EA027209B1 - Ферментативное восстановление - Google Patents

Ферментативное восстановление Download PDF

Info

Publication number
EA027209B1
EA027209B1 EA201500018A EA201500018A EA027209B1 EA 027209 B1 EA027209 B1 EA 027209B1 EA 201500018 A EA201500018 A EA 201500018A EA 201500018 A EA201500018 A EA 201500018A EA 027209 B1 EA027209 B1 EA 027209B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
wah
rgo
azr
zeg
agd
Prior art date
Application number
EA201500018A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201500018A1 (ru
Inventor
Джорджио Бертолини
Паоло Магри
Original Assignee
Лабораторио Кимико Интернационале С.П.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Лабораторио Кимико Интернационале С.П.А. filed Critical Лабораторио Кимико Интернационале С.П.А.
Publication of EA201500018A1 publication Critical patent/EA201500018A1/ru
Publication of EA027209B1 publication Critical patent/EA027209B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/40—Oxygen atoms
    • C07D211/42—Oxygen atoms attached in position 3 or 5
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к энантиоселективному ферментативному способу получения оптически активного производного 3-гидроксипиперидинкарбоновой кислоты.

Description

Одной целью настоящего изобретения является способ получения оптически активного производного 3-гидроксипиперидинкарбоксилата, который является простым, безопасным и рентабельным.
Другой целью изобретения является способ получения оптически активного производного 3гидроксипиперидинкарбоксилата ферментативным восстановлением соответствующих оксопроизводных.
Другой целью изобретения является энантиомерно чистая оптически активная 3гидроксипиперидинкарбоновая кислота и ее эфиры.
Описание изобретения
Таким образом, согласно одному из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (I)
где хиральный углерод находится в конфигурации (К) или (8);
К выбирают из водорода и СОК!;
К! выбирают из водорода, (С1-С6)алкила и ОК2;
К2 выбирают из (С1-С6)алкила, бензила, причем указанный бензил необязательно замещен одной или несколькими (С1-С6)алкильными группами;
включающему восстановление соединения формулы (II)
в которой К имеет значения, указанные выше, ферментной оксидоредуктазой в присутствии кофактора и косубстрата, регенерирующего указанный кофактор.
Соединения формулы (II), в данном описании также субстрат, известны в технике.
Согласно настоящему изобретению термин алкил обозначает линейную или разветвленную насыщенную или ненасыщенную алкильную группу. Согласно предпочтительному воплощению изобретения (С1-С6)алкил представляет собой трет-бутил.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения К представляет собой СОК1.
Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения К1 представляет собой ОК2.
Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения К представляет собой СОО-третВи или СОО-бензил.
Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения соединение формулы (I) находится в (^-конфигурации.
Фермент оксидоредуктаза, который используется в способе по изобретению, представляет собой предпочтительно полипептид дрожжевого или бактериального происхождения.
Согласно выгодному воплощению изобретения кофактор выбирают из никотинамидадениндинуклеотидфосфата (ΝΛΌΡ) и никотинамид-адениндинуклеотида (ΝΛΌ).
Согласно выгодному воплощению изобретения косубстрат представляет собой вторичный спирт, предпочтительно вторичный спирт, выбранный из (С1-С10)ОН, такой как 2-пропанол, 2-бутанол, 2пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гептанол и 2-октанол, предпочтительно 2-пропанол или 4-метил-2пентанол, наиболее предпочтительно 2-пропанол.
Согласно наиболее предпочтительному воплощению изобретения оксидоредуктазу выбирают из 8ЕО ГО Ш: 1, 8ЕО ГО Ш: 2, 8ЕО ГО Ш: 3 или 8ЕО ГО Ш:4, 8ЕО ГО Ш: 5, 8ЕО ГО Ш: 6, 8ЕО ГО Ш: 7, 8ЕО ГО Ш: 8 и 8ЕО ГО Ш:9.
Применение фермента оксидоредуктазы, выбранной из 8ЕО ГО NО: 1, 8ЕО ГО NО: 2, 8ЕО ГО NО: 3 или 8ЕО ГО Ш:4, 8ЕО ГО Ш: 5, 8ЕО ГО Ш: 6, 8ЕО ГО Ш: 7, 8ЕО ГО Ш: 8, 8ЕО ГО Ш:9 и их произ- 1 027209 водных, таких как аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 60%-ную идентичность с одной из указанных последовательностей, для получения соединения формулы (I) из соединения формулы (II) составляет другой аспект настоящего изобретения.
8ЕО ГО N0: 1 является предпочтительным ферментом оксидоредуктазой для способа по изобретению.
Согласно предпочтительному аспекту изобретение относится к способу получения соединения формулы (I')
где хиральный углерод находится в (§)-конфигурации, и К' выбирают из Н, СОО-трет-Ви или СООбензила, который включает восстановление соединения формулы (II')
где К' имеет значения, указанные выше, оксидоредуктазой 8Е0 ГО N0: 1 в присутствии кофактора и косубстрата, регенерирующего указанный кофактор.
Кофактор и косубстрат предпочтительно являются такими, какие указаны выше как предпочтительные.
Таким образом, в наиболее предпочтительном аспекте изобретение относится к способу получения соединения формулы (I') путем восстановления соединения формулы (II') оксидоредуктазой 8Е0 ГО N0: 1 в присутствии ΝΛΌΗ или ΝΆΌΡΗ как кофактора и вторичного спирта, в частности 2-пропанола или 4метил-2-пентанола, наиболее предпочтительно 2-пропанола, в качестве косубстрата, регенерирующего указанный кофактор.
Согласно предпочтительному воплощению К' представляет собой СОО-трет-Ви.
Согласно другому своему аспекту изобретение относится к соединению формулы (I'), определенному выше, содержащему менее 0,1% изомера (К), предпочтительно к соединению формулы (I'), где К' представляет собой СОО-трет-Ви.
Организм, продуцирующий ферменты оксидоредуктазы, применимые при энатиоселективном ферментативном восстановлении, может быть дикого типа или вариантом и предпочтительно выбирается из дрожжей или бактерий, например дрожжей рода СаиШба или ΡίοΗία.
Оксидоредуктазы 8Е0 ГО N0: 1-8Е0 ГО N0: 9 известны в технике.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 1, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма РюЫа сар5и1а!а, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в ЕР 1633779.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 2, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма КНобососси5 сгу1Нгоро1|5. или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в ЕР 1499716.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 3, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма Мс15с1пико\У1а ζο6ε11ίί, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в ЕР 1685248.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 4, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма СаиШба рагар5Йо515, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в Еηζуте М1стоЬ. ТесНио1., 1993, №ν; 15 (11): 950-8.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 5, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма ТНеттоаиегоЬшт Ьгоски, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в I. Ат.СНет. §ос, 1986,108, раде5 162.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 6, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма МютоЬас1егшт 5р., или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в \У0 2007/012428.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 7, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма КНобососси5 гиЬег, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в Аидете. СНет. Ση! Еб. Еид1., 2002, татсН 15; 41(6): 1014.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 8, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма РюЫа 50р1б15, или нуклеотидной последовательностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в \У0 2007/012428.
Полипептид, включающий 8Е0 ГО N0: 9, может быть кодирован последовательностью ДНК, которую можно получить, например, из организма Оотбоша гаЬг1рег11ис1а, или нуклеотидной последователь- 2 027209 ностью, которая с ней гибридизирует, раскрытой в \У0 2007/012428.
Последовательность ДНК может представлять собой любую ДНК, кодирующую полипептиды (ЗЕО ГО N0: 1, ЗЕО ГО N0: 2, ЗЕО ГО N0: 3, ЗЕО ГО N0:4, ЗЕО ГО N0: 5, ЗЕО ГО N0: 6, ЗЕО ГО N0: 7, ЗЕО ГО N0: 8, ЗЕО ГО N0:9). Она может представлять собой ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, показанную в прилагаемом списке последовательностей как ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕЦ ГО N0: 11, ЗЕЦ ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 18, или ДНК, кодирующую полипептиды, имеющие ферментативную активность при асимметричном восстановлении по изобретению, и гибридизирующую в строгих условиях с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, показанную в списке последовательностей как ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 11, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 18.
Термин ДНК, гибридизирующая в строгих условиях с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, показанную в списке последовательностей как ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 11, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 18 обозначает ДНК, которую можно получить методом гибридизации колоний, гибридизации бляшек или саузерн-гибридизации, с использованием в качестве зонда ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, показанную в списке последовательностей как ЗЕО ГО N0: 10, ЗЕО ГО N0: 11, ЗЕО ГО N0: 12, ЗЕО ГО N0:13, ЗЕО ГО N0: 14, ЗЕО ГО N0: 15, ЗЕО ГО N0: 16, ЗЕО ГО N0: 17, ЗЕО ГО N0: 18, или части последовательностей из списка последовательностей. Конкретнее, такие указанные ДНК можно идентифицировать, осуществляя гибридизацию с использованием фильтра с колонией или ДНК из бляшки, иммобилизованной на нем, при 65°С в присутствии 0,7-1,0М №С1, и промывая фильтр 0,1-2x330 при 65°С (1-кратный концентрированный раствор 33С, включающий 150 мМ №С1 и 15 мМ цитрата натрия). Гибридизацию можно осуществить методом, описанным в Мо1еси1аг с1оши§, А 1аЪога!огу тапиа1, 8есоиб ебйюи (Со1б Зртшд НагЪог ЬаЪота1огу Рге88, 1989), или в другой литературе.
На практике энантиоселективное восстановление можно осуществить с использованием фермента оксидоредуктазы в суспензии в реакционной смеси или иммобилизованного обычным способом. Фермент можно использовать в полностью очищенном состоянии, в частично очищенном состоянии или в микробных клетках, в которых он экспрессирован. Сами клетки можно использовать в нативном состоянии, проницаемом состоянии или лизированном состоянии. Специалистам в данной области техники будет понятно, что использование фермента в клетках предпочтительно для практического осуществления способа по изобретению, так как оно существенно экономичнее по затратам. Наиболее предпочтительно фермент экспрессируется в Е. сой и используется в виде суспензии нативных клеток.
Способ ферментативного восстановления соединений формулы (II) или (II') можно выполнить в смеси для восстановления, включающей указанное соединение формулы (II) или (II'), оксидоредуктазу, НАЭН или НАЭРН в качестве кофактора, косубстрат, такой как вторичный спирт, и подходящий буфер.
