CN117143844A - 一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用 - Google Patents
一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及酶催化技术领域，尤其是一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用，该NADH焦磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris‑HCl，pH为7.5～10.0，加入NADH焦磷酸酶的粗酶液，30℃反应。该NADH焦磷酸酶与野生型NADH焦磷酸酶相比，可应用于适用于碱性pH催化NADH，表现出更强的耐碱性。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体领域为一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及其还原形式(NADH)是体内无处不在的分子，在能量代谢中起着至关重要的作用，因为它们在线粒体氧化磷酸化过程中充当氢化物接受和氢化物供体辅酶。除了作为氧化还原辅助因子的作用外，在过去十年中，NAD+已被发现是许多蛋白质家族的关键底物，通过其下游作用，这些蛋白质参与500多种酶促反应并调节细胞中几乎所有主要的生物过程.NAD+的这种连续酶促利用通过膳食色氨酸的从头合成或通过其从前体中回收来抵消。通过施用NAD+前体NMN补充NAD+已被证明可有效改善老年小鼠缺血IR损伤和肾毒性药物引起的肾小管损伤。这些结果使人们注意到使用NAD+前体对抗人类代谢疾病。
关于这种分子在细胞中的作用的信息非常稀少。事实上，只有一种酶活性被描述用于产生NMNH。据推测，在细胞中，NMNH将通过烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶(NMNATs)转化为NADH。然而，Nudix二磷酸酶的NMNH产生和NMNATs用于NADH合成仅在体外使用分离的蛋白质进行了描述，以及NMNH如何参与细胞NAD+代谢仍然未知。
有研究人员探索了NMNH给药在小鼠中的体内效应，并证明这种新的前体有效地提高了血液和各种组织中的NAD+水平，包括肾脏，在相同浓度下使用时比NMN更大。
这些结果证实，NMNH做为还原的NAD+前体可以作为非常有效的NAD+增强子，并为新一代高效的NAD+增强分子的发现提供了新的思路。
还原型烟酰胺单核苷酸(NMNH)虽然吸收效果优于NMN，但其水溶液稳定性很差，在常温中性pH时极易降解，并随时间的延长进一步加剧，对规模生产造成较大的障碍。为解决此问题，有两种方案值得尝试：一个是提升酶活、缩短总反应时间，以减少NMNH的降解发生时间，反应结束尽快进行提取流程；另一个是提升总反应体系的pH值，使NMNH的稳定性增强，减缓在反应过程中降解程度。而第二种方案可以通过筛选耐碱微生物来源的蛋白、点突变提升酶的耐碱性而实现，对于酸性条件易降解的产物，筛选耐碱突变体并将最佳反应条件调整至碱性，对于反应的进行、产物的保护以及后续分离提取都将带来积极的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶可用于催化NADH，其使用方法为：取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris-HCl，pH为7.5～10.0，加入NADH焦磷酸酶的粗酶液，30℃反应。
其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
②分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存，使用时按每公斤湿菌体加入2公斤纯水使用。
其中，所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
其中，所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
其中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶能够适用于碱性pH催化NADH，与野生型NADH焦磷酸酶相比，表现出更强的耐碱性，可取得较好的社会效益和经济价值。
附图说明
图1为0.5g/L NADH高效液相色谱结果；19.2分钟为底物NADH。
图2为0.4g/LNMNH高效液相色谱结果；8.2分钟为产物NMNH峰。
图3为实施例5反应30分钟的检测结果。
图4为对比例1反应30分钟的检测结果。
图5为实施例6反应15分钟的检测结果。
图6为实施例7反应15分钟的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。
以下实施例中涉及到的液相检测条件如下：
流动相：A相：15.6g二水合磷酸二氢钠溶解于900mL，完全溶解后加水定容1000mL。再加入20mL甲醇，充分溶合，再过滤超声。B相：甲醇。A:B＝95％:5％。
保留时间：22分钟等度洗脱。
柱子类型：岛津C18 4.6*250mm*5μm。
紫外波长：340nm。
柱温：30℃。
进样体积：10μL。
实施例1野生型NADH焦磷酸酶基因序列的获得
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，引物序列如表2所示，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
表1
| 2mMdNTP mix(2mM eachdNTP) | 5μl |
| 10×Pfubuffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO：4，命名为PKNPYwt，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
表2
| 1 | ATGCGTACCGGTCGTTGGCAGTCTGCTCTGCTGGACCCGGCTGCTGCTGGTGGTTG |
| 2 | GTTAGCGTCACCCAGGAACTGCTGTTTGTAGTGAGCCAGAGCCCAACCACCAGCAGCAGC |
| 3 | GTTCCTGGGTGACGCTAACGGTGTTCTGTTCCCGCGTGAATGGCTGAAACGTCAGGACCT |
| 4 | TCACCGTCGAAGTGACCAACACCGTGTTCAGACAGAACACGCAGGTCCTGACGTTTCAGC |
| 5 | TGGTCACTTCGACGGTGACGCTATCTACCTGCTGGAAGTTGACGCTCCGGAACGTCTGGA |
| 6 | AGCTTCCAGCATGAAGTGACGCAGACCGATCCAGTCGCAACCTTCCAGACGTTCCGGAGC |
| 7 | GTCACTTCATGCTGGAAGCTGACGAAGACCTGTTCGCTATGCTGGGTTTCGCTTCTCAGA |
| 8 | GCAAGAACCGCAGAAACGGTTTTCACGAGCCCAGGTACCGATCTGAGAAGCGAAACCCAG |
