CN106053461A - 一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

重氮法直接胆红素检测试剂盒在试剂稳定性能上存在很大缺陷，目前市场上流通的重氮法直接胆红素检测试剂盒，在不偏移检测结果5%左右的条件下，一般只能控制在5天左右，很多产品只能控制在2‑3天，鉴于以上问题，本发明一种稳定的直接胆红素重氮法检测试剂盒通过柔和了D‑吡喃葡萄糖苷，D‑吡喃葡萄糖，羟基乙叉二磷酸，葡聚糖4中不同的稳定剂，按照一定的配比形成一种有效的保护网，增强试剂的稳定性。

Description

一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及到血清或血浆中的直接胆红素含量的检测。

背景技术

胆红素包含游离胆红素和直接胆红素两种：直接胆红素又可称为结合胆红素，即血液中游离胆红素运输到肝脏后，迅速被肝细胞摄取，胆红素在肝细胞胞浆中主要与Ｙ蛋白和Ｚ蛋白结合（以Ｙ蛋白为主）。然后在内质网中结合葡萄糖醛酸生成水溶性结合胆红素；游离胆红素亦可以成为未结合胆红素，即没有与葡萄糖醛酸结合，未结合的胆红素主要是血红素在单核吞噬系统细胞微粒体血红素加氧酶的作用催化下，形成线性四吡咯的水溶性胆绿素，胆绿素进一步在细胞液中活性较强的胆绿素还原酶作用催化下，还原成胆红素。

目前对于直接胆红素的检测诊断方法有很多种，重氮法、高效液相色谱法（HPLC）、氧化酶法、钒酸盐法等。重氮法是历史最久，目前为止应用较广的方法，但是该方法测定直接胆红素时受到多种因素影响，结果差异性较大；高效液相色谱法（HPLC）对仪器和设备要求较高，因此不能作为常规方法使用；氧化酶法灵敏度高，抗干扰能力不是很强，主要是由于酶对温度要求极高，活性只能在一定温度范围内才能发挥最佳作用，而且该种方法试剂价格极高难于推广；钒酸盐法是上世纪９０年代由日本学者提出的一种新型的氧化方法，但是该方法对仪器损伤较大，钒酸盐的氧化性高于高锰酸钾，也不利于保存。

鉴于以上因素，发明了一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒。该方法是集合了多种稳定剂和保护剂按照不同比例组成的，具有延长试剂稳定，增强试剂在运输及储存过程中因环境因素引起的试剂不稳定性,从而为胆红素重氮法检测方法学提供新的资料。

发明内容

本发明内容在于解决重氮法在检测、储存和运输过程中不稳定性因素，本发明的试剂盒一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒，该发明试剂盒解决了重氮法不稳定问题，线性问题。

直接胆红素与2,4-二氯苯胺重氮盐结合后形成重氮化合物,该化合物在酸性条件下呈现出红色,引起545nm处的吸光光度值的变化，重氮化合物的含量可以通过吸光光度变化来计算，进而计算出血清中直接胆红素的含量。

本发明是一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒，本发明试剂盒是由试剂R1和试剂R2两种试剂组成的液体型双试剂检测诊断试剂，其中试剂R1包括乙二胺四乙酸二钠，氨基苯磺酸，氯化钠， D-吡喃葡萄糖苷，D-吡喃葡萄糖，葡聚糖，Triton X-405，柠檬酸-甘氨酸缓冲液；试剂R2包含2,4-二氯苯胺重氮盐，乙二胺四乙酸，盐酸，甘氨酸-盐酸缓冲液，D-吡喃葡萄糖苷， D-吡喃葡萄糖，葡聚糖，羟基乙叉二膦酸。

本发明试剂盒一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒，试剂R1和R2各物质的选择依据是：

乙二胺四乙酸二钠是一种离子螯合剂，它能有效的螯合金属离子，防止一些杂质离子对检测反应引起不必要的干扰。

氨基苯磺酸作为颜色产生物， 用于制作偶氮染料。

氯化钠用于模拟人体内血液环境，保证反应的进行是在体外相同条件下进行的，从而保证检测的真实性和可靠性。

D-吡喃葡萄糖苷、D-吡喃葡萄糖、葡聚糖和羟基乙叉二膦酸作为稳定剂物质。

柠檬酸-甘氨酸缓冲液主要是缓冲作用，保证反应时外环境的稳定，致使检测结果不会受到波动和影响。

2,4-二氯苯胺重氮盐作为反应底物，与直接胆红素结合形成重氮盐，在偶氮染料哦存在时，呈现红色，引起545nm处吸光光度值的变化，通过吸光光度值的变化间接计算直接胆红素的含量。

