JP3971967B2 - 還元性物質の定量方法及び定量用試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の還元性物質、あるいは試料中の成分から生成された還元性物質を、鉄イオンと、該鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を用いて定量する際に、試料中に共存する特定成分の影響を回避し、試料中の還元性物質を正確に定量することができる方法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、試料中の還元性物質、あるいは生体試料中の生体成分より酵素反応等により生成する還元性物質を定量する方法の一つとして、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させ、３価の鉄イオンが還元性物質によって還元されて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出・定量する方法が知られている。
【０００３】
例えば、本出願人は、特開２０００−３３８０９６号公報において、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを簡便で高感度に定量する方法を提案している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法では、血清や血漿等の生体試料、下水や河川水等の環境試料を測定対象とした場合、試料中に共存する他の成分の影響を受け、還元性物質を正確に定量できない場合があることが分かった。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出することにより試料中の還元性物質を定量する方法において、試料中に共存する特定成分の影響を回避し、還元性物質を正確に定量できる方法及び定量用試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、試料中に共存する銅イオンや銅を含む成分、トランスフェリン等が測定に影響を与えていることを突き止め、これらの成分の影響を回避することにより、試料中の還元性物質を正確に定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の第１は、測定試料中の還元性物質に、３価の鉄イオンを作用させ、該鉄イオンが還元されて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を用いて検出し、定量する際に、銅イオン特異的なキレート剤、及びアルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることを特徴とする還元性物質の定量方法を提供するものである。
【０００８】
上記発明によれば、銅イオン特異的なキレート剤を共存させることにより、銅イオンや銅を含む成分の影響を回避することができ、試料中の還元性物質を正確に定量することができる。また、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることにより、トランスフェリン類の影響を回避することができ、試料中の還元性物質をより正確に定量することができる。
【０００９】
本発明の第２は、前記第１の発明において、前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１０】
上記発明によれば、鉄イオンと金属指示薬との反応に影響を与えることなく銅イオンの影響を回避することができる。
【００１３】
本発明の第３は、前記第１又は第２の発明において、前記測定試料に、更に、有機酸を共存させる、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１４】
上記発明によれば、有機酸を共存させることにより、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができ、効率よくトランスフェリン類の影響を回避することができる。
【００１５】
本発明の第４は、前記第３の発明において、前記有機酸は、酒石酸である、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１６】
上記発明によれば、効率よくアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができる。
【００１７】
本発明の第５は、前記第１〜４のいずれかの発明において、前記還元性物質は、硫化水素又は硫化物イオンである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１８】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを正確に定量することができる。
【００１９】
本発明の第６は、前記第５の発明において、前記硫化水素又は硫化物イオンは、測定試料に含まれる含硫アミノ酸に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を作用させることにより生成したものである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２０】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを定量することにより、試料中のホモシステインやシステイン等の含硫アミノ酸を正確に定量することができる。
【００２１】
本発明の第７は、前記第１〜６のいずれかの発明において、前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２２】
上記発明によれば、３価の鉄イオンの安定性が増加し、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量することができる。
【００２３】
本発明の第８は、前記第７の発明において、更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２４】
上記発明によれば、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度を向上することができる。
【００２５】
本発明の第９は、前記第１〜８のいずれかの発明において、前記測定試料は、生体試料又は環境試料である、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２６】
上記発明によれば、血清等の生体試料に含まれる血清銅やトランスフェリン等の影響を回避することができ、また、下水や河川水等の環境試料に含まれる銅イオン等の影響を回避することができ、これらの試料中の還元性物質を正確に測定することができる。
【００２７】
本発明の第１０は、銅イオン特異的なキレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、３価の鉄イオンと、２価又は３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬とを含むことを特徴とする、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００２８】
上記発明によれば、銅イオン等を含む試料中の還元性物質を簡便かつ正確に定量することができる試薬を提供できる。また、銅イオンだけでなくトランスフェリン類の影響を回避することができるので、生体試料中の還元性物質の定量に好適な試薬を提供できる。
【００２９】
本発明の第１１は、前記第１０の発明において、前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３０】
上記発明によれば、鉄イオンと金属指示薬との反応に影響を与えることなく銅イオンの影響を回避することができるので、環境試料中の還元性物質の定量に好適な試薬を提供できる。
【００３３】
本発明の第１２は、前記第１０又は第１１の発明において、更に有機酸を含む、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３４】
上記発明によれば、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができ、効率よくトランスフェリン類の影響を回避することができる。
【００３５】
本発明の第１３は、前記第１２の発明において、前記有機酸は、酒石酸である、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３６】
上記発明によれば、効率よくアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができる。
【００３７】
