CN107525774A - 氢氧化钾法总蛋白诊断检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明试剂盒涉及到蛋白检测领域，主要是涉及到一种蛋白检测试剂，试剂R1中的K+可以有效的去除高脂和右旋糖酐引起的干扰，对双缩脲试剂在方法学上进一步完善，酒石酸和碘化钾的螯合作用，使得试剂中有效物质得以长期稳定，羟基乙叉二膦酸保证了试剂一定液体质的稳定，为检测结果的准确性提供有效保障。

Description

氢氧化钾法总蛋白诊断检测试剂盒

技术领域

本发明试剂盒涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及到血清中总蛋白通过氢氧化钾法进行检测诊断其含量。

背景技术

血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。脂肪酸对身体而言很重要，有两个方面：它是脂质的主要组成成分，而脂质又构成了细胞周围和细胞内所有的生物膜；它们又是能量的不竭的源泉。我们的身体有了一个脂肪酸仓库——脂肪。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。因此可见血清蛋白对机体的重要作用。

双缩脲试剂检验法是临床使用已久的检测血清蛋白的方法，尤其以Doumas改良法为主，为各个实验室及化验室所采用。Doumas法检测血清蛋白时，准确度高、精密度强备受关注。但是该方法存在以下缺点：一是当待检血清样本中脂类含量偏高，对检测结果造成极大影响，使得结果偏高；二是对于点滴中含有右旋糖苷的样本同样不能进行检测，主要是由于葡萄糖与双缩脲试剂中的Cu²⁺发生反应生成红色物质，严重影响了比色测定，不能确定其检测诊断结果。

市场上目前流通的各种双缩脲试剂无一不是经过改良之后的，但是尚未见到任何试剂，能够同时消除高脂和右旋糖酐对诊断检测带来的干扰。

鉴于以上问题，我们发明了氢氧化钾法诊断检测试剂盒，该方法是在多种碱性物质中选择的能在很大程度上降低高脂和右旋糖酐带来的干扰。本发明采用氢氧化钾和对应浓度的酒石酸钾钠溶液，配置成双试剂诊断检测试剂盒，在一定程度上克服了高脂和右旋糖酐对血清蛋白检测带来的干扰。

发明内容

本发明目的在于提供一种氢氧化钾法总蛋白检测诊断试剂盒，有效地解决了双缩脲试剂不能排除高脂和右旋糖酐带来的干扰问题，为Doumas方法学的完善提供了新资料。

检验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物，在碱性溶液中能与Cu²⁺发生双缩脲反应，形成复杂的紫色物质，该物质在波长540nm时有最大光吸收值。血清中总蛋白结构与双缩脲类似，在碱性条件下同样能与Cu²⁺发生反应生成紫色的络合物，络合物的颜色与蛋白质浓度成正比，与蛋白质的分子量及其氨基酸组成无关，通过记录在540nm下的吸光度变化，根据标准液浓度来计算所检测样本中蛋白的含量。

应用本发明氢氧化钾法检测总蛋白试剂盒，测定血清中总蛋白的含量方法如下：检测波长主波长为540nm、辅波长为700nm，样本量：试剂R1：试剂R2=5μL:125:μL:125μL。

本发明是一种氢氧化钾法总蛋白检测试剂盒，是由试剂R1和试剂R2组成的双试剂液体型检测诊断试剂盒，其中

试剂R1组成为：

碘化钾 2-6g/L

酒石酸钾钠 8-16g/L

无水硫酸铜 4-8g/L

丙三醇 1.5-3.0ml/L

叠氮钠 0.01-0.8g/L

水质稳定剂 0.2-1ml/L

试剂R2组成为：

氢氧化钾 0.1-0.4M/L

丙三醇 1.5-3.0ml/L

防腐剂 0.01-0.8g/L

羟基乙叉二膦酸 0.2-1ml/L

本发明氢氧化钾法总蛋白检测诊断试剂盒，其试剂R1和试剂R2的选择依据是：

酒石酸钾钠作为一种螯合剂，能够保护络合物离子状态的Cu²⁺， 防止Cu²⁺与溶液中多余的OH^-形成CuO沉淀。

碘化钾作用增加试剂的稳定性，延长试剂使用寿命。

五水硫酸铜可以与蛋白质中的氨基酸之间连接的肽键发生双缩脲反应，生成紫色的络合物，进而引起吸光度的变化。

氢氧化钾一是提供一种碱性条件下pH环境，二是K+对于消除高脂和右旋糖酐带来的干扰影响。

丙三醇是一种保护剂，防止试剂遭受高温、低温对溶液产生影响。

叠氮钠作用防止试剂霉变变质。

羟基乙叉二膦酸能与水中钙、镁离子等成垢物质形成稳定的络合物，易溶于水，起良好的螯合、分散、缓蚀作用，阻止结垢并对老垢层起到疏松作用，便于清垢。

本发明可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。

应用本发明进行体外样本诊断检测时，设定波长为540nm，将吸取的样本与反应杯中，然后加上试剂R1进行孵育。加入试剂R2时，发生双缩脲反应，通过计算吸光度变化来计算所检测样本中总蛋白的含量。

本发明是一种氢氧化钾法蛋白体外诊断检测试剂盒，测定方法如下所述：样本样品（或者是朗道质控品1005UN），朗道复合校准品938UN作为校准品，样本中加入R1试剂孵育5min，充分混匀然后读取此时的吸光度A1，加入试剂R2，37℃反应5min然后读取此时的吸光度R2，计算ΔA,根据公式：

直接胆红素的含量=吸光度（A2-A1）*标准液浓度

其中样本用量5μL,试剂R1为125μL,试剂R2为125μL。

和市场上目前流通的直接胆红素检测试剂盒相比，本发明的试剂盒，对于高脂和含有右旋糖酐样本可以排除其干扰，本发明试剂盒测量准确度较好，精密度高，重复性好，试剂稳定性较好，适用于全自动生化分析仪，临床使用价值较大。

附图说明

图1相关性作图。

具体实施方式：

以下结合图表，实施例对本发明进行说明

实施例1

本发明在具体实施中，试剂R1组成为：

碘化钾 3g/L

酒石酸钾钠 16g/L

无水硫酸铜 8g/L

丙三醇 3.0ml/L

叠氮钠 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

试剂R2组成为：

氢氧化钾 0.4M/L

丙三醇 3.0ml/L

防腐剂 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

实施例2

试剂R1组成为：

碘化钾 6g/L

酒石酸钾钠 12g/L

无水硫酸铜 8g/L

丙三醇 3.0ml/L

叠氮钠 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

试剂R2组成为：

氢氧化钾 0.4M/L

丙三醇 3.0ml/L

叠氮钠 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

实施例3

试剂R1组成为：

碘化钾 6g/L

酒石酸钾钠 8g/L

无水硫酸铜 8g/L

丙三醇 3.0ml/L

叠氮钠 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

试剂R2组成为：

氢氧化钾 0.2mol/L

丙三醇 3.0ml/L

叠氮钠 0.5g/L

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

本发明试剂盒性能检测实验：

抗干扰实验

购买右旋葡萄糖苷，以朗道校准品938UN进行校准，以朗道质控品1005UN做为参考物质，配制成70g/L的右旋葡萄糖苷溶液，将溶液取溶解朗道质控品1005UN，暂时称作A液。然后通过倍比稀释配制成不同梯度的质控品，即A液、1/2A液、1/4A液、1/8A液。对高脂干扰试验检测方法同上，所用注射用软磷脂配制15g/L的溶液，其余方法同上，不再重述。运用迈瑞800全自动生化分析仪进行测试，采用市场上流通总蛋白试剂盒作为对照试剂。采用实施例1配方，不在重述，测试结果如表1所示：

表1.本发明试剂盒与对照试剂盒的抗干扰能力

由表1可以看出，本发明试剂盒对右旋葡萄糖苷的抗干扰能力在35g/L左右，但是对照试剂盒对右旋葡萄糖苷的抗干扰能力在17.5/L左右，本发明试剂盒在对干扰物右旋葡萄糖苷的抗干扰能力高于对照试剂盒。对干扰物软磷脂的抗干扰能力，本发明试剂盒在7.5g/L左右但是对照试剂盒只能在3.75g/L左右，显然本发明试剂盒对干扰物右旋葡萄糖苷和软磷脂的抗干扰能力上优于对照试剂盒。但是当两种干扰物质同时存在时，发现本试剂盒对两种物质的抗干扰能力有所下降，对照试剂盒亦是如此。

重复性实验

运用朗道校准品938UN进行校准，对朗道质控品1005UN重复测试N=20次，所用试剂为本发明实施例2配方试剂与市场流通总蛋白检测试剂盒，检测方法不在重述。检测结果如表2所示：

表2本发明与对照试剂重复性检测结果

通过表2发现，本发明试剂盒在重复性上和对照试剂盒基本没有差别，二者可认为是同效的。

临床样本检测实验

本发明试剂盒同对比试剂盒对随进N=40个临床样本进行测试，测试结果以表格的形式在下表进行体现，通过该表格3录的数值，进而计算出，本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性。所用的试剂为本发明实施例3中配方，对照试剂为市场流通的总蛋白检测试剂盒试剂。

表3本发明试剂盒与对照试剂盒临床检测结果

结合表3和附图1说明本发明试剂盒和对比试剂盒相关性r=0.99975。

线性实验

用牛血清蛋白配置高浓度溶液，通过本发明试剂盒和市场流通试剂盒作对照检测其本发明试剂盒线性范围，配制的牛血清蛋白溶液浓度300g/L,为了进一步验证本发明试剂盒的范围，因此将制备好的牛血清蛋白稀释2倍、3倍、5倍等，检测结果如表4所示

表4本发明试剂盒与对照试剂盒线性实验检测结果

稀释倍数	0	2	3	5	10
						理论值 （g/L）	300	150	100	60	30
本发明试剂盒 （g/L）	204	121	100.4	59.1	31
						对比试剂盒（g/L）	233	133	101	59.4	29.8

通过表4很明显本发明试剂盒的线性范围低于对照试剂盒，这是本发明试剂盒的一大缺点，但是人体内血清中总蛋白含量一般60-88g/L，对于检测人体血清中总蛋白含量足以胜任。

综上所述，本发明试剂盒——氢氧化钾法总蛋白检测诊断试剂盒，进一步完善了双缩脲反应原理检测血清总蛋白方法学，同时对于以往通过氢氧化钠法检测血清中总蛋白不能排除右旋葡萄糖苷和脂类对检测时带来的干扰提供了新的方向。本发明在解决右旋葡萄糖苷和高脂在检测中引起的干扰指明了方向，再加上本发明试剂长期稳定，抗干扰能力较强、成本较低，对仪器不会产生腐蚀影响，操作方便，对环境几乎没有污染，可行性强，经济和社会效益巨大，是测定总胆红素试剂上的一种创新。

Claims (3)

1.氢氧化钾法总蛋白检测诊断试剂盒：其特征在于本发明试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂诊断检测试剂盒；其中试剂R1是0.1-0.4M/L的氢氧化钾、1.5-3.0ml/L的丙三醇、2-3g/L的碘化钾、防腐剂0.01-0.8g/L、水质稳定剂0.2-1ml/L；试剂R2是由2-4g/L的酒石酸钾钠、4-8g/L的无水硫酸铜、1.5-3.0ml/L的丙三醇、防腐剂0.01-0.8g/L、水质稳定剂0.2-1ml/L组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂R1和R2能够在pH5.0-9.0范围内储存，当环境pH低于5.0时，会对试剂R1的内环境pH值稳定造成影响，影响后期反应，当环境pH高于9.0时，试剂R2产生不可逆的反应生成氧化铜，严重影响试剂盒的检测效果。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂R1中的K⁺可以去除高脂和右旋糖酐引起的干扰。