| 9 | CGTTTCTGCGGTTCTTGCGGTGCTCCGATGCAGCGTATGCCGCGTGACCGTGCTATGCGT |
| 10 | CGGAGACAGCAGCGGGTAACGCTGGATGTCGCAGGTTTCGCAACGCATAGCACGGTCACG |
| 11 | CCCGCTGCTGTCTCCGTCTATGATCGTTCTGGTTACCCGTGGTGACGAACTGCTGCTGGC |
| 12 | AGCCAGGGTAGAGTACATACCCGGAACGAAACGCGGAGAACGAGCCAGCAGCAGTTCGTC |
| 13 | GGTATGTACTCTACCCTGGCTGGTTTCTGCGAACCGGGTGAATCTGTTGAACACTGCGTT |
| 14 | ACCGATTTCCAGACCAACTTCTTCACGAACTTCACGAGCAACGCAGTGTTCAACAGATTC |
| 15 | GAAGTTGGTCTGGAAATCGGTAACATCCGTTACCTGGGTTCTCAGTCTTGGCCGTTCCCG |
| 16 | CACCAGAAACGTAGTCAGCGTGGAAACCCAGCATCAGAGAGTGCGGGAACGGCCAAGACT |
| 17 | CGCTGACTACGTTTCTGGTGAAATCGTTATGCAGCCGGACGAAATCGAAGACGCTCGTTG |
| 18 | ACGACCAGCCGGCAGACGCGGCAGTTCGTCGATACGGAACCAACGAGCGTCTTCGATTTC |
| 19 | CTGCCGGCTGGTCGTTCTATCGCTCGTTACCTGATCGACGTTTTCCTGGCTCGTCGTGCT |
| 20 | TTAGTGACCACCACCCGGCAGAACCGGGTCCGGCAGACCAGCACGACGAGCCAGG |
实施例2NADH焦磷酸酶突变体基因序列的获得
本发明的适用于碱性pH下反应的NADH焦磷酸酶，其源于SEQ ID NO：3的野生型NADH焦磷酸酶。NADH焦磷酸酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。
通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证退火温度(Tm)差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，引物序列如表4所示，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
表3
| 2mMdNTP mix(2mM eachdNTP) | 5μl |
| 10×Pfubuffer | 5μl |
| Pfu DNA polymerase(10U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 使得反应体系总体积至50μl |
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQ IDNO：2，命名为PKNPY2，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。与PKNPYwt的序列相比，具有三处突变R130Q，P178A，H184Q。
表4
实施例3摇瓶表达测试
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
实施例4分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15L，工作体积为8L，所用到的培养基为酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当OD600约为50.0(湿重约为100g/L)时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存，使用时按每公斤湿菌体加入2公斤纯水使用。
实施例5突变体碱性pH反应
30℃水浴反应，0.5mM MgCl2，0.5mM MnCl2，20mMTris-HCl，pH＝10.0；60mM NADH干粉；10g/L的粗酶液PKNPY2。30分钟取样检测产物生成情况。图3结果显示，PKNPY2体系在30分钟时已反应完成90％以上的底物。由于副产物腺苷酸在波长340nm时吸光较弱，并未显示出明显吸收峰，但并不影响对总体反应的判断。
对比例1野生蛋白碱性pH反应
30℃水浴反应，0.5mM MgCl2，0.5mM MnCl2，20mMTris-HCl，pH＝10.0；60mM NADH干粉；10g/L的粗酶液PKNPYfwt。30分钟取样检测产物生成情况。图4结果显示，PKNPwt体系在30分钟时仅反应不足10％的底物。显示野生蛋白不具有碱性pH反应的能力，推测是由于高pH抑制酶活或导致蛋白变性。
实施例6突变体碱性pH反应
30℃水浴反应，0.5mM MgCl2，0.5mM MnCl2，20mMTris-HCl，pH＝9.5；60mM NADH干粉；10g/L的粗酶液PKNPY2。15分钟取样检测产物生成情况。图5结果显示，PKNPY2体系在15分钟时85％以上的底物已完成转化。
实施例7突变体近中性pH反应对比
30℃水浴反应，0.5mM MgCl2，0.5mM MnCl2，20mMTris-HCl，pH＝7.5；60mMNADH干粉；10g/L的粗酶液PKNPY2。15分钟取样检测产物生成情况。图6结果显示，仅约60％的NADH反应完，剩余底物较多，明显差于实施例5高pH条件结果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶在催化NADH中的应用。
3.根据权利要求2所述适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶在催化NADH中的应用，其特征在于：取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris-HCl，pH为7.5～10.0，加入NADH焦磷酸酶的粗酶液，30℃反应。
4.根据权利要求3所述适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶在催化NADH中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①摇瓶发酵
挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；
②分批补料发酵
分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存。
5.根据权利要求4所述适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶在催化NADH中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
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