨ３．８の１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液に対して２４時間透析する。これにより酵素内部に存在する金属イオンを除去する。次にトリス緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で２４時間透析を行い、アポ酵素とした。このようにアポ化した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素及び組換え微生物由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素を１ｍＭのバナジン酸のみ、もしくは、１ｍＭのバナジン酸及び１ｍＭのカルシウムと共に３０℃で１２時間保温しホロ酵素とした。そして、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０℃で、２０分間、湯浴により加熱処理を行った。このような加熱処理を施した酵素液のハロペルオキシダ−ゼ活性をモノクロロジメドンを基質としてモノクロロモノブロモジメドンを生産物として測定した結果を、図１に示す（実施例１）。図１よりカルシウムを含有することにより熱安定性が向上することが示された。
【００６２】
次に、アポ化した組換え微生物から調製した酵素液を、１ｍＭバナジン酸およびそれぞれ１ｍＭのカルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、アルミニウム、銀の各金属と共に保温することによりホロ化した後、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃で、２０分間、湯浴により加熱処理を行った。このような加熱処理を施した酵素液のハロペルオキシダ−ゼ活性をモノクロロジメドンを基質としてモノクロロモノブロモジメドンを生産物として測定した結果を、図２に示す（実施例２）。図２よりカルシウム、ストロンチウム、マグネシウムの添加が熱安定性を向上させることが示された。
【００６３】
組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液を１ｍＭバナジン酸と保温した酵素と天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素について熱安定性を測定した結果を図３に示す。本図３における海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼの熱安定性のグラフと図１の１ｍＭのバナジン酸のみでホロ化した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼの熱安定性のグラフを比較すると同等であることが示された。これにより、天然の海藻から調製されたハロペルオキシダ−ゼは、熱安定性測定に十分なバナジウムイオンを含有していると考えられた。また、図３に示される１ｍＭバナジン酸と保温した組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液の熱安定性のグラフと図１の天然の海藻および組換え微生物それぞれから調製し１ｍＭバナジン酸および１ｍＭのカルシウムと保温することによりホロ化したハロペルオキシダ−ゼ酵素液の熱安定性のグラフを比較すると同等であることが示された。これにより、図３に示される組換え微生物から調製し１ｍＭバナジン酸によりホロ化したハロペルオキシダ−ゼ酵素液には、その結晶構造の解析から予想されるように充分なカルシウムイオンが含まれていることが示された（実施例３）。つまり、２価の金属カチオンを含有する適当な天然培地などを用いて組換え微生物などを培養することによりハロペルオキシダ−ゼを調製するかもしくは、天然の海藻からもしくは組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼに２価の金属カチオンを存在させることによりハロペルオキシダ−ゼの熱安定性が向上されることが示された。
【００６４】
酵素の活性測定は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。２０μｍｏｌの臭化カリウム、２μｍｏｌの過酸化水素、６０ｎｍｏｌのモノクロロジメドンを含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．９８ｍｌと酵素調製液０．０２ｍｌを混合し、３０℃で反応させ、反応開始後、１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。対照として酵素溶液もしくは、過酸化水素を含まない系を用いて上記と同様に操作し、得られた吸光度の減少の差を求めた。１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量とした。
【００６５】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明は、ハロペルオキシダ−ゼ中に２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ、そのハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法、及びハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物が、水性媒体中で２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法を提供する。これによりハロペルオキシダ−ゼを用いる物質変換反応において、ハロペルオキシダ−ゼの安定化を促進し、産業的応用に有用となる熱安定性の向上ができるようになるものである。
【００６６】
また、本発明のハロペルオキシダ−ゼ及びその安定化方法は、ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価金属カチオンであるカルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を用いることにより簡便に行われる方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然の海藻及び組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼにカルシウムイオンを存在させたハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。
【図２】２価の金属カチオンを存在させたハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。図中、Ｖはバナジン酸を、Ａｇ、Ａｌ、Ｓｒ、Ｍｇ、Ｃａはそれぞれ金属カチオンの添加を示す。
【図３】天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼ及びバナジン酸と保温した組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。図中、Ｗｉｌｄは天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼを、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔは組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼを示し、Ｖｈａバナジン酸添加、Ｃａはカルシウム添加を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化に関するものである。さらに詳しく述べると、本発明は、蛋白質のヨ−ド化反応、ステロイドのハロゲン化反応、ハロヒドリンの合成反応などのハロペルオキシダ−ゼ活性の加熱処理などによる低下を抑制する方法に関するものである。さらに本発明は、これらの活性低下を抑制する安定化方法による安定化ハロペルオキシダ−ゼの調製方法に関するものであり、その調製法によるハロペルオキシダ−ゼの提供に関するものでる。