乙二胺四乙酸是一种离子螯合剂，它能有效的螯合金属离子，防止一些杂质离子对检测反应引起不必要的干扰。

盐酸，提供一种强酸性环境。

甘氨酸-盐酸缓冲液主要是缓冲作用，保证反应时外环境的稳定，致使检测结果不会受到波动和影响。

本发明可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。

应用本发明进行体外样本诊断检测时，操作方法如下，设置波长为545nm，终点法，样本量：试剂R1：试剂R2=10ul：200ul：50ul。样本针吸取样本后于试剂R1中进行孵育，以保证反应环境外界条件的稳定，然后读取吸光光度值为ΔA1，进而加入试剂R2，样本中的直接胆红素与2,4-二氯苯胺重氮盐结合形成重氮盐，重氮盐与氨基苯磺酸产生颜色反应显示红色，引起波长545nm处吸光光度值的变化，37℃反应5-10分钟左右读取吸光光度值为ΔA2，通过计算吸光光度值的变化，进而计算出直接胆红素的含量。计算公式如下：

直接胆红素含量=标准液浓度*吸光光度值（ΔA2-ΔA1）

相对于市场上目前流通的重氮法直接胆红素检测试剂盒，本发明试剂盒，精密度高，重复性好，抗干扰能力强，尤为重要的是试剂稳定性较好，适用于全自动生化分析仪，临床使用价值较大。

附图说明

图1 临床样本检测试验中本发明试剂盒检测结果与对比试剂盒检测结果的相关性；

图2 本发明试剂与对照试剂稳定性检测结果对比；

图3 本发明试剂盒与对照试剂盒抗干扰实验结果；

图4 临床样本检测试验中本发明试剂盒检测结果与对比试剂盒检测结果统计图表。

具体实施方式

以下结合图表，实施例对本发明进行说明。

实施例1

本发明在具体实施中，所述的试剂R1为：

乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%

氨基苯磺酸 50mM-100mM

氯化钠 5g-9g/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.05%%

D-吡喃葡萄糖 0.075%%

葡聚糖 0.3%

Triton X-405 0.125%-0.4%

柠檬酸-甘氨酸缓冲液 0.1mol/L

试剂R2为：

2,4-二氯苯胺重氮盐 50-100m mol/L

乙二胺四乙酸 0.1%-1%

盐酸 0.1M-0.4M

甘氨酸-盐酸缓冲液 0.1mol/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.05%%

D-吡喃葡萄糖 0.075%

葡聚糖 0.3%

羟基乙叉二膦酸 20m mol/L。

实施例2

乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%

氨基苯磺酸 50mM-100mM

氯化钠 5g-9g/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.075%%

D-吡喃葡萄糖 0.125%%

葡聚糖 0.4%

Triton X-405 0.125%-0.4%

柠檬酸-甘氨酸缓冲液 0.1mol/L

试剂R2为：

2,4-二氯苯胺重氮盐 50-100m mol/L

乙二胺四乙酸 0.1%-1%

盐酸 0.1M-0.4M

甘氨酸-盐酸缓冲液 0.1mol/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.05%%

D-吡喃葡萄糖 0.075%

葡聚糖 0.3%

羟基乙叉二膦酸 15m mol/L。

实施例3

乙二胺四乙酸二钠 0.1%-0.5%

氨基苯磺酸 50mM-100mM

氯化钠 5g-9g/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.1%%

D-吡喃葡萄糖 0.2%%

葡聚糖 0.5%

Triton X-405 0.125%-0.4%

柠檬酸-甘氨酸缓冲液 0.1mol/L

试剂R2为：

2,4-二氯苯胺重氮盐 50-100m mol/L

乙二胺四乙酸 0.1%-1%

盐酸 0.1M-0.4M

甘氨酸-盐酸缓冲液 0.1mol/L

D-吡喃葡萄糖苷 0.075%%

D-吡喃葡萄糖 0.125%

葡聚糖 0.5%

羟基乙叉二膦酸 10m mol/L。

本发明试剂盒性能检测试验：

稳定性试验检测：

运用本发明实试剂盒（实施例1）和目前市场上流通的试剂盒进行对比，校准液和质控品分别是朗道926UN和1005UN，使用仪器为全自动生化分析仪BS-800，参数设置如下，波长为545nm，反应方向为正方向，读数点设置为14-16点和31-33点，样本量：试剂R1：试剂R2=10ul：200ul：50ul。检测结果如图2所示：