本発明の第１４は、前記第１０〜１３のいずれかの発明において、更に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を含む、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３８】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを定量することにより、試料中のホモシステインやシステイン等の含硫アミノ酸を正確に定量することができる。
【００３９】
本発明の第１５は、前記第１０〜１４のいずれかの発明において、前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００４０】
上記発明によれば、３価の鉄イオンの安定性が増加するので、鉄イオン含有試薬の保存安定性を向上させることができると共に同一試薬中に鉄イオンと金属指示薬とを含有させることが可能となり、試薬数を少なくすることができる。また、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量可能な定量用試薬を得ることができる。
【００４１】
本発明の第１６は、前記第１５の発明において、更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００４２】
上記発明によれば、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度の高い定量用試薬を得ることができる。
【００４３】
【発明の実施形態】
本発明において用いられる銅イオン特異的なキレート剤（以下、銅キレート剤という。）としては、銅イオンと錯体を形成し、２価又は３価の鉄イオンとそれらに特異的に反応して発色する金属指示薬との反応に悪影響を及ぼさないものであれば特に制限されることなく用いることができる。例えば、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものが好ましく挙げられる。より具体的には、ネオクプロイン塩酸塩やバソクプロインスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。このような銅キレート剤を用いることにより、銅イオンや銅を含む成分の影響を効率よく回避することができる。
【００４４】
また、本発明で用いられるアルミニウム塩、ガリウム塩としては、２価又は３価の鉄イオンとそれらに特異的な金属指示薬との反応に悪影響を及ぼさないものであれば特に制限されることなく用いることができる。アルミニウム塩としては、塩化アルミニウム、硝酸アルミニウム等が好ましく例示できる。また、ガリウム塩としては、硝酸ガリウム、リン酸ガリウム、硫酸ガリウム等が好ましく例示できる。上記アルミニウム塩やガリウム塩はそれぞれ単独で用いてもよく、併用してもよい。アルミニウム塩及び／又はガリウム塩を用いることにより、トランスフェリン類の影響を効率よく回避することができる。
【００４５】
本発明において、測定試料は特に限定されず、例えば、下水、河川水、海水、空気中の成分の捕集液等の環境試料にも適用できる。なお、これらの環境試料を用いる場合は、トランスフェリン類が含まれている可能性はほとんどないため、銅キレート剤だけで夾雑成分の影響を充分に回避することができる。
【００４６】
一方、銅イオンや銅を含む成分、トランスフェリン類が含まれているような場合には、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩とを併用することで夾雑成分の影響を回避する。したがって、例えば、血液、血清、血漿等の生体試料を用いる場合は、血清銅（血清中の銅の９０〜９５％は血清蛋白の１つであるセルロプラスミンに、残りがアルブミンと結合しているとされる。）やトランスフェリン類が含まれているため、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩とを併用する。
【００４７】
本発明においては、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐため、有機酸を併用することが好ましい。有機酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、IDA（イミノ二酢酸）等が好ましく例示できるが、中でも酒石酸やIDAが好ましく、特に酒石酸が好ましい。
【００４８】
また、３価の鉄イオンとしては、具体的には水溶液中で３価の鉄イオンを遊離する化合物（以下、３価鉄化合物という。）であれば特に制限なく用いることができる。例えば、塩化鉄（III）、硫酸鉄（III）アンモニウム水和物等のイオン化合物のほか、エチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄（III）、シュウ酸アンモニウム鉄（III）水和物等のキレート化合物が挙げられる。
【００４９】
本発明においては、３価の鉄イオンが錯体を形成していることが好ましい。３価の鉄イオンの錯体としては、例えば、上記のようなキレート化合物が好ましく用いられ、中でもエチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄（III）が好ましく用いられる。また、塩化鉄（III）等のイオン化合物を、３価の鉄イオンが錯体を形成するような条件下、例えば、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の共存下で用いてもよい。３価の鉄イオンとして錯体を用いることにより、該鉄イオンの安定性が向上するので、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量することができる。
【００５０】
更に、上記のような錯体を用いる場合は、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤（以下、単に補助剤という。）を共存させることが好ましい。上記補助剤は、使用する３価鉄化合物の種類に応じて適宜選択することができるが、IDA（イミノ二酢酸）、ADA（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、Bicine（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）等が好ましく例示でき、特にADAが好ましい。このような補助剤を用いることにより、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度を向上することができる。
【００５１】
また、２価又は３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬としては、公知の金属指示薬を用いることができるが、発色感度が高いものが好ましく用いられる。なお、以下の説明においては、２価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を単に２価鉄イオン特異的金属指示薬、３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を単に３価鉄イオン特異的金属指示薬といい、これらをまとめて鉄イオン特異的金属指示薬という。
【００５２】
２価鉄イオン特異的金属指示薬としては、例えば、1,10-フェナントロリン塩酸塩やバソフェナントロリンスルホン酸等の他、ピリジルアゾ化合物やニトロソアミノフェノール化合物等が利用可能である。具体的には、ピリジルアゾ化合物としては、2-（5-ブロモ-2-ピリジルアゾ）-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール・ナトリウム塩（商品名：5Br・PAPS、以下、5Br・PAPSと略記する）、2-（5-ニトロ-2-ピリジルアゾ）-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール・ナトリウム塩（商品名：Nitro・PAPS）等、ニトロソアミノフェノール化合物としては、2-ニトロソ-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール（商品名：Nitroso・PSAP）、2-ニトロソ-5-［N-エチル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール（商品名：Nitroso・ESAP）等が好ましく挙げられる。
【００５３】
３価鉄イオン特異的金属指示薬としては、例えば、フェロン、カルシクローム（Calcichrome）、クロマズロールＢ（Chromazurol B）、クロマズロールＳ（Chromazurol S）、クロモトロープ酸（Chromotropic acid）等が挙げられる。
【００５４】
上記のような鉄イオン特異的金属指示薬は様々な特徴を持ったものが市販されており、例えば、（株）同仁化学研究所等から入手することができる。
【００５５】
本発明の還元性物質の定量方法は、３価の鉄イオンを還元できる還元性物質であれば定量可能であり、例えば、アスコルビン酸、硫化水素、硫化物イオン等が例示できるが、特に、硫化水素又は硫化物イオンを定量する場合に好適である。
【００５６】