【０００２】
【従来の技術】
自然界において、有機化合物にハロゲンを導入する反応の殆どは、ハロペルオキシダ−ゼを触媒として過酸化水素に依存していることが知られている。
【０００３】
【化１】
２ＡＨ ＋ ２Ｘ− ＋ Ｈ２Ｏ２ → ２ＡＸ ＋ ２Ｈ２Ｏ
（式中、ＡＨは親核性化合物、Ｘ−は、Ｃｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−のいずれかのハライドイオンである。）
【０００４】
１９８０年半ば、数種の微生物においても、クロラムフェニコ−ル、クロロテトラサイクリン、カルダリオマイシン、ピロ−ルニトリン等の有用な有機ハロゲン抗生物質の生産菌にハロペルオキシダ−ゼが検出され（大城ら、化学と生物、３２（１）、３５，１９９４、Ｐ．Ｄ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１６２６（１９６１），Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔａｌ，ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．，１７３，５，１９８４，Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１９１１，１９８５，Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｅｒ，３６８，１２２５，１９８７）、これらを含めた微生物由来のハロペルオキシダ−ゼの研究が盛んに行われている。
【０００５】
ハロペルオキシダ−ゼは、このように微生物において抗生物質の生産を触媒する酵素であることが知られているが、さらには当該酵素を用いて合成物質を基質にして種々の合成化合物を合成する研究が進められている。例えば、蛋白質のヨ−ド化反応（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０７，４４５，１９８３）、ステロイド等のハロゲン化反応（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，３７，４０５７，１９６８，Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８）、ハロヒドリンの合成反応（Ｊ．Ｇｅｉｇｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５，３６６，１９８３）等の触媒としての応用の範囲が広がりつつある。
【０００６】
一方、近年海洋環境中にも数多くの有機ハロゲンが存在し、中でも海藻中に極めて多種類のハロゲン化合物が含まれ、多くの海藻がハロペルオキシダ−ゼを生産していることが明らかになった。（Ｗ．Ｄ．Ｈｅｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１６，３４０，１９８０，Ｈ．Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２９６１，１９８５，Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１５，２７，１９８７）
これらの生理的意義は、海洋生態学の観点からのみならず、応用的観点からも非常に興味深いものである。ハロゲン化合物は抗菌性が強いため自己防御物質あるいは忌避物質として、海藻の生存戦略としての重要な意義を持っていると考えられる。また、生産されたハロゲン化合物が他の生物に対する情報伝達物質として働いている可能性についての研究も報告されてきている。例えば、ブロモメタンがウニやアワビなどの海洋性植食動物幼生の着底、変態誘起をする現象が見出されている。（Ｋ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉ．，６０，７９５−７９６，１９９４）
【０００７】
これら海藻由来のハロペルオキシダ−ゼについても、酵素科学的性質、遺伝子科学的情報、及び、蛋白質科学的性質が解明されてきており、遺伝子工学的なハロペルオキシダ−ゼの供給の可能性が報告されている。また、その酵素科学的性質の解析の中から、有機溶媒に対して安定性が高いという報告がなされている。（Ｅ．ｄｅ Ｂｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，３０，６０７，１９８７）しかしながら、その他の安定性についての解析及びさらなる安定性の向上についての検討はなされていないのが現状である。（Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５，特開昭６１−２４２５７７、Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８，Ｍ． Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８，特開平１０−２４８５８１、Ｔ．Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２，Ｄ．Ｊ．Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，２１，１９９３，Ｉｓｕｐｏｖ Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２９９，１０３５，２０００，Ｊ．Ｎ．Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１，５９，２００２，ＰＣＴ ＷＯ０１／５３４９４）
【０００８】
前述のように、ハロペルオキシダ−ゼは多くの有用なハロゲン化合物を製造する触媒として有用であるが、かかる目的を達成する為には、産業応用に耐え得る安定した酵素活性の発揮が期待される。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６１−２４２５７７
【００１０】
【特許文献２】特開平１０−２４８５８１
【００１１】
【特許文献３】ＰＣＴ ＷＯ０１／５３４９４
【００１２】
【非特許文献１】大城ら、化学と生物、３２（１）、３５，１９９４
【００１３】
【非特許文献２】Ｐ．Ｄ．Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３６，１６２６（１９６１）
【００１４】
【非特許文献３】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．，１７３，５，１９８４
【００１５】
【非特許文献４】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１９１１，１９８５
【００１６】
【非特許文献５】Ｋ．−Ｈ．ｖａｎ Ｐｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｅｒ，３６８，１２２５，１９８７
【００１７】
【非特許文献６】Ｗ．Ｄ．Ｈｅｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１６，３４０，１９８０
【００１８】
【非特許文献７】Ｈ．Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９，２９６１，１９８５
【００１９】
【非特許文献８】Ｎ．Ｉｔｏｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，１５，２７，１９８７
【００２０】
【非特許文献９】Ｋ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ
Ｓｃｉ．，６０，７９５−７９６，１９９４
【００２１】