结合图2,我们发现本发明试剂在历时4个月后,4度储存的试剂几乎没有任何衰减，但是对照试剂在第30天时开始衰减，4个月后已经衰减了近30%；37度条件下，本发明试剂历时30天，没有衰减，但是其后开始衰减，4个月后衰减20%左右，对照试剂在在第9天时已经开始衰减，4个月后衰减40%左右；45度条件时本发明试剂在15天后开始衰减，但是从15天至120天期间几乎不再发生衰减，对照试剂在第6天开始衰减，120天后衰减达到了50%左右。因此本发明试剂盒在直接胆红素重氮法检测中，其稳定性有了很大程度的提高，但是存在不足。

抗干扰性实验：

购买软磷脂，配制15g/L的溶液，将溶液溶解朗道质控品1005UN，暂时称作A液。然后通过倍比稀释配制成不同梯度的质控品，即A液、1/2A液、1/4A液、1/8A液。EDTA-2Na配制同上，其A液浓度为20g/L。运用迈瑞800全自动生化分析仪进行测试，采用市场上流通重氮法直接胆红素试剂盒作为对照试剂，本发明试剂盒采用实施例2配方进行配制，操作方法不再重述，检测结果如图3所示：

根据图3检测结果，我们发现软磷脂对于重氮法直接胆红素检测试剂盒是有影响的，本发明试剂盒能够抵抗15g/L的软磷脂，但是低于靶值10%左右，对照试剂随着软磷脂浓度的增加，检测结果逐步降低，当软磷脂达到15g/L时，已经高出靶值200%；对EDTA-2Na中干扰物质来说，本发明试剂盒几乎不受其影响，但是随着EDTA-2Na浓度的升高，对照试剂检测结果逐步升高，当EDTA-2Na达到20g/L时，检测结果高出靶值200%左右，因此就干扰物质软磷脂和EDTA-2Na来说，本发明试剂盒抵抗二者的干扰能力远优于对照试剂。

临床样本检测实验：

本发明试剂盒同对比试剂盒对随进N=40个样本进行测试，测试结果以图4进行体现，通过图4的数值，进而计算出，本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性。本发明试剂盒采用实施例3配方进行检测。检测结果如图4所示：

结合图4和图1说明，本发明试剂盒在临床样本检测时，二者的相关性r=0.996。

综上所述，本发明试剂盒一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒在临床样本检测时与对照试剂盒有较好的相关性，但是在试剂稳定性和对干扰物质的抗干扰能力方面均优于对照试剂，为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。

Claims (7)

1.一种稳定的重氮法直接胆红素检测试剂盒，其特征在于本发明试剂盒是双试剂液体型试剂盒。

2.根据权利要求１所述的试剂盒，其特征在于本发明试剂盒试剂Ｒ１和试剂Ｒ２的使用比例为4:1。

3.根据权利要求２所述的试剂盒，其特征在于试剂Ｒ１是由0.1mol/L的柠檬酸甘氨酸缓冲液、0.1%-0.5%的乙二胺四乙酸二钠、50mM-100mM的氨基苯磺酸、5g-9g/L的氯化钠、表面活性剂和稳定剂组成的；试剂Ｒ２是由50-100mM的２，４－二氯苯胺重氮盐；0.1%-1%的乙二胺四乙酸；0.1M-0.4M盐酸；0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液和稳定剂。

4.根据权利要求２所述的试剂盒，其特征在于稳定剂是由D-吡喃葡萄糖苷，D-吡喃葡萄糖，羟基乙叉二磷酸，葡聚糖中一种或几种。

5.根据权利要求２所述的试剂盒，其特征在于本发明试剂盒中使用的稳定剂是由D-吡喃葡萄糖苷，羟基乙叉二磷酸，D-吡喃葡萄糖和葡聚糖四种按照一定比例组合而成的。

6.根据权利要求３所述的试剂盒，其特征在于本发明试剂盒所使用的表明活性剂是非离子型表面活性剂。

7.根据权利要求５所述的试剂盒，其特征在于本发明试剂盒所使用的表面活性剂是Triton X-405。