Энантиомерный избыток соединения формулы (II) или (II') при энантиоселективном восстановлении составляет по меньшей мере примерно 90%, предпочтительно по меньшей мер, примерно 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 99%.
Производные ферментов оксидоредуктаз представляют собой такие полипептиды, имеющие по меньшей мере 60%-ную идентичность с ЗЕО ГО, указанными выше, и обладающие оксидоредуктазной активностью. Специалистам в данной области техники известно, что существуют системы и технология, доступные для точного определения идентичности последовательностей.
Для того чтобы определить процент идентичности двух последовательностей, последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в последовательность первой аминокислотной последовательности можно внести бреши для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих позициях аминокислот. Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком, что и в соответствующей позиции во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в такой позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, разделяемых последовательностями (т.е. % идентичности =# идентичных позиций/общее число позиций (например, перекрывающиеся позиции х 100).
На основании вышеуказанных общих принципов процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Кагйи аиб АЙ8сйи1 (Ргос. №и1. Асаб. 3с1. иЗА, 87: 2264-2268, 1990), модифицированный так, как в Катйи аиб АЙ8СЙи1 (Ргос. №6. Асаб. 3с1. И3А, 90: 5873-5877, 1993). Такой алгоритм вводят в программу ВЬАЗТ, АЙ8сйи1 е! а1. (I. Мо1. Бю1., 215: 403410, 1990). Когда используют программы ВЬАЗТ и Оарреб ВЬАЗТ, используют параметры по умолчанию соответствующей программы.
Реакцию восстановления можно осуществить в однофазной системе с клетками, содержащими фермент, суспендированный в них. С другой стороны, реакцию можно выполнить в двухфазной системе вода/органический растворитель, как описано в ИЗ 2009/0017510 и ИЗ 7371903. Реакцию можно выполнять как обычную периодическую реакцию или как непрерывный процесс. Следует признать, что одним
- 3 027209 из существенных преимуществ энантиоселективного ферментативного восстановления для коммерческих применений является то, что оно поддается непрерывному осуществлению.
Реакционная смесь предпочтительно содержит от примерно 35 до 500 г клеток на кг сырого продукта, полученного восстановлением. Суспензия представляет собой водную часть реакционной смеси, которая также содержит буфер, например ТЕА-буфер (триэтаноламин), фосфатный буфер, трис-НС1 или глициновый буфер. Буфер может дополнительно включать ионы для стабилизации фермента, например источник ионов магния. Другие добавки, которые могут присутствовать в буфере для стабилизации ферментов, могут включать полиол, такой как глицерин, сорбиты и т.п., соединения серы, такие как 1,4-ОЬдитиотреитол, глутатион, цистеин или подобные, аминокислоты и пептиды или детергенты, такие как ДМСО. Предпочтительным стабилизатором для фермента является полиол, в частности глицерин, который может присутствовать в количестве от примерно 10 до 80%, предпочтительно примерно 50 мас.% относительно массы клеточной суспензии.
Способ энантиоселективного ферментативного восстановления осуществляют с использованием принципа сопряженного субстрата, при этом косубстрат в реакционной смеси используется для регенерации кофактора или кофермента, функция которого предоставлять водород для восстановления субстрата формулы (II) или (II').
Кофактор предпочтительно используют в восстановленном состоянии, т.е. ΝΑΌΡΗ или ΝΑΌΗ соответственно. Кофактор присутствует в реакционной смеси в концентрации от примерно 0,01 М до 5 мМ, предпочтительно, 0,05-0,5 мМ.
В реакции косубстрат функционирует, окисляясь при регенерации кофактора ΝΑΌΡΗ или ΝΑΌΗ. Косубстрат присутствует в реакционной смеси в количестве от примерно 10 до 80 об.%, предпочтительно от примерно 10 до 50 об.%, наиболее предпочтительно примерно 15-25 об.%.
Окисленный кофактор, образовавшийся во время восстановления соединения формулы (II) или (II'), восстанавливается за счет окисления косубстрата, которое также можно катализировать ферментом оксидоредуктазой. Таким образом, отдельным экономическим преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что фермент оксидоредуктаза действует как восстановитель соединения так и как окислитель косубстрата, следовательно, никакой другой фермент не должен использоваться для регенерации кофактора.
Однако, что также входит в объем настоящего изобретения, для того чтобы увеличить скорость восстановления субстрата формулы (II) или (II'), в реакционную смесь добавляют другой фермент для регенерации кофактора.
В другом воплощении в реакционную смесь может быть добавлен органический растворитель, который не участвует в регенерации кофактора, и процесс восстановления выполняется в водноорганической 2-фазной системе. Примеры таких растворителей включают, без ограничения, диэтиловый эфир, третичный бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан. Такой растворитель может присутствовать в количестве примерно 1-50 об.% относительно объема реакционной смеси.
Количество субстрата формулы (II) или (II') в реакционной смеси предпочтительно превышает примерно 0,1 мас.% и может возрастать до примерно 50 мас.%, причем препочтительная концентрация составляет от примерно 5 до 30 мас.%. Количество указанного субстрата будет изменяться в зависимости от его чистоты, так как способ можно осуществлять с субстратом в очищенном состоянии или в виде сырого продукта, содержащего различные количества и типы примесей.
После добавления всех компонентов рН реакционной смеси будет находиться в интервале 5-10, предпочтительно, от 7 до 9, оптимально составлять примерно 7,5.
Ферментативное восстановление по настоящему изобретению осуществляют при температуре примерно 10-45°С, предпочтительно примерно 20-40°С, наиболее предпочтительно при примерно 25-35°С.
Способ энантиоселективного восстановления, кроме получения соединений формулы (I) или (I') с высоким выходом и весьма высокой энантиоселективностью, является экономически эффективным и безопасным для окружающей среды. Так, соединение формулы (I) или (I') высокой оптической чистоты можно получить в присутствии фермента в вышеуказанных условиях реакции за 2-96 ч, предпочтительно за от примерно 4 до 24 ч.
Во время инкубации рН смеси поддерживают в интервалах, заданных выше, путем периодической проверки и добавления обычного кислотного или щелочного реагента, например карбоната натрия и гидроксида натрия соответственно.
Экспериментальный раздел.
Пример 1.
Получение раствора фермента.
Компетенетные клетки ЕзсйейсЫа сой 81агВБ21 (Эе3) (ЧпуПгодеп) или клетки КБ791 (генетический штамм Е.сой, Уа1е, υδΑ) соответственно трансформируют экспрессирующими конструкциями рЕТ21ΜΙΧ, кодирующими различные оксидоредуктазы. Затем колонии ЕзсйейсЫа сой, трансформированные экспрессирующими конструкциями, культивируют в 200 мл среды ЬВ (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 1% №С1) с 50 мкг/мл ампициллина или 40 мкг/мл канамицина соответственно до тех пор,
- 4 027209 пока не достигнут оптической плотности 0,5, измеренной при 550 нм. Экспрессию рекомбинантного белка индуцируют добавлением изопропилтиогалактозида (ΙΡΤΟ) в концентрации 0,1 мМ. После 16 ч индукции при 25°С и 220 об/мин клетки собирают и замораживают при -20°С.
Для получения растворов фермента 30 г клеток ресуспендируют в 150 мл триэтаноламинового буфера (100 мМ, рН 7, 1 мМ М§С12, 10% глицерина) и гомогенизируют с использованием гомогенизатора высокого давления. Затем раствор фермента смешивают со 150 мл глицерина и хранят при -20°С.
Пример 2.
Получение реакционной смеси.
Реакционные смеси получают с использованием восстановленных кофакторов (А) и использованием окисленного кофактора в комбинации с подходящим косубстратом для регенерации восстановленного кофактора (В).
В зависимости от конкретных требований для отдельного фермента используют или калийфосфатный буфер, 100 мМ, рН 7,5, или триэтаноламиновый буфер, 100 мМ, рН 7,5. Кроме того, буфер может содержать 1 мМ М§С12 или 10% (об./об.) для стабилизации.
Реакционная смесь А.
160 мкл буфера;
100 мкл ΝΑΌΗ/ΝΑΌΡΗ (40 мг/мл);
мкл 2-пропанола;
мкл раствора фермента согласно примеру 1;
мг трет-бутил-3-оксопиперидинкарбоксилата.
Реакционная смесь В (с 2-пропанолом).
450 мкл буфера;
0,05 мг ΝΑΏ/ΝΑΏΡ;
мкл раствора фермента согласно примеру 1;
мг трет-бутил-3-оксопиперидинкарбоксилата;
мкл 2-пропанола;
мкл фермента для регенерации, если требуется.
Реакционная смесь В (с 4-метил-2-пентанолом).
250 мкл буфера;
0,05 мг ΝΑΏ/ΝΑΏΡ;
мкл раствора фермента согласно примеру 1;
мг трет-бутил-3-оксопиперидинкарбоксилата;
250 мкл 4-метил-2-пентанола;
мкл фермента для регенерации, если требуется.
После 24 ч инкубации образцы А и В экстрагируют дихлорметаном и анализируют с использованием ГХ. Образцы анализируют на энантиомерный избыток и конверсию.
Пример 3. Получение трет-бутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 5>ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
К смеси 450 мкл буфера (100 мМ фосфата калия, рН 7,5, 1 мМ ΖηΟ2). 50 мг трет-бутил-3оксопиперидинкарбоксилата, 0,05 мг ΝΑΏ и 50 мкл 2-пропанола добавляют 75 мкл суспензии фермента 8ЕО ГО ΝΟ: 1 согласно примеру 1. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. Через 24 ч субстрат полностью превращается в соответствующий третбутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Пример 4. Получение трет-бутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 5>ЕО ГО ΝΟ: 2.
К смеси 400 мкл буфера (100 мМ триэтаноламина, рН 7,5, 1 мМ М§С12), 50 мг трет-бутил-3оксопиперидинкарбоксилата, 0,05 мг ΝΑΌ и 100 мкл 2-пропанола добавляют 43 мкл суспензии фермента 8ЕО ГО ΝΟ: 2 согласно примеру 1. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. Через 24 ч примерно 98% субстрата превращаются в соответствующий третбутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Пример 5. Получение трет-бутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 5>ЕО ГО ΝΟ: 5.
К смеси 400 мкл буфера (100 мМ триэтаноламина, рН 7,5, 1 мМ М§С12), 50 мг трет-бутил-3оксопиперидинкарбоксилата, 0,05 мг ΝΑΌ и 100 мкл 2-пропанола добавляют 43 мкл суспензии фермента 8ЕО ГО ΝΟ: 5 согласно примеру 1. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. Через 24 ч примерно 98% субстрата превращаются в соответствующий третбутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Пример 6. Получение трет-бутил-(3§)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 5>ЕО ГО ΝΟ: 8.
