一种血清不饱和铁结合力检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,具体涉及一种用于血清不饱和铁结合力测定的检测试剂盒。
背景技术
人体含铁量约4g,其中2/3存在于红细胞血红蛋白中,其余1/3则储备在肝、脾和骨髓中,有Fe2+和Fe3+两种形式,血清中的Fe3+全部与转铁蛋白结合。转铁蛋白又称为运铁蛋白(Transferrin,TRF),负责运输体内由消化管吸收的铁和由红细胞降解的铁,以TRF-Fe3+的复合物形式进入骨髓中,供成熟红细胞的生成。通常血清中只有1/3的转铁蛋白与铁结合,其余2/3未结合,转铁蛋白这种潜在的结合铁的能力称为不饱和铁结合力UIBC(Unsaturated Iron Binding Capacity),能结合的最大铁量称为总铁结合力TIBC(TotalIron Binding Capacity),等于血清铁与不饱和铁结合力之和。TIBC测定可用于辅助临床疾病诊断,如缺铁性贫血、急性肝炎等疾病会引起TIBC增高,肝硬化、肾病、尿毒症、慢性感染、白血病及遗传性转铁蛋白缺乏症等则会引起TIBC降低。TIBC亦可间接反映转铁蛋白的水平,有重要的临床意义。
总铁结合力(TIBC)、不饱和铁结合力(UIBC)的测定,根本上是基于血清中铁的测定,即先将转铁蛋白用过量铁标准溶液饱和后,再通过测定体系中的铁来得到。
血清铁的测定方法有原子吸收法、电化学法、比色法等。原子吸收法与电化学法虽样品用量少,分析时间短,但因需要专门的测试仪器,且价格昂贵,应用范围有限,目前在临床实验室广泛使用的是比色法。临床血清铁比色法测定原理:在酸性条件下使Fe3+与转铁蛋白解离,并加入还原剂(例如羟胺、抗坏血酸、巯基乙酸、肼等)将Fe3+还原成Fe2+,再用一种能与亚铁离子络合的色原去络合亚铁离子,然后进行比色测定。临床广泛使用的色原有亚铁嗪、呋喃三嗪二钠盐(ferene)、红菲绕啉(BPZ)、三吡啶基三啉(TPZ)等。
传统TIBC测定是在碱性条件(pH8.0~8.9)下,向血清中加入过量的Fe3+标准溶液,使转铁蛋白饱和,剩余的未结合的铁加轻质碳酸镁(也可用其他吸附剂如铁交换树脂、氧化铝柱或磁珠等)吸附,然后离心沉淀除去,取上层血清,按血清铁测定铁含量,即为总铁结合力。该法要除去多余的铁,需沉淀、离心等手工操作,样本需用量大,处理繁琐耗时长,不适于临床大量样本检测和自动化。
Hachiro Yamanishi(Clinical Chemistry,2002:1565-1570)报道了用3试剂法直接测定血清总铁结合力,不用除去饱和转铁蛋白多余的铁,简化了测定步骤,具有重要的临床意义,但因3试剂需用特殊加样功能的全自动生化仪,不能在一般生化仪上使用而限制了发展;专利CN101226152介绍了一种直接测定血清总铁结合力的试剂方法。
目前发展比较成熟的是计算法,即由不饱和铁结合力加上血清铁计算总铁结合力,市场上已开发有血清铁和不饱和铁结合力检测试剂盒,可以在自动生化仪上进行快速测定。不饱和铁结合力测定原理:向血清样本中加入含过量铁离子的碱性缓冲液,使未与铁结合的转铁蛋白全部与铁离子结合,剩余的铁离子在还原剂、显色剂作用下生成有色物质,在特定波长下测定吸光度,计算缓冲液中铁离子的减少量即为血清的不饱和铁结合力。
目前最广泛使用的还原剂为抗坏血酸(维生素C),可使Fe3+还原为Fe2+,因抗坏血酸在溶液状态下不稳定、易分解,试剂中常需加入其他具有维持VC稳定性的物质,USpatent5420008中除VC外,还添加巯基乙酸、硫代苹果酸、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙醇、β-巯基丙酸、还原型谷胱甘肽、DTT等含巯基的还原性物质或盐酸羟胺来保持VC的稳定性;专利文献JP49092219A、5903M68B中提到使用偏磷酸盐、N-乙酰半胱氨酸、亚硫酸盐有利于维持抗坏血酸溶液的稳定,在室温下储存4周后保存约80%;N-乙酰半胱氨酸并添加亚硫酸盐,可稳定10天;JP6247855A中采用焦亚硫酸钠作为稳定剂;CN201110233022中综合专利文献中添加还原性稳定物质并代替巯基类化合物得到一种无不良气味、稳定性好的测定血清不饱和铁结合力试剂。