例えば、上記のような環境試料において、硫化水素や硫化物イオンは、環境汚染の重要な指標の一つであり、これらを定量することにより、環境汚染の度合いを判定することができる。
【００５７】
また、上記のような生体試料において、硫化水素又は硫化物イオンは、含硫アミノ酸（ホモシステイン、システイン等）に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素（以下、硫化水素生成酵素という。）を作用させた際に生成し、これを定量することにより、含硫アミノ酸を定量することができる（特開２０００−１６６５９７号公報、特開２０００−２７０８９５号公報参照）。ちなみに、ホモシステインは、心筋梗塞、脳梗塞等の血栓塞栓症あるいは動脈硬化症におけるリスクファクターとして注目されており、システインは、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標と成り得る。
【００５８】
ホモシステインに作用して硫化水素を生成する酵素としては、Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼ、ο−アセチルホモセリン−リアーゼ等が好ましく例示できる。Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼは、例えば、シュードモナス属の細菌等のそれを産生する微生物から公知の方法により得ることもでき、和光純薬株式会社等から市販されているものを用いてもよい。また、ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、それを産生する様々な微生物（例えば、Ozaki等.，J．Biochem．91；1163-1171（1982）、Yamagata.，J．Biochem．96；1511-1523（1984）、Brzywczy等.，Acta．Biochimica．Polonica．40（3）；421-428（1993））等から公知の方法により得ることもでき、市販の酵素（例えば、ユニチカ株式会社製のバチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」等）を用いてもよい。
【００５９】
一方、システインに作用して硫化水素を生成する酵素としては、ο−アセチルセリン−リアーゼ、β−シアノアラニンシンターゼ、システインリアーゼ等が好ましく例示できる。ο−アセチルセリン−リアーゼは、それを産生する微生物や植物（例えば、Burnell等.，Biochim．Biophys．Acta 481；246-265（1977）、Nagasaw等.，Methods Enzymol 143；474-478（1987）、Droux等.，Arch．Biochem．Biophys．295（2）；379-390（1992）、Yamaguchi等.，Biochim．Biophys．Acta 1251；91-98（1995））等より公知の方法で得ることができる。また、β-シアノアラニンシンターゼは、Hendrickson等., Meth. Enzymol. 17B, 233-239．に記載された方法により、システインリアーゼは、Tolasa等., Biochimiya 31, 98-102 (1966)に記載された方法により得ることができる。
【００６０】
以下、本発明の還元性物質の定量方法について、好ましい態様を挙げて説明する。
【００６１】
例えば、測定試料として環境試料を用いる場合は、環境試料に所定濃度となるように銅キレート剤を添加して充分に混合した後、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬を添加し、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを該金属指示薬で検出し、吸光度を測定することにより還元性物質を定量することができる。
【００６２】
また、測定試料として生体試料を用いる場合は、生体試料に所定濃度となるように銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を添加して充分に混合した後、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬を添加し、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを該金属指示薬で検出し、吸光度を測定することにより還元性物質を定量することができる。
【００６３】
なお、本発明の定量方法は、上記のように生体試料中に含まれる含硫アミノ酸（ホモシステイン、システイン）の定量にも適用できるので、このような場合は、含硫アミノ酸を含む生体試料に、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸と一緒に上記硫化水素生成酵素を添加して、硫化水素又は硫化物イオンを生成させて、これを定量すればよい。また、予め含硫アミノ酸に上記硫化水素生成酵素を作用させて、硫化水素又は硫化物イオンを生成させた後、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を添加して、定量してもよい。
【００６４】
このように本発明の定量方法は、試料中の還元性物質を直接定量するだけでなく、試料中に含まれる特定成分から還元性物質を生成させ、生成した還元性物質を定量することにより、試料中の特定成分を定量するような場合にも有効に適用することができる。
【００６５】
本発明の定量方法において、銅キレート剤の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定できるが、通常、0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMが特に好ましい。また、銅キレート剤を作用させる際のpHは、4.5〜9.5が好ましく、6〜9がより好ましい。
【００６６】
アルミニウム塩及び／又はガリウム塩の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定できるが、通常、0.01〜10mMが好ましく、0.05〜5mMがより好ましく、0.1〜3mMが特に好ましい。また、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩等を作用させる際のpHは、4.5〜9.5が好ましく、6〜9がより好ましい。
【００６７】
有機酸の添加濃度は、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができるような濃度であればよく適宜設定できるが、通常、0.01〜50mMが好ましく、0.05〜20mMがより好ましく、0.1〜5mMが特に好ましい。
【００６８】
３価の鉄イオン、鉄イオン特異的金属指示薬の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定することができる。通常、３価の鉄イオン濃度は0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMMが特に好ましい。また、鉄イオン特異的金属指示薬の添加濃度は、0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMが特に好ましい。また、３価の鉄イオンと鉄イオン特異的金属指示薬とを作用させる際のpHは、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬が金属キレート錯体を形成しやすいpH域であればよく、例えば、２価の鉄イオンと「Nitroso・PSAP」（商品名、（株）同仁化学研究所製）の金属キレート錯体の形成における至適pHは5.6〜10.1とされている（（株）同仁化学研究所の第２２版カタログ254ページ参照）。
【００６９】
補助剤の添加濃度は、３価の鉄イオンの添加濃度に応じて適宜設定できるが、通常、0.01〜10mMが好ましく、0.05〜5mMがより好ましく、0.1〜3mMが特に好ましい。
【００７０】
なお、本発明の定量方法においては、上記の成分以外に、界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤を添加することにより、試薬成分の析出を防止することができると共に測定時の再現性向上等を図ることができる。界面活性剤の添加濃度は、通常、0.001〜5％が好ましく、0.01〜2％がより好ましい。
【００７１】
次に、本発明の定量用試薬について説明する。
本発明の定量用試薬は、上記の還元性物質の定量方法を簡便に実施できるように構成されたものであり、少なくとも銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩（好ましくは更に有機酸）と、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬とを含むように構成された定量用試薬である。
【００７２】