К смеси 250 мкл буфера (100 мМ фосфата калия, рН 7,5, 1 мМ ΖηΟ2), 50 мг трет-бутил-3оксопиперидинкарбоксилата, 0,05 мг ΝΑΌ и 250 мкл 4-метил-2-пентанола добавляют 100 мкл суспензии фермента 8ЕО ГО ΝΟ: 8 согласно примеру 1. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температу- 5 027209 ре при непрерывном перемешивании. Через 24 ч примерно 98% субстрата превращаются в соответствующий трет-бутил-(38)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Пример 7. Получение трет-бутил-(38)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 9.
К смеси 400 мкл буфера (100 мМ фосфата калия, рН 7,5,1 мМ МдС12), 100 мг трет-бутил-3оксопиперидинкарбоксилата, 0,05 мг ΝΆΌ и 100 мкл 2-пропанола добавляют 30 мкл суспензии фермента 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 9 согласно примеру 1. Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. Через 24 ч примерно 95% субстрата превращаются в соответствующий третбутил-(38)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Пример 8. Получение трет-бутил-(38)-3-гидроксипиперидинкарбоксилата с использованием оксидоредуктазы 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 9.
Суспендируют 10 г субстрата трет-бутил-3-оксопиперидинкарбоксилата в 20 мл 2-пропанола. В отдельном сосуде 10 мг ΝΆΌ растворяют в 80 мл буфера (100 мМ фосфата калия, рН 7,5, 1 мМ МдС12) и 5,7 мл раствора фермента 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 9, как в примере 1. Смесь 2-пропанол/субстрат добавляют к смеси буфер/фермент. Реакционную смесь инкубируют при 30°С при непрерывном перемешивании. Через 24 ч примерно 95% субстрата превращаются в соответствующий трет-бутил-(38)-3-гидроксипиперидинкарбоксилат, показывающий энантиомерный избыток >99,8%.
Результаты приводятся в табл. 1.
Таблица 1
8Е(2 ГО ΝΟ Конверсия в реакционной смеси А трет-Бутил-(3 8)-3 - гидроксипиперидин карбоксилат трет-Бутил-(ЗК)-3- гидроксипиперидин карбоксилат Кофактор
8Εζ) ГО N0:1 >99 99,8 0,2 ΝΑϋΗ
ЗЕ(2 ГО N0:2 >99 >99,9 Не опр. ΝΑΟΗ
8Е<2 ГО N0:3 >99 99,5 0,5 ΝΑϋΡΗ
8Е0 ГО N0:4 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋΗ
8Е<3 ГО N0:5 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋΡΗ
ЗЕ<3 ГО N0:6 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋΗ
5Εζ) ГО N0:7 >99 >99,9 Не опр. ΝΑΟΗ
ЗЕ(3 ГО N0:8 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋΗ
ЗЕ(3 ГО N0:9 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋΗ
3Εζ> ГО ΝΟ Конверсия в реакционн ой смеси В трет-Бутил-(38)3-гидрокси пиперидин карбоксилат трет-Бутил- (ЗК)-3- гидроксипи перидинкарб оксилат Кофак тор Кофермент, применяемый для регенерации
3Ε(} ГО N0:1 >99 99,8 0,2 ΝΑϋ Сопряженный субстрат, 2-пропанол
5Ε<3 ГО N0:2 >99 >99,9 Не опр. ΝΑΟ Сопряженный субстрат, 2-пропанол
3Ε<2 ГО N0:4 >99 >99,9 Не опр. ΝΑϋ Сопряженный субстрат, 2-пропанол
8Ε(2ΙΟΝΟ:6 >97 >99,9 Не опр. ΝΑΟ Сопряженный фермент, 2-метил-4пентанол
8Ε0 ГО N0:7 >99 >99,9 Не опр. ΝΑΟ Сопряженный субстрат, 2-пропанол
8Ε(2 ΙϋΝ0:8 >97 >99,9 Не опр. ΝΑΟ Сопряженный фермент, 2-метил-4пентанол
8Ε<3 ГО N0:9 >98 >99,9 Не опр. ΝΑΟ Сопряженный субстрат, 2-пропанол
- 6 027209
5Ε()ΙΙΕΝΟΕ Ι_Ι5ΤΙΝΟ
<110>
<120> ЕпгутаТтс гес!исттоп
<130>
<160> 18
<170> Ратептт уегзТоп 3.;
<210> <211> <212> <213> 1 341 РКТ Рт'сКта сарзиТаТа
<400> 1
мет Зег АТа Ьеи Зег ьуз ТКг СТп АТа СТу Туг Пе РКе ьуз ЬУЗ СТу
1 5 10 15
АТа С) у НТ 5 Пе УаТ ЬУЗ АТа сТи УаТ Рго Пе Рго ЬУЗ РГО ТКг СТу
20 25 30
АТа СТп Зег 35 Ьеи Ьеи Агд УаТ ьуз 40 АТа АТа СТу мет суз 45 нтз Зег Азр
|_еи ΗΪ 5 УаТ Пе СТу сТи тКг ьеи сТи УаТ Рго ТКг Азр СТу Туг УаТ
50 55 60
Ьеи СТу НТЗ сТи Пе АТа СТу сТи Ьеи УаТ СТи Пе СТу Азр Зег УаТ
65 70 75 80
А5П Рго сТи УаТ РКе 85 ьуз УаТ СТу СТу Агд 90 Туг АТа УаТ нтз сТу 95 Ьеи
АЗП Зег суз СТу 100 5ег Суз сТи МеТ Суз 105 Агд ТКг СТу Нтз Азр 110 АЗП Азр
суз ТКг СТу АЗП СТи Зег ьуз тгр Туг СТу ьеи СТу Пе Зег СТу ОТ у
115 120 125
туг СТп СТп туг Ьеи Ьеи УаТ Рго АЗП зег НТ 5 НТЗ 1_еи 1_еи Рго Пе
130 135 140
Рго Азр Азп УаТ Зег Туг сТи уаТ АТа АТа АТа тКг Зег Азр АТа УаТ
145 150 155 160
Беи ТКг РГО туг НТ 5 АТа Пе ьуз АЗП Зег СТу УаТ тКг РГО Зег Зег
165 170 175
Ьуз УаТ ьеи мет РКе СТу Ьеи СТу СТу Ьеи СТу Зег АЗП АТа Ьеи СТп
180 185 190
Пе Ьеи ЬУ5 АТа РКе СТу АТа Туг УаТ УаТ АТа УаТ Азр УаТ ьуз РГО
195 200 205
страница 1
А1а Зег ЬУ5 АТа Пе АТа А5р сТи РКе ьуз АТа Азр сТи рКе туг ТКг
210 215 220
Азр Пе Зег СТп Зег зег Тгр ьуз РГО АТа зег РКе Азр туг Суз РКе
225 230 235 240
Азр РКе УаТ 5ег Ьеи 245 СТп УаТ ТКг РКе Азр 250 Пе Суз СТп ьуз туг 255 Пе
ьуз Зег НТ 5 сТу ТКг Пе РКе Рго УаТ СТу ьеи СТу Зег Зег Ьуз ьеи
260 265 270
ТКг РКе Азр 275 |_еи СТу А5П |_еи АТа 280 ьеи Агд сТи УаТ ьуз 285 Пе УаТ сТу
АЗП РКе Тгр сТу ТКг Зег СТп сТи СТп Пе сТи АТа мет сТи 1_еи УаТ
290 295 300
зег 5ег СТу Агд УаТ ьуз РГО СТп УаТ НТЗ тКг тКг сТи ьеи сТи АЗП
305 310 315 320
ьеи РГО сТи Зег Ьеи сТи ьуз 1_еи сТи сТи СТу ьуз Пе Азп СТу Агд
325 330 335
ьеи Уа! Мет 1_еи Рго 340 <210> 2 <211> 348 <212> РКТ <213> кКосТососсиз егутКгороТтз <400> 2
мет 1 ЬУЗ АТа Пе СТп 5 Туг тКг Агд Пе СТу АТа сТи Рго оТи ьеи тКг
10 15
сТи Пе Рго Ьуз РГО сТи Рго СТу Рго сТу сТи УаТ Ьеи ьеи сТи УаТ
20 25 30
тКг АТа АТа СТу УаТ суз НТЗ 5ег А5р Азр РКе Пе мет зег ьеи РГО
35 40 45
сТи СТи СТп Туг тКг туг сТу 1_еи РГО ьеи тКг 1_еи СТу нтз сТи СТу
50 55 60
АТа СТу ьуз УаТ АТа АТа УаТ СТу сТи СТу УаТ сТи СТу ьеи Азр Пе
65 70 75 80
СТу ТКг АЗП УаТ УаТ УаТ туг СТу Рго тгр СТу суз СТу Азп Суз Тгр
90 95
- 7 027209
нт5 Суз Зег С1п с!у геи с!и А5П туг 105 Су5 Зег Агд А1а С1п 110 С1 и геи
100
С1у 11 е Азп РГО РГО С1у геи С1у А1а Рго С1у А1а геи А1а С1и РЬе
115 120 125
мег 11 е 130 Уа1 Азр Зег Рго Агд 135 НТ 5 геи Уа1 РГО 11 е 140 С1у Азр геи Азр
Рго Уа! гуз тЬг Уа1 РГО геи тЬг Азр А1а С1у геи ТЬг РГО туг НТ 5
145 150 155 160
А1а 11 е гуз Агд Зег геи рго гуз геи Агд С1у С1у зег туг А1а Уа1
165 170 175
Уа1 11 е с1у тЬг 180 С1у С1у геи с1у нт 5 185 Уа1 А1а Пе с1п геи 190 геи Агд
НТ 5 геи зег А1а А1а тЬг Уа1 Пе А1а геи Азр Уа1 зег А1а Азр гуз
195 200 205
