PT1437401E - Oxidorredutase - Google Patents

Description

ΡΕ1437401 1 DESCRIÇÃO "OXIDORREDUTASE" A presente invenção diz respeito a uma oxidorredutase, uma sequência de DNA da oxidorredutase isolada, uma proteína de fusão na base da oxidorredutase e um procedimento para obtenção enatioselectiva de ésters de S-2-hidroxi-ácidos. Ácidos 2-hidroxi e os seus ésters apresentam bases de síntese quirais importantes a partir dos quais podem ser obtidos uma série de compostos que mantêm a quiralidade no átomo C2, por exemplo epoxidos, ésteres alquilo, ésteres de hidrazinilo, ésteres alfa-N-alcoxiamino ou ésteres alfa-amino.

Até agora foram dedicados numerosos trabalhos de investigação ao desenvolvimento de métodos para a preparação de ácidos 2-hidroxi e os seus ésters enantioméri-camente puros, nas quais foram consideradas diferentes reacções químicas e biocatalíticas. Até agora ainda não se conseguiu desenvolver procedimentos que preencham os requisitos para a produção à escala industrial. Especialmente para a produção de ácidos 2-hidroxi e os seus ésters, a introdução de centros quirais catalisada por enzimas parece superior à síntese por meio de catalisadores químicos. 2 ΡΕ1437401

De entre os procedimentos catalisados por enzimas existem, de momento, três procedimentos diferentes. Uma via é a sintese de cianidrina quiral catalisada por oxini-trilase seguida de hidrólise, também frequentemente catalisada por enzimas (Biotransformations in Organic Chemistry, A Textbook. 4th Edition, Springer (2000), K.Faber; Cyanhydrin formation). A desvantagem deste procedimento é a utilização de HCN, tóxico.

Um outro procedimento é a separação racémica de ésters de ácidos 2-hidroxi com a ajuda de lipases, por exemplo de Pseudomonas flourescens, Kalaritis, P. et al.). A desvantagem deste método é o rendimento teórico de somente 50%.

Um outro procedimento é a sintese de ácidos 2-hidroxi quirais e os seus ésters através da redução de ácidos 2-oxo pro-quirais ou dos seus ésters. São conhecidas as transformações com células inteiras de levedura ou células de Proteus vulgaris ou Proteus mirabilis ou procedimentos com enzimas isolados. No caso das transformações com células de leveduras inteiras a actividade enzimática re-dutiva sobre os ácidos 2-oxo foi atribuída à enzima lactato desidrogenase ou malato desidrogenase (Ramesh N. Patel Stereoselective Biocatalyse, NY (2000), 14. Tereoselective Synthesis of Chiral Compounds Using Whole- Cell Bioca-talysis, Paola D'Arrigo, Giuseppe Pedrocchi-Fantoni and Stefano Servil), enquanto no caso de reduções realizadas 3 ΡΕ1437401 com Proteus parece ser responsável uma proteína ferro-enxofre de membrana dependente do molibdeno (Eur J Biochem (1994); 222(3):1025-32, The (2R)-hydroxycarboxylate-vio-logen-oxidoreductase from Proteus vulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein, Trautwein T, Krauss F, Lottspeich F, Simon H.)·

Em procedimentos conhecidos para a redução de ésters de ácidos 2-oxo são utilizadas os enzimas isolados (D/L)-Lactato desidrogenase (US 5,686,275), (D/L)-di-hidro-xiisocaproato desidrogenase (US 6,033,882) ou D-mandelato desidrogenase (Appl Environ Microbiol 2002 Feb; 68(2):947-51, Two forms of NAD-dependent D-mandelate dehydrogenase in Enterococcus faecalis IAM 10071. Tamura Y. et al 10), que podem também ser obtidos clonados, sobreexpressos e comercialmente. Estes enzimas são dependents do NADH e não transformam ésters de ácidos 2-oxo. Além disso é conhecido que enzimas que reduzem ácidos 2-oxo ou os seus ésteres, não transformam álcoois secundários.

Além disso são conhecidos procedimentos em que o coenzima NAD é regenerado com formato desidrogenase, por exemplo de Candida boidinii ou recombinante de Pseudomonas floureszens (Biotechnology, Biotransformations I (Rehm and Reed) 9. Alcohol Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions J. Peters Wiley-VCH-Verlag, (1998)). Exemplar é o procedimento para a produção enzimática de ácido R-2-hidroxi-4-fenil-butírico com a ajuda de D-lactato desidrogenase de Staphylococcus epidermidis (Industrial 4 ΡΕ1437401

Biotransformations, Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Wiley-VCH-Verlag, (2000)). Desvantagem da regeneração do coenzima com formato desidrogenase é a baixa actividade específica da formato desidrogenase (4 a 10 U/mg) e os elevados custos para a produção do enzima. Assim, do ponto de vista económico é necessário utilizar o enzima várias vezes o que resulta num processo comparativamente bem mais complicado e por isso mais caro.

Uma missão da invenção é remediar as desvantagens mencionadas do procedimento da técnica actual, por meio de uma oxidorredutase.

Esta missão é resolvida, de acordo com a invenção, através de uma oxidorredutase, que reduz ésters de ácidos 2-oxo aos correspondents ésters de S-2-hidroxi-ácidos na presença de NADPH e água, e é caracterizado em que apresenta mais do que 70% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18 e uma actividade específica de mais do que 1 ymol por mg, no que diz respeito à transformação de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo a S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A invenção diz respeito, entre outras a oxidorre-dutases que podem ser obtidas de Lactobacillus (L. reuteri, L. Kefiri, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus ou L. fermentum. A invenção diz aida respeito à oxidorredutase de 5 ΡΕ1437401

Lactobacillus reuteri, que apresenta a sequência de amino-ácidos de acordo com a SEQ ID NO: 18, como descrito no protocolo de sequências junto.

Preferidas são oxidorredutases que apresentam 80% a 99,5%, especialmente 90% a 99,5%, especialmente preferidas de 99% a 99,5% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:18.A medição da actividade especifica da oxidorreducatse de acordo com a SEQ ID NO:18 ou dos seus derivados ou análogos é realizada com o sistema teste que vai ser descrito no exemplo 2. A invenção diz respeito ainda a uma oxidor-redutase que é caracterizada em que ela apresenta 2 a 50 aminoácidos a mais ou 1 a 50 aminoácidos a menos do que a oxidorredutase com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18. Preferidas são oxidorredutases em que se encontram 1 a 25 aminoácidos, especialmente 2 a 20 aminoácidos, preferencialmente 3 a 10 aminoácidos mais ou menos do que a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18. A invenção diz respeito ainda a uma oxidorredutase, que é caracterizada em que ela apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e é modificada uma, duas, três, quarto ou cinco vezes através de um polímero solúvel em água. Um exemplo de um polímero solúvel em água é polietilenoglicol. A ligação do polietilenoglicol ocorre preferencialmente na extremidade N-terminal da oxidorredutase de acordo com SEQ ID NO: 18. A oxidorredutase de 6 ΡΕ1437401 acordo com SEQ ID NO: 18 pode também estar ligada a um sólido tal como polietileno, polistirol, polisacárido, celulose ou derivado de celulose. A invenção diz ainda respeito a uma proteína de fusão que é ainda caracterizada em que apresenta a oxidor-redutase com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18 e que a oxidorredutase está ligada a um outro polipéptido no terminal N- ou no terminal carboxi através de uma ligação peptídica. As proteínas de fusão podem, por exemplo ser separadas mais facilmente de outras proteínas ou são expressas nas células em maiores quantidades. A invenção diz ainda respeito a um anticorpo que se liga especificamente à oxidorredutase de acordo com a SEQ ID NO:18. A produção deste anticorpo ocorre por de métodos conhecidos através da imunização de mamíferos adequados tais como cavalo, ratinho, rato ou porco e subsequente obtenção dos anticorpos. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. A invenção diz ainda respeito a uma sequência de ácidos nucleicos isolada, que codifica para a oxidorredutase de acordo com a SEQ ID NO:18. A invenção diz respeito, além disso, a uma sequência isolada de ácido desoxiribonucleico (sequência de DNA) da oxidorredutase que catalisa a redução de ésters de ácidos 2-oxo na presença de NADPH e água aos correspondents 7 ΡΕ1437401 ésters de S-2-hidroxi-ácido, em que a sequência de DNA escolhida pertence ao grupo que consiste em a) SEQ ID NO:19 ou a sua cadeia complementar b) uma sequência de DNA que hibridiza com a sequência de DNA de acordo com a) ou com a sua cadeia complementar, em que a hibridização ocorre sob condições es-tringentes e c) uma sequência de DNA, que devido à degeneração do código genético, codifica uma proteína que é codificada por uma ou mais sequências de DNA de acordo com a) ou b) . A hibridização está descrita, por exemplo por Sambrok e Russel em Molecular Cloning a laboratory Manual, Vol 1, Capítulo 1, Preotocolo 30-32. A invenção diz respeito, além disso a uma sequência de DNA isolada que é caracterizada em que ela apresenta mais do que 70% de identidade com a sequência de DNA SEQ ID NO: 19 ou a sua cadeia complementar e codifica uma proteína que apresenta uma actividade específica de mais do que lymol por mg, no que diz respeito à conversão de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo a S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Preferidas são sequências de DNA que apresentam 80% a 99,5%, especialmente 90% a 99,5%, preferida 99% a 99,5% de identidade com a sequência de DNA SEQ ID NO:19. ΡΕ1437401 A invenção diz respeito além disso a um vector de clonagem que contem uma ou mais das referidas sequências de ácido nucleico ou de DNA. A invenção diz respeito além disso a um vector de expressão que se encontra em células de bactérias, leveduras, insectos, plantas ou mamiferos e que contem uma ou mais das sequências acima referidas de ácido nucleico ou DNA e está ligado de forma apropriada a uma sequência de controlo de expressão. A invenção diz respeito ainda a uma células hospedeiro, que é uma células de bactéria, levedura, insecto, planta ou mamífero e foi transformada ou transfec-tada com um dos vectores de expressão acima referidos. A identidade das referidas sequências de DNA ou sequências de proteínas são calculadas de modo que se soma o número de aminoácidos ou bases de ácido nucléico que são idênticos a parte das sequências de proteína ou DNA, se divide pelo número total de aminoácidos ou bases de ácido nucléico e se multiplica por cem.