上記の各基本的成分は、上記の定量方法で説明したものと同様のものが好ましく用いられ、他の成分として、補助剤、緩衝液、界面活性剤等を適宜用いることもできる。例えば、界面活性剤を用いることにより、試薬成分の析出を防止することができ、試薬の保存安定性を向上させることができる。また、３価の鉄イオンとして錯体を用いた場合、補助剤を一緒に用いることにより、測定感度を向上することができる。なお、各成分の濃度は、上記の添加濃度等に基いて適宜設定すればよい。
【００７３】
本発明の定量用試薬は、少なくとも２つ以上の試薬から構成されていることが好ましい。例えば、還元性物質の定量に適した試薬構成として、２試薬構成として、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を含む第一試薬と、３価の鉄イオンと鉄イオン特異的金属指示薬とを含む第二試薬とから構成することができる。更に、これらの試薬は、適宜界面活性剤を含むことができる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００７５】
実施例１（トランスフェリンの影響の検討）
試料及び試薬として以下のものを調製して用いた。
【００７６】
試料：アポトランスフェリン（Apo-Tf、シグマ−アルドリッチ社製）を0、1、2、3mg/mLとなるように添加した25μM硫化ナトリウム水溶液。なお、試薬ブランクとしては生理食塩水を用いた。
【００７７】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、塩化アルミニウム（又は硝酸ガリウム）0.42mM、IDA（又は酒石酸）0.42mM
【００７８】
なお、第一試薬は、塩化アルミニウム又は硝酸ガリウムと、IDA又は酒石酸との組み合わせにより、▲１▼塩化アルミニウム−IDA、▲２▼塩化アルミニウム−酒石酸、▲３▼硝酸ガリウム−IDA、▲４▼硝酸ガリウム−酒石酸の４種類を用いた。
【００７９】
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００８０】
比較例１
実施例１の第一試薬において、塩化アルミニウム（又は硝酸ガリウム）、及びIDA（又は酒石酸）を除いたものを用いた。
【００８１】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて以下のようにして試料の測定を行なった。すなわち、試料14μLに第一試薬210μLを加え、37℃で5分間放置した。さらに、第二試薬56μLを加え37℃にて5分間放置後、波長750nmにおける吸光度測定し、アポトランスフェリンを添加しない場合の吸光度との差を硫化ナトリウム濃度（μM）に換算して表１に示した。
【００８２】
【表１】
【００８３】
表１から、比較例１ではアポトランスフェリンの添加濃度に応じて明らかな負の影響が認められた。一方、実施例１の各条件（▲１▼〜▲４▼）では著しく負の影響が改善されていることが分かる。この結果から、アルミニウム塩又はガリウム塩を添加することにより、試料中に含まれるトランスフェリンの影響を回避できることが分かった。
【００８４】
実施例２（銅の影響の検討）
試料及び試薬として以下のものを用いた。
【００８５】
試料：塩化銅を銅イオンとして0、100、200μg/dL含むように添加した50μM硫化ナトリウム水溶液を用いた。
【００８６】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、硝酸ガリウム0.42mM、酒石酸0.42mM、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）1.67mM
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００８７】
比較例２
実施例２の第一試薬において、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）を除いたものを用いた。
【００８８】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて、上記と同様にして試料の測定を行ない、塩化銅を添加しない場合の吸光度との差を硫化ナトリウム濃度（μM）に換算して表２に示した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
表２から、比較例２では塩化銅の添加濃度に応じて正の影響が認められた。一方、実施例２ではほとんど塩化銅の影響が認められなかった。この結果から、ネオクプロイン塩酸塩又はバソクプロインスルホン酸塩を添加することにより、試料中に含まれる銅イオンの影響を回避できることが分かった。
【００９１】
実施例３（トランスフェリンの影響の検討）
測定試料：アポトランスフェリンを0、1、2、3mg/mLとなるように添加したL−ホモシスチン（シグマ−アルドリッチ社製）12.5μM水溶液（L−ホモシステインとして25μM相当）を用いた。
【００９２】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、硝酸ガリウム0.42mM、酒石酸0.42mM、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）1.67mM、組換えο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「rＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）2.5U/mL（力価はメーカー表示値による。）
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００９３】
比較例３
実施例３の第一試薬において、硝酸ガリウム及び酒石酸を除いたものを用いた。
【００９４】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて上記と同様にして試料の測定を行ない、アポトランスフェリンを添加しない場合の吸光度との差をL−ホモシステイン濃度（μM）に換算して表３に示した。
【００９５】
【表３】
【００９６】
表３から、ガリウム塩を添加した実施例３は、比較例３に比べトランスフェリンによる負の影響が改善されていることが分かる。
【００９７】
実施例４（血清銅の影響の検討）
試料：血清蛋白の１つであり、血清中の銅の９０〜９５％が結合しているとされるセルロプラスミン（シグマ−アルドリッチ社製）を0、4.6、9.3、18.5、37.0mg/ｄLとなるように添加したL−ホモシスチン12.5μM水溶液（L−ホモシステインとして25μM相当）を用いた。なお、使用したセルロプラスミンのロットでは、88.8mg蛋白が133μｇ銅に相当する。
そして、第一、第二試薬は、実施例３と同じものを用いた。
【００９８】
比較例４
第一、第二試薬として、比較例３と同じものを用いた。
【００９９】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて上記と同様にして試料の測定を行ない、セルロプラスミンを添加しない場合の吸光度との差をL−ホモシステイン濃度（μM）に換算して表４に示した。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
表４から、比較例４ではセルロプラスミンの添加濃度に応じて正の影響が認められた。一方、実施例４ではほとんどセルロプラスミンの影響が認められなかった。この結果から、ネオクプロインを添加することにより、血清銅の影響を回避できることが分かった。
【０１０２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出して試料中の還元性物質を定量する際に、銅キレート剤、及びアルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることにより、試料中の夾雑成分の影響を回避して、試料中の還元性物質を正確に定量することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の還元性物質、あるいは試料中の成分から生成された還元性物質を、鉄イオンと、該鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を用いて定量する際に、試料中に共存する特定成分の影響を回避し、試料中の還元性物質を正確に定量することができる方法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、試料中の還元性物質、あるいは生体試料中の生体成分より酵素反応等により生成する還元性物質を定量する方法の一つとして、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させ、３価の鉄イオンが還元性物質によって還元されて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出・定量する方法が知られている。
【０００３】