Ьеи С1и геи А1а тЬг гуз Уа1 С1у А1а НТ 5 С1и Уа1 Уа1 геи Зег Азр
210 215 220
ьуз Азр А1а А1а С1 и А5П Уа! Агд гуз Пе тЬг С1у Зег С1п С1у А1а
225 230 235 240
А1а геи Уа! геи Й? РЬе Уа1 с1у туг С1п 250 РГО ТЬг 11 е Агр тЬг 255 А1а
мег А1а Уа1 А1а С1у Уа1 С1у Зег Агр Уа! ТЬг Пе Уа! С1у 11 е С1у
260 265 270
А5Р С1у с!п А1а НТ 5 А1а гуз Уа1 С1у РЬе РЬе С1п зег Рго Туг С1и
275 280 285
А1а Зег Уа1 тЬг Уа1 РГО туг Тгр С1у А1а Агд А5П С1и геи Пе С1и
290 295 300
геи Не Азр геи А1а НТ 5 А1а С1у Пе РЬе А5р Пе А1а Уа1 С1и ТЬг
305 310 315 320
РЬе 5ег геи Азр А5П С1у А1а С1и А1а туг Агд Агд геи А1а А1а С1у
325 330 335
тЬг геи зег с1у Агд А1а Уа! Уа! Уа1 РГО С1у геи
340 345
<210> 3 <211> 338 <212> ΡΚΤ <213> ме!5сЬптко\л/та гоЬеПтт
<401 э> . 3
Мег ТЬг тЬг зег Уа1 РЬе Уа! зег с! у А1а тЬг С1у РЬе 11 е А1а С1п
1 5 10 15
НТ 5 Уа1 Уа! гуз геи геи геи зег гуз С1у туг АЗП Уа! Уа1 С1у Зег
20 25 30
Уа1 Агд тЬг А1а С1и гуз С1у гуэ А5П геи А! а гуз геи РЬе С1у тЬг
35 40 45
С1у 5ег 50 РЬе тЬг Туг С1и Уа! 55 Уа! РГО гуз геи С1и 60 А1а РГО С1у А1а
РЬе А5р С1 и А1а геи С1и гуз НТ 5 РГО с!и Уа! зег Уа1 РЬе геи НТ 5
65 70 75 80
ТЬг А1а Зег РГО Уа1 ТЬг РЬе АЗр Уа! гуз А5р 11 е С1и гуз С1и геи
85 90 95
геи геи РГО А1а Уа! с! и С1у тЬг гуз АЗП Уа! РЬе зег а! а Пе гуз
100 105 110
А1а НТ 5 С1у РГО С1п Пе гуз АЗП Уа1 Уа! Уа! тЬг зег зег Уа! А1а
115 120 125
А1а А1а геи Азр РГО а! а Агд АЗП геи Азр РГО ТЬг РЬе тЬг Уа! Азп
130 135 140
С1и Азр зег Тгр Азп РГО ίί е зег тгр С1и Азр Зег гуз С1п Азп А! а
145 150 155 160
ме! тЬг с!у Туг РЬе с1у Зег ЬУ5 гуз РЬе А1а С1и гуз А! а А1а Тгр
165 170 175
Азр РЬе уа! С1и а! а С1и гуз Рго АЗП РЬе геи геи АЗП тЬг Уа! геи
180 185 190
Рго Уа! туг Уа! РЬе с! у РГО С1п А1а РЬе А5р зег С1и Уа1 гуз с1у
195 200 205
С1и геи АЗП туг зег А1а с! и Пе Пе АЗП гуз геи геи гуз геи с! у
210 215 220
Рго Азп Азр С1и Уа1 Рго зег С1п геи С1у с1у РЬе Уа! Азр уа! Агд
225 230 235 240
Азр Уа1 а! а гуз А1а 245 НТ 5 геи А1а А1а РЬе 250 е!и с1у С1у геи Зег 255 АЗП
С1п Агд геи геи геи Агд ТЬг А1а А1а РЬе АЗП А1а С1п Агд Уа! геи
260 265 270
- 8 027209
Α5Ρ Ιΐθ Ιΐθ А5П Азп Ьу5 РКе Уа! Азп Ьеи Агд с!у с!п ьеи Рго ТКг
275 280 285
С1у тКг 290 Рго Суз ьуз С1у С! и 295 РГО С1и Бег ТКг С1у 300 Бег уа! тКг Азр
А5П Бег Агд тКг ьуз ьуз Ьеи ьеи Азп РКе Рго а! а Пе Азр ьеи С1и
305 310 315 320
Α5Π Суз Уа1 Уа! Азр Бег Уа! тКг С1п Ьеи мет ьуз Бег с!п ьуз ьуз
325 330 335
Уа! ьеи
<210> - 4
<211> 336
<212> 1 РКТ
<213> ι СапсКба | эагарзПозт з
<400> 4
Ме! Бег Пе РГО Бег Бег С1п туг С1у РКе уа! РКе АЗП ьуз С1п Бег
1 5 10 15
с!у Ьеи АЗП ьеи Агд Азп Азр ьеи РГО Уа! НТЗ ьуз РГО ьуз А! а е1у
20 25 30
С1п Ьеи Ьеи ьеи ьуз уа! Агр А! а Уа! С! у ьеи суз Нтз Бег А5р ьеи
35 40 45
ΗΤ5 Уа1 Пе туг с! и с! у ьеи АЗр суз с!у Азр АЗП Туг Уа1 ме! с! у
50 55 60
НТЗ С1и Пе а! а С! у тКг Уа! А1а а! а Уа! с! у Азр Азр Уа1 11 е Азп
65 70 75 80
Туг Ьуз Уа! С1у Азр Агд Уа! А1а суз Уа! С! у Рго АЗП С1у СУ5 е!у
85 90 95
С1у Суз Ьуз туг Суз Агд С! у а! а 11 е Азр Азп Уа! суз ьуз АЗП А! а
100 105 110
РКе С1у Азр 115 Тгр РКе С! у Ьеи С1у 120 туг Азр С1у с!у туг 125 С1п С1п туг
Ьеи ьеи Уа! тКг Агд РГО Агд АЗП ьеи Бег Агд Пе РГО Азр АЗП Уа!
130 135 140
Бег А! а А5р Уа! А! а А! а А! а Бег ТКг Азр А! а Уа1 ьеи ТКг РГО туг
145 150 155 160
НТ 5 А1а Пе ьуз МеГ А! а с!п Уа! Бег РГО ТКг Бег А5П Пе Ьеи ьеи
165 170 175
Пе С! у а! а с! у С! у Ьеи с! у с! у Азп А! а Пе с!п Уа! А! а ьуз а! а
180 185 190
РКе С! у А! а 195 ьуз Уа! тКг Уа! ьеи 200 Азр ьуз ьуз ьуз С! и 205 А1а Агд Азр
с!п А! а ьуз ьуз Ьеи с! у А! а Азр А! а Уа1 туг С! и ТКг Ьеи Рго с! и
210 215 220
Бег Пе Бег РГО С! у Бег РКе Бег а! а Суз РКе Азр РКе Уа! Бег Уа!
225 230 235 240
С1п А! а тКг РКе Азр 245 Уа1 суз с1п ьуз туг 250 Уа! с! и РГО ьуз с! у 255 Уа!
11 е ме! Рго Уа! с! у ьеи с1у а! а РГО АЗП Ьеи Бег РКе АЗП Ьеи С1у
260 265 270
Азр ьеи а! а ьеи Агд с! и Пе Агд Пе Ьеи С1у Бег РКе Тгр С! у тКг
275 280 285
ТКг АЗП Азр ьеи Азр Азр уа! ьеи ьуз Ьеи Уа! Бег с! и с! у Ьуз Уа1
290 295 300
ьуз Рго Уа! Уа! Агд Бег а! а ьуз ьеи Ьуз С1и Ьеи Рго с! и Туг Пе
305 310 315 320
С! и ьуз ьеи Агд АЗП Азп а! а туг с! и С1у Агд Уа! Уа! РКе А5П Рго
325 330 335
<210> 5 <211> 352 <212> ΡΚΤ <213> тКегтоапаегоЬас!ег Ьгосктт <400> 5
ме! ьуз С! у РКе А! а ме! Ьеи Бег Пе С! у ьуз Уа! е!у тгр Пе с! и
1 5 10 15
ьуз С! и ьуз РГО А1а Рго с! у Рго РКе Азр А! а 11 е Уа! Агд рго ьеи
20 25 30
а! а Уа1 Αί а РГО Суз тКг Бег Азр Пе НТЗ тКг Уа! РКе с! и с! у А1а
35 40 45
Пе С! у с! и Агд нтз Азп ме! 11 е Ьеи С! у НТ 5 С1и А! а Уа1 с! у с! и
50 55 60
Уа! Уа! с! и Уа! с! у Бег с! и Уа! Ьуз Азр РКе ьуз Рго с! у Азр Агд
65 70 75 80
Уа1 Уа! Уа1 рго А1а 11е ТЬг Рго Азр тгр Агд тЬг Зег С1и Уа1 б1п
85 90 95
Агд с1у Туг НТ 5 100 б!п НТ 5 зег С1у б!у 105 МеТ ьеи А1а С1у Тгр 110 ьуз РЬе
5ег АЗП Уа! Ьуз Азр С1у Уа1 РЬе С1у б!и РЬе РЬе НТ 5 Уа! А5П Азр
115 120 125
А1а Азр мет АЗП Ьеи А1а НТ 5 ьеи РГО ьуз С1и 11 е РГО Ьеи С1и А1а
130 135 140
А1а 145 Уа1 мет 11 е Рго Азр 150 мет мет тЬг тЬг & РЬе НТ 5 С1у А1а С1и 160
ьеи А1а Азр 11 е С1и 165 Ьеи С1у А1а ТЬг Уа1 170 А1а Уа1 ьеи С1у 11 е 175 б1у
рго Уа1 с1у ьеи мет А1а Уа! А1а б!у А1а ьуз ьеи Агд С1у А1а б!у
180 185 190
Агд Не Пе А1а Уа! С1у Зег Агд РГО Уа1 суз Уа1 Азр А1а А1а ьуз
195 200 205
Туг туг 210 С1у А1а ТЬг Азр 11 е 215 Уа1 АЗП Туг ьуз А5р 220 С1у Рго Пе б!и
Зег 6ΐη Пе мет АЗП Ьеи тЬг с!и С1у ьуз б1у Уа! Азр А1а А1а Пе
225 230 235 240
Пе А1а б!у С1у Азп 245 А1а Азр Пе мет А1а 250 тЬг А1а Уа1 Ьуз Пе 255 Уа1
ьуз РГО б!у б1у тЬг 11 е А1а АЗП Уа1 АЗП туг рЬе б1у С1и б!у б1и
260 265 270
Уа1 ьеи Рго Уа! РГО Агд Ьеи б!и Тгр б!у суз С1у мет а! а НТ 5 ьуз
275 280 285
ТЬг Пе ьуз б!у С1у ьеи суз РГО с!у б1у Агд ьеи Агд МеТ с!и Агд
290 295 300
Ьеи 11 е Азр ьеи Уа1 РЬе туг ьуз Агд Уа1 А5р РГО Зег ьуз ьеи Уа1
305 310 315 320
ТЬг НТ 5 Уа1 РЬе Агд с!у РЬе Азр Азп 11 е с1 и ьуз А1а РЬе мет ьеи
325 330 335
мет ьуз А5Р ьуз Рго ьуз Азр ьеи 11 е ьуз Рго Уа! Уа! Пе Ьеи А1а
340 345 350
<210> 6 <211> 347 <212> ΡΚΤ <213> мтсгоЬасТеп'ит зр,
<400> ι 5
МеТ ьуз А1а Ьеи б1п туг ТЬг ьуз 11 е С1у зег НТ 5 Рго б!и Уа! Уа!