转铁蛋白与铁的结合是可逆的,在pH7.5~9条件下,二者结合很稳定,在酸性条件或pH>9时,转铁蛋白会与铁解离,因此测定血清不饱和铁结合力的测定试剂组分为:pH7.5~9的碱性缓冲液、过量铁离子(硫酸铁、氯化铁、硫酸铁铵、硫酸亚铁铵、氯化亚铁等)、强还原剂及色原。以往专利文献中配制pH7.5~9的碱性缓冲液多为Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等,这些缓冲液与铁离子都有一定的结合能力,加入还原剂和色原后显色时间较长,但显色后稳定时间有比较短,造成检测的准确度和精密度不理想,不利于临床检测应用。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足,提供一种可显著缩短显色时间并提高试剂检测血清不饱和铁结合力的准确度、精密度,显色后稳定时间长的血清不饱和铁结合力测定试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明的血清不饱和铁结合力测定试剂盒,由试剂1和试剂2组成,其中试剂1包括含过量铁离子(水溶性盐)的碱性缓冲液、表面活性剂、去干扰剂、防腐剂,试剂2包括缓冲液、抗坏血酸、稳定剂、表面活性剂。
另色原亦是试剂的重要组成成分,可与亚铁离子络合生成有色物质,呈色稳定,在特定波长下有特定的吸光度,所述色原可包括在试剂1中,也可添加在试剂2中,择一添加。
具体的,本发明的血清不饱和铁结合力测定试剂盒,其中试剂1、试剂2各组分及浓度范围为:
试剂1:碱性缓冲液(pH7.5~9) 0.1-1.0mol/L
过量铁离子(水溶性盐) 1~5mmol/L
表面活性剂 0.1%-1.0%
去干扰剂 0~100mmol/L
水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐 0~200mmol/L
防腐剂 0~1.0%(质量百分比);
试剂2:缓冲液(pH1.0~6.0) 0.05-0.5mol/L
抗坏血酸 0~500mmol/L
稳定剂 0~100mmol/L
表面活性剂 0.1%~1.0%(质量百分比)
防腐剂 0~1.0%(质量百分比);
上述试剂盒中还包括在试剂1中或在试剂2中的色原0.1~30mmol/L。
本发明的上述试剂盒中的试剂可以是干粉状态,使用前加水溶解混匀后使用;也可以是液体试剂,直接使用。
本发明试剂1中所述碱性缓冲液可以是乙酸、巴比妥酸、邻苯二甲酸、羟基乙酸、α-羟基丁酸、甘氨酸、乳酸、甘油酸、羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦杏仁酸中的一种与氢氧化钠或氢氧化钾加水配合形成pH7.5~9的缓冲液;或上述酸中一种的碱金属盐或上述酸中的一种与Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、乙醇胺缓冲液、硼砂缓冲液或磷酸盐缓冲液配合后调节pH7.5~9构成的缓冲液。
本发明试剂1中过量铁离子为由硫酸铁、氯化铁、硫酸亚铁铵、硫酸铁铵、硫酸亚铁、氯化亚铁、甘氨酸亚铁、甘氨酸铁、乳酸亚铁、次氮基三乙酸铁或次氮基三乙酸亚铁等中的一种含铁化合物溶于水中构成水溶液添加到试剂1中;试剂1中的铁离子浓度范围在1~5mmol/L。
本发明试剂1中所含的表面活性剂的浓度为0.1%~1.0%,为非离子表面活性剂,可消除血清样本中脂浊的影响,如可选自Tween系列(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等中的一种)、TritonX系列(如TritonX-100等)、Brij系列(如Brij35、Brij90等)中的一种或几种,其中对液体类表面活性剂所述浓度为体积百分比浓度,固体类表面活性剂为质量百分比浓度。
试剂1中的去干扰剂可选硫脲、氨基硫脲、N,N-二甲基硫脲、异硫脲等中的一种,优选硫脲,浓度范围1-60mmol/L,主要作用是消除血清中铜离子的影响。
另试剂1中加入的水溶性碳酸盐或水溶性碳酸氢盐,优选碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐,如钠盐或钾盐等,浓度范围优选为30~150mmol/L。
试剂2选用pH1.0~6.0的酸性缓冲液,有利于保持抗坏血酸的稳定性,优选醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐-柠檬酸盐或磷酸盐-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液等中的一种。
试剂2中的表面活性剂可以选用Tween系列(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、TritonX系列(如TritonX-100等)、Brij系列(如Brij35、Brij90等)、Span系列等非离子表面活性剂的一种或几种,其中对液体类表面活性剂所述浓度为体积百分比浓度,固体类表面活性剂为质量百分比浓度。
试剂2中的稳定剂为维持抗坏血酸的的稳定性,可以选用具有还原性的物质,如盐酸羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中的一种或几种;或具有巯基的化合物如巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸等中的一种或几种;或盐酸羟胺、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中的一种或几种与上述具有巯基的化合物中的一种或几种的结合;稳定剂浓度优选为1-80mmol/L。
试剂1、试剂2中防腐剂可选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂(如Proclin300)、尼泊金酯类(如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯)等中的一种或几种;防腐剂的浓度为质量百分比,优选为0.01-0.8%。
本发明所述色原可以是3-(2-吡啶基)-5,6-双苯磺酸)-1,2,4-三嗪(亚铁嗪Ferrozine)及其盐类,三吡啶基三啉(TPZ三吡啶基三嗪)、红菲绕啉(BPZ)、ferene等,可选择加在试剂1中也可选择加在试剂2中,优选加在试剂2中(因试剂1中有过量铁离子存在,显色剂若加入会有显色;而试剂2中没有铁离子,试剂颜色为显色剂颜色(不同于与铁结合后颜色),浓度范围在0.1~30mmol/L。
本发明的抗坏血酸优选30-100mmol/L。
以上所涉及的试剂或缓冲液均可通过商业渠道获得,或按照本领域常规方法进行配制,其中所涉及到的技术术语和相关技术术语的缩写均按本领域通常理解。例如TritonX-100表示聚乙二醇辛基苯基醚,Ferrozine表示亚铁嗪,Tris表示三羟甲基氨基甲烷,Brij表示聚环氧乙烯月桂酰醚等。
本发明的UIBC测定试剂盒,测定方法为两点终点法,温度37℃,R1:R2:样本=200:40:20,其中R1为试剂1,R2为试剂2,测定主波长(以色原为亚铁嗪为例)为570nm,副波长为700nm。R1加入样本或校准品后37℃孵育5min后,记录吸光度A1,然后加入R2继续孵育5min后记录吸光度值A2.
UIBC计算方法:
UIBC浓度=(ΔA样本/ΔA校准)×校准品浓度
ΔA=A待测-A空白,A=A2-A1
本发明的优点和有益效果:
1.本发明采用在碱性条件下(pH7.5~9)测定“不饱和铁结合力”(UIBC),原理是:血清中转铁蛋白通常仅有1/3与铁结合,其余2/3则未结合;在碱性溶液中用过量铁离子(一般是定量的)将2/3未结合的转铁蛋白饱和,用加进去的铁离子量减去剩下的铁离子便是不饱和铁结合力(临床上是通过与UIBC校准品比较就可以计算出样本的UIBC值);需注意的是:碱性条件下,转铁蛋白与铁不会解离,另外在碱性测定条件下也不需要将其解离;相对于专利CN101226152(直接测定血清总铁结合力的试剂方法)在酸性条件下,原理不同;若在酸性条件下检测的话就需要转铁蛋白与铁解离完全,检测结果才能完全反应铁离子的浓度,从而反应总铁结合力的浓度,所以该技术中需要加入解离剂(但解离剂的作用是否有效不太清楚,因为在酸性条件pH<4.5下转铁蛋白与铁不能结合,二者就已经分开解离了)。
2.本发明采用含多羟基的有机酸或其碱金属盐来配制碱性缓冲液或在以上缓冲液基础上调节pH,可明显加快显色时间,使显色反应在短时间内达到终点,并可以稳定保存较长时间;另该种物质中含O配位键,可与铁离子结合成较稳定的配合物,提高铁离子在碱性缓冲液中的稳定性,从而提高试剂稳定性。
附图说明
图1不同浓度UIBC的血清样本得到线性图。
图2 40份临床血清样本,分别用实施例1试剂与日本和光公司UIBC试剂进行检测,得到的线性图(其中X轴代表和光UIBC检测结果,Y轴代表实施例1所测UIBC结果)。
图3 Tris缓冲液显色效果图(结果显示显色未达终,耗时较长)。
图4用含羟基碱性缓冲液的显色效果图。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明作出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
比较例1
实施例1
实施例2
实施例3
与比较例1相比,按R1:R2:样本=200:40:20的比例,于5ml透明管中分别加入样本100μl,R1试剂1ml,37℃水浴孵育5min后,加入试剂R2200μl,记录显色时间;比较例1需要在1分钟后逐渐显色,在2min后才逐渐达到终点;实施例1、2、3加入后即显色,并达到终点,且显色稳定。
下面结合表格对实施例1试剂盒分析性能进行说明。
1、精密度
表1、精密度评估结果
2、线性
将高、低值血清样本按不同行比例稀释得到不同浓度UIBC的血清样本得到线性图如图1所示:在0~80μmol/L范围内,线性回归方程为y=1.0125x-0.3838,R2=0.9996,线性良好。
3、方法学比对试验
取40份临床血清样本,分别用实施例1试剂与日本和光公司UIBC试剂进行检测,并将结果进行比较,如图2所示。其中X轴代表和光UIBC检测结果,Y轴代表实施例1所测UIBC结果。
由图2所示可看出与和光的线性回归方程为:y=0.9825x+0.3243,相关系数R2=0.9965,大于0.995,相关性良好。
检测灵敏度
4、检测灵敏度
评估方法采用20个空白样本讯号强度的标准差,及3-15个最低非零样本讯号强度的标准差,用统计软件EP Evaluator release 6计算所得。实验结果显示本发明试剂有很好的灵敏度,能完全符合美国临床实验室改进修正法规。
表2 试剂检测灵敏度
5、对靶值在36μmol/L、46μmol/L的质控液在相同条件下,采用实施例1、2、3、4对其进行检测20次,将检测结果的平均值与靶值进行比较,以检测所述试剂的准确性,同时比较每个测定的变异系数,以检测所述实施例的检测精密度,结果如表3所示。
表3 实施例检测两质控水平结果
6、Tris与铁离子结合显色快慢分析
Tris全名为三羟甲基氨基甲烷,由其配制的碱性缓冲液与铁离子有一定的配位结合能力(通常用配位常数来表示,一般而言,配位常数越大表示形成的配合物越稳定),显色物质(即本发明中提到的色原)必须与铁结合后才能显色,这就涉及到“铁先与碱性缓冲液物质分开,即先“分离”再与“显色物质”结合的过程,也可以理解为:显色物质将铁从原有配合物中夺取过来,若铁与Tris的结合比较强,则显色物质夺取铁所需的时间就要长一些,而用含羟基的有机酸配成的碱性缓冲液,则铁与其的结合就要弱一些,显色物质夺取铁所需时间就要短一些。
显色快慢图
图3Tris缓冲液显色效果示意图,结果显示显色未达终,耗时较长;
图4为用含羟基碱性缓冲液的效果图,加进去即可显色达到平衡。
从上述检测结果可知,本发明试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性,显示速度快,能完全满足临床检验要求。