例えば、本出願人は、特開２０００−３３８０９６号公報において、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを簡便で高感度に定量する方法を提案している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の方法では、血清や血漿等の生体試料、下水や河川水等の環境試料を測定対象とした場合、試料中に共存する他の成分の影響を受け、還元性物質を正確に定量できない場合があることが分かった。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出することにより試料中の還元性物質を定量する方法において、試料中に共存する特定成分の影響を回避し、還元性物質を正確に定量できる方法及び定量用試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、試料中に共存する銅イオンや銅を含む成分、トランスフェリン等が測定に影響を与えていることを突き止め、これらの成分の影響を回避することにより、試料中の還元性物質を正確に定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の第１は、測定試料中の還元性物質に、３価の鉄イオンを作用させ、該鉄イオンが還元されて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を用いて検出し、定量する際に、銅イオン特異的なキレート剤、及びアルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることを特徴とする還元性物質の定量方法を提供するものである。
【０００８】
上記発明によれば、銅イオン特異的なキレート剤を共存させることにより、銅イオンや銅を含む成分の影響を回避することができ、試料中の還元性物質を正確に定量することができる。また、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることにより、トランスフェリン類の影響を回避することができ、試料中の還元性物質をより正確に定量することができる。
【０００９】
本発明の第２は、前記第１の発明において、前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１０】
上記発明によれば、鉄イオンと金属指示薬との反応に影響を与えることなく銅イオンの影響を回避することができる。
【００１３】
本発明の第３は、前記第１又は第２の発明において、前記測定試料に、更に、有機酸を共存させる、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１４】
上記発明によれば、有機酸を共存させることにより、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができ、効率よくトランスフェリン類の影響を回避することができる。
【００１５】
本発明の第４は、前記第３の発明において、前記有機酸は、酒石酸である、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１６】
上記発明によれば、効率よくアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができる。
【００１７】
本発明の第５は、前記第１〜４のいずれかの発明において、前記還元性物質は、硫化水素又は硫化物イオンである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００１８】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを正確に定量することができる。
【００１９】
本発明の第６は、前記第５の発明において、前記硫化水素又は硫化物イオンは、測定試料に含まれる含硫アミノ酸に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を作用させることにより生成したものである、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２０】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを定量することにより、試料中のホモシステインやシステイン等の含硫アミノ酸を正確に定量することができる。
【００２１】
本発明の第７は、前記第１〜６のいずれかの発明において、前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２２】
上記発明によれば、３価の鉄イオンの安定性が増加し、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量することができる。
【００２３】
本発明の第８は、前記第７の発明において、更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２４】
上記発明によれば、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度を向上することができる。
【００２５】
本発明の第９は、前記第１〜８のいずれかの発明において、前記測定試料は、生体試料又は環境試料である、還元性物質の定量方法を提供するものである。
【００２６】
上記発明によれば、血清等の生体試料に含まれる血清銅やトランスフェリン等の影響を回避することができ、また、下水や河川水等の環境試料に含まれる銅イオン等の影響を回避することができ、これらの試料中の還元性物質を正確に測定することができる。
【００２７】
本発明の第１０は、銅イオン特異的なキレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、３価の鉄イオンと、２価又は３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬とを含むことを特徴とする、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００２８】
上記発明によれば、銅イオン等を含む試料中の還元性物質を簡便かつ正確に定量することができる試薬を提供できる。また、銅イオンだけでなくトランスフェリン類の影響を回避することができるので、生体試料中の還元性物質の定量に好適な試薬を提供できる。
【００２９】
本発明の第１１は、前記第１０の発明において、前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３０】
上記発明によれば、鉄イオンと金属指示薬との反応に影響を与えることなく銅イオンの影響を回避することができるので、環境試料中の還元性物質の定量に好適な試薬を提供できる。
【００３３】
本発明の第１２は、前記第１０又は第１１の発明において、更に有機酸を含む、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３４】
上記発明によれば、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができ、効率よくトランスフェリン類の影響を回避することができる。
【００３５】
本発明の第１３は、前記第１２の発明において、前記有機酸は、酒石酸である、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３６】
上記発明によれば、効率よくアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができる。
【００３７】
本発明の第１４は、前記第１０〜１３のいずれかの発明において、更に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を含む、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００３８】
上記発明によれば、試料中の硫化水素又は硫化物イオンを定量することにより、試料中のホモシステインやシステイン等の含硫アミノ酸を正確に定量することができる。
【００３９】
本発明の第１５は、前記第１０〜１４のいずれかの発明において、前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００４０】
上記発明によれば、３価の鉄イオンの安定性が増加するので、鉄イオン含有試薬の保存安定性を向上させることができると共に同一試薬中に鉄イオンと金属指示薬とを含有させることが可能となり、試薬数を少なくすることができる。また、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量可能な定量用試薬を得ることができる。
【００４１】
本発明の第１６は、前記第１５の発明において、更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、還元性物質の定量用試薬を提供するものである。
【００４２】