1 5 10 15
С1 и 11 е 61 и ьуз 20 РГО зег РГО С1у Рго 25 б1у 61 п Уа1 ьеи Ьеи 30 ьуз Уа1
ТЬг А1а А1а б1у Уа! Суз НТ 5 зег А5р С1и РЬе Уа1 мет Зег ьеи Зег
35 40 45
с!и с1и б!п туг тЬг А1а А1а е!у туг РГО ьеи Рго ьеи тЬг ьеи б1у
50 55 60
НТ 5 б!и б!у А1а б1у Пе Уа1 б1и б1и ьеи б!у б1и б!у Уа1 б!и НТ 5
65 70 75 80
ьеи Зег Уа1 б1у Азр А1а Уа! А1а Уа! туг б1у РГО тгр б!у суз б1у
85 90 95
Агд Суз Агд АЗП 100 суз А1а С1п с!у ьуз 105 с!и Азп туг суз тЬг 110 АЗП А1а
б1п А1а 61 и б!у Пе мет Рго РГО б!у ьеи С1у А1а РГО б1у Зег мет
115 120 125
А1а С1и туг мет Пе Уа! Азр Зег а! а Агд Нт 5 ьеи Уа! Рго ьеи б1у
130 135 140
Ьеи Азр Рго Уа1 б1п Азп Уа1 Зег ьеи ТЬг А5р А! а б!у ьеи ТЬг
150 155 160
Рго туг НТ 5 А1а Уа! ьуз тЬг Зег ьеи РГО ьуз ьеи б1у А1а 61 у тЬг
165 170 175
тЬг А1а Уа1 Уа! Пе С1у ТЬг С1у б! у ьеи С1 у НТ 5 Уа1 А1а Пе б!п
180 185 190
11 е ьеи Агд А1а Уа1 5ег А1а А1а ТЬг Уа1 Пе А1а Ьеи Азр Уа1 Азп
195 200 205
А5р С1и ьуз Ьеи А1а ьеи А1а ьуз С1и Уа1 61 у А! а НТ 5 Нт 5 ТЬг Уа1
210 215 220
мет зег Азр б!у б!у А1а Уа! Азр а! а 11 е Агд Агд ьеи тЬг Азр б1у
225 230 235 240
Ьеи С1у А1а Азп А1а Уа! РЬе Азр РЬе Уа1 61 у А1а Азр РГО тЬг Пе
245 250 255
А1а тКг А1а 11е С1у А! а А! а А1а Ьеи АЗр а! а Азр ΐ! е тКг Пе Уа!
260 265 270
с!у Пе С1у б!у С1у ТКг а! а НТ 5 Уа1 6! у РКе б1у тКг уа! А1а Туг
275 280 285
А5р А1а А! а Беи Агд Не Рго Туг Тгр с! у Зег Агд 5ег с! и ьеи Пе
290 295 300
б!и Уа! 1_еи Азр Ьеи А! а Агд Зег с1у б! η уа! б! у Уа! б1и 11 е 6ΐη
305 310 315 320
Агд туг Зег 1_еи Азр 325 Азр с! у Рго ьуз А! а 330 Туг б!и а! а ьеи а! а 335 А! а
е!у тКг Уа! Агд с!у Агд а! а Уа! Пе Уа! РГО
340 345
<210> 7 <211> 346 <212> РКТ
<213> кКодососсиз гиЬег
<400> 7
Мег ьуз а!а ьеи с! η туг ТКг б! и 11 е б!у зег б!и РГО Уа1 Уа! Уа!
1 5 10 15
Азр Уа! Рго тКг РГО а! а Рго С1у РГО 61 у б!и Пе ьеи Ьеи 1_уз Уа!
20 25 30
ТКг л!а д!а с!у 1_еи суз НТЗ Зег АЗР 11 е РКе Уа! мет Азр МеТ РГО
35 40 45
а!а с!и с!п Туг Пе туг б!у Ьеи Рго Ьеи ТКг Ьеи б1у НТЗ б!и б1у
50 55 60
Уа! С!у тКг Уа! А! а с! и 1_еи б!у а! а б1у Уа1 ТКг 61 у РКе б1и тКг
65 70 75 80
с! у Азр а! а Уа! А! а 85 Уа! туг С1у РГО Тгр 90 б1у суз 61 у а! а суз 95 НТ 5
а!а Суз а!а Агд 100 б! у Агд с! и Азп туг 105 суз ТКг Агд а! а А1а 110 б!и ьеи
с!у 1!е тКг Рго РГО С! у |_еи б!у зег РГО б1у зег мет а! а б!и Туг
115 120 125
мет ΐ!е Уа! Азр Зег А1а Агд НТ 5 ьеи Уа1 РГО Пе б!у Азр 1_еи Азр
130 135 140
Рго Уа! А1а А1а Уа1 Рго Ьеи ТКг Азр а! а с1у 1_еи ТКг РГО туг НТЗ
145 150 155 160
А!а 11е 5ег Агд Уа1 ьеи РГО ьеи Ьеи 61 у Рго б1у Зег ТКг А! а Уа1
165 170 175
Уа! 11е с! у Уа! б!у с!у Ьеи б! у НТ 5 Уа! б1у Пе с! η 11 е Ьеи Агд
180 185 190
А!а Уа! зег а!а а! а Агд Уа1 Не А1а Уа! Азр Ьеи Азр А5р Азр Агд
195 200 205
Беи А1а [_еи А1а Агд с! и Уа! б1у А! а Азр а! а А1а Уа! ьуз Зег б1у
210 215 220
А!а б1у А!а а!а Азр А! а Не Агд С! и Ьеи ТКг б1у 61 у б!и б1у А! а
225 230 235 240
ТКг А!а Уа! РКе Азр РКе Уа! б! у А! а 61 η Зег ТКг 11 е Азр ТКг А! а
245 250 255
61 η б!п Уа! Уа! А! а Не Азр б1у НТ 5 11 е Зег Уа! Уа! б1у ΐ! е Нт 5
260 265 270
А!а с!у А!а Нтз А! а 1-уз Уа1 б! у РКе РКе МеТ Пе Рго РКе б1у А1а
275 280 285
Зег Уа! Уа! ТКг Рго туг тгр б!у тКг Агд Зег б1и |_еи мет Азр Уа!
290 295 300
Уа! Азр Ьеи а!а Агд А! а б! у Агд 1_еи Азр 11 е Нтз тКг б! и ТКг РКе
305 310 315 320
ТНг ьеи Азр б1и с!у Рго ТКг А! а Туг Агд Агд 1_еи Агд б!и б!у 5ег
325 330 335
11е Агд б!у Агд 340 б!у Уа! Уа! Уа! Рго 345 61 у
<210> 8 <211> 336 <212> ΡΚΤ <213> Рт'сКта δΐτρτάτ’δ
<400> , 8
Мет Зег Пе Рго а! а тКг 61 п Туг б1у РКе Уа! РКе ТКг Ьуз Ьуз Азр
1 5 10 15
61 у Ьеи 1_уз Пе Агд б!и АЗП мет РГО Уа! Ьеи 61 и Рго 1_уз А! а Азр
20 25 30
б!п Уа! 1_еи ьеи 1_уз уа! Α5Ρ а! а Уа! б!у 1_еи суз Нт 5 Зег Азр Теи
35 40 45
НТ 5 НТ 5 65 А1а 11е туг Азр 50 С1у тЬг 70 РЬе 55 Пе Азр Уа! РЬе с!у Азр Азп Туг Уа! МеТ С1у 60
с!и 11 е А1а с1у ьуз ьуз с!у а!а МеТ Уа! А5р РЬе
75 80
Тгр Αδρ ьеи АЗП ТЬг Агд уа! а! а суз РЬе с! у РГО Азп Зег Суз с! у
85 90 95
НТ 5 Суз С1п Ьеи Суз Агд ТЬг С! у РЬе С! и АЗП Азр Суз Пе АЗП Уа!
100 105 110
Уа! Азп С1у 115 тгр РЬе С1у Ьеи с! у 120 ьуз АЗП с! у С! у Туг 125 с! η с!п туг
Ьеи Ьеи Уа1 С1и ьуз РГО Агд АЗП Ьеи Уа! а! а Пе Рго А5р Азп Уа!
130 135 140
с! и ьеи Зег Азр а! а а! а А! а Пе тЬг Азр А! а ьеи ьеи ТЬг Рго Туг
145 150 155 160
НТ 5 А1а мет Агд ьеи 165 А1а с!у Уа! Агд Зег 170 С!у тЬг ьуз ьеи Ьеи 175 С! η
11 е С1у а! а С1у с1у Ьеи с!у Уа1 АЗП с! у Пе с! η Пе а! а ьуз А! а
180 185 190
РЬе С1у а! а С1п Уа1 тЬг Уа! Пе Азр ьуз ьуз Рго с! и а! а Уа! Азр
195 200 205
Уа! А1а ьуз Зег ьеи с!у А1а А5р с! и Уа! Туг Зег а! а ьеи Рго С1и
210 215 220
Зег ТЬг Зег РГО с!у Зег РЬе АЗр Уа! А! а Пе А5Р Туг Уа! Зег ТЬг
225 230 235 240
С1п С1у тЬг РЬе Азр ТЬг Суз С! п ьуз Туг Уа! Агд зег ьуз с! у Азп
245 250 255
11 е Уа! рго Уа! С1у ьеи а! а а! а Рго Агд Пе 5ег РЬе АЗП Ьеи С! у
260 265 270
Азр ьеи а! а Ьеи Агд С1и Пе Азп уа! ьеи с!у Зег РЬе Тгр с! у ТЬг
275 280 285
Зег Зег АЗР ьеи ьуз С1и суз РЬе Азр Ьеи Уа! Зег ьуз с! у ьуз Уа!
