JP3702450B2 - 乳酸脱水素酵素測定用試薬 - Google Patents

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルカリ緩衝液を用いた乳酸脱水素酵素測定用試薬を溶液で供給する際に、吸光度上昇(ブランクアップ)を抑え、長期間安定に保存できる試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
多成分の微量検体中から目的成分を定量的に測定する臨床化学検査は、迅速さ、正確さ、さらには簡便化、微量化が求められ、検査の自動化が進められてきた。これに伴い、測定用の試薬も自動検査装置に適用できる形態で供給されることが求められている。従来は、酵素や基質を含む試薬はその保存安定性を考慮して、反応に必要な成分を含む凍結乾燥品として提供され、使用時に緩衝液等で溶解して用いられていたが、近年は作業性やコスト面から、予め必要な成分が調製された試薬溶液(以下液状試薬という)で供給され、自動検査装置にそのまま供給できる2試薬系で構成されることが主流となってきている。このような液状試薬で供給する場合、酵素類の安定性が著しく低下するため、長期間(例えば半年から1年)安定に保存するために各種安定化剤の添加等が検討されている。また、日本臨床化学会(JSCC)の勧告法では試薬の品質を一定に保つために緩衝液の種類や濃度および基質の濃度や反応時のpHを定め、これに準拠した試薬を奨励している。特にアルカリ緩衝液を用いた試薬の場合、保存中に酸化されて紫外部に吸収をもつ物質が生じることにより吸光度が自然上昇する現象(ブランクアップ)が認められる。このため、測定範囲の低下、測定感度の低下、試薬の保存安定性の低下による有効期限の短縮、共存物質による測定値への影響を受け易い等の問題があった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
上記試薬中の酸化を防止する方法として、従来、アルカリ緩衝液の添加濃度を増加させたり、空気との接触を少なくすることで影響を回避することが行われていた。しかしながら、添加濃度を増加させると勧告法の基準から外れ、また空気との接触面積を減らすのに試薬ボトルにチューブを差し込む方法などが取られていたが充分な効果は得られていない。
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、液状試薬を保存中にアルカリ緩衝液の酸化を抑えて経時安定性を高めることで、液状試薬を長期にわたり安定に保存できる方法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は生体試料中の乳酸脱水素酵素を測定するためアルカリ緩衝液を含む試薬溶液において、前記試薬溶液がアミノ酸を含んでなる乳酸脱水素酵素測定用試薬である。
ここで試薬溶液中のキレート剤の添加濃度は2.5〜40mM、アミノ酸の添加濃度は25〜400mM、スルフヒドリル化合物の添加濃度は0.4〜50mMの範囲で使用されることが好ましい。
【0005】
本発明におけるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロオン酸、エチレンジアミン−ビス(メチレンリン酸)1/2水和物、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキスメチレンスルホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸等が挙げられ、その添加濃度としては2.5〜40mMであることが好ましい。2.5mM以下の濃度では十分なブランクアップ防止効果が得られにくく、40mM以上の濃度では初期吸光度が高値になることや反応阻害が起こること等の影響が生じる傾向がある。
【0006】
本発明におけるアミノ酸としてはアラニン、アスパラギン酸、システイン等が挙げられ、その添加濃度としては25〜400mMであることが好ましい。25mM以下の濃度では十分なブランクアップ防止効果が得られず、400mM以上の濃度では初期吸光度が高値になることや反応阻害が起こること等の影響が生じる傾向がある。
【0007】
本発明におけるスルフヒドリル化合物としては2−メルカプトエタノール、N−アセチルシステイン、還元形グルタチオン等が挙げられ、その添加濃度は0.4〜50mMであることが好ましい。0.4mM以下の濃度では十分なブランクアップ防止効果が得られにくく、50mM以上の濃度では初期吸光度が高値になることや反応阻害が起こること等の影響が生じる傾向がある。
【0008】
本発明におけるアルカリ緩衝液は、濃度範囲が100〜1000mMであり、pHが8から10までの範囲のものが好ましい。アルカリ緩衝液としては、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、モノエタノールアミン(MEA)、ジエタノールアミン(DEA)、トリエタノールアミン(TEA)、2−エチルアミノエタノール(EAE)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−2−ヒドロキシ−3−アミノエタンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
【0009】
本発明におけるアルカリ緩衝液を用いた生体成分測定用試薬とは、乳酸脱水素酵素(LDH)測定用試薬である。その生体成分測定用試薬は、L−(+)乳酸リチウムとアジ化ナトリウムを含むアルカリ緩衝液にアミノ酸を添加し調整したものである。この時、キレート剤あるいはスルフヒドリル化合物を含んでもよい。
【0010】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に述べる。