上記発明によれば、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度の高い定量用試薬を得ることができる。
【００４３】
【発明の実施形態】
本発明において用いられる銅イオン特異的なキレート剤（以下、銅キレート剤という。）としては、銅イオンと錯体を形成し、２価又は３価の鉄イオンとそれらに特異的に反応して発色する金属指示薬との反応に悪影響を及ぼさないものであれば特に制限されることなく用いることができる。例えば、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものが好ましく挙げられる。より具体的には、ネオクプロイン塩酸塩やバソクプロインスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。このような銅キレート剤を用いることにより、銅イオンや銅を含む成分の影響を効率よく回避することができる。
【００４４】
また、本発明で用いられるアルミニウム塩、ガリウム塩としては、２価又は３価の鉄イオンとそれらに特異的な金属指示薬との反応に悪影響を及ぼさないものであれば特に制限されることなく用いることができる。アルミニウム塩としては、塩化アルミニウム、硝酸アルミニウム等が好ましく例示できる。また、ガリウム塩としては、硝酸ガリウム、リン酸ガリウム、硫酸ガリウム等が好ましく例示できる。上記アルミニウム塩やガリウム塩はそれぞれ単独で用いてもよく、併用してもよい。アルミニウム塩及び／又はガリウム塩を用いることにより、トランスフェリン類の影響を効率よく回避することができる。
【００４５】
本発明において、測定試料は特に限定されず、例えば、下水、河川水、海水、空気中の成分の捕集液等の環境試料にも適用できる。なお、これらの環境試料を用いる場合は、トランスフェリン類が含まれている可能性はほとんどないため、銅キレート剤だけで夾雑成分の影響を充分に回避することができる。
【００４６】
一方、銅イオンや銅を含む成分、トランスフェリン類が含まれているような場合には、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩とを併用することで夾雑成分の影響を回避する。したがって、例えば、血液、血清、血漿等の生体試料を用いる場合は、血清銅（血清中の銅の９０〜９５％は血清蛋白の１つであるセルロプラスミンに、残りがアルブミンと結合しているとされる。）やトランスフェリン類が含まれているため、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩とを併用する。
【００４７】
本発明においては、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐため、有機酸を併用することが好ましい。有機酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、IDA（イミノ二酢酸）等が好ましく例示できるが、中でも酒石酸やIDAが好ましく、特に酒石酸が好ましい。
【００４８】
また、３価の鉄イオンとしては、具体的には水溶液中で３価の鉄イオンを遊離する化合物（以下、３価鉄化合物という。）であれば特に制限なく用いることができる。例えば、塩化鉄（III）、硫酸鉄（III）アンモニウム水和物等のイオン化合物のほか、エチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄（III）、シュウ酸アンモニウム鉄（III）水和物等のキレート化合物が挙げられる。
【００４９】
本発明においては、３価の鉄イオンが錯体を形成していることが好ましい。３価の鉄イオンの錯体としては、例えば、上記のようなキレート化合物が好ましく用いられ、中でもエチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄（III）が好ましく用いられる。また、塩化鉄（III）等のイオン化合物を、３価の鉄イオンが錯体を形成するような条件下、例えば、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の共存下で用いてもよい。３価の鉄イオンとして錯体を用いることにより、該鉄イオンの安定性が向上するので、試薬ブランク発色値を低減することができ、より正確に定量することができる。
【００５０】
更に、上記のような錯体を用いる場合は、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤（以下、単に補助剤という。）を共存させることが好ましい。上記補助剤は、使用する３価鉄化合物の種類に応じて適宜選択することができるが、IDA（イミノ二酢酸）、ADA（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、Bicine（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）等が好ましく例示でき、特にADAが好ましい。このような補助剤を用いることにより、錯体を形成している３価の鉄イオンが還元性物質によって還元され易くなるので、測定感度を向上することができる。
【００５１】
また、２価又は３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬としては、公知の金属指示薬を用いることができるが、発色感度が高いものが好ましく用いられる。なお、以下の説明においては、２価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を単に２価鉄イオン特異的金属指示薬、３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を単に３価鉄イオン特異的金属指示薬といい、これらをまとめて鉄イオン特異的金属指示薬という。
【００５２】
２価鉄イオン特異的金属指示薬としては、例えば、1,10-フェナントロリン塩酸塩やバソフェナントロリンスルホン酸等の他、ピリジルアゾ化合物やニトロソアミノフェノール化合物等が利用可能である。具体的には、ピリジルアゾ化合物としては、2-（5-ブロモ-2-ピリジルアゾ）-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール・ナトリウム塩（商品名：5Br・PAPS、以下、5Br・PAPSと略記する）、2-（5-ニトロ-2-ピリジルアゾ）-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール・ナトリウム塩（商品名：Nitro・PAPS）等、ニトロソアミノフェノール化合物としては、2-ニトロソ-5-［N-N-プロピル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール（商品名：Nitroso・PSAP）、2-ニトロソ-5-［N-エチル-N-（3-スルフォプロピル）アミノ］フェノール（商品名：Nitroso・ESAP）等が好ましく挙げられる。
【００５３】
３価鉄イオン特異的金属指示薬としては、例えば、フェロン、カルシクローム（Calcichrome）、クロマズロールＢ（Chromazurol B）、クロマズロールＳ（Chromazurol S）、クロモトロープ酸（Chromotropic acid）等が挙げられる。
【００５４】
上記のような鉄イオン特異的金属指示薬は様々な特徴を持ったものが市販されており、例えば、（株）同仁化学研究所等から入手することができる。
【００５５】
本発明の還元性物質の定量方法は、３価の鉄イオンを還元できる還元性物質であれば定量可能であり、例えば、アスコルビン酸、硫化水素、硫化物イオン等が例示できるが、特に、硫化水素又は硫化物イオンを定量する場合に好適である。
【００５６】
例えば、上記のような環境試料において、硫化水素や硫化物イオンは、環境汚染の重要な指標の一つであり、これらを定量することにより、環境汚染の度合いを判定することができる。
【００５７】
また、上記のような生体試料において、硫化水素又は硫化物イオンは、含硫アミノ酸（ホモシステイン、システイン等）に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素（以下、硫化水素生成酵素という。）を作用させた際に生成し、これを定量することにより、含硫アミノ酸を定量することができる（特開２０００−１６６５９７号公報、特開２０００−２７０８９５号公報参照）。ちなみに、ホモシステインは、心筋梗塞、脳梗塞等の血栓塞栓症あるいは動脈硬化症におけるリスクファクターとして注目されており、システインは、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標と成り得る。
【００５８】