290 295 300
Ьу5 РГО ьуз Уа! тЬг Уа! А! а Рго Ьеи ьуз с! η ьеи РГО б!и туг Пе
305 310 315 320
Уа! ьуз ьеи с!п АЗП 325 Зег а!а Туг с! и с! у 330 Агд Уа1 Уа! РЬе ьуз 335 Рго
<210> 9
<211> 347
<212> РКТ
<213> ι Еогс1опа гиЬгорегТтпстиз
<400> 9
Мет 1 ьуз а! а Пе С1п 5 Не Пе С! η РГО с!у 10 ьуз Рго Рго с! и ьеи 15 Агд
с!и Уа1 с! и ьуз 20 Рго ТЬг Рго Агд Рго 25 с!у С! η Уа! Ьеи ьеи 30 ьуз Уа!
тЬг а! а а! а С1у А1а Суз Нт 5 Зег Азр Азр РЬе Уа! ьеи А5П ьеи РГО
35 40 45
с!и с1и с!у РЬе Рго Туг РГО ьеи РГО МеТ тЬг ьеи с!у НТ 5 С! и с! у
50 55 60
А! а с! у уа! Уа! а! а С1и Уа! с! у тЬг с! у Уа! тЬг С! у Пе Зег с! и
65 70 75 80
с!у ТЬг зег Уа! А1а Уа! Туг с! у а! а Тгр с! у суз с! у уа! суз Нт 5
85 90 95
РЬе суз а! а Агд с!у Ьеи с! и АЗП туг суз Зег Агд А! а с! у с!и Ьеи
100 105 110
с! у 11 е тЬг РГО РГО с! у Ьеи с! у АЗП РГО с! у а! а мет а! а с! и Туг
115 120 125
ьеи ьеи Уа! А5р Азр А1а Агд Нт 5 ьеи Уа! РГО Ьеи с! у Азр Ьеи Азр
130 135 140
Рго Уа! а! а а! а Уа! Рго Ьеи тЬг Азр А! а с! у ьеи ТЬг Рго Туг НТ 5
145 150 155 160
А1а Не ьуз РГО зег 165 ьеи РГО ьуз ьеи Уа! 170 С! у с!у ТЬг ТЬг А! а 175 Уа!
Уа! 11 е с!у а! а 180 С1у с!у Ьеи с! у НТ 5 185 Уа! С! у Пе с! η ьеи 190 ьеи Агд
НТ 5 Ьеи ТЬг РГО зег Агд Уа! Пе А! а ьеи Азр Уа! Зег Азр Азр ьуз
195 200 205
ьеи А! а РЬе А1а Агд С1и Уа! С! у А! а НТ 5 с! и Уа! Уа! Ьеи зег АЗр
210 215 220
А1а Азр а! а уа! А1а А5П Уа! Агд ьуз Пе ТЬг с! у АЗП Азр с! у А! а
- 12 027209
225 230 235 240
тЬг А1а Уа! РЬе 8? РЬе Уа! с! у Ьеи е!п 250 РГО ТЬг Ьеи Азр Пе 255 А! а
Μθΐ С!у Уа! Уа! 260 с1у тЬг мег с! у А5р 265 Уа! Уа! Пе Уа! б!у 270 Пе С! у
А5р мех Уа! А! а ТЬг А1а 1_У5 Уа! с! у РЬе РЬе тЬг с! η Рго туг С! и
275 280 285
Уа! 5ег 290 Уа! Агд А! а Рго туг 295 Тгр С! у а! а Агд Азр 300 с! и ьеи Пе с! и
Уа1 Ьеи Азр Ьеи а! а Агд А5р с! у Уа! Ьеи с1и Уа! а! а Уа! с! и Агд
305 310 315 320
РЬе 5ег Ьеи Азр Азр 325 с! у Уа! с! и А! а туг 330 Агд Агд ьеи а! а А! а 335 Азп
А5р ьеи Агд С! у Агд А! а Уа! Уа! Уа! Рго Азр
340 345
<210> 10 <211> 1026 <212> ϋΝΑ <213> РтсЬта сарзи!а!а <400> 10 агдгсгдсгс гсгхсаааас ссаддссддг гасагсггса адаадддгдс сддксасагс 60 дтсааддссд аддигссааг ссссаадсса асгддгдссс аагсгсггсг 1адддгсаад 120 дсьдсаддаа 1д1дссас1с гдасггдсас дгсагиддад ааасаидда ддгсссгасс 180 дагдддТасд гдсисддгса сдааа!1дсг ддЬдааЫдд гддадагсдд адасксддгс 240 аасссгдаад ииггааддг дддаддссд! 1агдс1дггс акддасгдаа ггсдгдгдда 300 гссгдгдада гдгдксдгас сддгсагдас аа!даскд1а сгддааагда агсдааакдд 360 гасддгсгдд дааггадкдд гддггассад садгассгдс гддгдссааа ггсдсасса! 420 с!а11дсс1а ггссадагаа сдгдгсскас даадХ1дс1д слдссассгс 1да1дсгд1с 480 «дасгссаг ассагдсгаг саадаапсс ддадгдасгс сагсггсгаа ддгдггдагд 540 гггддгскдд дгддкггддд аксдаасдса сисадаксс гсааддсакк 1ддадссга1 600 дгддмдссд тгдагдисаа дсссдсагсс ааадсааггд ссдасдаанг сааадсддаг 660 даакгсгага ссда!а!сад ссаа1с11с! Гддааассад сс1сд!11да 11ас1д1111 720 дасггсд-щг сдсгдсаддг сасстгсдас агсгдссада адгагагсаа дгсссасддк 780 асса1сГ1сс садгдддксг дддсгсдадс аадскдасС! гсдасПддд ааассгддса 840
11дсд1даад 1ааааа11дг тддгаасыс гддддгасгг сЬсаддааса дагсдаадса 900
агддадсгдд •Ыадсисддд Гаддд-Ьсаад сс-ьсаадис асассассда асЬЬдаааас 960
сыссгдааг сасггдаааа асгддаддад ддгаадагса а!ддаада!1 дд-ыагдсп 1020
ссатда 1026
<210> 11 <211> 1047 <212> ϋΝΑ <213> яЬоскэсоссиз егугЬгоро!тз
<400> 11 агдааддсаа гссад-ьасас дадаатсддс дсддаасссд аасссасдда даггсссааа 60
сссдадсссд д!ссаддгда адгдсгссгд даадгсассд сгдссддсдг с!дссасгсд 120
дасдаспса гсагдадсс! дсссдаадад садгасассг асддссггсс дсгсасдсгс 180
ддссасдаад дсдсаддсаа ддгсдссдсс дгсддсдадд дгдгсдаадд 1с1сдаса1с 240
ддаассаакд 1сд1сд1сга сдддссггдд ддцдгддса асгдггддса сгдсксасаа 300
ддасгсдада асгаидсгс гсдсдсссаа даасгсддаа -ьсаа-ьссгсс сддгсьсддг 360
дсасссддсд сдгтддссда дпсатдагс дгсдагтсгс сгсдссасст тдтсссдагс 420
ддгдассгсд асссддгсаа дасддгдссд ссдассдасд ссддгскдас дссд!агсас 480
дсдаксаадс дысгсгдсс дааасггсдс ддаддсгсд! асдсддггдг саггддгасс 540
ддсдддсЬсд дссасдгсдс саггсадсгс сгссдгсасс ГсЬсддсддс аасдд!са!с 600
дсьыддасд 1дадсдсдда саадсисдаа с-сддсаасса аддгаддсдс гсасдаддгд 660
д11с1дгсдд асааддасдс ддссдадаас дпсдсаада исасгддаад Ьсааддсдсс 720
дсаскддис гсдасггсд! сддсгассад сссассаьсд асассдсда! ддсьдгсдсс 780
дд!д1сддак садасдксас да!сд!сддд агсддддасд дссаддссса сдссааад!с 840
дддггсысс ааадгсспа сдаддсгксд дгдасад-Ыс сдьаггдддд гдсссдсаас 900
дадЫдаьсд ааггдагсда ссгсдсссас дссддсагсг гсдасаксдс ддгддадасс 960
ысадгсссд асаасддгдс сдаадсдТа! сдасдасгдд сгдссддаас дстсадсддс 1020
сдгдсдд-ьгд гддгсссгдд гсгдгад 1047
<210> 12 <211> 1018
<212> ϋΝΑ <213> мегзсЬптксмта 2оЬе!!тт
<400> 12
агдассасьг садгстггд! сСсгддгдсс ассддсггса Идсссадса сдгсд1:сааа 60
сгссгтсгсг сдаааддсга саасдгсдп ддсгссдгса даассдссда даааддсаад 120
аассгадсаа адсгагггдд сассддсгсс ИсассГасд аддгддгдсс сааасгсдаа 180
дсдссгддгд ссггтдасда ддссггддаа аадсагссад аддгдгсгдг дГГЫСдсас 240
асддссгсдс ссд-ьсассгг гдасдгсаад дасаггдада аададЫдс! ьсьссссдсс 300
дСсдадддса ссааааасд! сьььадьдсс ассааадссс асддсссдса дагсааааас 360
дгсдгддгда сдгссСсгдг гдсгдсддса сьсдагсссд сгадааассг ддассссасд 420
ПсаскдГда а!даадасгс тгддаассса агсгсдгддд аддасгсдаа дсадаасдсс 480
- 13 027209
ахдассдддх асхххддсхс саадаадххх дсададаадд ссдсдхддда ххххдхддаа 540
дссдадаадс ссаасхххсх дХХдаасасс дхдххдсссд хдхасдхсхх хддсссссад 600
дсдхххдасх ссдаддхсаа дддсдадсхс аасхасхсхд ссдааахсах саасаадххд 660
ххдаадххдд дасссаасда сдаадхдссс ХсдсаасХдд ддддхххсдх сдасдхдада 720
дасдхддсса аддсХсасХХ ддссдсаххс дадддсддас хсхсдаасса дсдссххххд 780
сххадаасдд садсдхххаа хдсдсаасдс дхдсххдаса хаахсаасаа хаадхххдхх 840
аасххдадад дасадххдсс сасхддаасд ссххдхааад дсдадссхда аадсасхддс 900
ХсХдХдасдд асааххсдад аассаадаад ххаххдаасх хсссадссах сдасххддад 960
аасхдхдхдд хддасхсддх хасссадсхс ахдаадхссс адаадааддх ХХХдХаад 1018
<210> 13 <211> 1011
<212> ϋΝΑ <213> СапсНйа рагарзПозтз
<400> 13 ахдхсааххс сахсаадсса дхасддаххс дхаххсааха адсаахсадд асххаахсхд 60
адааахдахх хдссхдхсса саадсссааа дсдддхсаах хдххдххдаа адххдахдсх 120
дХХддаХХдХ дхсаххсхда хххасахдхс ахххасдаад ддххддаххд ХддХдаХааХ 180
хахдхсахдд дасахдааах хдсхддаасх дХХдсХдсХд ХдддХдаХда хдхсаххаас 240
хасааддХХд дхдахсдхдх хдссхдхдхс ддасссаахд дахдхддхдд дхдсаадхах 300
хдхсдхддхд ссаххдасаа хдхахдхааа аасдсахххд дХдаХХддХХ сддаХХдддд 360
ХасдахддХд ддХаХсааса дхасххдххд дххасхадас сасдхаасхх дХсХсдХаХс 420
ссадахаасд ХаХсХдсада сдхддсхдсд дсххсаасхд ахдсхдхахх дасассахах 480
сасдсаахса адахддсхса адхдхсасса асххсдааха хсххдсххах хддхдсхддх 540
ддаххдддхд дааахдсаах хсаадххдсс ааддсаХХХд дХдсдааадХ хасхдххххд 600
дасааааааа аддаддсхсд хдассаадса аадаадххдд дхдсхдахдс адхххахдаа 660
асаххдссад аахссахххс хссхддсхсх ххххсадсах дххххдаххх хдхххсадхд 720
саадсхасах ххдахдхахд хсаааадхах дххдаассаа адддхдхаах хахдсссдхд 780
ддасхсддхд схссхааххх ахсдхххаах ххдддадахх хддсаххдад адаааХХсда 840
ахсххдддха дхххххдддд аасхасхаах дахххддахд ахдххххдаа аххддххадх 900