〔実施例1〕93mMのL− (+) −乳酸リチウムと0.1%(W/V) アジ化ナトリウムを含む464mMジエタノールアミン(DEA)緩衝液(pH8.8)に0mM、25mM、50mM、100mM、200mM、400mMのアラニンを添加し乳酸脱水素酵素測定用試薬の調製を行った。前記調製試薬を自動分析装置用容器に充填し、開栓したまま2〜10℃で保存を行い、1週間ごとに分光光度計(日立U−3210)で340nmにおける吸光度の測定を行った。その結果を図1に示す。なお図中の横軸は保存期間(週)を示し、縦軸は吸光度(Abs) を示す。
【0011】
〔実施例2〕93mMのL− (+) −乳酸リチウムと0.1%(W/V) アジ化ナトリウムを含む464mMジエタノールアミン(DEA)緩衝液(pH8.8)に0mM、3.5mM、7mM、14mM、28mM、56mMの2−メルカプトエタノールを添加して乳酸脱水素酵素測定用試薬の調製を行った。前記調製試薬を自動分析装置用容器に充填し、開栓したまま2〜10℃で保存を行い、1週間ごとに分光光度計(日立U−3210)で340nmにおける吸光度の測定を行った。その結果を図2に示す。なお図中の横軸は保存期間(週)を示し、縦軸は吸光度(Abs) を示す。
【0012】
〔実施例3〕93mMのL− (+) −乳酸リチウムと0.1%(W/V) アジ化ナトリウムを含む464mMジエタノールアミン(DEA)緩衝液(pH8.8)に0mM、0.4mM、0.8mM、1.6mM、3.2mM、6.4mMの還元形グルタチオンを添加して乳酸脱水素酵素測定用試薬の調製を行った。前記調製試薬を自動分析装置用容器に充填し、開栓したまま2〜10℃で保存を行い、1週間ごとに分光光度計(日立U−3210)で340nmにおける吸光度の測定を行った。その結果を図3に示す。なお図中の横軸は保存期間(週)を示し、縦軸は吸光度(Abs) を示す。
【0013】
〔実施例4〕93mMのL− (+) −乳酸リチウムと0.1%(W/V) アジ化ナトリウムを含む464mMジエタノールアミン(DEA)緩衝液(pH8.8)に0mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、40mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA−2Na)を添加して乳酸脱水素酵素測定用試薬の調製を行った。前記調製試薬を自動分析装置用容器に充填し、開栓したまま2〜10℃で保存を行い、1週間ごとに分光光度計(日立U−3210)で340nmにおける吸光度の測定を行った。その結果を図4に示す。なお図中の横軸は保存期間(週)を示し、縦軸は吸光度(Abs) を示す。
【0014】
〔実施例5〕93mMのL− (+) −乳酸リチウムと0.1%(W/V) アジ化ナトリウムを含む464mMジエタノールアミン(DEA)緩衝液(pH8.8)に
・50mMアラニンと10mM EDTA−2Na、
・50mMアラニンと1.6mM還元形グルタチオン、
・25mMアスパラギン酸と1.6mM還元形グルタチオン、
・50mMアラニンと10mM EDTA−2Naと1.6mM還元形グルタチオン、
・25mMアスパラギン酸と10mM EDTA−2Naと25mM N−アセチルシステイン、
をそれぞれ添加して乳酸脱水素酵素測定用試薬の調製を行った。前記調製試薬と安定化剤を添加してない試薬とを自動分析装置用容器に充填し、開栓したまま2〜10℃で保存を行い、1週間ごとに分光光度計(日立U−3210)で340nmにおける吸光度の測定を行った。その結果を図5に示す。なお図中の横軸は保存期間(週)を示し、縦軸は吸光度(Abs) を示す。
【0015】
図1〜4の結果から、アラニンなどのアミノ酸類、メルカプトエタノールや還元形グルタチオンなどのスルフヒドリル化合物、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムなどのキレート剤などを添加した液状試薬は、安定化剤を添加しない液状試薬に比べて経時的なブランクアップを抑えることができる。また、図5の結果より、アミノ酸、スルフヒドリル化合物、キレート剤などの安定化剤を1種以上混合して使用した場合でも、単独で使用した場合と同様に経時的なブランクアップを抑えることができる。
【0016】
【発明の効果】
本発明によれば、アルカリ緩衝液の酸化によって生じる紫外部に吸収を持つ物質が生じることを抑制できるため、試薬ブランクの上昇を抑えることができる。この方法によって、測定値のバラツキがなく、試薬性能の劣化も防ぐことができるため、安定したアルカリ緩衝液を含む乳酸脱水素酵素測定用液状試薬の供給が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1における経時安定性の効果を示すグラフである。
【図2】実施例2における経時安定性の効果を示すグラフである。
【図3】実施例3における経時安定性の効果を示すグラフである。
【図4】実施例4における経時安定性の効果を示すグラフである。
【図5】実施例5における経時安定性の効果を示すグラフである。

Claims (3)

  1. 生体試料中の乳酸脱水素酵素を測定するためのアルカリ緩衝液を含む試薬溶液において、前記試薬溶液がアミノ酸を含んでなる乳酸脱水素酵素測定用試薬。
  2. 試薬溶液中におけるアミノ酸の添加濃度が25〜400mMであることを特徴とする請求項1記載の乳酸脱水素酵素測定用試薬。
  3. 前記試薬溶液がアミノ酸とキレート剤を含んでなる請求項1記載の乳酸脱水素酵素測定用試薬。
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