ホモシステインに作用して硫化水素を生成する酵素としては、Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼ、ο−アセチルホモセリン−リアーゼ等が好ましく例示できる。Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼは、例えば、シュードモナス属の細菌等のそれを産生する微生物から公知の方法により得ることもでき、和光純薬株式会社等から市販されているものを用いてもよい。また、ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、それを産生する様々な微生物（例えば、Ozaki等.，J．Biochem．91；1163-1171（1982）、Yamagata.，J．Biochem．96；1511-1523（1984）、Brzywczy等.，Acta．Biochimica．Polonica．40（3）；421-428（1993））等から公知の方法により得ることもでき、市販の酵素（例えば、ユニチカ株式会社製のバチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」等）を用いてもよい。
【００５９】
一方、システインに作用して硫化水素を生成する酵素としては、ο−アセチルセリン−リアーゼ、β−シアノアラニンシンターゼ、システインリアーゼ等が好ましく例示できる。ο−アセチルセリン−リアーゼは、それを産生する微生物や植物（例えば、Burnell等.，Biochim．Biophys．Acta 481；246-265（1977）、Nagasaw等.，Methods Enzymol 143；474-478（1987）、Droux等.，Arch．Biochem．Biophys．295（2）；379-390（1992）、Yamaguchi等.，Biochim．Biophys．Acta 1251；91-98（1995））等より公知の方法で得ることができる。また、β-シアノアラニンシンターゼは、Hendrickson等., Meth. Enzymol. 17B, 233-239．に記載された方法により、システインリアーゼは、Tolasa等., Biochimiya 31, 98-102 (1966)に記載された方法により得ることができる。
【００６０】
以下、本発明の還元性物質の定量方法について、好ましい態様を挙げて説明する。
【００６１】
例えば、測定試料として環境試料を用いる場合は、環境試料に所定濃度となるように銅キレート剤を添加して充分に混合した後、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬を添加し、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを該金属指示薬で検出し、吸光度を測定することにより還元性物質を定量することができる。
【００６２】
また、測定試料として生体試料を用いる場合は、生体試料に所定濃度となるように銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を添加して充分に混合した後、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬を添加し、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを該金属指示薬で検出し、吸光度を測定することにより還元性物質を定量することができる。
【００６３】
なお、本発明の定量方法は、上記のように生体試料中に含まれる含硫アミノ酸（ホモシステイン、システイン）の定量にも適用できるので、このような場合は、含硫アミノ酸を含む生体試料に、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸と一緒に上記硫化水素生成酵素を添加して、硫化水素又は硫化物イオンを生成させて、これを定量すればよい。また、予め含硫アミノ酸に上記硫化水素生成酵素を作用させて、硫化水素又は硫化物イオンを生成させた後、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を添加して、定量してもよい。
【００６４】
このように本発明の定量方法は、試料中の還元性物質を直接定量するだけでなく、試料中に含まれる特定成分から還元性物質を生成させ、生成した還元性物質を定量することにより、試料中の特定成分を定量するような場合にも有効に適用することができる。
【００６５】
本発明の定量方法において、銅キレート剤の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定できるが、通常、0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMが特に好ましい。また、銅キレート剤を作用させる際のpHは、4.5〜9.5が好ましく、6〜9がより好ましい。
【００６６】
アルミニウム塩及び／又はガリウム塩の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定できるが、通常、0.01〜10mMが好ましく、0.05〜5mMがより好ましく、0.1〜3mMが特に好ましい。また、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩等を作用させる際のpHは、4.5〜9.5が好ましく、6〜9がより好ましい。
【００６７】
有機酸の添加濃度は、アルカリｐＨにおけるアルミニウムやガリウムの水酸化物の生成を防ぐことができるような濃度であればよく適宜設定できるが、通常、0.01〜50mMが好ましく、0.05〜20mMがより好ましく、0.1〜5mMが特に好ましい。
【００６８】
３価の鉄イオン、鉄イオン特異的金属指示薬の添加濃度は、試薬の測定感度や用いる試料量等を考慮して適宜設定することができる。通常、３価の鉄イオン濃度は0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMMが特に好ましい。また、鉄イオン特異的金属指示薬の添加濃度は、0.01〜50mMが好ましく、0.1〜20mMがより好ましく、0.5〜10mMが特に好ましい。また、３価の鉄イオンと鉄イオン特異的金属指示薬とを作用させる際のpHは、還元性物質によって還元されて生じた２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬が金属キレート錯体を形成しやすいpH域であればよく、例えば、２価の鉄イオンと「Nitroso・PSAP」（商品名、（株）同仁化学研究所製）の金属キレート錯体の形成における至適pHは5.6〜10.1とされている（（株）同仁化学研究所の第２２版カタログ254ページ参照）。
【００６９】
補助剤の添加濃度は、３価の鉄イオンの添加濃度に応じて適宜設定できるが、通常、0.01〜10mMが好ましく、0.05〜5mMがより好ましく、0.1〜3mMが特に好ましい。
【００７０】
なお、本発明の定量方法においては、上記の成分以外に、界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤を添加することにより、試薬成分の析出を防止することができると共に測定時の再現性向上等を図ることができる。界面活性剤の添加濃度は、通常、0.001〜5％が好ましく、0.01〜2％がより好ましい。
【００７１】
次に、本発明の定量用試薬について説明する。
本発明の定量用試薬は、上記の還元性物質の定量方法を簡便に実施できるように構成されたものであり、少なくとも銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩（好ましくは更に有機酸）と、３価の鉄イオンと、鉄イオン特異的金属指示薬とを含むように構成された定量用試薬である。
【００７２】
上記の各基本的成分は、上記の定量方法で説明したものと同様のものが好ましく用いられ、他の成分として、補助剤、緩衝液、界面活性剤等を適宜用いることもできる。例えば、界面活性剤を用いることにより、試薬成分の析出を防止することができ、試薬の保存安定性を向上させることができる。また、３価の鉄イオンとして錯体を用いた場合、補助剤を一緒に用いることにより、測定感度を向上することができる。なお、各成分の濃度は、上記の添加濃度等に基いて適宜設定すればよい。
【００７３】
本発明の定量用試薬は、少なくとも２つ以上の試薬から構成されていることが好ましい。例えば、還元性物質の定量に適した試薬構成として、２試薬構成として、銅キレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、好ましくは更に有機酸を含む第一試薬と、３価の鉄イオンと鉄イオン特異的金属指示薬とを含む第二試薬とから構成することができる。更に、これらの試薬は、適宜界面活性剤を含むことができる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００７５】
実施例１（トランスフェリンの影響の検討）
試料及び試薬として以下のものを調製して用いた。
【００７６】
試料：アポトランスフェリン（Apo-Tf、シグマ−アルドリッチ社製）を0、1、2、3mg/mLとなるように添加した25μM硫化ナトリウム水溶液。なお、試薬ブランクとしては生理食塩水を用いた。
【００７７】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、塩化アルミニウム（又は硝酸ガリウム）0.42mM、IDA（又は酒石酸）0.42mM
【００７８】
なお、第一試薬は、塩化アルミニウム又は硝酸ガリウムと、IDA又は酒石酸との組み合わせにより、▲１▼塩化アルミニウム−IDA、▲２▼塩化アルミニウム−酒石酸、▲３▼硝酸ガリウム−IDA、▲４▼硝酸ガリウム−酒石酸の４種類を用いた。
【００７９】
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００８０】
比較例１
実施例１の第一試薬において、塩化アルミニウム（又は硝酸ガリウム）、及びIDA（又は酒石酸）を除いたものを用いた。
【００８１】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて以下のようにして試料の測定を行なった。すなわち、試料14μLに第一試薬210μLを加え、37℃で5分間放置した。さらに、第二試薬56μLを加え37℃にて5分間放置後、波長750nmにおける吸光度測定し、アポトランスフェリンを添加しない場合の吸光度との差を硫化ナトリウム濃度（μM）に換算して表１に示した。
【００８２】
【表１】
表１から、比較例１ではアポトランスフェリンの添加濃度に応じて明らかな負の影響が認められた。一方、実施例１の各条件（▲１▼〜▲４▼）では著しく負の影響が改善されていることが分かる。この結果から、アルミニウム塩又はガリウム塩を添加することにより、試料中に含まれるトランスフェリンの影響を回避できることが分かった。
【００８４】
実施例２（銅の影響の検討）
試料及び試薬として以下のものを用いた。
【００８５】
試料：塩化銅を銅イオンとして0、100、200μg/dL含むように添加した50μM硫化ナトリウム水溶液を用いた。
【００８６】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、硝酸ガリウム0.42mM、酒石酸0.42mM、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）1.67mM
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００８７】
比較例２
実施例２の第一試薬において、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）を除いたものを用いた。
【００８８】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて、上記と同様にして試料の測定を行ない、塩化銅を添加しない場合の吸光度との差を硫化ナトリウム濃度（μM）に換算して表２に示した。
【００８９】
【表２】
表２から、比較例２では塩化銅の添加濃度に応じて正の影響が認められた。一方、実施例２ではほとんど塩化銅の影響が認められなかった。この結果から、ネオクプロイン塩酸塩又はバソクプロインスルホン酸塩を添加することにより、試料中に含まれる銅イオンの影響を回避できることが分かった。
【００９１】
実施例３（トランスフェリンの影響の検討）
測定試料：アポトランスフェリンを0、1、2、3mg/mLとなるように添加したL−ホモシスチン（シグマ−アルドリッチ社製）12.5μM水溶液（L−ホモシステインとして25μM相当）を用いた。
【００９２】
第一試薬：トリス塩酸緩衝液110mM（pH8.5）、ADA 8.33mM、チオグリセロール8.33mM、界面活性剤0.5%、硝酸ガリウム0.42mM、酒石酸0.42mM、ネオクプロイン塩酸塩（又はバソクプロインスルホン酸塩）1.67mM、組換えο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「rＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）2.5U/mL（力価はメーカー表示値による。）
第二試薬：Nitroso-PSAP（同仁化学研究所社製）1mM、Fe(III)EDTA 5mM
【００９３】
比較例３
実施例３の第一試薬において、硝酸ガリウム及び酒石酸を除いたものを用いた。
【００９４】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて上記と同様にして試料の測定を行ない、アポトランスフェリンを添加しない場合の吸光度との差をL−ホモシステイン濃度（μM）に換算して表３に示した。
【００９５】
【表３】
表３から、ガリウム塩を添加した実施例３は、比較例３に比べトランスフェリンによる負の影響が改善されていることが分かる。
【００９７】
実施例４（血清銅の影響の検討）
試料：血清蛋白の１つであり、血清中の銅の９０〜９５％が結合しているとされるセルロプラスミン（シグマ−アルドリッチ社製）を0、4.6、9.3、18.5、37.0mg/ｄLとなるように添加したL−ホモシスチン12.5μM水溶液（L−ホモシステインとして25μM相当）を用いた。なお、使用したセルロプラスミンのロットでは、88.8mg蛋白が133μｇ銅に相当する。
そして、第一、第二試薬は、実施例３と同じものを用いた。
【００９８】
比較例４
第一、第二試薬として、比較例３と同じものを用いた。
【００９９】
そして、日立7170形自動分析装置を用いて上記と同様にして試料の測定を行ない、セルロプラスミンを添加しない場合の吸光度との差をL−ホモシステイン濃度（μM）に換算して表４に示した。
【０１００】
【表４】
表４から、比較例４ではセルロプラスミンの添加濃度に応じて正の影響が認められた。一方、実施例４ではほとんどセルロプラスミンの影響が認められなかった。この結果から、ネオクプロインを添加することにより、血清銅の影響を回避できることが分かった。
【０１０２】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、還元性物質に３価の鉄イオンを作用させて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオン特異的金属指示薬を用いて検出して試料中の還元性物質を定量する際に、銅キレート剤、及びアルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることにより、試料中の夾雑成分の影響を回避して、試料中の還元性物質を正確に定量することができる。
Claims (16)
- 測定試料中の還元性物質に、３価の鉄イオンを作用させ、該鉄イオンが還元されて生じる２価の鉄イオン又は残余の３価の鉄イオンを、これらの鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬を用いて検出し、定量する際に、銅イオン特異的なキレート剤、及びアルミニウム塩及び／又はガリウム塩を共存させることを特徴とする還元性物質の定量方法。
- 前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、請求項１に記載の還元性物質の定量方法。
- 更に、有機酸を共存させる、請求項１又は２に記載の還元性物質の定量方法。
- 前記有機酸は、酒石酸である、請求項３に記載の還元性物質の定量方法。
- 前記還元性物質は、硫化水素又は硫化物イオンである、請求項１〜４のいずれか一つに記載の還元性物質の定量方法。
- 前記硫化水素又は硫化物イオンは、測定試料に含まれる含硫アミノ酸に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を作用させることにより生成したものである、請求項５に記載の還元性物質の定量方法。
- 前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、請求項１〜６のいずれか一つに記載の還元性物質の定量方法。
- 更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、請求項７に記載の還元性物質の定量方法。
- 前記測定試料は、生体試料又は環境試料である、請求項１〜８のいずれか一つに記載の還元性物質の定量方法。
- 銅イオン特異的なキレート剤と、アルミニウム塩及び／又はガリウム塩と、３価の鉄イオンと、２価又は３価の鉄イオンと特異的に反応して発色する金属指示薬とを含むことを特徴とする、還元性物質の定量用試薬。
- 前記銅イオン特異的なキレート剤は、ネオクプロイン、バソクプロイン又はそれらの塩から選ばれたものである、請求項１０に記載の還元性物質の定量用試薬。
- 更に、有機酸を含む、請求項１０又は１１に記載の還元性物質の定量用試薬。
- 前記有機酸は、酒石酸である、請求項１２に記載の還元性物質の定量用試薬。
- 更に、含硫アミノ酸に作用して硫化水素を生成する酵素を含む、請求項１０〜１３のいずれか一つに記載の還元性物質の定量用試薬。
- 前記３価の鉄イオンは、錯体を形成している、請求項１０〜１４のいずれか一つに記載の還元性物質の定量用試薬。
- 更に、鉄イオンに配位する能力を有する補助剤を共存させる、請求項１５に記載の還元性物質の定量用試薬。
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