дааддхааад ххааасссдх хдхдадаадх дссаааххда аддааХХдсс ададхахахх 960
даааааххда дааасаахдс ххахдааддх ададххдххх ххаахссаха д 1011
<210> 14 <211> 1059 <212> ϋΝΑ <213> тЬегтоапаегоЬасхег ЬгоскН
<400> 14 ахдаааддхх ххдсаахдсх садхахсддх ааадххддсх ддаххдадаа ддаааадссх 60
дсхссхддсс сахххдахдс хаххдхаада ссхсхадсхд хддссссххд сасххсддас 120
аххсахассд хххххдаадд сдссаххддс дааадасаха асахдахасх сддхсасдаа 180
дсхдхаддхд аадхадххда адхаддхадх даддХаааад аХХХХааасс хддхдахсдс 240
дххдххдхдс садсхаххас сссхдаххдд сддассхсхд аадхасааад аддахахсас 300
садсасХссд дХддааХдсХ ддсаддсХдд аааХХХХсда аХдХаааада хддхдххххх 360
ддхдаахххх ХХсаХдХдаа хдахдсхдах ахдаахххад сасахсхдсс хааадааахх 420
ссаххддаад схдсадххах даххсссдах ахдахдасса схддххххса сддадсхдаа 480
схддсадаха хадааххадд ХдсдасддХа дсадххххдд дхаххддссс адхаддхсхх 540
ахддсадхсд схддхдссаа аххдсдхдда дссддаадаа ххаххдссдх аддсадхада 600
ссадхххдхд хадахдсхдс аааахасхах ддадсхасхд ахаххдхааа схахааадах 660
ддхссхахсд ааадхсадах хахдаахсха асхдааддса ааддхдхсда хдсхдссахс 720
ахсдсхддад дааахдсхда саххахддсх асадсадхха адаххдххаа ассхддхддс 780
ассахсдсха ахдхааахха ххххддсдаа ддададдХХХ хдссхдххсс хсдхсххдаа 840
ХддддХХдсд дсаХддсХса ХаааасХаХа аааддсдддс ХаХдссссдд ХддасдХсХа 900
адаахддааа дасхдаххда ссххдххххх хахаадсдхд хсдахссххс хаадсхсдхс 960
асхсасдххх хссддддахх хдасаахахх дааааадссх ххахдххдах дааадасааа 1020
ссаааадасс хаахсааасс хдххдхааха ххадсахаа 1059
<210> 15 <211> 1044 <212> ΟΝΑ <213> МтсгоЬасХегзиш зр. <400> 15
аХдааддсас хссадхасас даадахсдда хсссассссд аадхсдхсда дахсдадаад 60
сссхсдссдд дхсссдддса ддхасхдсхс ааадхсассд ссдссддсдх схдссасхсд 120
дасдадххсд хдахдадссх садсдаддад садхасассд схдссддсха сссссхдссд 180
сХсасссХсд ддсасдаадд сдссддсахс дхсдаддадс хсддсдаадд хдхсдадсас 240
схдадсдхсд дадасдссдх сдссдхсхас ддссссхддд дххдсддссд схдссдсаас 300
хдсдсдсадд дсааддадаа схасхдсасд аасдсссадд сддаддддах сахдссхссс 360
ддхсХсдддд схсссддсхс ааХддсддад ХасаХдаХсд Хсдасадсдс дсдасассХс 420
дххссдсхсд дсдассхсда ссссдхдсад аасдхххссх хдасддахдс сддссхдасс 480
ссдхассасд сддхсаадас дхсасххссд аадсхдддсд ссддаасдас ддсддхсдхд 540
аХсддсассд ддддхсхсдд асасдхсдсд аххсадахсс Хдсдддсддх дХсддссдсд 600
ассдхдахсд сдххддасдх саасдасдад ааасхсдсдс хддссаадда ддхсддсдсс 660
сахсасассд ХсаХдадсда сддсддсдсс дхсдасдсда ХХсдссддсХ сассдасддх 720
сХдддсдсда асдссдхсхх сдасххсдхс ддхдсддасс сдасдахсдс дасддсдаха 780
ддадсадссд сдсхсдасдс адасахсасд ахсдхсддса хсддсддсдд аасддсхсас 840
- 14 027209 дгсддггссд дсассдСсдс 1Га1дасдсд дсдсЕИсдса ГсссдсаГГд дддсгсдсдс 900 адсдаастда гсдаддгдсй сдасстсдсд сдстсадддс аддсдддадг сдадаГссад 960 сдстастсас Ссдасдасдд сссдааддсд 1асдаддсдс Тсдссдсддд сасддГссдс 1020 ддссдсдссд гсаСсдСссс сгда 1044 <210> 16 <211> 1041
<212> ϋΝΑ <213> яЬойососсиз гиЬег
<400> 16 а!дааадссс Тссадгасас сдадагсддс гссдадссдд 1сдгсд1сда сдхссссасс 60
ссддсдсссд ддссдддсда дагссйдсгд ааддисассд сддссддсиг дгдссасгсд 120
дасагсйгсд СдаХддаса! дссддсадад садгасагсг асддГсййсс ссГсасссйс 180
ддссасдадд дсдгсддсас сдгсдссдаа сИсддсдссд дсд-Ссассдд аХСсдадасд 240
ддддасдссд Тсдссдгдга сдддссдТдд дддсдсддгд сдгдссасдс дгдсдсдсдс 300
ддссдддада асгасгдсас ссдсдссдсс дадсгдддса гсассссдсс сддгстсддс 360
гсдсссдддг сдайддссда дгасагдагс дгсдасгсдд сдсдссассг сдгсссдагс 420
ддддассгсд ассссдгсдс ддсдд11:ссд сгсассдасд сдддсстдас дссд!ассас 480
дсдагсгсдс дддгссСдсс сстдсгддда сссддстсда ссдсддгсдт сатсддддгс 540
ддсддасссд ддсасдхсдд саиссадагс сгдсдсдссд гсадсдсддс ссдсд!дагс 600
дссдйсдайс гсдасдасда ссдасгсдсд сйсдсссдсд аддСсддсдс сдасдсддсд 660
дгдаадгсдд дсдссддддс ддсддасдсд агссдддадс гдассддсдд гдадддсдсд 720
асддсддгдг гсдасггсд! сддсдсссад гсдасдагсд асасддсдса дсаддгддтс 780
дсдаИсдасд ддсасагсгс ддгддгсддс агссагдссд дсдсссасдс сааддхсддс 840
ггсггсайда ТсссдГХсдд сдсдгссдгс дгдасдссдг асСддддсас дсддгссдад 900
сгдагддасд гсдгддасс! ддсссдгдсс ддссддсгсд асаСссасас сдадасдсгс 960
асссгсдасд адддасссас ддссйассдд сддсгасдсд адддсадсаг ссдсддссдс 1020
ддддтддгсд гсссдддсгд а 1041
<210> 17 <211> 1011 <212> ΡΝΑ <213> РтсНта δΐτριάίδ <400> 17
агдгсхатгс стдсгасаса асатддпгс дгсггсасса ааааддасдд иггааааан 60
сдсдадааса ГдссГдИст сдаасссаад дсСдассаад 1сХ1дс11аа адгсдасдса 120
д!адда11дс дгсасгсгда ссгссатдсс агсгасдасд дсгтсдасп гддгдасааг 180
гасдггагдд дссасдаааг сдссддсасс а!1д1саада адддадсса! ддгсдас!1Г 240
Сдддассгаа асасссд!дг гдссгд-ст ддгссааасг ссхдтддсса пдгсаасгт 300
гд-ссдгас1д дппдаааа гда-сгдгагс аагдгсдиса асддстдд!! гддаШадд! 360
ааааасддад дсгассадса агапгдггд дггдаааадс сссдгааггг дд«дсга« 420
ссадасаасд гсдадсгдйс сдагдсадсг дссаггассд асдсгггдгг дасссссгас 480
сагдссагда даггадсгдд 1дггада1са ддсасдаадс ГсИдсаааГ гддтдсйдда 540
ддапдддад гааагддгаг ГсадаИдсГ ааадсагпд дадсгсаад! сасгдшагс 600
дасааааадс ссдаддсгд! адасдгсдс! аададссгад дсдсадагда адгагаггс! 660
дсасггссгд аагсаассад ГссдддаадГ псдагдид с!агсдасга сдтсгасг 720
сааддсас!! гсдасасггд гсаааадгас дгсадагсга адддгаагаг гдггсссдгг 780
ддаггддссд сгссаадааг 11сд11гаас Пдддадагг 1ддссс11ад адаааггаа! 840
дСссИддТа дсггсгдддд 1асагса1сс дасидаадд аагд-сггсда гггддгсадс 900
аадддсааад 1сааасс1аа ддгдасгд!! дстсса!1да адсаагтдсс гдаайаса!! 960
дгсаадггас адааГГсддс сгасдааддг адад!сд1д! 1саадсса1д а 1011
<210> 18 <211> 1044 <212> ϋΝΑ <213> Согс1опа гиЬгореггтпсгиз <400> 18
агдааддсса 11сада1са1 ссадссдддс ааассдссдд адсгдсдсда дд!сдадааа 60
сссасдссдс дхсссдддса ддгдггдсгд ааддгдасдд садссддсдс с!дсса11сд 120
дасдасСйсд ГссГсаасс! дсссдаддаа ддапсссс! агсссггдсс дагдасдсгс 180
ддссасдаад дддссддсд! ддгсдссдад дгсддгассд дсд-Ссассдд сагсгссдад 240
ддсассгсдд гддссдгдга сддадссгдд ддтгдсддсд гсгдгсасгг сгдсдсссдс 300
ддсс!ддада ас!ас!дсад ссдадссддс даас!сддса ссассссасс ддд-ссгсддс 360
аасссдддсд сдатддссда дтасстдсхс дгддасдасд сасддсагсг ддгдссдсис 420
дд-Сдассгсд асссддГддс ГдсадИссса сйсассдагд ссддссСсас дсссгассас 480
дсдагсааас ссгсдсиисс даадсГддТс ддсддсасса сддсадгддг сагсддадсс 540
ддгддгсисд ддса!д!сдд датссаасГд сТТсдссасс гдассссдгс ссддд!дасс 600
дс1с1сдасд гдадсдасда саадс!сдсд Шсдсдсдсд аддгсддддс йсасдаддгд 660
дгдсгсгссд асдссдагдс сдСсдсдаас дтссдсаада гсассддсаа сдагддгдсд 720
ассдссдгс! гсдасггсд! сдддсйдсаа ссСасдсГсд асагсдсдаг дддсдтсдгс 780
дддассагдд дйдасдгддт даГсдСдддс агсддгдаса ГддГсдссас ддсдааддгс 840
ддсисгиса сссадсссТа сдаддгдгсд дгасдсдсдс сдгассдддд ддсдсдсдас 900
даастсайсд аддгдстдда 1с1сдсасдс даеддддггс Тсдаддгддс дд!сдаасда 960
11с1сасгсд агдасддсд! сдаддссгас сддсдасгдд ссдссаагда сссгсдаддд 1020
сдадсадгсд 1дд1дссгда сгда 1044
- 15 027209

Claims (8)

1. Способ получения соединения формулы (I) 'Ν
I
К .он (I), где хиральный углерод находится в (^[-конфигурации;
К выбирают из водорода и С0К;
К1 выбирают из водорода, (С1-С6)алкила и 0К2;
К2 выбирают из (С1-С6)алкила и бензила, причем указанный бензил необязательно замещен одной или несколькими (С1-С6)алкильными группами;