Vectores de clonagem apropriados são, por exemplo vectores ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratage-ne), pDrive cloning Vector (Qiagen), pS Blue, pET Blue, pET LIC (Novagen) assim como vectores de clonagem TA-PCR (Invitrogene).

Vectores de expressão apropriados são, por exemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, 9 ΡΕ1437401 pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRMl/pRM9, pTrxFus, pASl, pGEx, pMAL, pTrx.

Sequências de controlo de expressão apropriadas são por exemplo promotor trp-lac(tac), promotor trp-lac (trc), promotor lac, promotor T7, promotor XpL. A oxidorredutase de Lactobacillus reuteri é um homodímero com um peso molecular, determinado num gel SDS, de 30 a 35 kDa e um peso molecular, determinado por cro-matografia de permeação em gel, de 60 a 65 kDa. O óptimo de temperatura encontra-se no intervalo de 55°C a 60°C e tem um pH óptimo de 6,5 a 7,0. A oxidorredutase de Lactobacillus reuteri apresenta uma boa estabilidade a temperatura e pH e é estável durante pelo menos 5 horas num intervalo de ph de 4,5 a 8,5 e num intervalo de temperatura de 15°C a 50°C e apresenta ainda uma elevada estabilidade em solvents orgânicos. O enzima é isolável especialmente a partir de microorganismos do género Lactobacillus e pode ser detec-tado num teste espectrofotométrico pela diminuição de NADPH a 340 nm em presença de um substrato apropriado, por exemplo ácido etil-2-oxo-4-fenilbutírico ou ácido etil-2-oxovalérico. A oxidorredutase de acordo com a invenção, de Lactobacillus reuteri, foi clonada e pode ser sobre-expres-sa em Escherichia (E.)coli com actividades de lOOOOU/g a 10 ΡΕ1437401 30000 U/g de peso húmido de E.coli. O enzima é assim barato e disponível em grandes quantidades. Em bancos de dados não foram encontradas sequências aparentadas, só pode ser presumido um parentesco longíquo com enzimas do grupo hidroxiacil-CoA desidrogenases.

Num procedimento para obtenção da oxidorredutase de Lactobacillus reuteri, o DNA que codifica a oxidorredutase de Lactobacillus reuteri é expresso num microorganismo procariota ou eucariota apropriado. Preferencialmente a oxidorredutase de Lactobacillus reuteri é transformada numa estirpe de Escherichia coli, especialmente em células Escherichia coli BL21star (DE3) (Invitrogen cat No. C6010-03) derivada de E.coli BL21, com cópia cromossómico do gene de RNA-polimerase T7, sob controlo do promotor lacUV5, sem ompT e proteaseLon, B121 star tem mutação em RnaseE (rnel31) . A oxidorredutase pode ser obtida por exemplo, cultivando as células recombinants de Escherichia coli, induzindo a expressão da oxidorredutase e, em seguida, após cerca de 10 a 18 horas, lisando as células por meio de sonificação ou moagem húmida com contas de vidro num moinho apropriado (Retsch, 10 min, 24 Hz) . O extracto celular obtido pode ser, ou utilizado directamente, ou ser adicionalmente purificado. Para isso o extracto celular pode ser, por exemplo, centrifugado e o sobrenadante obtido submetido a cromatografia por interacção hidrofóbica, por exemplo cromatografia por interacção hidrofóbica em 11 ΡΕ1437401 butilsepharose Fast Flow (Pharmacia) , seguida de permeação de gel (Superdex 200 HR, Pharmacia). A invenção diz ainda respeito a um procedimento para obtenção enantio-selectiva de ésters de S-2-hidroxi-ácidos, que é caracterizado em que, se reduz ésters de ácidos 2-oxo em presença de oxidorredutase, NADPH e água ao correspondente éster de S-2-hidroxi-ácido e se isola o éster de S-2-hidroxi-ácido formado. O procedimento de acordo com a invenção apresenta elevado tempo de utilização após preparação, uma pureza enantiomérica de mais de 94% dos ésters de S-2-hidroxi-ácidos e um elevado rendimento em relação à quantidade de ésters de 2-oxo-ácido utilizada.

Sob o termo "NADPH" entende-se fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido. Sob o termo "NADP" entende-se fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina.

Sob o termo ésteres de 2-oxo-ácido, entende-se

por exemplo compostos da Fórmula I R2-C(0)-C(0)-O-Rl (I) RI representa 1. alquilo-(C1-C20) de cadeia linear ou ramificada, 2. alcenilo-(C2-C20) ? em que o alcenilo é de cadeia linear ou ramificada e, dependendo do comprimento da cadeia, contem uma, duas, três ou quarto ligações duplas, 12 ΡΕ1437401 3. alcinilo-(C2-C20) , em que alcinilo é de cadeia linear ou ramificada e contem eventualmente uma, duas, três ou quarto ligações triplas. 4. arilo-(C6-Ci4) , 5. alquil (Ci-Cs)-arilo-(C6-C14), 6. heterociclo (C5-C14) que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7. cicloalquilo (C3-C7) R2 representa 1. alquilo-(C1-C20) de cadeia linear ou ramificada, 2. alcenilo- (C2-C20) , em que o alcenilo é de cadeia linear ou ramificada e, dependendo do comprimento da cadeia, contem uma duas, três ou quarto ligações duplas, 3. alcinilo-(C2-C20), em que alcinilo é de cadeia linear ou ramificada e contem eventualmente uma, duas, três ou quarto ligações triplas. 4. arilo-(Cô-Ch) , 5. alquil (Ci-Cs) -arilo- (C6-C14) , 6. heterociclo (C5-C14) que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7. cicloalquilo (C3-C7) em que os grupos mencionados acima nos pontos 1 a 7 são não substituídos ou substituídos de uma a três vezes independents uns dos outros com: 13 ΡΕ1437401

a) OH b) Halogénio, tal como flúor, cloro, bromo ou iodo, c) -NO2, d) -C (O) -O- (C1-C20) -alquilo, em que alquilo é de cadeia linear ou ramificada não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou niro ou e) heterociclo (C5-Ci4)que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro,

Pelo termo "éster de S-2-hidroxi-ácido" entende-se compostos da Fórmula II R2-C(OH)-C(O)-O-Rl (II) em que o grupo -OH está na configuração S em relação ao átomo de carbono ao qual está ligado e RI e R2 têm o significado como na fórmula.

Pelo termo arilo entende-se grupos carbonados aromáticos com 6 a 14 átomos de carbono no anel. Grupos arilo (C6-C14) são, por exemplo fenilo, naftilo, por exemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenil-ilo, por exemplo 2-bifenil-ilo, 3-bifenil-ilo e 4-bifenil-ilo, antrilo ou fluorenilo. Grupos bifenil-ilo, grupos naftilo e especialmente grupos fenilo são grupos arilo preferidos. Sob o termo "halogénio" entende-se um elemento do grupo Fluor, cloro, bromo ou 14 ΡΕ1437401 iodo. Sob o termo alquilo " -(C1-C20)" entende-se um grupo carbonado cuja cadeia carbonada é linear ou ramificada e contem 1 a 20 átomos de carbono por exemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo terciário, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonenilo ou decanilo.

Pelo termo "cicloalquilo (C3-C7)" entende-se grupos carbonados cíclicos como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo ou ciclo-heptilo. 0 termo "heterociclo (C5-C14) significa um anel heterocíclico de 5 a 14 membros, monocíclico ou bicíclico, que é parcialmente ou totalmente saturado. Exemplos de heteroátomos são N,0 e S. Exemplos do termo heterociclos (C5-C14) são grupos derivados de pirrole, furano, tiofeno, imidazole, pirazole, oxazole, isoxazole, tiazole, isotiazo-le, tetrazole, 2-óxido de 1,2,3,5-oxatiadiazole, triazolo-na, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidinadiona, triazo-le, que estão substituídos com F,-CN, -CF3 ou alquilo-C(O)-0-(Ci-C4), 3-hidroxipirro-2,4-diona, 5-oxo-l,2,4-tiadiazo-le, piridina, pirazina, pirimidina, índole, isoindole, indazole, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, quinolina, cinolina , carbolina e heterociclos benzo-, ciclopenta-, ciclo-hexa- ou ciclo-hepta-anelados. Especialmente preferidos são grupos 2- ou 3-pirrolilo, fenilpirrolilo, tais como 4- ou 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por exemplo l-metil-2-, -4- ou -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-, 3- ou N-óxido 15 ΡΕ1437401 de 4-piridilo, 2-pirazinilo, 2-, 4- ou 5-pirimidinilo, 2-, 3- ou 5-indolilo, 2-indolilo substituído, por exemplo 1-metilo, 5-metilo, 5-metoxi, 5-benziloxi-, 5-cloro ou 4,5-dimetil-2-indolilo, l-benzil-2- ou -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclo-hepta[b]-5-pirrolilo, 2-, 3-ou 4-quinolilo, 1-, 3- ou 4-isoquinolilo, 1-oxo-l,2-di-hidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzotienilo, 2-benzoxazolilo ou benzotiazolilo ou di-hidropiridinilo, pirrolidinilo, por exemplo 2- ou 3- (N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfoli-nilo, tetrahidrotienilo ou benzodioxolanilo.

Compostos preferidos da fórmula I são, por exemplo 2-oxovalerato de etilo, 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo, piruvato de etilo, glioxilato de etilfenilo, ácido etil-2-oxo-3-fenilpropiónico, 8-cloro-6-oxo-octanoato de etilo, 2-oxobutirato de etilo, 2-oxo-hexanoato de etilo, fenilglioxilato de metilo, 2-oxovalerato de metilo, piruvato de metilo, 2-oxo-4-fenilbutirato de metilo, ácido 2-metilo-2-oxo-3-fenilpropiónico, 8-cloro-6-oxooctanoato de metilo, 2-oxibutirato de metilo ou 2-oxo-hexanoato de metilo.

Os correspondents ésters de S-2-hidroxi-ácidos formados são por exemplo S-2-hidroxivalerato de etilo, S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, L-lactato de etilo ou S-mandelato de etilo.

Oxidorredutases apropriadas são provenientes por 16 ΡΕ1437401 exemplo de Lactobacillus reuteri. A oxidorredutase pode ser utilizada no procedimento de acordo com a invenção ou completamente purificada ou parcialmente purificada ou em células que a contenham. As células utilizadas podem ser nativas, permeabilizadas ou lisadas. Preferencialmente é utilizada a oxidorredutase clonada de acordo com a SEQ ID NO:18. A actividade por volume da oxidorredutase utilizada é de 250 Unidades/ml (U/ml) a 20000 U/ml, preferencialmente cerca de 10000 U a 50000 U. A unidade enzimática 1 U corresponde, nesse caso, à quantidade de enzima necessária para converter lpmol de 2-oxo-fenil butirato de etilo a S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo por minuto (min). A invenção diz ainda respeito a um procedimento para a obtenção enantiosselectiva de éster de S-2-hidroxi-ácido, que compreende a) a redução do éster de 2-oxo-ácido, na presença de oxidorredutase, NADPH e água até ao correspondente éster de S-2-hidroxi-ácido, b) a redução ao mesmo tempo do NADP formado através da oxidorredutase, com uma desidrogenase e um co-substrato, e c) o isolamento do éster quiral de S-2-hidroxi-ácido formado. 17 ΡΕ1437401

Desidrogenases apropriadas são, por exemplo álcool desidrogenases de Thermoanaerobium brockii, Lactoba-cillus kefir ou Lactobacillus brevis, requerendo estes enzimas NADPH como coenzima (DE 19 610984, EP 0 456 107 WO 97/32012).

Co-substratos apropriados para a álcool desidrogenase apropriada são álcoois tais como etanol, 2-propanol (isopropa-nol), 2-butanol, 2-pentanol ou 2-octanol.

Além disso a redução de NADP também pode ser realizada com enzimas conhecidamente utilizados para a regeneração de NADPH, por exemplo com glucose desidrogenase ou formato desidrogenase dependente de NADPH (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). O co-substrato apropriado para o procedimento de acordo com a invenção, quando se utiliza glucose desidrogenase, é glucose. Substratos apropriados da formato desidrogenase são, por exemplo sais de ácido fórmico tais como formato de amónio, formato de sódio ou formato de cálcio.

Preferencialmente é utilizada a álcool desidrogenase de Lactobacillus minor (DE 101 19274). A álcool desidrogenase pode ser utilizada, no procedimento de acordo com a invenção ou completamente purificada ou parcialmente 18 ΡΕ1437401 purificada, ou podem ser utilizadas células completas, que contêm álcool desidrogenase. As células utilizadas podem, nesse processo encontrar-se na forma nativa, permeabilizada ou lisada. Por cada kg de composto a ser convertido da fórmula I, são utilizadas 10 000 U a 200 000 U de álcool desidrogenase, preferencialmente cerca de 25 000 U a 100 000 U. A unidade enzimática corresponde ai à quatidade de enzima necessário para converter lymol de co-substrato (p.ex. 2-propanol) por minuito (min).

Preferencialmente á adicionado à água um tampão, por exemplo fosfato de potássio, Tris/HCl ou tampão de trietanolamina com um valor de pH de 5 a 10, preferencialmente um valor de pH de 6 a 9. A concentração de tampão é de 10 mM a 150 mM, preferencialmente de 90 mM a 110 mM, especialmente 100 mM. O tampão pode adicionalmente conter ainda iões para estabilizar ou activar os enzimas, por exemplo, iões magnésio para estabilizar a álcool desidrogenase de Lactobacillus minor. A temperatura no procedimento de acordo com a invenção é de, por exemplo de cerca de 10°C a 60°C, preferencialmente de 30°C a 55°C.

De acordo com uma forma de execução preferencial do procedimento, as reações são realizadas na presença de um solvente orgânico. 19 ΡΕ1437401

Os solventes orgânicos preferidos são, por exemplo éter dietilico, éter t-butil-metílico, éter diisopropí-lico, éter dibutilico, acetato de butilo, heptano, hexano ou ciclo-hexano. A mistura reaccional consiste, por aplicação de solventes adicionais, numa fase aquosa e numa fase orgânica. A fase orgânica é formada por um um solvente orgânico apropriado no qual se encontra dissolvido o substrato ou é formada pelo próprio substrato insolúvel em água. A fase orgânica constitui de cerca de 5% a 80% do volume reaccional total, preferencialmente de 10% a 40%.

No sistema de duas fases de acordo com a invenção, a água forma uma primeira fase liquida e o solvente orgânico a segunda fase liquida. Eventualmente pode ainda existir uma fase sólida ou uma fase liquida adicional, que resulta de oxidorredutase e/ou álcool desidrogenase não completamente dissolvidas ou do composto da fórmula I. No entanto é preferível duas fases líquidas sem fase sólida. As duas fases líquidas são, preferencialmente, misturadas de forma mecânica, para se produzir uma superfície grande entre as duas fases líquidas. A concentração do cofactor NADPH em relação à fase aquosa é de 0,001 mM a 0,1 mM, especialmente de 0,005 mM a 0,02 mM. 20 ΡΕ1437401

Preferencialmente é ainda utilizado, no procedimento de acordo com a invenção, um estabilizante adicional da álcool desidrogenase. Estabilizantes apropriados são, por exemplo glicerina, sorbitol ou dimetilsulfóxido (DMSO).

Os compostos da fórmula I são utilizados nos procedimentos de acordo com a invenção, numa quantidade de 10% a 60% em relação ao volume total, preferencialmente de 15% a 50%, especialmente de 20% a 40%. A quantidade de co-substrato para a regeneração de NADP a NADPH como isopropanol é de cerca de 5% a 50% em relação ao volume total, preferencialmente de 1% a 30%, especialmente de 15% a 25%. O procedimento de acordo com a invenção é efec-tuado, por exemplo, num recipiente (vaso de reacçâo) fechado de vidro ou de metal. Para isso os componentes são introduzidos separadamente no vaso reaccional e agitados sob uma atmosfera de, por exemplo, azoto ou ar. Dependendo do substrato e composto da fórmula I utilizado o tempo de reacção varia entre 1 hora e 48 horas, especialmente de 2 horas a 24 horas.

Em seguida a mistura da reacção é processada. Para isso a fase aquosa é separada, a fase orgânica é filtrada. A fase aquosa pode eventualmente ser extraida uma vez mais e adicionalmente processada, tal como a fase orgânica. Em seguida, o solvente orgânico é, eventualmente 21 ΡΕ1437401 evaporado da fase orgânica límpida. Assim se obtem, por exemplo, o produto S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo com uma pureza enantiomérica de mais de 94% e basicamente livre de eduto 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo. O rendimento total do processo é, depois da destilação do produto de 50% a 95% em relação à quantidade de eduto utilizada. A invenção vai ser ilustrada através dos exemplos seguintes:

Exemplo 1 Rastreio de oxidorredutases para redução de ésteres de ácidos 2-oxo em estirpes do género Lactobacillus.

Para o rastreio foram cultivadas diversas estirpes do género Lactobacillus no seguinte meio (dados em g/1) : glucose (20), extracto de levedura (5), extracto de carne (10), hidrogenocitrato de di-amónio (2), acetato de sódio (5), sulfato de mangano (0,05), hidrogenofosfato de di-potássio (2) . O meio foi ésterilizado a 121°C e as estirpes do género Lactobacillus (em seguida abreviado por L.) foram cultivadas sem regulação adicional de pH ou adição de oxigénio.

Em seguida 125 mg de células foram ressuspensas em 800 μΐ de tampão (Trietanolamina (TEA) 100 mM, pH 7,0), adicionadda 1 g de contas de vidro e abertas 10 min a 4°C num moinho de bolas (Retsch). O sobrenadante obtido após 2 minutos (min) de centrifugação a 12000 rotações por minuto 22 ΡΕ1437401 (rpm), foi utilizado no rastreio de actividade para determinação do excesso de enantiómero. Como substrato foram utilizados 2-oxopentanoato de etilo e 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo.

Mistura Reaccional para Rastreio de Actividade: 860 μΐ 0,1 Μ KH2PO4/K2PO4 pH=7,0 MgCl2 1 mM 20 μΐ NADPH/NADH (10 mM) 20 μΐ lisado 100 μΐ substrato (100 mM) A reacção foi monitorizada durante 1 min a 340 nm.

Mistura Reaccional para determinação do valor do ee 20 μΐ lisado 100 μΐ NADH/NADPH (50 mM) 60 μΐ Substrato (2-oxo-4-fenilbutirato de etilo) A mistura reaccional para determinação do ee foi extraída após 24 horas (h) com clorofórmio e analisado o excesso enantiomérico por meio de GC. O excesso enantiomérico calcula-se como se segue: ee(%)= ((R-álcool-S-álcool)/(R-álcool+S-álcool)) x 100 ΡΕ1437401 23

Tabela 1 N°. DSMZ Nome Actividade 2-oxo-4-fenil-butirato de etilo em U/g células organismo hospedeiro Actividade 2-oxcpentanoato de etilo em U/g células organismo hospedeiro NADH NADPH Valor ee 20011 L. casei 0 0 — 0 0 20019 L. curvatus var. curvatus 0 0 — 0 0 20184 L. farciminis 0 0 — 0 0 20243 L. gasseri 0 0 — 0 0 20249 L. alimentarius 0 0 — 0 0 20494 L. sakei 0 0 — 0 0 20555 L. salivarius var. salivarius 0 0 — 0 0 20557 L. jensenii 0 0 — 0 20074 L. delbrueckii var. Delbruckii 0 0 — 0 0 20001 L. coryniformis var. coryniformis 0 0 — 0 0 20190 L. haloterans 0 0 — 0 0 20016 L. reuteri 0 12,3 94%S 0 21,1 20003 L. bifermentans 0 0 — 0 0 L. kefiri 0 2,5 26% 0 7,7 4864 L. oris 0 0 — 0 0 20515 L. collinoides 2,6 3,4 26% 2,5 7,7 20014 L. minor 0 0 — 0 0 20593 L. kandleri 3,6 3,6 32% 4,3 12,8 5705 L. parabuchneri 0 5,1 38% 0 11,3 20349 L. fructosus 0 0 — 0 0 20055 L. cellobiosus 0 12,3 92% 0 13,3 20015 L. reuteri 0 12 96,6%S 0 26 20049 L. fermentum 0 7,7 82% 0 6,8 20052 L. fermentum 0 0 — 0 0 24 ΡΕ1437401 DSMZ significa "Deutsche Sammlung fur Mikroor-ganismen und Zellkulturen-Colecção Alemã para Microorga-nismos e Cultura de Células", Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig.

Da Tabela 1 decorre que no género Lactobacillus apresentam-se vários tipos de oxidorredutase dependente de NADPH com 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo ou 2-oxopentanoato de etilo como substrato.

Definição da unidade enzimática: 1 U corresponde à quantidade de enzima requerido para converter 1 ymol de substrato por minuto.

Exemplo 2: Isolamento de uma oxidorredutase dependente de NADPH a partir de Lactobacillus reuteri

Para isolamento de uma oxidorredutase dependente de NADPH a partir de Lactobacillus reuteri, o organismo foi cultivado como descrito no exemplo 1. Após terem atingido a fase estacionária, as células foram colhidas e separadas do meio por centrifugação. A libertação do enzima ocorreu através de moagem húmida por meio de esferas de vidro, mas também podia ter sido efectuada por outros métodos de abertura. Para isso, 20 g de L. reuteri foram suspendidas em 80 ml de tampão de lise (100 ml de trietanolamina, 1 mM MgCl2 pH=7) e após adição de 80 ml de esferas de vidro ocorreu a abertura das células por meio de um moinho de esferas (Retsch, 10 min, 24 Hz). 25 ΡΕ1437401

Ao extracto crú obtido após a centrifugação foram adicionadas 242 mg de (NH4)2S04 para uma concentração final de 50% de sulfato de amónio e foi agitado lh a 4°C. Em seguida o pellet foi precipitado por centrifugação a 12000 rpm durante 10 min e o sobrenadante obtido foi purificado por meio de FPLC. O enzima foi purificado por cromatografia de interacção hidrofóbica em Fast Flow butil Sepharose e em seguida permeação de gel (Superdex 200 HR, Pharmacia). Para isso o sobrenadante após a precipitação com sulfato de amónio foi directamente aplicado numa coluna FF de butil sepharose equilibrada com TEA 100 mM pH=7,0 e (NH4)2S04 1M e eluido com um gradiente salino linear decrescente. O enzima foi ai diluido a (NH4)2S04 0M. As fracções activas foram purificadas e restritas a um volume apropriado através de ultrafiltração (limite de exclusão 10 kDa). A actividade enzimática da oxidorredutase é determinada num sistema teste de acordo com o exemplo 1, (Rastreio de actividade) e a determinação da quantidade de proteína ocorreu de acordo com Lowry et al. Journal of Biological Chemistry. 193 (1951): 265-275 ou Peterson et al., Analytical Bioche-mistry, 100 (1979) : 201-220) . Do quociente entre a actividade enzimática e a quantidade de proteína resulta a actividade específica, na qual a conversão de lymol por min, corresponde a 1 Unidade (U).

Em seguida, a preparação enzimática crua foi adicionalmente purificada por meio de permeação de gel (TEA 100 mM pH=7,0 NaCl 0,15 M, MgCl2 1 mM) e, ao mesmo tempo 26 ΡΕ1437401 determinado o peso molecular do enzima nativo. Como padrões de peso molecular foram utilizadas Catalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), Albumina (69,8 kDa) e Ovalbumina (49,4 kDa) .

Tabela de purificação

Tabela 2

Passo de Volume Actividade Actividade Actividade Espe- Rendimento purificação [ml] [U/ml] Total[U] cífica [U/mg] Extracto crú 20 9,3 186 0,25 100% Precipitação 20 5,4 109 0,83 57% (NH4)2S04 Butilsepharose 1 20 20 54 10% Permeação de gel 0,1 20 2 120 1,1% O peso molecular determinado através de permeação de gel da proteína no estado nativo é de 60 í 5 kDa.

Exemplo 3: Determinação da sequência N-terminal e determinação de um péptido interno após digestão „in gel" A preparação enzimática foi separada após a permeação de gel num gel de 10% dodecilsulfato de sódio (SDS) e aplicada numa membrana de PVDF. A banda peculiar a cerca de 30 a 35 kDa foi submetida a sequenciação N-terminal por meio de degradação de Edman (procise 492, PE-Biosystems. Foi obtida a seguinte sequência N-terminal): 27 ΡΕ1437401 SEQ ID 1:

MKNIMIAGAGVLGSQ A banda SDS-PAGE da mesma proteína foi reduzida com ditiotreitol, carboximetilada e digerida com endopro-teinase Lys-C. Os péptidos obtidos foram separados numa coluna capilar de HPLC 300 pm x 150 mm (Vydac RP18, LC Packings. Foram colhidas manualmente 25 gracções e testadas para o péptido adequado à sequenciação. A fracção 12 com MH+=1491.8 foi sequenciado com degradação de Edman e obteve-se a seguinte sequência: SEQ ID 2:

SDYERDLHLTDK

Exemplo 4: Clonagem do enzima 4.1. Clonagem de um fragmento de gene específico de L. reuteri com ajuda de PCR (Polymerase chain reaction). O DNA cromossómico foi extraído das células de Lactobacillus reuteri, segundo o método descrito em "Molecular cloning" de Maniatis & Sambrook. O DNA genómico resultante serviu como matriz para a reacção em cadeia por polimerase (PCR) com sequências iniciadoras degeneradas. Nesse processo as sequências iniciadoras 5' degeneradas da sequência de aminoácids N-terminal (seq. No:l) e as sequências iniciadoras 3' da sequência de aminoácidos de um 28 ΡΕ1437401 péptido de localização interna foram deduzidas com a inclusão do código genético universal (Seq No:3, 4, 5 e 6).

Os construtos de sequências iniciadoras estão listados em seguida

N=A,T,C ou G; Y=T ou C; R=A ou G

As sequências iniciadoras foram produzidas de acordo com procedimentos conhecidos. 5'-01igo 3: ATGAARAAYATYATGATY GCHGGCGC 5'-01igo 4:

ATGAARAAYATYATGATY GCHGGTGC 3'-01igo 5:

RTGHARATCMCGTTCRTAATC 3'-oligo 6:

RTGHARATCMCGTTCRTAGTC A amplificação foi realizada em tampão de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mM, MgC12 2,5 mM, mistura de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP)l mM, 30 pMol de cada Sequência iniciadora e 2,5 U de AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Após uma activação da AmpliTaq Gold Polimerase (10 min, 94°C) e 35 ciclos de PCR seguintes (94°C, 60 sec; 29 ΡΕ1437401 53°C, 45 sec; 72°C, 60 sec) a reacção foi arrefecida a 4°C e a mistura total de PCR foi aplicada num gel de agarose 1%, para análise.

4.2 Subclonagem do produto de amplificação de PCR

Um fragmento específico do gene (S)-ADH de L. reuteri identificado a 200 bp foi, após purificação em gel (kit de extracção Qiaex Agarose), ligado ao vector de clonagem TA-Cloning pCR2.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) . Após a transformação de 2yl da mistura de ligação em células E.coli Top 10F', foi feito um screen (triagem) do DNA das colónias originadas quanto à presença do plasmídeo pCR2.1 com um fragmento de PCR de 200bp integrado. Para isso foi realizada uma análise de restrição com endonuclease Eco RI. Em seguida foram sequenciados clones positivos com as seguintes sequências iniciadoras:

Ml3 rev: 5'CAGGAAACAGCTATGACC 3' e Ml3 uni: 5'TGTAAAACGACGGCCAGT 3'

com a ajuda de sequências DNA ABI A análise da sequência do fragmento de gene de 159 bp (Seq. No:7) mostrou uma grelha de leitura aberta de 53 aminoácidos, nas quais também se pode encontrar os dois fragmentos de sequência do terminal N e do péptido interno. 30 ΡΕ1437401 4.3 Clonagem do segmento de gene de comprimento total que codifica para (S)-ADH em L. reuteri

Baseado na sequência nucleotidica do fragmento de gene de 159 bp do exemplo 4.2 foram construídos pares de sequências iniciadoras específicas para uma reacção em cadeia por polimerase inversa (iPCR)com o seguinte Nest-PCR (Seq. No:8,9,10 e 11) .

Nesse processo as sequências iniciadoras 8 e 9 são complementares ao terminal 3' do fragmento de gene encontrado e as sequências iniciadoras 10 e 11 complementares à região na vizinhança do terminal 5'.

Oligo 8: ATCCGGCTTTAATGTCAGCGT Oligo 9:

CGACGGATTAAGGCGCTGAAAAG

Oligo 10:

CTACCTAATACGCCAGCACCAG

Oligo 11:

GCCAGCACCAGCAATCAT DNA cromossómico de células de L. reuteri foi digerido com endonuclease de Eco RI e utilizado para religação com T4 ligase. Os fragmentos de DNA cromossómico ΡΕ1437401 31 circular resultantes servem de matriz para o iPCR. Foram realizados os seguintes ciclos de amplificação de um PCR num tampão de PCR (ver exemplo 2), MgC12 com 30 pMol de cada sequência iniciadora 8 e 10, 25 ng do produto de reli-gação como template e 2,5 U AmpliTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems):

ciclo 1: 94°C, 10 min ciclo 2 x 30: o O 1 min 57°C, 45 sec 72°C, 1 min ciclo 3: 72°C, 7 min O O OO O sinal de PCR foi em seguida intensificado através de Nest-PCR. A concentração óptima de MgCl2 era, nesta reacção de 2 mM e 2μ1 do primeiro iPCR como template. O óptimo de temperatura para o par de sequências iniciadoras 9 e 11 foi determinado a 57°C, através de um gradiente de PCR. Os ciclos de amplificação seguintes foram necessários para detectar um produto de PCR especifico de 1200 bp (pares de bases)de comprimento, com AmpliTaq Gold DNA polimerase: ciclo 1: ciclo 2 x 40: ciclo 3: 95°C, 10 min 95°C, 45 sec 57°C, 1 min 72°C, 90 sec 72°C, 7 min 32 ΡΕ1437401 4°C, 00 A banda específica com um comprimento de 1200 bp (pares de bases) foi purificada sobre um gel de agarose 1% por meio do kit de extracção Qiaex Gel (Qiagen, Hilden, Alemanha) e utilizado numa reacção de ligação com o vector de clonagem TA-PCR2.1 (Invitrogen).

Após a transformação de 2μ1 da mistura de ligação em células E.coli Top 10F', foi feito o rastreio de colónias resistentes à ampicilina obtidas para a presença do plasmídeo pCR2.1 com o fragmento de PCR de 1200 bp integrado. Para isso, foi realizada uma análise de restrição com endonuclease Eco RI. Em seguida os clones positivos foram sequenciados com as sequências iniciadoras M13 rev e M13 uni, como descrito em 4.2.

A análise de sequência do fragmento de DNA de 1241 (Seq No: 12 mostra no região da extremidade 5' uma grelha de leitura aberta de 148 aminoácidos. A sequência dos primeiros 15 aminoácidos N-terminais correspondia à sequência de aminoácidos C-terminal Seq No: 7 de 4.2. A análise da sequência C-terminal do fragmento de 1241 bp mostrou segmentos de DNA regulatórios na extremidade N-terminal do gene (S)-ADH de L. reuteri.

Baseado na sequência do fragmento de DNA de 1241 bp, cuja região N-terminal (447 bp) apresenta um outro segmento de gene da oxidorredutase de L. reuteri, foram 33 ΡΕ1437401 construídas sequências iniciadoras específicas para uma reacção em cadeia por polimerase inversa (iPCR)com subsequente Nest-PCR (Seq. No:13 e 14). As sequências iniciadoras 13 e 14 são complementares ao prolongamento 3' do fragmento de gene encontrado.

Oligo 13: CCAGAGGTGATTGAAGAAGCTAC Oligo 14 :

CCGGGAAATAAAGATGGTT O DNA cromossómico de células de L-reuteri foi digerido com Afl III endonuclease e utilizado para religação com T4 Ligase. Os fragmentos de DNA cromossómico circular resultantes servem de matriz para o iPCR. Os seguintes ciclos de amplificação de PCR foram realizados num tampão de PCR (ver exemplo 4.1), MgCl2 1 mM, com 30 pMol de cada sequência iniciadora 7a/9a, 25 ng de produto de religação como template (molde) e 2,5 U de DNA polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems): ciclo 1: 94°C, 10 min ciclo 2 x 30: 95°C, 1 min ciclo 3: 56°C, 45 sec 72°C, 1:45 min 72°C, 7 min 34 ΡΕ1437401 O sinal de PCR foi em seguida intensificado através de um Nest-PCR. A concentração óptima de MgC12 era, nesta reacção de 2 mM e 2μ1 do primeiro iPCR foram utilizados como template para o Nest-PCR. Foram necessaries os seguintes ciclos de amplificação com DNA Polimerase AmpliTaq Gold para poder detectar um produto especifico de 950 bp de comprimento ciclo 1: kD o O 10 min ciclo 2 x 40: to o O 45 sec 56°C, 1 min 72°C, 1:45 min ciclo 3: 72°C, 7 min O O oo

Uma banda especifica com um comprimento de 950 bp foi purificada sobre um gel de Agarose 1% por meio de um kit de extracção Qiaex Gel (Qiagene) e utilizado numa reacção de ligação com o vector de clonagem TA-PCR pCR2.1 (Invitrogen).

Após a transformação de 2 μΐ da mistura de ligação em células E.coli Top 10F', foi feito um rastreio (triagem) de DNA de colónias resistentes à ampicilina obtidas, para testar a presença do plasmideo pCR2.1 com o fragmento de PCR de 950 bp integrado. Para isso foi realizada análise de restrição com endonuclease Eco RI. Em seguida os clones positivos foram sequenciados com as 35 ΡΕ1437401 sequências iniciadoras M13 rev e Ml3 uni, tal como descrito em 4.2.

0 fragmento de DNA inserido no vector pCR2.1 tinha 822 bp de comprimento e tinha, na extremidade N uma grelha de leitura de 126 aminoácidos, que terminava com um codão de STOP e um laço de terminação (Seq No: 15) . O péptido 5' de 12 aminoácidos correspondia à extremidade C-terminal da sequência No:12. Assim, o fragmento de DNA gerado por iPCR de 822 bp contem a extremidade C-terminal do segmento de gene que codifica para uma oxidorredutase de L. reuteri.

4.4 Síntese do gene completo de uma oxidorredutase de L. reuteri por meio de PCR

Baseado nas sequências No: 7 e No:15 foram construídas sequências iniciadoras específicos para uma clonagem subsequente do gene de comprimento total num sistema de expressão conveniente. Neste processo a sequência iniciadora 5' foi modificada com uma sequência de reconhecimento para Nde I e a sequência iniciadora 3' com uma sequência de reconhecimento para Hind III (Seq. No:16; Seq. No:17)

Oligo 16:

GCGGAATTCCATATGAAGAATATCATGATTGCT 36 ΡΕ1437401

Oligo 17:

CCCAAGCTTAATGCTTCAGAAAATCTGG O DNA genómico das células de L. reuteri serviu como matriz para a reacção em cadeia por polimerase. Foi amplificado num tampão de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0); KC1 50 mM; MgS04 10 mM; mistura dNTP 1 mM; 30 pMol de cada sequência iniciadora e 2,5 U de DNA polimerase Platinum Pfx (Invitrogen) ] com 300 ng de template e com os seguintes ciclos de temperatura:

ciclo 1: o O 2 min ciclo 2 x 40: 94 °C, 15 sec 58 °C, 30 sec C7ó co o o 75 sec ciclo 3: C7ó co o o 7 min o O OO O produto de PCR resultante foi, após purificação sobre um gel de agarose 1%, digerido com Nde I e Hind III e ligado a um vector pET21a (Novogen, Madison, USA)tratado com a mesma endonuclease. Após a transformação de 2μ1 da mistura de ligação em células de E.coli Top 10F' os DNA plasmidicos de colónias resistentes à ampicilina foram testados quanto à correcção da ligação por meio de análise de restrição com endonucleases Nde I e Hind III. O constru-to para expressão pET21-reut#10 foi sequenciado. O gene da oxidorredutase de Lactobacillus reuteri possui uma grelha de leitura aberta de 882 bp no total (Seq. No: 19) que corresponde a uma proteina com 294 aminoácidos (Seq. No:18) 37 ΡΕ1437401 4.5 Produção de (S)-ADH recombinante em E.coli Células competentes Escherichia coli StarBL21 (De3) foram transformadas com o constructo de expressão pET21-reut#10. A estirpe foi cultivada em meio LB (triptona 1%, extracto de levedura 0,5%, NaCl l%)com ampicilina (50pg/ml), até atingir uma densidade óptica de 0,5 a 500 nm. A expressão da oxidorredutase foi induzida por adição de isopropiltiogalactósido (IPTG) numa concentração final de 1 mM. Após 8 horas de indução a 25°C e 220 rpm as células foram colhidas e congeladas a -20°C.

Nas experiências seguintes para caracterização bioquímica a 100 mg de células foram adicionados 600 μΐ de tampão de lise e 600 μΐ de esferas de vidro e abertas 10 min num moinho de esferas. Nesse processo o lisado apresentou uma actividade com 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo de 2000 a 4000 U/ml. O enzima pode então ser expresso com uma actividade de 10000 U/g a 30000 U/g de peso húmido de E.coli. Deste modo o enzima está acessível barato e em grandes quantidades.

Exemplo 5: Caracterização da oxidorredutase recombinante de L. reuteri 38 ΡΕ1437401 5.1. pH óptimo

Produção de dos seguintes tampões de medida, todos 50 mM e com MgCl2, 1 mM com valores de pH diferentes.

Tabela 3

Valor de pH Sistema tampão Valor de pH Sistema tampão 4 Acetato de Na/ácido acético 7,5 KH2PO4/K2PO4 4,5 Acetato de Na/ácido acético 8 KH2PO4/K2PO4 5 Acetato de Na/ácido acético 8,5 KH2PO4/K2PO4 5,5 KH2PO4/K2PO4 9 Glicina/NaOH 6 KH2P04/K2P04 9,5 Glicina/NaOH 6,5 KH2P04/K2P04 10 Glicina/NaOH 7 KH2P04/K2P04 11 Glicina/NaOH

Diluição da amostra como necessário (1:20) Mistura de medida (30°C) 870 μΐ 20 μΐ 10 μΐ 2-3 min +100 μΐ tampão de medida com pH variável NADPH 10 mM (8,6 mg/ml H20) enzima diluído incubação solução de substrato (2-oxo-4-fenil-butirato de etilo 100 mM)

Para determinar o pH óptimo a reacção enzimática foi determinada em cada tampão indicado na tabela 3. Nesse processo pode verificar-se para o enzima, de acordo com a invenção um pH óptimo entre 6,5 e 7. No intervalo de pH de 4,5 a 8 o enzima apresenta 80% da sua actividade máxima, a 39 ΡΕ1437401 um valor de pH de abaixo de 4,0 e acima de 8,5 a actividade declina rapidamente. A dependência da actividade do enzima na armazenagem em tampões com diferentes valores de pH, foi investigada no intervalo de pH de 4 a 11. Para isso foram utilizados tampões diferentes (50 mM) no intervalo de pH de 4 a 11 e neles incubado o enzima sobreexpresso no exemplo 4, diluido 1:200 e incubado 30, 60 e 300 min. Todos os tampões continham MgC12 1 mM. Em seguida foram utilizados 10 μΐ desta mistura em testes de actividade normais. O valor de partida é ai o valor de medida que se obtem imediatamente após diluição do enzima em tampão de fosfato de potássio 50 mM pH=7. Este valor correspondia, em condições predefinidas a uma variação de extinção de 0,70/min e foi considerado como valor 100% e todos os valores de medida seguintes foram considerados relativamente a este valor.

Nesse processo foi observado que a oxidorredutase recombinante de L. reuteri é estável no intervalo de 4,5 a 8,0 e pode ser incubada durante pelo menos 5 h sem perda de actividade. Aos valores de pH 4,0 e 9,0 foi observada, após 5h uma actividade de 50% ou 40% respectivamente. Valores de pH acima de 9,5 conduziram a uma desactivação imediacta do enzima. 5.3 Óptimo de temperatura

Para a determinação da temperatura óptima foi 40 ΡΕ1437401 medida a actividade enzimática no intervalo de temperatura de 15°C a 70°C na medida Standard. Como é evidente na tabela o enzima atingiu a sua máxima actividade a 55°C, e em seguida a actividade diminui rapidamente.

Tabela 4

Temperatura (°C) Actividade em U/ml de enzima não-diluido Temperatura (°C) Actividade em U/ml de enzima não-diluido 15 385 45 2900 20 745 50 3200 25 1090 55 3800 30 1350 60 617 35 1860 65 180 40 2500 70 90 5.4 Estabilidade à temperatura

De modo análogo ao descrito em 5.2 foi determinada a estabilidade à temperatura para o intervalo de 15°C a 70°C. Para isso foi incubada uma diluição de 1:200 do enzima purificado durante 60 min e 180 min à respectiva temperatura e em seguida medida a 30°C com a mistura teste acima mencionada. Também aqui foi considerado como valor de medida de partida obtido imediatamente após a diluição do enzima em tampão de fosfato de potássio 50 mM pH=7.0. Este valor foi também aqui considerado como 100%. O enzima é, nesse processo num intervalo de temperatura de 15°C a 50°C completamente estável e não apre- 41 ΡΕ1437401 senta, após 3h de incubação, nenhuma perda de actividade. A 55°C, já não é detectável actividade ao fim de 30 min. 5.5 Espectro de substrato/Excesso de enatiómero O espectro de substrato da oxidorredutase de acordo com a invenção foi determinado através da medida da actividade enzimática com uma série de cetonas, oxoácidos assim como dos seus ésteres. Para isso foi utilizada a mistura de medida Standard (exemplo 5.1) com diferentes substratos. A actividade com 2-oxo-4-fenil butirato de etilo foi considerada 100% e todos os outros substratos foram considerados em relação a este. O enzima não apresentou uma actividade de desidrogenase dependente de NADP para (R) ou (S) 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, (R) ou (S) 4-cloro-3-hidroxibutirato ou (D) ou (L) lactato de etilo.

Para a determinação do valor do ee, foi realizada a seguinte reacção para substratos escolhidos. ΙΟΟμΙ NADPH (50mM) 60 μΐ substrato (100 mM) e 1 a 2 unidades de oxidorredutase

As preparações foram extraídas com clorofórmio após 24h e analisado o excesso de enantiómero do álcool resultante por meio de GC. ΡΕ1437401 42

Tabela 5

Substrato Actividade relativa% Estereosse- lectividade Substrato Actividade relativa% Estereosse- lectividade Cetona Éster de ácido 3-oxo l-fenil-2-prcpanona 3 nb 4-cloroacetoacetato de etilo 16 56%R 2-cloro-l-(3-cloro-fenil)etano-l-ona 0 nb Acetoacetato de metilo 0,3 78%S Acetofenona 0 nb ácido etil-8-cloro-6-oxo-octanóico 190 94%R caprilofenona 0 nb Ácido dimetil-3-οχο-1,8-octanodióico 42 Racemato 50% 2-octanona 1 Racemato 50% 3-oxovalerato de etilo 1,3 nb 3-octanona 4 nb Acetona 0 nb Éster de 2-oxo-ácido Ácidos 2-oxo 2-oxovalerato de etilo 190 nb Ácido 2-oxovalérioo 0 nb 2-oxo-4-fenilbuti-rato de etilo 100 98%S Ácido 2-oxo-3-fenilprcpiónico 0,5 nb Piruvato de etilo 2 99%S Ácido 2-oxobutirico 0 nb Fenilglioxilato de etilo 2 oxidação R-2-hidroxi-4- fenilbutirato 0 nb 2-propanol 0 nb S-2-hidroxi-4- fenilbutirato 0 nb D-lactato de etilo 0 nb S-4-cloro-3- hidroxibutirato 0 nb L-lactato de etilo 0 nb R-4-cloro-3- hidroxibutirato 0 nb 43 ΡΕ1437401

Como se pode observar na tabela pela oxidor-redutase de Lactobacillus reuteri são reduzidos especialmente ésteres de ácidos 2-oxo, estereosselectivamente, aos ésteres de ácidos 2-hidroxi correspondentes. Os correspondentes ácidos 2-oxo não foram aceites como substrato, e do mesmo modo, metil-cetonas não foram praticamente reduzidas. Ésteres de ácidos 3-oxo são parcialmente reduzidos mas na maioria das vezes, de modo não estereosselectivo. 5.6. Estabilidade a solventes

Para investigar a estabilidade do enzima por contacto com solventes orgânicos, a oxidorredutase de L. reuteri foi diluida com as misturas de solventes indicadas 1:400 (no caso de solventes orgânicos misciveis em água) e incubadas à temperatura ambiente. Em seguida foram utilizados 10 μΐ da solução de enzima na reacçâo Standard. Também aqui foi considerado 100% o valor de partida, após diluição com tampão (tampão fosfato de potássio 100 mM, pH=7.0, MgCl2 1 mM), e todos os outros valores considerados em relação a este. No caso de solventes orgânicos não misciveis em água, a diluição também ocorreu em tampão de fosfato de potássio, foi adicionado o mesmo volume de solvente orgânico para a reacção e a misturareaccional foi incubada num termo mixer a 170 rpm. A medida de actividade ocorreu a partir da fase aquosa. ΡΕ1437401 44

Tabela 6

Actividade 8h 24h Actividade 8h 24h Tampão KPP lOOmM pH=7 MgCl2 lmM 72% 70% Acetato de etilo 0 0 5% Isopropanol 77% 77% Acetato de butilo 74% 12% 10% Isopropanol 86% 85% Éter dietilico 32% 20% 20% Isopropanol 100% 100% MTBE 90% 81% 30% Isopropanol 0% 0 Éter diisopropilico 94% 77% 5% EtOH 64% 65% Clorofórmio 6% 0% 10 EtOH 68% 70% Hexano 115% 100% 20% EtOH 83% 80% Heptano 113% 100% 30% EtOH 77% 75% Ciclo-hexano 113% 100% 10% DMSO 80% 80% 20% DMSO 79% 80%

Como se pode observar na tabela 6 a oxidor-redutase de L. reuteri apresenta uma estabilidade surpren-dentemente boa em relação a solventes orgânicos. Além disso, o enzima é até mesmo estabilizado em solventes orgânicos misciveis em água e não-misciveis em comparação com a incubação em tampãosozinho. 5.7. Determinação de Km e Vmax para NADPH e 2-oxopentanoato de etilo

Para determinação dos valores de Km e Vmax de NADPH e 2-oxopentanoato de etilo foram escolhidas as seguintes condições: 45 ΡΕ1437401 A. Variação de NADPH/ concentração de substrato constante 970 ml Solução de 2-oxopentanoato de etilo em tampão fosfato de potássio pH=7 20 μΐ NADPH (concentrações finais de 200-5 μΜ) 10 μΐ Solução de enzima (1:300) B. Variação da concentração de substrato /NADPH constante 970 μΐ Solução de 2-oxopentanoato de etilo em tampão fosfato de potássio pH=7 (concentração de 10 a 0,1 mM) 20 μΐ NADPH (concentração final 0,2 mM) 10 μΐ Solução de enzima (1:300)

Km Vmax NADPH 0,004+0,0018 mM 3080 U/ml 18500 U/g de peso húmido de E.coli 2-oxopentanoato de 0,18±0,07 mM 3080 U/ml 18500 U/g de peso etilo húmido de E.coli

Como solução de enzima foi utilizado o lisado obtido de 0,1 g de células de E.coli recombinantes (600 μΐ) diluído 1:300. 5.8 Conversão preparativa de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo 46 ΡΕ1437401 A. Regeneração de coenzimas com álcool desidrogenase secundária de Thermoanerobium brochii

Para uma reacção preparativa foi incubada uma mistura de 4 ml de fosfato de potássio 100 mM, pH=7,0, isopropanol 2 ml, 2-oxo-4-fenil butirato de etilo, 0,064 mg NADP, 1000 Unidades de oxidorredutase de L. reuteri e 10 mg de ADH de Thermoanerobium brocki (Fluka, cerca de 100 U em relação à oxidação de 2-propanol) durante 24 h à temperatura ambiente sob mistura constante. Após 24 h o substrato 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo estava completamente convertido a 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Nesse processo foi formado o correspondente S-álcool a 97%. B. Regeneração de coenzima com álcool desidrogenase secundária (KRED 1004, Biocatalytics, Pasadena)

Para uma reacção preparativa foi incubada uma mistura de 4 ml de fosfato de potássio 100 mM, pH=7,0, isopropanol 2 ml, 2-oxo-4-fenil butirato de etilo, 0,064 mg NADP, 1000 U de oxidorredutase de L. reuteri e 1 mg KRED 1004 (Biocatalytics Inc, Pasdena) durante 2h à temperatura ambiente sob mistura constante. Após 2h o substrato 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo estava completamente convertido a 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Nesse processo foi formado o correspondente S-álcool a 98%. 47 ΡΕ1437401

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Juelich Enzyme Products GmbH <120> Oxidoreduktase aus Lactobacillus reuteri <130> (TH)4061 <160> 19 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <400> 1

Met lys Asn lie iMel Síe Ala Gfy Ala Gly Vai Leu Giy Ser Gin 1 5 10 15

<210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> <4 00> 2

Ser Asp Tyr Glu Arg Asp teu Hís Leu ThrAsp Lys 1 5' 10 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <4 00> 3 atgaaraaya tyatgatygc hggcgc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <4 00> 4 atgaaraaya tyatgatygc hggtgc 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <4 00> 5 rtgharatcm cgttcrtaat c 21 48 ΡΕ1437401 <210 > β <211> 21 <212 > DNA <213> artificial <400> 6 rtgharatcm cgttcrtagt c 21

<210> 7 <211> 159 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <4 00> 7 atgaagaata leaígattge ígglgctgge gíattaggta gteaga^c aMeaaacs 60 gcittatesg gctttaatgt cagcgtatat aatcaocata Itgatacagc tgagcgacgg 120 attáâggogc tgaaaagfga ttacgaacgt gáfttacat 158 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <4 00> 8 atccggcttt aatgtcagcg t 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <4 00> 9 cgacggatta aggcgctgaa aag 23 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <4 0 0 > 10 ctacctaata cgccagcacc ag 22 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <400> 11 gccagcacca gcaatcat 18 49 ΡΕ1437401

<210 > 12 <211> 1257 <212 > DNA <213> Lactobacillus reuteri <4 0 0 > 12 cgaçggaità aggcgetjpa aagtgaftat gaacgígact Ipcaítigac tgaíaaggaa 60 ttíeaacagg gecBaalaa taííâaagíg aft&etgatg atgfigcgae cgcggtfaaa: 120

gatgctgatí taaígaltga agcattaçca gsatcgítag agttaaagga gcagtíttac 1BO gaagaggtít cagááítagc ecctgaa&a® acaafcíttg atapaactc· ctdacatít 240 alccctagcc aadagctec tíatactgaí cggccagsaa aatítetea lalgcacttt 300 gctaaccaaa ittggaaatt íaatgtggte gaasttatgg gcacctccca aaeaagteea 360 gaggígatíg aagaagctac aaagíítgee çgggaaataa agatggftçç ígltalccti 420 aalaaagaae aacacggtta fôtktgaat tcatggtgsa tcagsaatgç elggttatga 400 ctiíggígac gattaíggía agcctdtga taagadgc* gttgaâgcãc tteafejaogc 540 aatcatggct gaagaígaag tcatetíggí tcçaadggt. tcataeacta acattgcaÉ 600 actctlta§c gaaíacecag ãagiaaagag teacattsag eaaategííg egaígggtgg 660 ttcattctcf ggcggtsaca tgaccagtgt agctgaattt aacgtcttca ctgatocgga 720 ígctgctaag attatgtaca atgcgggtgt tecaatígta aetgttggat tggatgfêac 7S0 títaaaggcg eteiaacíg cggatacgat tgaaaaacit ggtagteíta ataapctgg 840 ígaaatgcta caíggaitaa tcacgcacta {aaígatggt agtgâtcsag ggcgtecaat 900 gcacgatgtt aataô&tct tetaccttet tcatccãgaa gcaíUáctã epagpeat 800 gtgggttgat gttcaaacag acggfccagc aateggtgot actg «ggfg acattcgcgc 1Q2G tgcttaccat gatggeaaga ©caacgcaaa aglftgtlta gatattgaíg cígaataetl 1080 caataagtgg ttettagaag «agtaagcaa aatgaaataa gatactaaga gctgagsgtt 1140 tgettlcggc tctttttatt acfôctagt gtaagcgofit eacgatãiaa tagfaatagí 1200 taa agtaagg aggaaatacc aa atgaagaa tataatgaíl gdggtgctg gcaagcc 1257 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial 50 ΡΕ1437401 <4 0 0 > 13 ccagaggtga ttgaagaagc tac 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <4 0 0 > 14 ccgggaaata aagatggtt 19

<210> 15 <211> 822 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <4 0 0 > 15 ccgggaaata aagatggtíc ctgttatcci taataaagsa caacacggtt atattctgaa 60 ttoccttftg attecgttãc ttgcatctgg tctíagttta ígggctaaag gagtígctga 120 tecâgcgãíg aOgátaagg attgg átgat fcgáeaggt gcaccaatgg gaccattígg 180 tati&agat alggttggtt tacggacag© afcgcaaatc gaacggaatg cctalpoca 240 gactaaggat gaaagtcata aggaaatígc egatsagaig pacag&tga tícaagaagg 300 geaegaagga asagaatcgcj gacaaggai fetaattat cegaatçcag çetieatgga 360 tçcagattft dgaagcatt. aagattâ&gt aigaaaacg ftaggaaagg gagcaagala 420 agagtcgctc gigactgtta tctcactcce ttattítgcg ctceaaM cac-gíaaicc 480 ggttgcaaca atggcaaaât tacggtaeag tagtagsgaa cgtgaaacaa aaaatgttte 540 áogaaâggag acctaátáâa tgaatectga acàáttícaa caâgeattag ctgatqatgg 800 tattacctta feageagaaG aaatgcaaca aítígctgac talaceaat tattagttga 680 aactaatgáá catggtgg-g t tgaígftcaa cagaeggícc agcatcggíg ctaeígtggt 720 gãcMtegcg etgcttacat gatggc.âgac caaeg&Sããg íttgttagat atgatgcíga 780 ataciteaat aagtggttct taaagaagta gcaaatgaat ag 822 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <4 0 0 > 16 gcggaattcc atatgaagaa tatcatgatt gct 33 <210> 17 51 ΡΕ1437401 <211> 28

<212 > DNA <213> Artificial <4 0 0 > 17 cccaagctta atgcttcaga aaatctgg 28

<210> 18 <211> 294 <212> PRT <213> Lactobacillus reuteri <400> 18 ivet Lys Asn si® r*iet sse Ala Gly Ala eiy vai Leu Giv Ser Gin Sfe 1 5 -10 . 15

Ate Tyr Gin Thr Ala Leu Ser Gly Phe Asa Vai Ser Vai Tyr Asn Hls 20 25 30

His lie Asp Thr Ate Gíu Arg Arg ile Lys Ate teu Lys Ser Asp Tyr 35 40 45

Glu Ara Asp Leu His teu Thr Asp Lys Glu Phe Gin Gin Gly Leu As 50 . 55 60

Asn He lys Vai Ite Thr Asp Asp Vai Ala Thr Ala Vai Lys Asp Ala 65 70 75 80

Asp Leu Met lie Glu Ala Leu Pro Glu Ser Leu Glu Leu Lys Glu Gin 85 90 95

Phe Tyr Glu Glu Vai Ser Glu Leu Ala Pre Glu lys Thr lie Phe Ala 400 105 110

Ser Asa Ser Ser Thr Phe He Pro Ser Gin Leu Ala pro Tyr Thr Asp 11:5 120 125

Arg Pra Glu Lys Phe Leu Asn Met His Phe Ala Asn Gin Ha Trp Lys 130 135 140

Phe Asn Vai Vai Gtu ile Met Gly Thr Ser Gin Thr Ser Pro Glu Vai 145 150 155 160

He Glu Glu Ala Thr Lys Phe Ala Arg Glu lia lys Met Vai Pro Vai 165 170 175 52 ΡΕ1437401

Ite Leu Aet Lye GJe Gin His Gly Tyr Ite Leu Asn Ser Leu Leu Me 180 ' 185 ISO

Pso Leu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Leu Tsp Ala Lys Gly Vai Ala Asp 195 2QQ 205

Pro Ala Met He Asp Lys Asp Tip Met lie Stf Tfcr Gly Atei Pro Met 210 215 220

Gly Pro Phe Gly Me leu Asp Met Vai Gly teu Afg Thr Ala Ala Gin 225 230 235 240

<210 > 19 <211> 885 <212> DNA <213> Lactobacillus reuteri <4 0 0 > 19 stgaagaata teatgaftgc ígglgdjggc gtertaggta gteagãtige aiateaaacg 60 gcttíatccg. gctttaatgf cagcgíatat aatcaecata ttgatacegc tgagcgacgg 120 attaaggege tgaaaagtga ftatgaacgt gaeítgcatt tgadgataa ggaatttcaa 180 Gâiggcetta aíâataítáa agtgattaeí gatgaígttg cgaccgcggl taaagatgd 240 gatttaatga ttgaagcatt accagaatcg ítagag»aâ aggagcagít tiaegaâgag 300 gttScagaet tagoccctga aaaaaeaate tttgctagea aetectetac aíítatet 360 agecââctag caccttatac tgateggeca gaaâaattte «aatâtgcs ctttgetaac 420 caaatttgga aatttaatgt ggtcgaaatt aígggcaect eccaaacaag tccagaggtg 480 attgasâpag etâeaaagft tgcccgggââ atãâaptgg Kectgttat ccttaataaa 540 gaacaacacg gttalattct gaattcccít «gatecgt tacttgcale iggiêitagt 600 ãaígggcta aaggagttgc ígateeageg aigaitgala aggattggat gatttcgaca 660 ggtycaesaã tgggaccatt tggtatttta gatatggttg gtttacggac agcagçgcaa 720 afegaacgga atgcctatgc ecagadaag gatgaaagte ataaggaaat tgcegataag 780 atggaacage tgâtteaãga agggcãcgaa ggaaaagaaí eggfacaagg atátatsat 840 53 ΡΕ1437401 fateegaaíc cagccttcaí ggatccagat tttcígaagc atíaa

Lisboa, 11 de Março de 2011

Claims (26)

1. ΡΕ1437401 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma oxidorredutase que reduz ésters de 2-oxo-ácido na presença de NADPH e água até aos correspondentes ésters de S-2-hidroxi-ácido, caracterizada por apresentar mais do que 7 0% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18 e apresentar uma actividade especifica de mais de 1 ymol por mg, em relação à conversão de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo em S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.
2. 2. Oxidorredutase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por apresentar de 80% a 99,5%, particularmente de 90% a 99,5%, de modo particularmente preferível de 99% a 99,5% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
3. 3. Oxidorredutase de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada por apresentar a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18.
4. 4. Oxidorredutase de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por poder ser obtida a partir de Lactobacillus (L.) reuteri, L. kefir, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus ou L. fermentum.
5. 5. Oxidorredutase de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada por apresentar 1 a 50 2 ΡΕ1437401 aminoácidos mais ou 1 a 50 aminoácidos menos do que a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18.
6. 6. Uma oxidorredutase de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por apresentar 1 a 25 aminoácidos, em particular 2 a 20 aminoácidos e de preferência 3 a 10 aminoácidos mais ou menos que a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18.
7. 7. Oxidorredutase de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por apresentar a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:18 e estar modificada uma, duas, três, quatro ou cinco vezes por um polímero solúvel em água.
8. 8. Oxidorredutase de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o polímero solúvel em água ser polietilenoglicol.
9. 9. Proteína de fusão caracterizada por representar a oxidorredutase com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 18 e por a oxidorredutase estar ligada a um outro polipéptido na sua extremidade N-terminal ou na sua extremidade carboxi-terminal por uma ligação peptidica.
10. 10. Anticorpo caracterizado por se ligar especi-ficamente à oxidorredutase de acordo com a SEQ ID NO:18. 3 ΡΕ1437401
11. 11. Sequência isolada de ácidos nucleicos que codifica a oxidorredutase de acordo com a SEQ ID NO:18.
12. 12. Sequência de DNA isolado de uma oxidorredutase de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que a sequência de DNA é seleccionada de um conjunto que consiste em: a) SEQ ID NO: 19 ou a sua cadeia complementar, b) uma sequência de DNA que hibridiza com a SEQ ID NO:19 ou a sua cadeia complementar sob condições estringentes e c) uma sequência de DNA que, devido à degenerescência do código genético, codifica uma proteína que é também codificada por uma ou várias das sequências de DNA de acordo com a) ou b).
13. 13. Sequência de DNA isolada caracterizada por apresentar mais de 70% de identidade com a sequência de DNA SEQ ID NO: 19 ou a sua cadeia complementar e por codificar uma proteína que apresenta uma actividade específica superior a 1 ymole por mg, em termos de conversão de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo em S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.
14. 14. Sequência de DNA isolada, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por apresentar de 80% a 99,5%, em particular de 90% a 99,5% e de preferência de 99% a 99,5% de identidade com a sequência de DNA SEQ ID NO:19. 4 ΡΕ1437401
15. 15. Vector de clonagem, caracterizado por apresentar uma ou mais das sequências de DNA, de acordo com as reivindicações 11 a 14.
16. 16. Vector de expressão, caracterizado por apresentar uma ou mais das sequências de DNA de acordo com as reivindicações 11 a 14 e estar ligado de modo apropriado a uma sequência de controlo de expressão.
17. 17. Uma célula hospedeiro que é uma célula bacteriana, de levedura, de insecto, de planta ou de mamífero e que foi transformada ou transfectada por um vector de expressão de acordo com a reivindicação 16.
18. 18. Processo para a obtenção enantiosselectiva de ésteres de S-2-hidroxi-ácido, caracterizado por um éster de 2-oxo-ácido ser reduzido na presença de uma oxidor-redutase de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, de NADPH e de água, até ao éster correspondente de ácido S-2-hidroxílico e por o éster de ácido S-2-hidroxílico formado ser isolado.
19. 19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por, como éster de 2-oxo-ácido, ser utilizado um composto da Fórmula I: (I) R2-C (0)-C(0)-0-R1 5 ΡΕ1437401 na qual RI representa 1. alquilo-(C1-C20) de cadeia linear ou ramificada, 2. alcenilo- (C2-C20) , em que o alcenilo é de cadeia linear ou ramificada e, dependendo do comprimento da cadeia, contem uma duas, três ou quarto ligações duplas, 3. alcinilo-(C2-C20) ^ em que alcinilo é de cadeia linear ou ramificada e contem eventualmente uma, duas, três ou quarto ligações triplas. 4. arilo-(C6-C14) , 5. alquil (Ci~C8) -arilo- (C6-Ci4) , 6. heterociclo (C5-C14) que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7. cicloalquilo (C3-C7) R2 representa 1. alquilo-(C1-C20) de cadeia linear ou ramificada, 2. alcenilo-(C2-C20) ? em que o alcenilo é de cadeia linear ou ramificada e, dependendo do comprimento da cadeia, contem uma duas, três ou quarto ligações duplas, 3. alcinilo-(C2-C20) , em que alcinilo é de cadeia linear ou ramificada e contem eventualmente uma, duas, três ou quarto ligações triplas. 6 ΡΕ1437401 4 . arilo- (C6-C14) , 5. alquil (Ci-Cg)-arilo-(C6-C14) , 6. heterociclo (C5-Ci4)que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7. cicloalquilo (C3-C7) em que os grupos mencionados acima nos pontos 1 a 7 são não substituídos ou substituídos de uma a três vezes independentes uns dos outros com: a) OH b) Halogénio, tal como flúor, cloro, bromo ou iodo, c) -NO2, d) -C (0) -0- (C1-C20) -alquilo, em que alquilo é de cadeia linear ou ramificada não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro ou e) heterociclo (C5-Ci4)que é não substituído ou substituído de uma a três vezes com halogénio, hidroxilo, amino ou nitro,
20. 20. Processo para obtenção enantiosselectiva de ésteres de S-2-hidroxi-ácido, caracterizado por a) um éster de 2-oxo-ácido ser reduzido na presença de uma oxidorredutase de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, de NADPH e de água até ao correspondente éster de ácido S-2-hidroxílico 7 ΡΕ1437401 b) o NADP formado pela oxidorredutase ser reduzido ao mesmo tempo até NADPH por uma desidrogenase e um co-substrato e c) o éster quiral do do S-2-hidroxi-ácido formado ser isolado.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por ser utilizado como éster de 2-oxo-ácido um composto da fórmula I de acordo com a reivindicação 19.
22. 22. Processo de acordo com as reivindicações 20 ou 21, caracterizado por, como hidrogenase, ser utilizada a álcool desidrogenase de Thermoanaerobium brockii, Lacto-bacillus kefir ou Lactobacillus brevis e como substrato ser utilizado etanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol ou 2-octanol.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado por, como desidrogenase, ser utilizada a glucose desidrogenase e como co-substrato ser utilizada glucose ou a formato desidrogenase dependente de NADPH e como co-substrato um sal do ácido fórmico, tal como formato de amónio, formato de sódio ou formato de cálcio.
24. 24. Processo de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado por as reacções serem conduzidas em presença de um solvente orgânico. ΡΕ1437401
25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por ser utilizado como solvente orgânico éter dietilico, éter metil-terc-butílico, éter diisopropilico, éter dibutilico, acetato de butilo, heptano, hexano ou ciclo-hexano.
26. 26. Procedimento de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado por a fase orgânica representar 5% a 80%, de preferência 10% a 40% do volume total da reacção. Lisboa, 11 de Março de 2011 1 ΡΕ1437401 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * tiS 5686275 A * EP 8486107 A * US 6033882 A * YlfD 87320*2 A * DE $0810884 * DE 10119274 Literatura que não é de patentes citada na Descrição *: K. Fs&er. Bieija ;n Oí#íbS Cisércisisy, A Testbòok. Sp?ia§er. 208Ô * Kaiaritts. P KsneSt ResotuSov st Es- tm cass^sed'sy--a L$ss®e- Bt^P^BáoaaBss feífSSSSRS, *9Sj; ^ 5$,. S12-S1S * Poeto-eiiisepp» Pwfcsochi-Fafttowí; Stefane Sôfvf< Sís?ços&:cc8v'8 SwSssste cf Dftiísí CefiSfcrestaíyste Rsmssh·' Paiei Stei&c&eiecuvs· SocsSs>>se. 200õ, 14 * :&tr j 3x>ctiem, 1854. *<& 222 ('*?> 1025-32 * Tasnufa Y. st aí. Twcí smtrs of NAD-depanásói D-ffssrsíJgís® daftyíliOçenss® Enteococffls- ísec-aSs iAiVí íGQ71. Apdi 5'im« FeArs©)' 2002. vd §8 (25. S47-5! * ,#áihà:benvâ!«g«f^^ÍKScteris£ss. Date cf Rsadscífí Car%dBks>$. J, peters, Biotecíisoios*· &- ®Γί?Γ3?<3Αί'ίΑ*»Ρ5 í iRsbín stsí Rseá) 9, W&ZY-VÇ& V&isg. 1998 * Ltess, K» ^eífessív; CiWandrey, ínáfeisM Si- istrsnsfeypsSííf». WSSj;V-VGH -Vfcaag , 2300 * Sandio*; Rwsse). kísSpsjssr Csi·^ 3 hbc*mtf. fAv-Uj; 'vOS 1 * Tíshtev et sf. J. mii&bml Bíob>%ís®s; «*· $*, 187-193 * Lewry et sl \3 '93,205-275 * Fsisísoíi et «1. Awfrfcí j> S^.te;síç', 1378, 1Ô& 201- 220