【非特許文献１０】Ｅ．ｄｅ Ｂｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，３０，６０７，１９８７
【００２２】
【非特許文献１１】Ｎ． Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５
【００２３】
【非特許文献１２】Ｎ． Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６３，１３７２５，１９８８
【００２４】
【非特許文献１３】Ｍ． Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８
【００２５】
【非特許文献１４】Ｔ． Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２
【００２６】
【非特許文献１５】Ｄ．Ｊ． Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，２１，１９９３
【００２７】
【非特許文献１６】Ｍ．Ｎ． Ｉｓｕｐｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２９９，１０３５，２０００
【００２８】
【非特許文献１７】Ｊ．Ｎ． Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１，５９，２００２
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な安定性を有するハロペルオキシダ−ゼ、及びそのようなハロペルオキシダ−ゼの安定化方法を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく海藻由来のハロペルオキシダ−ゼを精製取得し諸性質を検討してきた。さらには、その遺伝子構造を明らかにし組換え酵素を調製し、天然の海藻からの精製酵素との諸性質を比較検討した。（Ｏｈｓｈｉｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２）さらには、Ｘ線解析による本酵素の立体構造についても鋭意検討をした（大城ら、２００２年度日本農芸化学会大会（３月２７日））。
【００３１】
検討の結果、至適ｐＨ、至適温度、過酸化水素、およびＫＢｒに対する親和性、影響をうける阻害剤の種類は、ほぼ同一であったが、熱安定性については組換え酵素と自然界からの精製酵素が異なることを発見した。また、立体構造の解析の結果、酵素サブユニットあたり１分子のカルシウムが存在していることを明らかにした。（大城ら、２００２年度日本農芸化学会大会（３月２７日））すなわち、ハロペルオキシダ−ゼの熱安定性の向上には、カルシウムの分子内存在が関係していると考え、カルシウムを含む２価の金属カチオンを酵素分子内に存在させることにより酵素分子の構造が安定し酵素熱安定性が向上すると考えられた。そこで、カルシウムを含む２価の金属カチオンを酵素分子内に効率的に存在させる手段を講じることによって、ハロペルオキシダ−ゼの安定性を向上させうると考えた。
【００３２】
これらの研究の成果により、カルシウムを含む２価の金属カチオンがハロペルオキシダ−ゼ酵素分子内に効率的に存在していること、及びカルシウムを含む２価の金属カチオンをハロペルオキシダ−ゼに存在させる方法を見出し、活性の安定化を向上させることに成功し、これにより、本発明を完成した。
【００３３】
すなわち、上記目的は、自然界からの採取もしくは遺伝子工学的手法による組換え体調製物からの精製物に対して２価の金属カチオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を添加混合すること、もしくは、遺伝子工学的手法による組換え体調製物を、２価の金属カチオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を酵素分子内に１分子づつ含有できる程度に豊富な２価の金属カチオンを含有する培地中で培養することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法によって達成される。
【００３４】
本発明は以下のとおりである。
［１］ ２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ。
［２］ 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［３］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［４］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［５］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［６］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［７］ 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［１］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［８］ 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［７］記載のハロペルオキシダ−ゼ。
［９］ ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１０］ ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物が、水性媒体中で２価の金属カチオンを存在させることを特徴とする［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１１］ 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１２］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１３］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１４］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１５］ 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１６］ 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１７］ 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１６種である［９］記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
［１８］ 該２価金属カチオンの濃度が１ｍＭ以上である［９］記載の安定化方法。
【００３６】
【発明実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化方法の一実施形態を以下の通りに説明する。
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼとは、下記式（化１）式のような反応を触媒する酵素であり海藻、微生物及び動植物に含有されるいかなる酵素であっても良い。
【００３８】
【化２】２ＡＨ ＋ ２Ｘ− ＋ Ｈ２Ｏ２ → ２ＡＸ ＋ ２Ｈ２Ｏ
（式中、ＡＨは親核性化合物、Ｘ−は、Ｃｌ−，Ｂｒ−，Ｉ−のいずれかのハライドイオンである。）
【００３９】
これらのハロペルオキシダ−ゼを含有する海藻や微生物としては、褐色藻類であるＡｓｃｏｐｈｙｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ，Ｆｕｃｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ，Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ，Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ，Ｅｃｋｌｏｎｉａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ，紅色藻類であるＣｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ，Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ，Ｌａｕｒｅｎｃｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ，緑色藻類であるＰｅｎｉｃｉｌｌｕｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ，Ｕｌｖｅｌｌａ ｌｅｎｓなどやカビ類であるＣａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｖｅｒｃｕｌｌｏｓａ，Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ｄｉｄｙｍｏｓｐｏｒａ，細菌類であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ，放線菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓが代表的なものとして挙げられる。これらの中でも、活性発揮に寄与する補欠分子族としてバナジウムを配位するバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼが好ましい。
【００４０】
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼを調製する方法は、自然界から海藻を採取しそれから酵素を単離精製しても、遺伝子工学的にハロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子を有する組換え微生物を作成、培養し、培養菌体から酵素を単離精製しても良い。海藻類からの酵素の精製については、海藻を水で洗浄後、ミキサ−、ボ−ルミル、海砂などの機械的方法で破砕し、ｐＨ５〜８付近の適当な緩衝液でハロペルオキシダ−ゼを抽出する。ついで抽出液を濾過または遠心分離して、固形物を除去し、得られた粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせることにより調製される。これについては、Ｎ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，１３１，４２８，１９８５，特開昭６１−２４２５７７中に例が述べられている。また、遺伝子工学的な組換え菌体の作成については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年などの一般的な文献に記載されている方法に従い作成することが可能である。また、これらハロペルオキシダ−ゼの発現微生物作成例として、Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のハロペルオキシダ−ゼについては前記の文献に示されている。また、このように微生物発現系については、市販の原核細胞発現系や、真核細胞発現系を用いることも可能である。例としては、原核細胞発現系としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＢＡＤ発現システムシリ−ズやｐＥＴ ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯシステム（２００１−２００２ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ）、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（２００２−２００３ ＴＯＹＯＢＯ社カタログ）が挙げられる。また、真核細胞発現系としては、酵母を用いたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔａｎｏｌｉｃａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳｐＥＣＴＲＡＴＭ Ｓ．ｐｏｍｂｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（２００１−２００２ ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ）や、ＴａＫａＲａ社の酵母を用いたＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性酵母形質転換システムや、糸状菌を用いたＰｙｒｉｔｈｉａｍｉｎｅ耐性形質転換システム（２００２−２００３ ＴａＫａＲａ社バイオ総合カタログ）などが挙げられる。
【００４１】
そして、これら作成された組換え微生物からのハロペルオキシダ−ゼ酵素の調製は、微生物培養、培養菌体の回収、洗浄後、菌体破砕、得られた粗酵素液を塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせることにより調製される。
【００４２】
このようにして調製された天然物から精製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液については、０．０１ｍＭから１０００ｍＭのＥＤＴＡなどの金属キレ−ト剤、好ましくは０．１ｍＭから１００ｍＭの濃度のを含んだＥＤＴＡなどの金属キレ−ト剤でｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜９の１〜１０００ｍＭのクエン酸−リン酸などの適当な緩衝液に対して２４時間程度透析する。これにより酵素内部に存在する金属イオンを除去し、次ぎにｐＨ２〜１０、好ましくはｐＨ３〜９の１〜１０００ｍＭのクエン酸−リン酸などの適当な緩衝液で２４時間程度透析を行い、アポ酵素とする。このようにアポ化した酵素を０．００１から１０００ｍＭのバナジン酸及び０．００１から１０００ｍＭの様々な２価カチオン、好ましくは、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオン、より好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオと共に０〜１００℃好もしくは５から５０℃で１２時間程度充分に保温する。このようにして調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液を基質と反応させることにより安定化した酵素液を得る。
【００４３】
本発明において、ハロペルオキシダ−ゼ反応によるハロゲン化、ハロヒドリン化に使用される基質としては、目的とされる生成物の種類によって異なるが、蛋白質、芳香族化合物、脂肪族化合物が使用される。詳しくは、芳香族化合物として、フェノ−ル、アニソ−ル、シトシン、ウラシル、チオフェン、ピラゾ−ル、脂肪族化合物としては、アルケン類、アルキン類、シクロアルカン類およびベ−タケト酸類等が上げられる。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。
【００４４】
本発明におけるハロペルオキシダ−ゼ反応は、ハライドイオンを基質とし、そのハライドイオンは、Ｃｌ−，Ｂｒ−，及びＩ−のいずれかが使用される。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。また、本反応におけるハロゲン化反応及びハロヒドリン化反応における基質である過酸化水素は、過不足無く供給されれば如何なる方法により供給されても良い。また、上記基質の添加濃度は、０．００１から１０００ｍＭである。
【００４５】
また、本発明におけるハロペルオキシダ−ゼによる酸化反応は、基質及び生成する物質の性質に適したｐＨの範囲内で行われる。本発明において、上記ｐＨの範囲は、３〜１３好ましくは４〜１１、より好ましくは５から８である。これから、本発明において使用できる酵素を懸濁するための液は、上記ｐＨの範囲に入るものであれば使用できるが、代表例としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びトリス緩衝液が挙げられる。また、上記した緩衝液以外にも生理食塩水等の塩類溶液を使用してもよい。さらに、反応の間にｐＨが大きく変動しない場合、あるいはｐＨをコントロ−ルできる場合には、緩衝液を必ずしも使用する必要はない。
【００４６】
本発明における酵素の安定性を比較するための活性測定は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。好ましくは、２０μモルの臭化カリウム、２μｍｏｌの過酸化水素、６０ｎｍｏｌのモノクロロジメドンを含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．９８ｍｌと酵素調製液０．０２ｍｌを混合し、３０℃で反応させ、反応開始後、１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。対照として酵素溶液もしくは、過酸化水素を含まない系を用いて上記と同様に操作し、得られた吸光度の減少の差を求める。１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量とする。
【００４７】
本発明における酵素の安定性のうち熱安定性を比較測定するための酵素液の調製方法は、上記実施により調製した酵素調製液を、０℃〜１００℃の間で、１分間から６０分間、好ましくは５分間から３０分間、より好ましくは１０分間から２０分間、水浴もしくはブロックヒ−タ−により加熱処理を行うことである。さらに、種々の２価カチオンの存在の有無、加熱処理の実施、未実施による条件のことなる酵素液についての酵素活性を測定することにより、それぞれの酵素液の活性を測定する。
【００４８】
【実施例】
以下実施例をもって本発明をさらに具体的に説明する。本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例において組換え微生物の作成については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ エｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法に従った。
【００４９】
実施例１〜３
Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ ＲＮＡは、Ｘｉｎｇらの方法（Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４，６５０，１９８８）により単離した。鳥取県の白兎海岸の浅瀬において海藻Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａを採取し、使用まで−８０℃で保存した。凍結乾燥した海藻８．９ｇを液体窒素存在下でモ−タ−付き組織破壊装置にて破砕し４０ｍｌの２％ ＳＤＳ，１％２−メルカプトエタノ−ル、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２分間懸濁する。グアニジン塩酸を０．８Ｍになるように添加し激しく混合後、フェノ−ル／クロロフォルム、クロロフォルム抽出を行う。水層に塩化リチウムが３Ｍになるように添加し、ＲＮＡを沈殿させ、遠心分離により回収する。この沈殿を、０．８ｍｌの１％ ＳＤＳ，０．５％２−メルカプトエタノ−ル、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し最終濃度が０．５Ｍになるように酢酸カリウムを添加する。この調製液を再度、フェノ−ル／クロロフォルム、クロロフォルム抽出を行う。水層に塩化リチウムが３Ｍになるように添加し、ＲＮＡを沈殿させ、遠心分離により回収する。この沈殿を、１．２ｍｌの滅菌水に溶解することにより１．３ｍｇの全ＲＮＡが調製できた。この全ＲＮＡを鋳型として、Ｎ末端側にＮｄｅＩ制限酵素部位をもつプライマ− ＢＰ−１（５‘−ＴＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣ−３’）Ｃ末端側にＮｏｔＩ制限酵素部位をもつプライマ− ＢＰ−２（５‘−ＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＧＴＡＧＴＴＣ−３’）を用いて、ＴａＫａＲａ社ＲＴ−ＰＣＲキットにより、Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子１．８ｋｂを増幅した。次に、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、この増幅したハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をアガロ−スゲルから切りだし精製した。ｐＥＴ２１−ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）プラスミドベクタ−およびこの精製断片を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩにより３７℃で１６時間処理した。そして、これらプラスミド及び精製断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ａ／ｂｐｏを作製した。
【００５０】
得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、その培養液１／１００容量を加えて、３７℃で振とう培養し、Ａ６００が０．５から１．０に上昇したときに、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を最終濃度１ｍＭになるように添加して、３７℃で１６時間２Ｌの三角フラスコ中で８００ｍｌのＬＢ培地を含む２Ｌの三角フラスコ中、３７℃１６時間培養後、１０、０００ｇで２０分間の遠心分離条件により集菌した。回収した培養菌体９４ｇ湿重量を１ｍＭバナジン酸を含有するトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）中に懸濁し超音波破砕した後、遠心上清を１２，０００ｇ３０分間の遠心分離条件で回収し粗酵素液とした。本粗酵素液を、５０ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）に懸濁し、１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析した。本透析液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（樹脂量５００ｍｌ、４．８ｘ２９．５ｃｍ）に流速１５０ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＮａＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）で洗浄後、０．３ＭＮａＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．５）で溶出を行った。回収した活性を含む画分は遠心型簡易濃縮装置（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）と遠心分離機（ＴＯＭＹ ＴＡ−６ ロ−タ−、３、０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮した。この精製濃縮した溶出液についてハロペルオキシダ−ゼ活性を試験したところ、活性が認められた（参考、Ｍ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２８，１０５，１９９８）。
【００５１】
また、上記に調製したＣｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ 構造遺伝子断片を、Ｎ末端側にＢａｍＨＩ制限酵素部位をもつプライマ− ５‘ＢＰＯＢａｍ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣ−３’）Ｃ末端側にＸｂａＩ制限酵素部位をもつプライマ− ３‘ＢＰＯＸｂａ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡ−３’）を用いて、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲキットにより、増幅した。次に、ＳｅｐｈａｇｌａｓＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、この増幅したハロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をアガロ−スゲルから切りだし精製した。この精製断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより３７℃で１６時間処理した。そして、これから、１．１ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片と０．７ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片を作製した。次に、糸状菌クロロペルオキシダ−ゼの発現ベクタ−であるｐＴＮＴ１４（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２３８２０−２３８２７，１９９９）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより３７℃で１６時間処理し、発現ベクタ−部分にＢＰＯ ０．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２０を作製した。この組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２０から、プラスミドの抽出を行い、制限酵素ＢａｍＨＩにより３７℃で１６時間処理した。発現ベクタ−部分にＢＰＯ １．１ｋｂのＢＰＯ ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２８を作製した。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ１タ−ミネ−タ−領域０．３ｋｂ断片をプラスミドｐＰＩＣＺａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から、Ｎ末端側にＸｂａＩ制限酵素部位をもつプライマ− ５‘ＰＩＣＸｂａ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＧ−３’）Ｃ末端側にＰｓｔＩ制限酵素部位をもつプライマ− ３‘ＰＩＣＰｓｔ（５‘−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣ−３’）を用いて、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲキットにより、増幅した。
【００５２】
この増幅断片を、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、アガロ−スゲルから切りだし精製した。この精製断片を、制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩにより３７℃で１６時間処理した。組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ２８から調製したプラスミドｐＴＮＴ２８を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩにより３７℃で１６時間処理したのち、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて、アガロ−スゲルから切りだし精製した。
【００５３】
ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで制限酵素消化した発現ベクタ−ｐＴＮＴ２８にＸｂａＩ及びＰｓｔＩで制限酵素消化したＣＹＣ１タ−ミネ−タ−領域０．３ｋｂ断片をＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社）を用いて１６℃で１６時間反応させ連結した。この連結したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡社）に塩化ルビジウム法により形質転換し組換え微生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＮＴ３０を作製した。
【００５４】
得られたプラスミドｐＴＮＴ３０をＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１に定法により形質転換し酵母発現形質転換株Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を得た。（参考 Ｔ．Ｏｈｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０，５９５，２００２）
【００５５】
Ｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ由来のブロモペルオキシダ−ゼの遺伝子を組み込んだプラスミドｐＴＮＴ３０をＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１（ＡＴＣＣ２０８２７５）に導入した酵母発現形質転換株Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を寒天２．０％を有する０．６７％Ｙｅａｓｔ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ ｗ／ｏＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ，２％ Ｇｌｕｃｏｓｅ，５０μｇ／ｍｌ Ｌ−Ｌｅｕ、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−Ｔｒｐの培地組成を有する培地（以下ＹＧＬＴと称する）２０ｍｌの平板培地に画線接種し、３０℃で２日間静地培養した培養することにより種菌株を準備する。プレ−ト上の本Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＪ１９９１／ｐＴＮＴ３０を、３００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌのＹＧＬＴ培地に白金耳接種し、２日間、３０℃で振とう培養し前培養とする。さらに、２Ｌの坂口フラスコに最終濃度２．５％Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２．５％Ｔｒｙｐｔｏｎｅの培地８００ｍｌに４０％Ｇａｌａｃｔｏｓｅ １００ｍｌ及び前培養液 １００ｍｌを接種し、３０℃で２日間振とう培養し本培養として、増殖が定常期に入るように培養し、一定量の菌体を含む培養液を調製する。この様にして調製された培養液から遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）によって菌体を回収し、必要であれば、水、緩衝液または生理食塩水等で菌体を洗浄する。
【００５６】
以下のようにハロペルオキシダ−ゼを精製調製する。精製手順は全て４℃以下で行った。このようにして回収した菌体３６５ｇを、トリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）中に懸濁し、８００ｍｌとした。そして、懸濁液を直径０．４５〜０．５ｍｍのガラスビ−ズ４０〜１０００ｍｌ、好ましくは２００〜５００ｍｌを用いてＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ Ａ． Ｂａｃｈｏｆｅｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ Ｂａｓｅｌ ５／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｔｙｐｅ ＫＤＬ−Ｓｐｅｃｉａｌ、容量６００ｍｌ、３、０００ｒｐｍ、流速２００ｍｌ／分、２℃）で処理した。菌体懸濁液がＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ容器に入ってから完全に出終わるまで１回とし、破砕液上清の２８０ｎｍの吸光度がほぼ一定になるまで処理を繰り返した。この菌体破砕液を４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、５〜２０分）し上清を無細胞抽出液とした。
【００５７】
無細胞抽出液を氷冷しながら、固体硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和にし、これを４℃で２時間攪拌して、４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。この上清に固体硫酸アンモニウムをさらに加えて６０％飽和にした。これを４℃で２時間攪拌して、４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。固体硫酸アンモニウム添加中は、１４％アンモニア水溶液を添加しｐＨを７．０に保持する。個体硫酸アンモニウム６０％飽和溶液を４℃で遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）した。そしてその沈殿物を５０ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）に懸濁し、１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析する。
【００５８】
固体硫酸アンモニウム６０％飽和溶液の遠心分離沈殿物のトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）懸濁物の透析処理後液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（樹脂量４９０ｍｌ、５ｘ２５ｃｍ）に流速１００ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＫＣｌ次いで０．３ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄後、０．４ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）でステップワイズ溶出を行った。回収した活性を含む画分は限外濾過装置（ＭＯＤＥＬ８２００、Ａｍｉｃｏｎ）と限外濾過膜（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）により濃縮後、この濃縮液を１００倍容量の同緩衝液で４回以上充分に４℃で透析した。
【００５９】
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム後透析処理を行ったハロペルオキシダ−ゼ溶液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（樹脂量２５ｍｌ、１．５ｘ１４ｃｍ）に流速１０ｍｌ／ｈで負荷し０．２ＭＫＣｌ次いで０．３ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄後、０．４ＭＫＣｌを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）でステップワイズ溶出を行った。回収した活性を含む画分は遠心型簡易濃縮装置（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）と遠心分離機（ＴＯＭＹ ＴＡ−６ ロ−タ−、３、０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮した。
【００６０】
また、海藻の酵素は、採取後、冷水にて洗浄し、紙タオルなどの間に挟み余分な水分を除去する。その後、５００ｍｇの海藻あたり４０メッシュの海砂を加えて冷却化で破砕して、４ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で抽出した。その後の操作は、塩析、吸着クロマトグラフィ−、イオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過などの公知の方法を適宜組み合わせ組換え微生物からの調製と同様に調製した。
【００６１】
このようにして調製した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素液及び組換え微生物由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素液を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだｐＨ３．８の１００ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液に対して２４時間透析する。これにより酵素内部に存在する金属イオンを除去する。次にトリス緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ７．４）で２４時間透析を行い、アポ酵素とした。このようにアポ化した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素及び組換え微生物由来のハロペルオキシダ−ゼ酵素を１ｍＭのバナジン酸のみ、もしくは、１ｍＭのバナジン酸及び１ｍＭのカルシウムと共に３０℃で１２時間保温しホロ酵素とした。そして、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０℃で、２０分間、湯浴により加熱処理を行った。このような加熱処理を施した酵素液のハロペルオキシダ−ゼ活性をモノクロロジメドンを基質としてモノクロロモノブロモジメドンを生産物として測定した結果を、図１に示す（実施例１）。図１よりカルシウムを含有することにより熱安定性が向上することが示された。
【００６２】
次に、アポ化した組換え微生物から調製した酵素液を、１ｍＭバナジン酸およびそれぞれ１ｍＭのカルシウム、ストロンチウム、マグネシウム、アルミニウム、銀の各金属と共に保温することによりホロ化した後、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃で、２０分間、湯浴により加熱処理を行った。このような加熱処理を施した酵素液のハロペルオキシダ−ゼ活性をモノクロロジメドンを基質としてモノクロロモノブロモジメドンを生産物として測定した結果を、図２に示す（実施例２）。図２よりカルシウム、ストロンチウム、マグネシウムの添加が熱安定性を向上させることが示された。
【００６３】
組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液を１ｍＭバナジン酸と保温した酵素と天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素について熱安定性を測定した結果を図３に示す。本図３における海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼの熱安定性のグラフと図１の１ｍＭのバナジン酸のみでホロ化した天然の海藻由来のハロペルオキシダ−ゼの熱安定性のグラフを比較すると同等であることが示された。これにより、天然の海藻から調製されたハロペルオキシダ−ゼは、熱安定性測定に十分なバナジウムイオンを含有していると考えられた。また、図３に示される１ｍＭバナジン酸と保温した組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼ酵素液の熱安定性のグラフと図１の天然の海藻および組換え微生物それぞれから調製し１ｍＭバナジン酸および１ｍＭのカルシウムと保温することによりホロ化したハロペルオキシダ−ゼ酵素液の熱安定性のグラフを比較すると同等であることが示された。これにより、図３に示される組換え微生物から調製し１ｍＭバナジン酸によりホロ化したハロペルオキシダ−ゼ酵素液には、その結晶構造の解析から予想されるように充分なカルシウムイオンが含まれていることが示された（実施例３）。つまり、２価の金属カチオンを含有する適当な天然培地などを用いて組換え微生物などを培養することによりハロペルオキシダ−ゼを調製するかもしくは、天然の海藻からもしくは組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼに２価の金属カチオンを存在させることによりハロペルオキシダ−ゼの熱安定性が向上されることが示された。
【００６４】
酵素の活性測定は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。２０μｍｏｌの臭化カリウム、２μｍｏｌの過酸化水素、６０ｎｍｏｌのモノクロロジメドンを含む、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．９８ｍｌと酵素調製液０．０２ｍｌを混合し、３０℃で反応させ、反応開始後、１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。対照として酵素溶液もしくは、過酸化水素を含まない系を用いて上記と同様に操作し、得られた吸光度の減少の差を求めた。１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量とした。
【００６５】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明は、ハロペルオキシダ−ゼ中に２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ、そのハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法、及びハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物が、水性媒体中で２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法を提供する。これによりハロペルオキシダ−ゼを用いる物質変換反応において、ハロペルオキシダ−ゼの安定化を促進し、産業的応用に有用となる熱安定性の向上ができるようになるものである。
【００６６】
また、本発明のハロペルオキシダ−ゼ及びその安定化方法は、ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価金属カチオンであるカルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも一種を用いることにより簡便に行われる方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然の海藻及び組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼにカルシウムイオンを存在させたハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。
【図２】２価の金属カチオンを存在させたハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。図中、Ｖはバナジン酸を、Ａｇ、Ａｌ、Ｓｒ、Ｍｇ、Ｃａはそれぞれ金属カチオンの添加を示す。
【図３】天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼ及びバナジン酸と保温した組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼの熱安定性を示す図である。図中、Ｗｉｌｄは天然の海藻から調製したハロペルオキシダ−ゼを、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔは組換え微生物から調製したハロペルオキシダ−ゼを示し、Ｖｈａバナジン酸添加、Ｃａはカルシウム添加を示す。
Claims (18)
- ２価の金属カチオンおよびバナジウムをサブユニットあたり１分子づつ含有することを特徴とするハロペルオキシダ−ゼ。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項１記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項７記載のハロペルオキシダ−ゼ。
- ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物中に２価の金属カチオンを存在させることを特徴とするハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- ハロペルオキシダ−ゼを含有する調製物が、水性媒体中で２価の金属カチオンを存在させることを特徴とする請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがノンヘム型のハロペルオキシダ−ゼである請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のハロペルオキシダ−ゼである請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のブロモペルオキシダ−ゼである請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ 属海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該ハロペルオキシダ−ゼがバナジウム依存型のｃｏｒａｌｌｉｎａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ海藻由来のブロモペルオキシダ−ゼである請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該２価金属カチオンが、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ラジウムイオンであるアルカリ土類金属イオンからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該２価金属カチオンが、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、マグネシウムイオンからなる群より選ばれた少なくとも１６種である請求項９記載のハロペルオキシダ−ゼの安定化方法。
- 該２価金属カチオンの濃度が１ｍＭ以上である請求項９記載の安定化方法。
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Cited By (6)
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