включающий восстановление соединения формулы (II) .0 (II), в которой К имеет значения, указанные выше, оксидоредуктазой 8Е0 ГО N0: 1 или аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 60%-ную идентичность с 8Е0 ГО N0: 1, в присутствии кофактора, выбранного из NА^Η и NА^ΡΗ, и косубстрата, регенерирующего указанный кофактор, который представляет собой вторичный спирт.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что К представляет собой С0Ю
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что К1 представляет собой 0К2.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что К представляет собой СОО-трет-Ви.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что К представляет собой СОО-бензил.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный вторичный спирт выбирают из 2-пропанола, 2бутанола, 2-пентанола, 4-метил-2-пентанола, 2-гептанола и 2-октанола.
7. Применение оксидоредуктазы 8Е0 ГО N0: 1 или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 60%-ную идентичность с 8Е0 ГО N0: 1, для получения соединения формулы (I) из соединения формулы (II) по пп.1-5.
8. Применение оксидоредуктазы 8Е0 ГО N0: 1 или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 60%-ную идентичность с 8Е0 ГО N0: 1, для получения соединения формулы (I) из соединения формулы (II) по п.5.
EA201500018A 2012-06-18 2012-06-18 Ферментативное восстановление EA027209B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2012/001178 WO2013190341A1 (en) 2012-06-18 2012-06-18 Process for producing chiral 1 - substituted 2 - piperidinols employing oxidoreductases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201500018A1 EA201500018A1 (ru) 2015-06-30
EA027209B1 true EA027209B1 (ru) 2017-06-30

Family

ID=46513795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500018A EA027209B1 (ru) 2012-06-18 2012-06-18 Ферментативное восстановление

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9410169B2 (ru)
EP (1) EP2861750B1 (ru)
CN (1) CN104603278A (ru)
BR (1) BR112014031474A2 (ru)
CA (1) CA2874055A1 (ru)
EA (1) EA027209B1 (ru)
ES (1) ES2619338T3 (ru)
WO (1) WO2013190341A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898178B (zh) * 2014-01-14 2016-08-17 苏州国镝医药科技有限公司 酶法制备高手性纯(s)-3-哌啶醇及其衍生物的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004111083A2 (de) * 2003-06-18 2004-12-23 Iep Gmbh Oxidoreduktase aus pichia capsulata
WO2009040080A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Iep Gmbh Process for the enantioselective enzymatic reduction of intermediates

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10119274A1 (de) 2001-04-20 2002-10-31 Juelich Enzyme Products Gmbh Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
DE10218689A1 (de) 2002-04-26 2003-11-20 Degussa ADH aus Rhodococcus erythropolis
DE10300335B4 (de) * 2003-01-09 2008-06-26 Iep Gmbh Oxidoreduktase
DE10354779A1 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobellii
AT413541B (de) 2004-05-10 2006-03-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von 2-butanol
AT501928B1 (de) * 2004-10-27 2010-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
AT502395B1 (de) 2005-07-27 2007-03-15 Iep Gmbh Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen
AT503017B1 (de) * 2005-12-19 2007-07-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen reduktion von hydroxyketoverbindungen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004111083A2 (de) * 2003-06-18 2004-12-23 Iep Gmbh Oxidoreduktase aus pichia capsulata
WO2009040080A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Iep Gmbh Process for the enantioselective enzymatic reduction of intermediates

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIZAKI, N. YASOHARA, Y. NAGASHIMA, N. HASEGAWA, J.: "Characterization of novel alcohol dehydrogenase of Devosia riboflavina involved in stereoselective reduction of 3-pyrrolidinone derivatives", JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS. B, ENZYMATIC, ELSEVIER, AMSTERDAM,, NL, vol. 51, no. 3-4, 9 November 2007 (2007-11-09), NL, pages 73 - 80, XP022442769, ISSN: 1381-1177, DOI: 10.1016/j.molcatb.2007.10.017 *
ROMAIN LACHERETZ, DOMINGO GOMEZ PARDO JANINE COSSY: "Daucus carota Mediated-Reduction of Cyclic 3-Oxo-amines", ORGANIC LETTERS , 14(23), 6012-6015 CODEN: ORLEF7; ISSN: 1523-7052, vol. 11, no. 6, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 1245 - 1248, XP002695243, ISSN: 1523-7060, DOI: 10.1021/OL8029214 *
VAN LUPPEN, J. J.; LEPOIVRE, J. A.; LEMIERE, G. L.; ALDERWEIRELDT, F. C.: "Enzymic in vitro reduction of ketones. Part 13. HLAD-catalyzed reduction of 3-piperidone derivatives to piperidinols with high enantiomeric purity", STUDIES IN ORGANIC CHEMISTRY, ELSEVIER BV, NL, vol. 18, no. Bio-Org. Heterocycl., 1 January 1984 (1984-01-01), NL, pages 277 - 280, XP008161337, ISSN: 0165-3253, ISBN: 978-0-444-42691-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201500018A1 (ru) 2015-06-30
US20150275249A1 (en) 2015-10-01
CN104603278A (zh) 2015-05-06
ES2619338T3 (es) 2017-06-26
BR112014031474A2 (pt) 2017-08-01
CA2874055A1 (en) 2013-12-27
US9410169B2 (en) 2016-08-09
EP2861750A1 (en) 2015-04-22
WO2013190341A1 (en) 2013-12-27
EP2861750B1 (en) 2016-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210254109A1 (en) D-Glucaric Acid Producing Bacterium, and Method for Manufacturing D-Glucaric Acid
US9957497B2 (en) Hydrocarbon synthase gene and use thereof
TW200914610A (en) Isopropyl alcohol-producing bacteria and method for producing isopropyl alcohol using the same
CN105567652B (zh) 一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用
CN108300743B (zh) 一种(r)-2-氯-1-(6-氟-苯并二氢吡喃-2-基)-1-乙醇的生物催化方法
KR20200040585A (ko) 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
DE60128640T2 (de) Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-Hydroxybutanoat
CN103898178B (zh) 酶法制备高手性纯(s)-3-哌啶醇及其衍生物的方法
JP7569783B2 (ja) １，３－プロパンジオールおよび酪酸の生産が改善された微生物
EA027209B1 (ru) Ферментативное восстановление
JP5649119B2 (ja) シロ−イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ−イノシトール製造方法
CN109722442B (zh) 7β-羟基胆酸脱氢酶及其应用
CN112176007B (zh) 一种氨基醇手性中间体的制备方法
CN110857444A (zh) 一种鲨肌醇的制备方法
CN101177686B (zh) 一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株
CN112553174B (zh) 一种脱氢酶在(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用
CN109913428A (zh) 一种7β-羟基类固醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用
CN114410563B (zh) 大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用
CN107955805B (zh) 一种稳定性提高的nadh氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用
CN106047826A (zh) 醛脱氢酶、其重组表达转化体及在他汀前体合成中的应用
CN115992190A (zh) 一种双酶偶联合成糠醇的方法
CN117143844A (zh) 一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用
CN104178469A (zh) 一种环丙烷甲酸酯水解酶、基因、突变体及其应用
CN116855561A (zh) 一种高温高pH条件下制备还原型烟酰胺单核苷酸的工艺
CN118638829A (zh) 一组含有核糖体结合位点的序列及应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU