WO2017221944A1 - カタラーゼ阻害剤及びカタラーゼ阻害剤を用いるアナライトの測定方法 - Google Patents

カタラーゼ阻害剤及びカタラーゼ阻害剤を用いるアナライトの測定方法 Download PDF

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WO2017221944A1
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圭吾 羽田
太志 遠藤
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パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社
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    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Definitions

  • the present application relates to a catalase inhibitor, an analyte measurement method using the inhibitor, a measurement kit, and the like.
  • R 1 to R 4 each independently represents a hydrogen atom, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms;
  • X ⁇ represents an anionic species.
  • a catalase inhibitor comprising a compound represented by: [2]
  • each of R 1 to R 4 independently represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and the hydrocarbon group includes a halogen, an amino group, a hydroxyl group, and a carboxyl group.
  • X ⁇ may be a halogen ion, an ion of a compound containing a halogen, a hydroxide ion, a carboxylate ion, a nitrate ion, a nitrite ion, or a group selected from the group consisting of [1] represents any one selected from the group consisting of acetate ion, hydrogen carbonate ion, dihydrogen phosphate ion, hydrogen sulfate ion, hydrogen sulfide ion, hydrogen oxalate ion, cyanate ion, and thiocyanate ion, [1
  • each of R 1 to R 4 independently represents a hydrogen atom or an unsubstituted linear or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms
  • X ⁇ represents a halogen atom.
  • a method for measuring an analyte based on the production of hydrogen peroxide comprising the following steps: (A) a step of mixing a sample containing an analyte and catalase and a catalase inhibitor according to any one of [1] to [4], (B) oxidizing the analyte with a first enzyme to generate hydrogen peroxide; and (C) measuring the hydrogen peroxide; [6] The method for measuring an analyte according to [5], wherein the step (B) is performed after the step (A) or simultaneously with the step (A).
  • a method for measuring an analyte based on the production of hydrogen peroxide comprising the following steps: (A) mixing a sample containing an analyte and catalase and a catalase inhibitor according to any one of [1] to [4], (B-1) producing a substrate from the analyte by the second enzyme; (B-2) oxidizing the substrate with a first enzyme to generate hydrogen peroxide, and (C) measuring the hydrogen peroxide; [8] The steps are performed in the order of (b-1), (a), (b-2) and then (c), or after the step (b-1), the step (a) and (B-2) is performed at the same time, and then the step (c) is performed, or the steps (a) and (b-1) are performed at the same time, and then after the step (b-2), The method for measuring an analyte according to [7], wherein step (c) is performed, [9] The hydrogen peroxide according to any one of [5] to [8], wherein
  • Analyte measurement method [10] A measurement kit for measuring an analyte in a sample containing catalase, A first enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes the analyte to produce hydrogen peroxide; and The catalase inhibitor according to any one of [1] to [4], Including a measurement kit, [11] A measurement kit for measuring an analyte in a sample containing catalase, A first enzyme that catalyzes a reaction that oxidizes a substrate to produce hydrogen peroxide; [1] to [4] catalase inhibitor according to any one of the above, and A second enzyme that catalyzes a reaction to produce the substrate from the analyte; Including a measurement kit, [12] The kit according to [10] or [11], further comprising peroxidase, [13] A reagent for sample pretreatment for measurement by an electrochemical method, including the catalase inhibitor according to any one of [1] to [4], and [14] by oxid
  • the present application provides a more preferable catalase inhibitor and an analyte measurement method using the catalase inhibitor.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows an example of the measuring method of the analyte using the catalase inhibitor of this application.
  • “NaN 3” represents sodium azide
  • “AIP” represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • the current response to HbA1c concentration when 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate is added at 1750 ⁇ M or 3500 ⁇ M is shown.
  • AIP represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • the current response to the HbA1c concentration when 1750 ⁇ M or 250 ⁇ M 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate is added is shown.
  • AIP represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • Catalase inhibitor of the present application is represented by the following formula (I): [Where: R 1 to R 4 each independently represents a hydrogen atom, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms; X ⁇ represents an anionic species. ] (Hereinafter also referred to as compound (I)).
  • Halogen includes bromo, chloro, iodo, or fluoro.
  • the hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms includes a saturated or unsaturated linear, branched or cyclic hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms may have a substituent, such as at least one substituent selected from the group consisting of halogen, amino group, hydroxyl group and carboxyl group. Groups.
  • anionic chemical species include halogen ions, halogen-containing compounds ions, hydroxide ions, carboxylate ions, nitrate ions, nitrite ions, acetate ions, bicarbonate ions, dihydrogen phosphate ions, hydrogen sulfates.
  • examples thereof include ions, hydrogen sulfide ions, hydrogen oxalate ions, cyanate ions, and thiocyanate ions, and preferably include halogen ions or ions of compounds containing halogen.
  • the ion of the halogen-containing compound include hexafluorophosphate ion and perchlorate ion.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a carbon number that may have a substituent.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, a halogen, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or an optionally substituted carbon atom having 1 to
  • the hydrocarbon group may have at least one substituent selected from the group consisting of halogen, amino group, hydroxyl group and carboxyl group
  • X ⁇ represents a halogen ion.
  • the compound (I) is a compound wherein R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom, or a linear, branched or cyclic saturated or unsaturated group having 1 to 4 carbon atoms represents a hydrocarbon group, the hydrocarbon group, halogen, an amino group, may have at least one substituent selected from the group consisting of hydroxyl and carboxyl groups,
  • X - is a halogen ion, a halogen Ions of compounds containing hydroxide, hydroxide ion, carboxylate ion, nitrate ion, nitrite ion, acetate ion, bicarbonate ion, dihydrogen phosphate ion, hydrogen sulfate ion, hydrogen sulfide ion, hydrogen oxalate ion, cyanic acid
  • the compound represents any one selected from the group consisting of ions and thiocyanate ions.
  • the compound (I) is a compound of the formula: wherein R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom, or a straight or branched chain saturated or unsaturated carbon atom having 1 to 4 carbon atoms. Represents a hydrogen group, and the hydrocarbon group may have at least one substituent selected from the group consisting of a halogen, an amino group, a hydroxyl group and a carboxyl group, and X ⁇ represents a halogen ion or a halogen.
  • the compound (I) is a compound represented by the formula: wherein R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom or an unsubstituted straight-chain or branched-chain saturated or branched chain having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 1 to R 4 are each independently a hydrogen atom or an unsubstituted straight-chain or branched-chain saturated or branched chain having 1 to 4 carbon atoms.
  • a compound which represents an unsaturated hydrocarbon group, and X 2 ⁇ represents a halogen ion or an ion of a compound containing a halogen.
  • compound (I) has the following structural formula: In other words, 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • the catalase inhibitor of the present application may be compound (I) itself, or, in addition to compound (I), water, solvent, buffer solution, protein, polymer material, saccharide, salt, interface as necessary. Additional components that do not affect the catalase inhibitory action of compound (I), such as an activator, an oxidizing agent, and a reducing agent, may be included.
  • the catalase inhibitor of the present application can be used, for example, in an analyte measurement method based on the production of hydrogen peroxide. Accordingly, as a second aspect of the present invention, there is provided an analyte measurement method based on the production of hydrogen peroxide using the catalase inhibitor of the present application (hereinafter also referred to as “measurement method of the present application”).
  • analyte means a substance to be measured.
  • measurement includes both “quantitative” and “qualitative” measurements.
  • the measurement method of the present application is to oxidize a substrate contained in a sample with a first enzyme, measure hydrogen peroxide generated by the oxidation reaction, and thereby measure an analyte.
  • the oxidation reaction is performed in the presence of the catalase inhibitor of the present application.
  • the substrate may be the analyte itself or may be generated from the analyte via one or more enzymatic reactions (reactions with a second enzyme).
  • the amount of hydrogen peroxide produced is proportional to the amount of analyte contained in the sample. Therefore, based on the amount of hydrogen peroxide, the amount of analyte contained in the sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance.
  • the first enzyme is an enzyme that catalyzes a reaction in which a substrate is oxidized to generate hydrogen peroxide.
  • the first enzyme can be appropriately determined depending on the type of analyte to be measured.
  • An example of the first enzyme is oxidase. Examples of such oxidase include, but are not limited to, glucose oxidase (Glucose Oxidase, EC number; 1.1.3.4), hexose oxidase (Hexose Oxidase, EC number; 1.1.3.
  • N-acylhexosamine oxidase N-Acylhexosamine Oxidase, EC number; 1.1.3.29
  • polyvinyl alcohol oxidase Polyvinyl-Alcohol Oxidase, EC number; 1.1.3.30
  • D-arabinono-1,4-lactone oxidase D-Arabino-1, 4-Lactone Oxidase, EC number; 1.1.3.37)
  • L-glutamate Oxidase L-glutamate Oxidase, EC number; 1.4.3.11
  • cyclohexylamine oxidase Cyclohexylamine Oxidase, EC number; 4.3.12
  • protein-lysine-6-oxidase Protein-lysine 6-Oxidase, EC number; 1.4.3.13
  • L-lysine oxidase L-lysine Oxidase, EC number; 1.
  • N8-acetylspermidine oxidase (propane-1,3-diamine formation) (N (8) -acetylspermidine Oxidase (Propane-1,3-Diamine-Forming), EC number: 1 5.3.15), spermine oxidase (Spermine Oxidase, EC number; 1.5.316), non-specific polyamine oxidase (Non-Specific polyamine Oxidase, EC number; 1.5.17), L-Saccharopine Oxidase (L-Saccharopine Oxidase, EC No .; 1.5.3.18), 4-methylaminobutanoate oxidase (formaldehyde formation) (4-Methylaminobutanoate Oxidase (Fo rmaldehyde-Forming), EC number; 1.5.3.19), N-alkylglycine oxidase (N-Alkylycine Oxidase,
  • farnesylcysteine lyase (EC number; 1.8.3.6), 3-hydroxyanthranylate oxidase (3-hydroxyanthranylate oxidase, EC number; 1.10.3.5), xanthine oxidase (Xanthine) Oxidase, EC number; 1.17.3.2), 6-hydroxynicotinate dehydrogenase (EC number; 1.17.3.3), reticuline oxidase (Reticuline Oxidase, EC number; 1. 21.3.3).
  • the substrate of the first enzyme is not limited, but, for example, glucose, hexose, cholesterol, aromatic primary alcohol, primary alcohol, L-gulonolactone, galactose, pyranose, L-sorbose, pyridoxine, hydroxy acid, ecdysone, choline Secondary alcohol, 4-hydroxymandelic acid, glycerol-3-phosphate, thiamine, hydroxyphytanic acid, N-acetylglucosamine, polyvinyl alcohol, D-arabinono-1,4-lactone, vanillyl alcohol, nucleoside, D-mannitol, alditol, prosolanapyrone II, paromamine, 6-hydroxyneomycin C, aclacinomycin-N, 4-hydroxymandelic acid, 5-hydroxymethylfurfural, aldehyde, pyruvic acid, Acid, glyoxylic acid, pyridoxal, aromatic aldehyde, abscisic aldehyde,
  • the sample is a sample that contains an analyte and contains or may contain catalase.
  • the sample is referred to as “sample containing analyte and catalase”.
  • examples of the sample include, but are not limited to, blood samples such as whole blood, plasma, serum, blood cells, blood dilutions (eg, human-derived diluted blood samples), urine, spinal fluid, sweat, tears, Examples include biological samples such as saliva, skin, mucous membranes, hair, various foods or extracts thereof, and beverages such as alcohol and juice.
  • the biological sample is not limited to human origin.
  • the blood sample is preferably used after hemolysis. The hemolysis treatment may be performed by a conventional method.
  • the presence of catalase in the sample causes a decrease in measurement accuracy in the method for measuring an analyte based on the production of hydrogen peroxide as in the present application. That is, since the hydrogen peroxide produced by the reaction with the first enzyme is consumed by the catalase, even if the amount of hydrogen peroxide produced is measured, it is produced depending on the amount of the analyte due to the influence of the catalase. The amount of hydrogen peroxide cannot be measured accurately. Therefore, in the measurement method of the present application, the reaction by the first enzyme is performed in the presence of a catalase inhibitor. For example, the sample and the catalase inhibitor are mixed before or at the same time as the sample is treated with the first enzyme.
  • the catalase inhibitor used here is the catalase inhibitor of the present application.
  • the influence of catalase was suppressed by allowing sodium azide to coexist in the reaction vessel.
  • sodium azide is not suitable for a system using an electrochemical method.
  • the present inventors have found that sodium azide has a catalase inhibitory activity, but causes a decrease in measurement accuracy in an analyte measurement by an electrochemical method.
  • the decrease in measurement accuracy due to sodium azide was significantly affected as the amount of analyte to be measured decreased. This is probably because azide ions released by sodium azide in the solution are quickly adsorbed on the electrode, thereby reducing the catalytic activity of the electrode and suppressing the oxidation-reduction reaction of hydrogen peroxide.
  • the electrode catalyst is more effective than sodium azide.
  • the effect on activity is assumed to be mild. In fact, as shown in the examples described later, when the catalase inhibitor of the present application was used, a decrease in measurement accuracy as with sodium azide was not observed.
  • the catalase inhibitor of the present application is not limited to a technique for measuring hydrogen peroxide by an electrochemical method, but can also be used for a technique for measuring hydrogen peroxide by another method such as a colorimetric method or chemiluminescence method. Needless to say, you can.
  • the amount of the catalase inhibitor of the present application mixed with the sample is not particularly limited, and is appropriately determined according to the sample to be measured and measurement conditions.
  • the final concentration of compound (I) at the reaction is about 175 ⁇ M to about 4.5 mM, about 200 ⁇ M to about 4 mM, about 250 ⁇ M to about 4 mM, about 300 ⁇ M to about 3.5 mM, or about A range of 350 ⁇ M to about 3.5 mM is mentioned.
  • the measurement of hydrogen peroxide may be performed by any method known in the art. Although not limited, for example, a colorimetric method, a chemiluminescence method, or an electrochemical method can be employed.
  • hydrogen peroxide generated when a substrate is oxidized by a first enzyme is colored in the presence of peroxidase (Peroxidase, EC number: 1.11.1.1.7). React with reagents.
  • the coloring reagent is a substance that develops color by depriving of hydrogen by reaction with hydrogen peroxide promoted by peroxidase.
  • chromogenic reagents include, but are not limited to, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt, 10- (carboxymethyl Aminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, 3,3-diaminobenzidine, N, N-bis (2-hydroxy-3- Sulfopropyl) tolidine, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline 6-ammonium sulfonate), orthophenylenediamine, and phenolic compounds or aniline derivatives and 4-aminoantipyrine or 3-methyl 2-benzothiazolinone A combination with hydrazone is mentioned.
  • a dye corresponding to the amount of hydrogen peroxide can be generated by reaction with the coloring reagent. Therefore, the amount of hydrogen peroxide can be quantified by detecting the produced dye by measuring the absorbance at the wavelength corresponding to the coloring reagent. Since the amount of hydrogen peroxide has a correlation with the amount of analyte, the analyte can be quantified by measuring the amount of hydrogen peroxide.
  • the oxidation reaction by the first enzyme and the reaction by peroxidase are generally carried out in the same reaction tank.
  • luminescent reagent is a substance that emits light upon deprivation of hydrogen by reaction with hydrogen peroxide promoted by peroxidase.
  • luminescent reagents are well known in the art and include, but are not limited to, luminol, isoluminol, N- (4-aminobutyl) -N-ethylisoluminol, lucigenin, acridinium ester, etc.
  • a light amount corresponding to the amount of hydrogen peroxide can be generated by the reaction with the luminescent reagent. Therefore, the amount of hydrogen peroxide can be quantified by detecting the luminescence amount of the luminescent reagent. Since the amount of hydrogen peroxide has a correlation with the amount of analyte, the analyte can be quantified by measuring the amount of hydrogen peroxide.
  • the oxidation reaction by the first enzyme and the reaction by peroxidase are generally carried out in the same reaction tank.
  • the predetermined voltage refers to a potential at which hydrogen peroxide is oxidized or reduced.
  • the predetermined voltage can be appropriately set by those skilled in the art depending on various conditions such as electrode material and pH.
  • working electrode for example, platinum or palladium
  • counter electrode for example, platinum or palladium
  • reference electrode for example, silver / silver chloride (saturated potassium chloride) electrode
  • it varies depending on the electrode material, pH, etc.
  • a voltage of about 6 V is applied, hydrogen peroxide is oxidized.
  • the two-electrode system (working electrode, counter electrode), it varies considerably depending on conditions and cannot be generally stated. For example, it is possible to oxidize hydrogen peroxide by applying a voltage of about 0.2 V to 0.5 V. It is done.
  • an electrode pair including a working electrode and a counter electrode, or three electrodes including a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode are used, and the predetermined voltage is applied between the working electrode and the counter electrode, or the working electrode is applied.
  • a predetermined voltage with respect to the reference electrode is applied to the electrode to cause an oxidation-reduction reaction of hydrogen peroxide, and the current value or the amount of charge flowing to the working electrode is measured.
  • the first enzyme may be supported on the electrode. When the first enzyme is supported on the electrode, hydrogen peroxide is generated on the electrode by spotting the electrode and a mixture of the catalase inhibitor of the present application on the electrode or immersing the electrode in the mixture. .
  • the first enzyme and the catalase inhibitor of the present application may be supported on an electrode, and a sample may be spotted on the electrode, or the electrode may be immersed in the sample.
  • Electrochemical techniques for the determination of hydrogen peroxide and electrodes used in the techniques are well known in the art.
  • the method for supporting the enzyme or inhibitor on the electrode may be any method capable of supporting the desired enzyme or inhibitor on the electrode, and is not particularly limited. Methods known in the art can be used. For example, an ink jet method may be used.
  • An example of the measurement method of the present application is an analyte measurement method based on the generation of hydrogen peroxide, (A) a step of mixing a sample containing an analyte and catalase and a catalase inhibitor containing compound (I), (B) oxidizing the analyte with a first enzyme to generate hydrogen peroxide; and (C) measuring the hydrogen peroxide; It is a method including.
  • the analyte is a substrate for the first enzyme.
  • step (B) the first enzyme and the sample are mixed to oxidize the analyte to generate hydrogen peroxide.
  • the oxidation reaction conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art. Step (B) is performed after step (A) or simultaneously with step (A).
  • step (C) the hydrogen peroxide generated in step (B) is measured.
  • the amount of hydrogen peroxide generated in step (B) is measured.
  • Step (C) may be performed after steps (A) and (B), or may be performed simultaneously with step (B). For example, you may perform in order of a process (A), (B), and then (C), or you may perform a process (C) after performing a process (A) and (B) simultaneously. Alternatively, steps (B) and (C) may be performed simultaneously after step (A), or all steps (A) to (C) may be performed simultaneously. As an example of performing the steps (B) and (C) simultaneously after the step (A), after mixing the sample and the catalase inhibitor of the present application, the mixed solution is used for the measurement of the first enzyme and hydrogen peroxide.
  • reagent is added to a reaction vessel containing a reagent (eg, peroxidase, coloring reagent, luminescent reagent, etc.), or when the mixed solution is added onto an electrode carrying a first enzyme and applying a voltage.
  • a reagent eg, peroxidase, coloring reagent, luminescent reagent, etc.
  • Examples of simultaneously performing all steps (A) to (C) include a sample, a catalase inhibitor of the present application, a first enzyme, and a reagent for measuring hydrogen peroxide (for example, a peroxidase, a coloring reagent, a luminescent reagent, etc. )
  • a sample is added on the electrode to which the catalase inhibitor and the first enzyme of the present application are loaded and to which a voltage is applied.
  • the measurement system including the step (B) of generating hydrogen peroxide accompanying the oxidation of the analyte by the first enzyme and the step (C) of measuring the generated hydrogen peroxide is shown.
  • the measurement method is not limited to this measurement system, and includes a method for measuring an analyte via a plurality of enzyme reactions.
  • a measuring method of the present application through a plurality of enzyme reactions for example, a step of obtaining a product (substrate) by reacting an analyte with a second enzyme, and the above-mentioned product using the first enzyme (for example, an oxidase).
  • Examples thereof include a measurement system including a step of generating hydrogen peroxide by oxidizing (substrate) and a step of measuring the generated hydrogen peroxide.
  • a further example of the measurement method of the present application is an analyte measurement method based on the production of hydrogen peroxide, (A) mixing a sample containing an analyte and catalase with a catalase inhibitor containing compound (I); (B-1) producing a substrate from the analyte by the second enzyme; (B-2) oxidizing the substrate with a first enzyme to generate hydrogen peroxide, and (C) measuring the hydrogen peroxide; It is a method including.
  • the analyte is a substance that generates a substrate for the first enzyme by the catalytic action of the second enzyme.
  • the analyte include, but are not limited to, proteins such as glycated hemoglobin [eg, hemoglobin A1c (hereinafter abbreviated as “HbA1c”)], glycated albumin, and the like.
  • step (b-1) the second enzyme and the sample are mixed to produce a substrate for the first enzyme from the analyte contained in the sample.
  • the second enzyme is not particularly limited and can be appropriately determined depending on the type of analyte.
  • the second enzyme include degrading enzymes (for example, protease, peptidase, etc.) and the like.
  • the reaction conditions for the second enzyme are not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art. For example, the reaction may be performed in the presence of a substance that promotes the production of a substrate from the analyte.
  • the reaction for producing the substrate of the first enzyme from the analyte may be a one-step reaction or a multi-step reaction.
  • the second enzyme includes a plurality of enzymes.
  • step (b-2) the first enzyme and the sample are mixed, and the substrate contained in the sample is oxidized to generate hydrogen peroxide.
  • the substrate is produced by the step (b-1).
  • the oxidation reaction conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • step (c) the hydrogen peroxide generated in step (b-2) is measured.
  • the amount of hydrogen peroxide generated in step (b-2) is measured.
  • Step (b-1) may be performed before step (a) or may be performed simultaneously with step (a).
  • the step (b-1) is performed before the step (b-2) or simultaneously with the step (b-2).
  • Step (b-2) is performed after step (a) or simultaneously with step (a).
  • steps (a), (b-1), (b-2) and then (c) may be performed in this order, or the steps (b-1), (a), (b-2) and then (C) may be performed in this order, or after step (a), steps (b-1) and (b-2) may be performed simultaneously, and then step (c) may be performed, or step (a) ), Steps (b-1), (b-2) and (c) may be performed at the same time, or steps (a) and (b-2) are performed at the same time after step (b-1).
  • step (c) may be performed, or after step (b-1), steps (a), (b-2) and (c) may be performed simultaneously, or steps (a) and ( b-1) may be performed simultaneously, and then step (c-2) may be performed after step (b-2), or steps (a) and (b-1) may be performed simultaneously, and then step (b-2) And (c) may be performed simultaneously, Performs processes as (a) (b-1) and the (b-2) simultaneously, and then may be subjected to step (c), or the entire process of (a) ⁇ (c) may be carried out simultaneously.
  • Examples of simultaneously performing all steps (a) to (c) include a sample, a catalase inhibitor of the present application, a first enzyme, a second enzyme, and a reagent for measuring hydrogen peroxide (for example, peroxidase, coloring reagent, Or a luminescent reagent, etc.) in the same reaction vessel at the same time, or a case where a sample is added on an electrode to which a catalase inhibitor, the first enzyme and the second enzyme of the present application are loaded and a voltage is applied. It is done.
  • a sample is added on an electrode to which a catalase inhibitor, the first enzyme and the second enzyme of the present application are loaded and a voltage is applied. It is done.
  • HbA1c As an example of the measurement method of the present application through the multiple enzyme reaction as described above, measurement using HbA1c as an analyte will be specifically described.
  • a blood sample or a blood cell sample is used as a sample.
  • the sample and the catalase inhibitor of the present application are mixed.
  • fructosyl-valylhistidine (Fru-Val-His) as a glycated peptide is generated from HbA1c in the sample using a protease as the second enzyme.
  • step (b-2) hydrogen peroxide is generated by oxidizing the glycated peptide generated in step (b-1) with fructosyl peptide oxidase (FPOX) as the first enzyme.
  • step (c) the hydrogen peroxide generated in step (b-2) is measured.
  • the protease include metalloproteases (eg, thermolysin), cysteine proteases (eg, papain, caspase, etc.), serine proteases (eg, chymotrypsin, subtilisin, etc.), and the like.
  • step (b-1) may be performed in the presence of a substance that promotes the degradation of the analyte by protease.
  • Such substances include surfactants such as nonionic surfactants, anionic surfactants, and cationic surfactants, and tetrazolium compounds.
  • surfactants such as nonionic surfactants, anionic surfactants, and cationic surfactants, and tetrazolium compounds.
  • a protease that generates fructosyl-valine (Fru-Val) as a glycated amino acid from HbA1c is used as the second enzyme in step (b-1), and the fructosyl peptide is used as the first enzyme in step (b-2).
  • FEOX fructosyl amino acid oxidase
  • any method of colorimetric method, chemiluminescence method, or electrochemical method is used for the measurement of hydrogen peroxide. Even when used, the amount of hydrogen peroxide produced by the oxidation of the analyte or the amount of hydrogen peroxide produced by the oxidation of the substrate produced from the analyte can be accurately measured.
  • the present assay kits The measurement kit for measuring an analyte in a sample which contains catalase according to the third aspect of the present application (hereinafter, referred to as “the present assay kit") will be described.
  • the measurement kit of the present application is a measurement kit for measuring an analyte in a sample containing catalase, and is used for measuring the analyte based on the generation of hydrogen peroxide.
  • the “sample containing catalase” includes a sample containing catalase and a sample possibly containing catalase.
  • the first example of the measurement kit of the present application includes the first enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the analyte to generate hydrogen peroxide, and the catalase inhibitor of the present application.
  • the second example of the measurement kit of the present application is a reaction that generates a substrate of the first enzyme from the first enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing the substrate to generate hydrogen peroxide, the catalase inhibitor of the present application, and the analyte.
  • the analyte is a substrate for the first enzyme.
  • the analyte is a substance that generates a substrate for the first enzyme. Examples of the first enzyme and the second enzyme are as described above.
  • the measurement kit of the present application may further contain peroxidase.
  • the measurement kit of the present application containing peroxidase is used for measuring an analyte by measuring hydrogen peroxide, for example, by a colorimetric or chemiluminescent method.
  • sample pretreatment reagent of the present application a sample pretreatment reagent for measurement by an electrochemical method containing the compound (I) (hereinafter referred to as “the sample pretreatment of the present application”). (Also referred to as “reagent”).
  • the sample pretreatment reagent of the present application is used to treat a sample before measurement when an analyte in the sample containing catalase is measured by an electrochemical technique.
  • the sample pretreatment reagent of the present application is a method of measuring an analyte based on the production of hydrogen peroxide, and the sample is subjected to a pretreatment in order to be subjected to a method of measuring the hydrogen peroxide by an electrochemical technique. Used to process. In this case, hydrogen peroxide is generated by the oxidation of the analyte catalyzed by the first enzyme, and the first enzyme is supported on the electrode.
  • the sample pretreatment reagent of the present application is used for catalase inhibition of compound (I) such as water, solvent, buffer solution, protein, polymer material, saccharide, salt, surfactant, oxidizing agent, reducing agent, as necessary. It may contain additional components that do not affect the action.
  • compound (I) such as water, solvent, buffer solution, protein, polymer material, saccharide, salt, surfactant, oxidizing agent, reducing agent, as necessary. It may contain additional components that do not affect the action.
  • sample pretreatment kit of the present application Next, a sample pretreatment kit for measuring the analyte in the sample containing the catalase according to the fifth aspect of the present application by an electrochemical method (hereinafter referred to as “sample of the present application”). The pretreatment kit "is also described.
  • a kit containing the catalase inhibitor of the present application and a second enzyme is provided.
  • the second enzyme is an enzyme that catalyzes a reaction that generates a substrate of the first enzyme from the analyte in the sample. Examples of the first enzyme and the second enzyme are as described above.
  • the sample pretreatment kit of the present application is used for treating a sample before measurement when an analyte in the sample containing catalase is measured by an electrochemical technique.
  • the sample pretreatment kit of the present application is a method for measuring an analyte based on the generation of hydrogen peroxide, wherein the hydrogen peroxide is generated by oxidation of a substrate generated from the analyte, and the excess It is used to pre-treat the sample in order to be subjected to a method of measuring hydrogen oxide by electrochemical techniques.
  • the first enzyme is supported on the electrode used in the electrochemical method.
  • kits containing the first enzyme, the catalase inhibitor of the present application, and the second enzyme is provided as the sample pretreatment kit of the present application.
  • the first enzyme and the second enzyme are as described above.
  • the kit can be used when the first enzyme is not supported on the electrode used in the electrochemical method.
  • kits containing the first enzyme and the catalase inhibitor of the present application is provided as the sample pretreatment kit of the present application.
  • the first enzyme is as described above.
  • the kit can be used when hydrogen peroxide is generated by the oxidation of the analyte catalyzed by the first enzyme, and the first enzyme is not supported on the electrode used in the electrochemical method.
  • the sensor for measuring an analyte includes an electrode including a working electrode and a counter electrode, and the first enzyme and the catalase inhibitor of the present application are supported on the electrode.
  • the electrode may further carry a second enzyme. Examples of the first enzyme and the second enzyme are as described above.
  • the constituent material of the electrode is not particularly limited and may be any material usually used for electrochemical determination of hydrogen peroxide such as platinum, gold, silver, palladium, carbon, iridium, iridium oxide. .
  • platinum or palladium is used as the electrode material.
  • the sensor may further include a reference electrode.
  • the method for supporting the enzyme and the catalase inhibitor on the electrode may be any method capable of supporting the desired enzyme and the catalase inhibitor on the electrode, and is not particularly limited. Any method known in the art can be used. For example, an ink jet method may be used.
  • an HbA1c sensor in which fructosyl peptide oxidase or fructosyl amino acid oxidase instead of fructosyl peptide oxidase and a catalase inhibitor of the present application are supported on an electrode.
  • the HbA1c sensor may further carry a protease on the electrode.
  • Catalase inhibitory effect test (foaming test) (Method) 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate (0.001% (w / v)) or sodium azide (0.001% (w / v)) and protease (actinase E, 18000 U / v) mL), anionic surfactant (sodium N-dodecanoyl sarcosinate, 0.5% (w / v)), potassium glutamate (300 mM), Bistris buffer (10 mM, pH 6.5), and human blood ( 25 minutes after addition of blood, 1% (v / v) of hydrogen peroxide was added into the mixture, and foaming (oxygen generation) after hydrogen peroxide was added. In addition, the density
  • sodium azide 350 ⁇ M or 1750 ⁇ M
  • 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate 350 ⁇ M or 1750 ⁇ M
  • Fructosyl peptide oxidase (229 U / ml), carboxymethyl cellulose (0.125% (w / v)), potassium phosphate buffer (25 mM, pH 8), glutamic acid Potassium (10 mM) and trehalose (0.5% (w / v)) were supported.
  • the measurement solution is spotted on the sensor, 0.62 V is applied between the working electrode and the counter electrode for 1 second, quiescent for 15 seconds, 0.25 V is applied to the working electrode and the counter electrode, and the current value after 10 seconds. Was measured.
  • concentration of each component shows the final concentration in a measurement liquid.
  • FIG. 2 shows the current response to HbA1c concentration when 350 ⁇ M or 1750 ⁇ M of sodium azide or 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate was added, respectively.
  • Table 1 shows the formula of the linear approximation curve of each measurement result, and Table 2 shows the value obtained by dividing the slope of the linear approximation curve by the intercept.
  • “NaN 3 ” represents sodium azide
  • AIP represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • Electrochemical measurement test of HbA1c using catalase inhibitor 2 (Method) In the same manner as in Example 2, the current value with respect to the HbA1c concentration was measured. However, 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate (1750 ⁇ M or 3500 ⁇ M) was used as a catalase inhibitor.
  • FIG. 3 shows the current response to HbA1c concentration when 1750 ⁇ M or 3500 ⁇ M 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate is added.
  • Table 3 shows an equation of the linear approximation curve of each measurement result
  • Table 4 shows a value obtained by dividing the slope of the linear approximation curve by the intercept.
  • AIP represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • Electrochemical measurement test of HbA1c using catalase inhibitor 3 (Method) In the same manner as in Example 2, the current value with respect to the HbA1c concentration was measured. However, 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate (1750 ⁇ M or 250 ⁇ M) was used as a catalase inhibitor.
  • FIG. 4 shows the current response to HbA1c concentration when 1750 ⁇ M or 250 ⁇ M 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate is added.
  • Table 5 shows the linear approximation curve formula of each measurement result
  • Table 6 shows values obtained by dividing the slope of the linear approximation curve by the intercept.
  • AIP represents 2-azido-1,3-dimethylimidazolinium hexafluorophosphate.
  • the catalase inhibitor of the present application can be used in various analyte measurement methods based on the amount of hydrogen peroxide produced. For example, it can be used for blood glucose level measurement.

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Abstract

下記の式（Ｉ）：［式中、　Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素数１～４の炭化水素基を表し、　前記炭化水素基は、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、　Ｘ－は、陰イオン化学種を表す。］ で表される化合物を含む、カタラーゼ阻害剤が提供される。

Description

カタラーゼ阻害剤及びカタラーゼ阻害剤を用いるアナライトの測定方法
　本願は、カタラーゼ阻害剤、該阻害剤を用いるアナライトの測定方法、測定キット等に関する。
　酵素反応を利用したアナライトの測定方法において、酵素の触媒によりアナライトが反応し、生成した過酸化水素の量を測定することで、アナライトを定量的又は定性的に測定する技術がある。しかしながら、血液等を検体とした場合、血液に含まれるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＥＣ番号；１．１１．１．６）が、アナライトの測定に利用される過酸化水素を分解してしまうため、アジ化ナトリウムをカタラーゼ阻害剤として用いる技術が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。
特許第４４６２３９５号公報
　上記のような状況下、より好ましいカタラーゼ阻害剤が望まれていた。
　発明者らは、鋭意研究の結果、ある種のアジド化合物がカタラーゼ阻害作用を有することを見出した。よって、本願は下記の態様を提供する。
［１］下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、
　Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～４の炭化水素基を表し、
　Ｘ－は、陰イオン化学種を表す。］
で表される化合物を含む、カタラーゼ阻害剤、
［２］式中、Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、又は炭素数１～４の炭化水素基を表し、前記炭化水素基は、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、Ｘ－は、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つを表す、［１］記載のカタラーゼ阻害剤、
［３］式中、Ｒ１～Ｒ４が、各々独立して、水素原子、又は非置換の炭素数１～４の直鎖又は分枝鎖の飽和炭化水素基を表し、Ｘ－が、ハロゲンイオン、又はハロゲンを含む化合物のイオンを表す、［１］記載のカタラーゼ阻害剤、
［４］式（Ｉ）で表される化合物が２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートである、［１］記載のカタラーゼ阻害剤、
［５］過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、下記の工程を含む方法：
　（Ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
　（Ｂ）第１酵素により前記アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
　（Ｃ）前記過酸化水素を測定する工程、
［６］前記工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）の後、又は、前記工程（Ａ）と同時に行われる、［５］に記載のアナライトの測定方法、
［７］過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、下記の工程を含む方法：
　（ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
　（ｂ－１）第２酵素により前記アナライトから基質を生成させる工程、
　（ｂ－２）第１酵素により前記基質を酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
　（ｃ）前記過酸化水素を測定する工程、
［８］前記工程が（ｂ－１）、（ａ）、（ｂ－２）、次いで（ｃ）の順で行われるか、又は前記工程（ｂ－１）の後、前記工程（ａ）と（ｂ－２）が同時に行われ、次いで前記工程（ｃ）が行われるか、又は前記工程（ａ）と（ｂ－１）が同時に行われ、次いで前記工程（ｂ－２）の後、前記工程（ｃ）が行われる、［７］に記載のアナライトの測定方法、
［９］前記工程（Ｃ）又は（ｃ）において、前記過酸化水素は、比色法、化学発光法又は電気化学的手法により測定される、［５］～［８］のいずれかに記載のアナライトの測定方法、
［１０］カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定する測定キットであって、
　前記アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、及び、
　［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤、
を含む、測定キット、
［１１］カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定する測定キットであって、
　基質を酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、
　［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤、及び、
　前記アナライトから前記基質を生成させる反応を触媒する第２酵素、
を含む、測定キット、
［１２］ペルオキシダーゼをさらに含む、［１０］又は［１１］に記載のキット、
［１３］［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤を含む、電気化学的手法による測定のための試料前処理用試薬、及び
［１４］第１酵素での基質の酸化による過酸化水素の生成に基づいて、カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを電気化学的手法により測定するための、試料前処理用キットであって、
　［１］～［４］のいずれかに記載のカタラーゼ阻害剤、及び、
　前記アナライトから前記基質を生成させる反応を触媒する第２酵素、
を含む、キット、
［１５］第１酵素が酸化酵素であり、第２酵素が分解酵素である、［５］～［１２］及び［１４］のいずれかに記載の測定方法又はキット。
　本願により、より好ましいカタラーゼ阻害剤、及び該カタラーゼ阻害剤を用いるアナライトの測定方法が提供される。
本願のカタラーゼ阻害剤を用いるアナライトの測定方法の一例を示す模式図である。 アジ化ナトリウム又は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートをそれぞれ３５０μＭ、１７５０μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。図中、「ＮａＮ３」はアジ化ナトリウムを示し、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。 ２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを１７５０μＭ又は３５００μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。図中、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。 ２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを１７５０μＭ又は２５０μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。図中、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。
　以下、本実施形態を詳細に説明する。実施形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施形態に記述される全ての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
１．本願のカタラーゼ阻害剤
　本願の第一の態様に係るカタラーゼ阻害剤（以下、「本願のカタラーゼ阻害剤」ともいう）は、下記の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、
　Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～４の炭化水素基を表し、
　Ｘ－は、陰イオン化学種を表す。］
で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）ともいう）を含む。
　ハロゲンとしては、ブロモ、クロロ、ヨード、又はフルオロが挙げられる。
　炭素数１～４の炭化水素基は、１～４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和の、直鎖、分枝鎖又は環状の炭化水素基を包含する。炭素数１～４の炭化水素基は、置換基を有していてもよく、該置換基としては、例えば、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基が挙げられる。
　陰イオン化学種としては、例えば、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、又はチオシアン酸イオン等が挙げられ、好ましくは、ハロゲンイオン又はハロゲンを含む化合物のイオンが挙げられる。ハロゲンを含む化合物のイオンとしては、例えば、ヘキサフルオロリン酸イオン又は過塩素酸イオンが挙げられる。
　一具体例において、化合物（Ｉ）は、式中、Ｒ１及びＲ２が、各々独立して、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～４の炭化水素基を表し、Ｒ３及びＲ４が、各々独立して、水素原子、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～４の炭化水素基を表し、前記炭化水素基が、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、Ｘ－が、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つを表す、化合物である。
　別の具体例において、化合物（Ｉ）は、式中、Ｒ１～Ｒ４が、各々独立して、水素原子、又は炭素数１～４の直鎖、分枝鎖又は環状の飽和又は不飽和炭化水素基を表し、前記炭化水素基が、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、Ｘ－が、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つを表す、化合物である。
　また別の具体例において、化合物（Ｉ）は、式中、Ｒ１～Ｒ４が、各々独立して、水素原子、又は炭素数１～４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和炭化水素基を表し、前記炭化水素基が、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、Ｘ－が、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つを表す、化合物である。
　また別の具体例において、化合物（Ｉ）は、式中、Ｒ１～Ｒ４が、各々独立して、水素原子、又は非置換の炭素数１～４の直鎖又は分枝鎖の飽和又は不飽和炭化水素基を表し、Ｘ－が、ハロゲンイオン、又はハロゲンを含む化合物のイオンを表す、化合物である。
　さらなる具体例において、化合物（Ｉ）は、下記の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される化合物、すなわち、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートである。
　本願のカタラーゼ阻害剤は、化合物（Ｉ）そのものであってもよく、または化合物（Ｉ）の他に、必要に応じて、水、溶媒、緩衝液、タンパク質、高分子材料、糖類、塩類、界面活性剤、酸化剤、還元剤等の、化合物（Ｉ）のカタラーゼ阻害作用に影響を与えない付加的成分を含んでいてもよい。
２．本願の測定方法
　本願のカタラーゼ阻害剤は、例えば、過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法に用いることができる。したがって、本願発明の第二の態様として、本願のカタラーゼ阻害剤を用いる過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法（以下、「本願の測定方法」ともいう）が提供される。
　本願明細書において「アナライト」とは、測定対象物質を意味する。
　本願明細書において、「測定」とは、「定量」及び「定性」のいずれの測定をも含む。
　本願の測定方法は、第１酵素により試料に含有される基質を酸化させ、該酸化反応により生成した過酸化水素を測定し、それによりアナライトを測定するものである。前記酸化反応は、本願のカタラーゼ阻害剤の存在下で行われる。前記基質は、アナライトそのものであってもよく、または１以上の酵素反応（第２酵素による反応）を介してアナライトから生成されてもよい。本願の測定方法において、過酸化水素の生成量は、試料に含有されるアナライトの量に比例する。したがって、過酸化水素の量に基づいて、予め作成した検量線を用いて、試料に含有されるアナライトの量を算出することができる。
　第１酵素は、基質を酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素である。第１酵素は、測定したいアナライトの種類によって適宜決定することができる。第１酵素の例として、酸化酵素（オキシダーゼ）が挙げられる。このような酸化酵素の例としては、限定するものではないが、グルコースオキシダーゼ(Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４)、ヘキソースオキシダーゼ(Ｈｅｘｏｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．５)、コレステロールオキシダーゼ(Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．６)、アリールアルコールオキシダーゼ(Ａｒｙｌ－ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．７)、Ｌ－グロノラクトンオキシダーゼ(Ｌ－ｇｕｌｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．８)、ガラクトースオキシダーゼ(Ｇａｌａｃｔｏｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．９)、ピラノースオキシダーゼ(Ｐｙｒａｎｏｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１０)、Ｌ－ソルボースオキシダーゼ(Ｌ－ｓｏｒｂｏｓｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１１)、ピリドキシン－４－オキシダーゼ(Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ　４－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号)、アルコールオキシダーゼ(Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１３)、(Ｓ)－２－ヒドロキシ酸オキシダーゼ（(Ｓ)－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１５)、エクジソンオキシダーゼ(Ｅｃｄｙｓｏｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１６)、コリンオキシダーゼ(Ｃｈｏｌｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１７)、第２級アルコールオキシダーゼ(Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ－Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１８)、４－ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ(４－ｈｙｄｒｏｘｙｍａｎｄｅｌａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．１９)、長鎖アルコールオキシダーゼ(Ｌｏｎｇ－Ｃｈａｉｎ－Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．２０)、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ(Ｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．２１)、チアミンオキシダーゼ(Ｔｈｉａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．２３)、ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ(Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｙｔａｎａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．２７)、Ｎ－アシルヘキソサミンオキシダーゼ(Ｎ－Ａｃｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．２９)、ポリビニルアルコールオキシダーゼ(Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ－Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．３０)、Ｄ－アラビノノ－１，４－ラクトンオキシダーゼ(Ｄ－Ａｒａｂｉｎｏｎｏ－１、４－Ｌａｃｔｏｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．３７)、バニリルアルコールオキシダーゼ -(Ｖａｎｉｌｌｙｌ－Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．３８)、ヌクレオシドオキシダーゼ(Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．３９)、Ｄ－マンニトールオキシダーゼ(Ｄ－ｍａｎｎｉｔｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４０)、アルジトールオキシダーゼ(Ａｌｄｉｔｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４１)、プロソラナピロンＩＩオキシダーゼ(Ｐｒｏｓｏｌａｎａｐｙｒｏｎｅ－ＩＩ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４２)、パロマミン　６’－オキシダーゼ(Ｐａｒｏｍａｍｉｎｅ　６’－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４３)、６－ヒドロキシネオマイシンＣオキシダーゼ(６’’’－Ｈｙｄｒｏｘｙｎｅｏｍｙｃｉｎ　Ｃ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４４)、アクラシノマイシン－Ｎ　オキシダーゼ(Ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ－Ｎ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４５)、４－ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ(４－Ｈｙｄｒｏｘｙｍａｎｄｅｌａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４６)、５－ヒドロキシメチルフルフラールオキシダーゼ(５－(Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ)Ｆｕｒｆｕｒａｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１．３．４７)、アルデヒドオキシダーゼ(Ａｌｄｅｈｙｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．１)、ピルビン酸オキシダーゼ(Ｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．３)、シュウ酸オキシダーゼ(Ｏｘａｌａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．４)、グリオキシル酸オキシダーゼ(Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．５)、ピルビン酸オキシダーゼ (ＣｏＡ－アセチル化)(Ｐｙｒｕｖａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ(ＣｏＡ－ａｃｅｔｙｌａｔｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．２．３．６)、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ(Ｉｎｄｏｌｅ－３－Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．７)、ピリドキサールオキシダーゼ(Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．８)、アリールアルデヒドオキシダーゼ(Ａｒｙｌ－Ａｌｄｅｈｙｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．９)、アブシシンアルデヒドオキシダーゼ(Ａｂｓｃｉｓｉｃ－Ａｌｄｅｈｙｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２．３．１４)、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．４)、アシルＣｏＡオキシダーゼ(Ａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．６)、ジヒドロウラシルオキシダーゼ(Ｄｉｈｙｄｒｏｕｒａｃｉｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．７)、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ(Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｒｂｅｒｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．８)、トリプトファンα，β－オキシダーゼ(Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　Ａｌｐｈａ，Ｂｅｔａ－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．１０)、Ｌ－ガラクトノラクトンオキシダーゼ(Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．１２)、アルボノウルシンシンターゼ(Ａｌｂｏｎｏｕｒｓｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．１３)、アクラシノマイシン－Ａ　オキシダーゼ(Ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ－Ａ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．３．３．１４)、Ｄ－アスパラギン酸オキシダーゼ(Ｄ－Ａｓｐａｒｔａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１)、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ(Ｌ－ａｍｉｎｏ-ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．２)、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ(Ｄ－Ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．３)、モノアミンオキシダーゼ(Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．４)、ピリドキサール－５’－リン酸シンターゼ(Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　５’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．５)、Ｄ－グルタミン酸オキシダーゼ(Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．７)、エタノールアミンオキシダーゼ(Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．８)、プトレシンオキシダーゼ(Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１０)、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ(Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１１)、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ(Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１２)、タンパク質－リシン－６－オキシダーゼ(Ｐｒｏｔｅｉｎ-ｌｙｓｉｎｅ　６－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１３)、Ｌ－リシンオキシダーゼ(Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１４)、Ｄ－グルタミン酸(Ｄ－アスパラギン酸)オキシダーゼ(Ｄ－Ｇｌｕｔａｍａｔｅ(Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ)　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１５)、Ｌ－アスパラギン酸オキシダーゼ(Ｌ－ａｓｐａｒｔａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１６)、グリシンオキシダーゼ(Ｇｌｙｃｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．１９)、Ｌ－リシン－６－オキシダーゼ(Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ　６－Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．２０)、一級アミンオキシダーゼ(Ｐｒｉｍａｒｙ－Ａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．２１)、ジアミンオキシダーゼ(Ｄｉａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．２２)、７－クロロ－Ｌ－トリプトファンオキシダーゼ(７－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｌ－Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．４．３．２３)、サルコシンオキシダーゼ(Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１)、Ｎ－メチル－Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ(Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｌ―Ａｍｉｎｏ－Ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．２)、(Ｓ）－６－ヒドロキシニコチンオキシダーゼ（(Ｓ）－６－Ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｃｏｔｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．５)、（Ｒ）－６－ヒドロキシニコチンオキシダーゼ(（Ｒ）－６－Ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｃｏｔｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．６)、Ｌ－ピペコリン酸オキシダーゼ(Ｌ－Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．７)、ジメチルグリシンオキシダーゼ(Ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１０)、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ(Ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１２)、Ｎ１－アセチルポリアミンオキシダーゼ(Ｎ（１）－Ａｃｅｔｙｌｐｏｌｙａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１３)、ポリアミンオキシダーゼ (プロパン－１，３-ジアミン形成)(Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－Ｄｉａｍｉｎｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．５．３．１４)、Ｎ８－アセチルスペルミジンオキシダーゼ(プロパン－１，３-ジアミン形成)(Ｎ（８）－Ａｃｅｔｙｌｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｐｒｏｐａｎｅ－１，３－Ｄｉａｍｉｎｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．５．３．１５)、スペルミンオキシダーゼ(Ｓｐｅｒｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１６)、非特異的ポリアミンオキシダーゼ(Ｎｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ 、ＥＣ番号；１．５．３．１７)、Ｌ－サッカロピンオキシダーゼ(Ｌ－Ｓａｃｃｈａｒｏｐｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．１８)、４－メチルアミノブタノアートオキシダーゼ(ホルムアルデヒド形成）(４－Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．５．３．１９)、Ｎ－アルキルグリシンオキシダーゼ(Ｎ－Ａｌｋｙｌｇｌｙｃｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３．２０)、４－メチルアミノブタノアートオキシダーゼ(メチルアミン形成)(４－Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ(ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．５．３．２１)、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ　Ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３)、フルクトシルペプチドオキシダーゼ(Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．５．３)、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ(過酸化水素形成）(ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｈ２Ｏ２－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．６．３．１)、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ(水形成)(ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｈ２Ｏ－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．６．３．２)、ＮＡＤＨオキシダーゼ(過酸化水素形成)(ＮＡＤＨ　Ｏｘｉｄａｓｅ(Ｈ２Ｏ２－Ｆｏｒｍｉｎｇ)、ＥＣ番号；１．６．３．３)、ＮＡＤＨオキシダーゼ(水形成)(ＮＡＤＨ　ＯｘｉｄａｓｅＨ２Ｏ－Ｆｏｒｍｉｎｇ、ＥＣ番号；１．６．３．４)、ニトロアルカンオキシダーゼ(Ｎｉｔｒｏａｌｋａｎｅ　Ｏｘｉｄ
ａｓｅ、ＥＣ番号；１．７．３．１)、尿酸オキシダーゼ(Ｕｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．７．３．３)、３－ａｃｉ－ニトロプロパンオキシダーゼ(３－ａｃｉ－Ｎｉｔｒｏｐｒｏｐａｎｏａｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．７．３．５)、亜硫酸オキシダーゼ(Ｓｕｌｆｉｔｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．１)、チオールオキシダーゼ(Ｔｈｉｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．２)、グルタチオンオキシダーゼ(Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．３)、メタンチオールオキシダーゼ(Ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．４)、プレニルシステインオキシダーゼ(Ｐｒｅｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．５)、ファルネシルシステインリアーゼ(Ｆａｒｎｅｓｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｌｙａｓｅ、ＥＣ番号；１．８．３．６)、３－ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ(３－Ｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１０．３．５)、キサンチンオキシダーゼ(Ｘａｎｔｈｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．１７．３．２)、６－ヒドロキシニコチン酸デヒドロゲナーゼ(６－Ｈｙｄｒｏｘｙｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ、ＥＣ番号；１．１７．３．３)、レチクリンオキシダーゼ(Ｒｅｔｉｃｕｌｉｎｅ　Ｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号；１．２１．３．３)等が挙げられる。
　第１酵素の基質は、限定するものではないが、例えば、グルコース、ヘキソース、コレステロール、芳香族一級アルコール、一級アルコール、Ｌ－グロノラクトン、ガラクトース、ピラノース、Ｌ－ソルボース、ピリドキシン、ヒドロキシ酸、エクジソン、コリン、第二級アルコール、４－ヒドロキシマンデル酸、グリセロール－３－リン酸、チアミン、ヒドロキシフィタン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、ポリビニルアルコール、Ｄ－アラビノノ－１，４－ラクトン、バニリルアルコール、ヌクレオシド、Ｄ－マンニトール、アルジトール、プロソラナピロンＩＩ、パロマミン、６－ヒドロキシネオマイシンＣ、アクラシノマイシン－Ｎ、４－ヒドロキシマンデル酸、５－ヒドロキシメチルフルフラール、アルデヒド、ピルビン酸、シュウ酸、グリオキシル酸、ピリドキサール、芳香族アルデヒド、アブシシンアルデヒド、プロトポルフィリノーゲン、アシルＣｏＡ、ジヒドロウラシル、テトラヒドロベルベリン、トリプトファン、Ｌ－ガラクトノラクトン、アクラシノマイシン－Ａ、Ｄ－アスパラギン酸、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、モノアミン、ピリドキサミン－５’－リン酸、Ｄ－グルタミン酸、エタノールアミン、プトレシン、Ｌ－グルタミン酸、シクロヘキシルアミン、ペプチジル－Ｌ－リシルペプチド、Ｌ－リシン、Ｌ－アスパラギン酸、グリシン、一級アミン、ジアミン、７－クロロ－Ｌ－トリプトファン、サルコシン、Ｎ－メチル－Ｌ－アミノ酸、ヒドロキシニコチン、Ｌ－ピペコリン酸、ジメチルグリシン、ジヒドロサンギナリン、ジヒドロケリルビン、ジヒドロマカルピン、Ｎ１－アセチルスペルミジン、Ｎ１－アセチルスペルミン、スペルミジン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、スペルミン、Ｌ－サッカロピン、４－メチルアミノブタノアート、Ｎ－アルキルグリシン、フルクトシルアミノ酸、フルクトシルペプチド、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＮＡＤＨ、ニトロアルカン、尿酸、３－ａｃｉ－ニトロプロパン酸、亜硫酸、チオール、グルタチオン、メタンチオール、プレニルシステイン、ファルネシルシステイン、３－ヒドロキシアントラニル酸、キサンチン、６－ヒドロキシニコチン酸、レチクリン、等が挙げられる。
　試料は、アナライトを含み、かつ、カタラーゼを含むか又はカタラーゼを含む可能性のある試料である。本願明細書では、前記試料を「アナライト及びカタラーゼが含まれる試料」と称する。前記試料の例として、限定するものではないが、全血、血漿、血清、血球、血液希釈物等の血液試料（例えば、ヒト由来の希釈血液試料）、尿、髄液、汗、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料、各種食品又はその抽出液、アルコール及びジュース等の飲料、等が挙げられる。また、生体試料はヒト由来に限らない。血液試料は、好ましくは溶血処理して用いる。溶血処理は常法により行えばよい。
　カタラーゼは過酸化水素を分解するので、試料中のカタラーゼの存在は、本願のような過酸化水素の生成に基づいてアナライトを測定する方法において、測定精度の低下をもたらす。すなわち、第１酵素による反応で生成した過酸化水素がカタラーゼにより消費されてしまうため、過酸化水素の生成量を測定しようにも、カタラーゼの影響により、アナライトの量に依存して生成された正確な過酸化水素の量を測定できない。そこで、本願の測定方法では、第１酵素による反応をカタラーゼ阻害剤の存在下で行う。例えば、試料を第１酵素で処理する前に、又は第１酵素で処理するのと同時に、試料とカタラーゼ阻害剤を混合する。ここで使用されるカタラーゼ阻害剤は、本願のカタラーゼ阻害剤である。
　従来技術では、アジ化ナトリウムを反応槽中に共存させることによりカタラーゼによる影響を抑制した。しかしながら、本願発明者らが酸化酵素による反応で生成された過酸化水素を測定する技術を鋭意検討した結果、アジ化ナトリウムは電気化学的手法を用いる系では好適ではないことが分かった。具体的には、本発明者らは、アジ化ナトリウムは、カタラーゼ阻害活性を有するものの、電気化学的手法によるアナライト測定において測定精度の低下を引き起こすことを見出した。アジ化ナトリウムによる測定精度の低下は、測定するアナライトの量が少なくなればなるほど顕著に影響が出た。これは恐らく、アジ化ナトリウムが溶液中で放出するアジ化物イオンが速やかに電極に吸着することにより、電極の触媒活性を低下させ、過酸化水素の酸化還元反応を抑制するためと考えられる。
　一方、本願のカタラーゼ阻害剤に含まれる化合物（Ｉ）は、アジド基が共有結合しているため、溶液中で速やかにアジ化物イオンを放出することがないので、アジ化ナトリウムよりも電極の触媒活性への影響が穏和であると推察される。実際、後述する実施例で示すように、本願のカタラーゼ阻害剤を使用した場合は、アジ化ナトリウムを使用したときのような測定精度の低下は見られなかった。なお、本願のカタラーゼ阻害剤は、過酸化水素を電気化学的手法により測定する技術に限定されず、過酸化水素を比色法や化学発光法等の他の方法により測定する技術にも用いることができることは言うまでもない。
　本願の測定方法において、試料と混合される本願のカタラーゼ阻害剤の量は、特に限定されず、測定する試料や測定条件に応じて適宜決定される。限定するものではないが、例えば、化合物（Ｉ）の反応時終濃度として、約１７５μＭ～約４．５ｍＭ、約２００μＭ～約４ｍＭ、約２５０μＭ～約４ｍＭ、約３００μＭ～約３．５ｍＭ、又は約３５０μＭ～約３．５ｍＭの範囲が挙げられる。
　本願の測定方法において、過酸化水素の測定は、当該分野で既知のいずれの方法によって行ってもよい。限定するものではないが、例えば、比色法、化学発光法、又は電気化学的手法を採用することができる。
　比色法による測定方法の例では、第１酵素により基質が酸化されることに伴い生成される過酸化水素を、ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号：１．１１．１．７）の存在下で発色試薬と反応させる。発色試薬は、ペルオキシダーゼにより促進される過酸化水素との反応で水素が奪われて発色する物質である。発色試薬の例は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩、１０－(カルボキシメチルアミノカルボニル)－３，７－ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジンナトリウム塩、３,３',５,５'－テトラメチルベンジジン、３，３－ジアミノベンジジン、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）トリジン、２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン６－スルホン酸アンモニウム）、オルトフェニレンジアミン、及びフェノール性化合物又はアニリン誘導体と４－アミノアンチピリン又は３－メチル２－ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとの組み合わせ等が挙げられる。発色試薬との反応により、過酸化水素の量に応じた色素を生成させることができる。したがって、発色試薬に対応する波長における吸光度の測定等によって、生成した色素を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。そして、過酸化水素の量はアナライトの量と相関があるため、過酸化水素の量を測定することで、アナライトを定量することができる。この種の測定法では、一般的には、第１酵素による酸化反応とペルオキシダーゼによる反応を同一反応槽で実施する。
　化学発光による測定方法の例では、第１酵素により基質が酸化されることに伴い生成される過酸化水素を、ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ番号：１．１１．１．７）の存在下で発光試薬と反応させる。発光試薬は、ペルオキシダーゼにより促進される過酸化水素との反応で水素が奪われて発光する物質である。発光試薬の例は、当該分野でよく知られており、限定するものではないが、ルミノール、イソルミノール、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、等が挙げられる。発光試薬との反応により、過酸化水素の量に応じた光量を生成させることができる。したがって、発光試薬の発光量を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。そして、過酸化水素の量はアナライトの量と相関があるため、過酸化水素の量を測定することで、アナライトを定量することができる。この種の測定法では、一般的には、第１酵素による酸化反応とペルオキシダーゼによる反応を同一反応槽で実施する。
　電気化学的手法による測定方法の例では、第１酵素により基質が酸化されることに伴い生成される過酸化水素に、所定の電圧を印加すると、過酸化水素の量に応じた電流値が検出される。したがって、この電流値を検出することで、過酸化水素の量を定量することができる。そして、過酸化水素の量はアナライトの量と相関があるため、過酸化水素の量を測定することで、アナライトを定量することができる。ここで、「所定の電圧」とは、過酸化水素が酸化、もしくは還元する電位をいう。所定の電圧は、電極材料やｐＨなどの種々の条件により、当業者が適宜設定することができる。例えば、３電極方式（作用極（例えば、白金又はパラジウム）、対極、参照極（例えば、銀／塩化銀（飽和塩化カリウム）電極））の場合、電極材料やｐＨなどによって異なるが、大抵、０．６Ｖ程度の電圧を印加すれば、過酸化水素は酸化する。２電極方式（作用極、対極）の場合は、条件によってかなり異なり、一概には言えないが、例えば、０．２Ｖ～０．５Ｖ程度の電圧を印加して過酸化水素を酸化させることが挙げられる。
　電気化学的手法では、例えば、作用極及び対極を含む電極対、もしくは作用極、対極及び参照極の３電極が使用され、作用極と対極との間に前記の所定の電圧を印加、もしくは作用極に参照極に対する所定の電圧を印加して、過酸化水素の酸化還元反応を生じさせ、作用極に流れる電流値もしくは電荷量を測定する。電極には、例えば、第１酵素を担持させてもよい。電極に第１酵素を担持する場合、試料と本願のカタラーゼ阻害剤の混合液を該電極に点着又は該電極を該混合液に浸漬させることにより、該電極上で過酸化水素が生成される。また、第１酵素及び本願のカタラーゼ阻害剤を電極に担持させて、該電極に試料を点着又は該電極を試料に浸漬してもよい。過酸化水素の定量のための電気化学的手法及び該手法に用いられる電極については、当該分野においてよく知られている。また、前記酵素や阻害剤を電極上に担持させる方法も、所望の酵素または阻害剤を電極上に担持させることが可能ないずれの方法であってもよく、特に限定されない。当該分野において知られた方法を用いることができる。例えば、インクジェット方式を用いてもよい。
　以下、本願の測定方法の具体例を挙げて説明する。
　本願の測定方法の一例は、過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、
（Ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、化合物（Ｉ）を含むカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
（Ｂ）第１酵素により前記アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
（Ｃ）前記過酸化水素を測定する工程、
を含む方法である。該測定方法において、アナライトは、第１酵素の基質である。
　工程（Ｂ）では、第１酵素と試料を混合して、アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる。ここで、酸化反応条件は特に限定されず、当業者であれば適宜決定することができる。工程（Ｂ）は、工程（Ａ）の後で行うか、又は工程（Ａ）と同時に行う。
　工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）で生成した過酸化水素を測定する。例えば、工程（Ｂ）で生成した過酸化水素の量を測定する。
　工程（Ｃ）は、工程（Ａ）及び（Ｂ）の後に行ってもよいし、又は工程（Ｂ）と同時に行ってもよい。例えば、工程（Ａ）、（Ｂ）、次いで（Ｃ）の順で行ってもよく、又は工程（Ａ）及び（Ｂ）を同時に行った後、工程（Ｃ）を行ってもよい。あるいは、工程（Ａ）の後、工程（Ｂ）及び（Ｃ）を同時に行ってもよく、又は全工程（Ａ）～（Ｃ）を同時に行ってもよい。工程（Ａ）の後、工程（Ｂ）及び（Ｃ）を同時に行う例としては、試料と本願のカタラーゼ阻害剤を混合した後、該混合液を、第１酵素及び過酸化水素の測定のための試薬（例えば、ペルオキシダーゼ、発色試薬、又は発光試薬等）を含む反応槽に投入する場合、又は、第１酵素を担持した、電圧を印加した電極上に、前記混合液を添加する場合等が挙げられる。全工程（Ａ）～（Ｃ）を同時に行う例としては、試料、本願のカタラーゼ阻害剤、第１酵素、及び過酸化水素の測定のための試薬（例えば、ペルオキシダーゼ、発色試薬、又は発光試薬等）を同時に同一反応槽に投入する場合、又は、本願のカタラーゼ阻害剤及び第１酵素を担持した、電圧を印加した電極上に、試料を添加する場合等が挙げられる。
　上述の例では、第１酵素によるアナライトの酸化に伴い過酸化水素を生成させる工程（Ｂ）と、生成した過酸化水素を測定する工程（Ｃ）を含む測定系を示したが、本願の測定方法は、この測定系に限定されるものではなく、複数酵素反応を介したアナライトの測定方法も包含する。複数酵素反応を介した本願の測定方法としては、例えば、第２酵素によりアナライトを反応させて生成物（基質）を得る工程と、上述の第１酵素（例えば、酸化酵素）によりこの生成物（基質）を酸化させることで過酸化水素を生成させる工程と、生成した過酸化水素を測定する工程を含む測定系が挙げられる。
　したがって、本願の測定方法のさらなる例は、過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、
（ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、化合物（Ｉ）を含むカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
（ｂ－１）第２酵素により前記アナライトから基質を生成させる工程、
（ｂ－２）第１酵素により前記基質を酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
（ｃ）前記過酸化水素を測定する工程、
を含む方法である。
　該測定方法において、アナライトは、第２酵素の触媒作用により第１酵素の基質を生成する物質である。該アナライトの例として、限定するものではないが、タンパク質、例えば、糖化ヘモグロビン［例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」と略す）］、糖化アルブミン等が挙げられる。
　工程（ｂ－１）では、第２酵素と試料を混合して、試料中に含まれるアナライトから第１酵素の基質を生成させる。第２酵素は、特に限定されず、アナライトの種類によって適宜決定することができる。第２酵素の例としては、分解酵素（例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ等）等が挙げられる。第２酵素による反応条件は、特に限定されず、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、アナライトからの基質の生成を促進させる物質の共存下で反応させてもよい。
　工程（ｂ－１）における、アナライトから第１酵素の基質を生成する反応は、一段階の反応であってもよく、または多段階の反応であってもよい。多段階の反応によってアナライトから第１酵素の基質が生成される場合、前記第２酵素には複数の酵素が含まれる。
　工程（ｂ－２）では、第１酵素と試料を混合して、試料中に含まれる基質を酸化させて過酸化水素を生成させる。前記基質は、工程（ｂ－１）により生成されたものである。ここで、酸化反応条件は特に限定されず、当業者であれば適宜決定することができる。
　工程（ｃ）では、工程（ｂ－２）で生成した過酸化水素を測定する。例えば、工程（ｂ－２）で生成した過酸化水素の量を測定する。
　工程（ｂ－１）は、工程（ａ）の前に行ってもよいし、又は工程（ａ）と同時に行ってもよい。また、工程（ｂ－１）は、工程（ｂ－２）の前に行うか、又は工程（ｂ－２）と同時に行う。工程（ｂ－２）は、工程（ａ）の後で行うか、又は工程（ａ）と同時に行う。例えば、工程（ａ）、（ｂ－１）、（ｂ－２）、次いで（ｃ）の順で行ってもよく、又は工程（ｂ－１）、（ａ）、（ｂ－２）、次いで（ｃ）の順で行ってもよく、又は工程（ａ）の後、工程（ｂ－１）と（ｂ－２）を同時に行い、次いで工程（ｃ）を行ってもよく、又は工程（ａ）の後、工程（ｂ－１）と（ｂ－２）と（ｃ）を同時に行ってもよく、又は工程（ｂ－１）の後、工程（ａ）と（ｂ－２）を同時に行い、次いで工程（ｃ）を行ってもよく、又は工程（ｂ－１）の後、工程（ａ）と（ｂ－２）と（ｃ）を同時に行ってもよく、又は工程（ａ）と（ｂ－１）を同時に行い、次いで工程（ｂ－２）の後、工程（ｃ）を行ってもよく、又は工程（ａ）と（ｂ－１）を同時に行い、次いで工程（ｂ－２）と（ｃ）を同時に行ってもよく、又は工程（ａ）と（ｂ－１）と（ｂ－２）を同時に行い、次いで工程（ｃ）を行ってもよく、又は全工程（ａ）～（ｃ）を同時に行ってもよい。全工程（ａ）～（ｃ）を同時に行う例としては、試料、本願のカタラーゼ阻害剤、第１酵素、第２酵素、及び過酸化水素の測定のための試薬（例えば、ペルオキシダーゼ、発色試薬、又は発光試薬等）を同時に同一反応槽に投入する場合、又は、本願のカタラーゼ阻害剤、第１酵素及び第２酵素を担持した、電圧を印加した電極上に、試料を添加する場合等が挙げられる。
　前記のような複数酵素反応を介した本願の測定方法の一例として、ＨｂＡ１ｃをアナライトとした測定について具体的に説明する。ＨｂＡ１ｃの測定では、例えば、試料として血液試料又は血球試料が用いられる。工程（ａ）において、該試料と本願のカタラーゼ阻害剤を混合する。工程（ｂ－１）において、第２酵素としてプロテアーゼを用いて、試料中のＨｂＡ１ｃから糖化ペプチドとしてのフルクトシル－バリルヒスチジン（Ｆｒｕ－Ｖａｌ－Ｈｉｓ）を生成させる。次いで、工程（ｂ－２）において、第１酵素としてフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）により、工程（ｂ－１）で生成した糖化ペプチドを酸化することで過酸化水素を生成する。次いで、工程（ｃ）において、工程（ｂ－２）で生成した過酸化水素を測定する。前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ（例えば、サーモリシン等）、システインプロテアーゼ（例えば、パパイン、カスパーゼ等）、セリンプロテアーゼ（例えば、キモトリプシン、スブチリシン等）等が挙げられる。さらに、プロテアーゼによるアナライトの分解を促進させる物質の存在下で工程（ｂ－１）を行ってもよい。このような物質としては、例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤等の界面活性剤、テトラゾリウム化合物等が挙げられる。また、工程（ｂ－１）における第２酵素として、ＨｂＡ１ｃから糖化アミノ酸としてのフルクトシル－バリン（Ｆｒｕ－Ｖａｌ）を生成させるプロテアーゼを用い、工程（ｂ－２）における第１酵素として、フルクトシルペプチドオキシダーゼに代えて、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ）を用いてもよい。
　本願の測定方法では、化合物（Ｉ）を含むカタラーゼ阻害剤と試料を混合しているので、過酸化水素の測定のために比色法、化学発光法、又は電気化学的手法のいずれの手法を用いても、アナライトの酸化により生じた過酸化水素の量、又はアナライトから生成された基質の酸化により生じた過酸化水素の量を正確に測定することができる。
３．本願の測定キット
　次に、本願の第三の態様に係るカタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定する測定キット（以下、「本願の測定キット」ともいう）について説明する。
　本願の測定キットは、カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定するための測定キットであって、過酸化水素の生成に基づいて前記アナライトを測定するために使用される。本願明細書において、「カタラーゼが含まれる試料」は、カタラーゼが含まれる試料、及びカタラーゼが含まれる可能性のある試料を包含する。
　本願の測定キットの第一の例は、アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、及び本願のカタラーゼ阻害剤を含む。本願の測定キットの第二の例は、基質を酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、本願のカタラーゼ阻害剤、及びアナライトから第１酵素の基質を生成させる反応を触媒する第２酵素を含む。本願の測定キットの第一の例において、アナライトは、第１酵素の基質である。本願の測定キットの第二の例において、アナライトは、第１酵素の基質を生成する物質である。第１酵素及び第２酵素の例については上述したとおりである。
　本願の測定キットは、ペルオキシダーゼをさらに含んでいてもよい。ペルオキシダーゼを含む本願の測定キットは、例えば、比色法又は化学発光法によって過酸化水素を測定することによりアナライトを測定するために使用される。
４．本願の試料前処理用試薬
　次に、本願の第四の態様に係る、化合物（Ｉ）を含む、電気化学的手法による測定のための試料前処理用試薬（以下、「本願の試料前処理用試薬」ともいう）について説明する。
　本願の試料前処理用試薬は、カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを電気化学的手法によって測定する場合に、測定前に試料を処理するために使用される。例えば、本願の試料前処理用試薬は、過酸化水素の生成に基づいてアナライトを測定する方法であって、前記過酸化水素を電気化学的手法によって測定する方法に付すために、試料を前処理するために使用される。この場合、第１酵素によって触媒されるアナライトの酸化によって過酸化水素が生成し、該第１酵素は、電極上に担持されている。本願の試料前処理用試薬は、必要に応じて、水、溶媒、緩衝液、タンパク質、高分子材料、糖類、塩類、界面活性剤、酸化剤、還元剤等の、化合物（Ｉ）のカタラーゼ阻害作用に影響を与えない付加的成分を含んでいてもよい。
５．本願の試料前処理用キット
　次に、本願の第五の態様に係るカタラーゼが含まれる試料中のアナライトを電気化学的手法により測定するための、試料前処理用キット（以下、「本願の試料前処理用キット」ともいう）について説明する。
　本願の試料前処理用キットとして、本願のカタラーゼ阻害剤、及び第２酵素を含むキットが提供される。第２酵素は、試料中のアナライトから第１酵素の基質を生成させる反応を触媒する酵素である。第１酵素及び第２酵素の例については上述したとおりである。
　本願の試料前処理用キットは、カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを電気化学的手法によって測定する場合に、測定前に試料を処理するために使用される。例えば、本願の試料前処理用キットは、過酸化水素の生成に基づいてアナライトを測定する方法であって、前記過酸化水素が、アナライトから生成した基質の酸化により生じ、かつ、前記過酸化水素を電気化学的手法によって測定する方法に付すために、試料を前処理するために使用される。この場合、第１酵素は、電気化学的手法において使用する電極上に担持されている。
　さらに、本願の試料前処理用キットとして、第１酵素、本願のカタラーゼ阻害剤、及び第２酵素を含むキットが提供される。第１酵素及び第２酵素については上述したとおりである。該キットは、電気化学的手法において使用する電極上に第１酵素が担持されていない場合に使用できる。
　さらに、本願の試料前処理用キットとして、第１酵素、及び本願のカタラーゼ阻害剤を含むキットが提供される。第１酵素については上述したとおりである。該キットは、第１酵素によって触媒されるアナライトの酸化により過酸化水素が生成する場合であって、電気化学的手法において使用する電極上に第１酵素が担持されていない場合に使用できる。
６．本願のセンサ
　さらに、本願の第六の態様として、アナライトを測定するためのセンサであって、作用極及び対極を含む電極を含み、第１酵素及び本願のカタラーゼ阻害剤が前記電極に担持されているセンサを提供する。前記電極は、さらに第２酵素を担持していてもよい。第１酵素及び第２酵素の例については上述したとおりである。電極の構成材料については、特に限定されず、白金、金、銀、パラジウム、カーボン、イリジウム、酸化イリジウム等の過酸化水素の電気化学的定量に通常用いられているいずれの材料であってもよい。好ましくは、白金、又はパラジウムが電極材料として用いられる。前記センサは、さらに参照極を含むものであってもよい。前記酵素、及びカタラーゼ阻害剤を電極上に担持させる方法は、所望の酵素、及びカタラーゼ阻害剤を電極上に担持させることが可能ないずれの方法であってもよく、特に限定されない。当該分野で既知のいずれかの方法を用いることができる。例えば、インクジェット方式を用いてもよい。
　例えば、アナライトがＨｂＡ１ｃである場合、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、又はフルクトシルペプチドオキシダーゼに代えてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、及び本願のカタラーゼ阻害剤が電極上に担持されたＨｂＡ１ｃセンサが提供される。前記ＨｂＡ１ｃセンサは、さらにプロテアーゼを電極に担持していてもよい。
　以下に、実施例に基づいて本願を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
カタラーゼ阻害効果試験（発泡試験）
（方法）
　２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファート（０．００１％（ｗ／ｖ））又はアジ化ナトリウム（０．００１％（ｗ／ｖ）と、プロテアーゼ（アクチナーゼＥ、１８０００Ｕ／ｍＬ）、陰イオン性界面活性剤（Ｎ－ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ））、グルタミン酸カリウム（３００ｍＭ）、ビストリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）、及びヒト血液（２５倍希釈相当）を混合した。血液添加後４分３０秒後に、過酸化水素１％（ｖ／ｖ）を前記混合液中に投入した。過酸化水素投入後の発泡（酸素発生）の有無を目視により確認した。なお、各成分の濃度は反応時終濃度を示す。
（結果）
　２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファート又はアジ化ナトリウムのいずれを添加した場合も、過酸化水素投入後の発泡が見られなかった。これは、血液中のカタラーゼを抑制できたことを示す。
カタラーゼ阻害剤を用いたＨｂＡ１ｃの電気化学的測定試験１
（方法）
　プロテアーゼ（アクチナーゼＥ、２２５０Ｕ／ｍＬ）、陰イオン性界面活性剤（Ｎ－ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム、５．０％（ｗ／ｖ））、グルタミン酸カリウム（３００ｍＭ）、リン酸カリウム緩衝液（３０ｍＭ、ｐＨ８）、カタラーゼ阻害剤、及びＨｂＡ１ｃ測定用実試料一次標準物質（検査医学標準物資機構より入手、ＪＣＣＲＭ　４１１、レベル１レベル３、及びレベル５のそれぞれの２５倍希釈相当を使用）を混合し、測定溶液を調製した。前記カタラーゼ阻害剤として、アジ化ナトリウム（３５０μＭ、又は１７５０μＭ）、又は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファート（３５０μＭ、又は１７５０μＭ）を使用した。
　パラジウム電極からなる作用極及び対極を備えたセンサに、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（２２９Ｕ／ｍｌ）、カルボキシメチルセルロース（０．１２５％（ｗ／ｖ））、リン酸カリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８）、グルタミン酸カリウム（１０ｍＭ）及びトレハロース（０．５％（ｗ／ｖ））を担持させた。
　前記センサに前記測定溶液を点着し、０．６２Ｖを１秒間作用極と対極の間に印加し、１５秒静止後、０．２５Ｖを作用極と対極に印加し、１０秒後の電流値を測定した。
　なお、各成分の濃度は測定液中の終濃度を示す。
（結果）
　結果を図２に示す。図２は、アジ化ナトリウム又は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートをそれぞれ３５０μＭ又は１７５０μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。また、各測定結果の線形近似曲線の式を表１に示し、線形近似曲線の傾きを切片で割った値を表２に示す。
　なお、表中、「ＮａＮ３」はアジ化ナトリウムを示し、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図２ならびに表１及び２から分かるように、３５０μＭではアジ化ナトリウムと２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートで近似曲線の傾きや感度（Ｓ／Ｎ比）に大きな違いはなかったが、１７５０μＭではアジ化ナトリウムの近似曲線の傾きが大きく下がり、感度の低下が生じた。一方、１７５０μＭの２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートでは、近似曲線の傾きの低下が見られず、かつ切片の値が減少するため、感度（Ｓ／Ｎ比）の向上が見られた。したがって、カタラーゼ阻害剤として２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを用いると、過酸化水素の電気的な感度が向上し、測定精度が上がることが分かった。
カタラーゼ阻害剤を用いたＨｂＡ１ｃの電気化学的測定試験２
（方法）
　実施例２と同じ方法で、ＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流値を測定した。但し、カタラーゼ阻害剤として、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファート（１７５０μＭ、又は３５００μＭ）を使用した。
（結果）
　結果を図３に示す。図３は、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを１７５０μＭ又は３５００μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。また、各測定結果の線形近似曲線の式を表３に示し、線形近似曲線の傾きを切片で割った値を表４に示す。
　なお、表中、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　図３ならびに表３及び４から分かるように、３５００μＭの２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを使用した場合も、十分な測定感度を有することが分かった。
カタラーゼ阻害剤を用いたＨｂＡ１ｃの電気化学的測定試験３
（方法）
　実施例２と同じ方法で、ＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流値を測定した。但し、カタラーゼ阻害剤として、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファート（１７５０μＭ、又は２５０μＭ）を使用した。
（結果）
　結果を図４に示す。図４は、２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを１７５０μＭ又は２５０μＭ添加した時のＨｂＡ１ｃ濃度に対する電流応答を示す。また、各測定結果の線形近似曲線の式を表５に示し、線形近似曲線の傾きを切片で割った値を表６に示す。
　なお、表中、「ＡＩＰ」は２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　図４ならびに表５及び６から分かるように、２５０μＭの２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートを使用した場合も、十分な測定感度を有することが分かった。
　本願のカタラーゼ阻害剤は、過酸化水素生成量に基づく各種アナライトの測定方法に利用できる。例えば、血糖値測定にも利用できる。

Claims (14)

  1. 　下記の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又は置換基を有していてもよい炭素数１～４の炭化水素基を表し、
    　Ｘ－は、陰イオン化学種を表す。］
    で表される化合物を含む、カタラーゼ阻害剤。
  2. 　式中、Ｒ１～Ｒ４は、各々独立して、水素原子、又は炭素数１～４の炭化水素基を表し、前記炭化水素基は、ハロゲン、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、
    　Ｘ－は、ハロゲンイオン、ハロゲンを含む化合物のイオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸水素イオン、硫化水素イオン、シュウ酸水素イオン、シアン酸イオン、及びチオシアン酸イオンからなる群から選択されるいずれか１つを表す、請求項１記載のカタラーゼ阻害剤。
  3. 　式中、Ｒ１～Ｒ４が、各々独立して、水素原子、又は非置換の炭素数１～４の直鎖又は分枝鎖の飽和炭化水素基を表し、Ｘ－が、ハロゲンイオン、又はハロゲンを含む化合物のイオンを表す、請求項１記載のカタラーゼ阻害剤。
  4. 　式（Ｉ）で表される化合物が２－アジド－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスファートである、請求項１記載のカタラーゼ阻害剤。
  5. 　過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、下記の工程を含む方法：
    　（Ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
    　（Ｂ）第１酵素により前記アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
    　（Ｃ）前記過酸化水素を測定する工程。
  6. 　前記工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）の後、又は、前記工程（Ａ）と同時に行われる、請求項５に記載のアナライトの測定方法。
  7. 　過酸化水素の生成に基づくアナライトの測定方法であって、下記の工程を含む方法：
    　（ａ）アナライト及びカタラーゼが含まれる試料と、請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤を混合する工程、
    　（ｂ－１）第２酵素により前記アナライトから基質を生成させる工程、
    　（ｂ－２）第１酵素により前記基質を酸化させて過酸化水素を生成させる工程、及び、
    　（ｃ）前記過酸化水素を測定する工程。
  8. 　前記工程が（ｂ－１）、（ａ）、（ｂ－２）、次いで（ｃ）の順で行われるか、又は前記工程（ｂ－１）の後、前記工程（ａ）と（ｂ－２）が同時に行われ、次いで前記工程（ｃ）が行われるか、又は前記工程（ａ）と（ｂ－１）が同時に行われ、次いで前記工程（ｂ－２）の後、前記工程（ｃ）が行われる、請求項７に記載のアナライトの測定方法。
  9. 　前記工程（Ｃ）又は（ｃ）において、前記過酸化水素は、比色法、化学発光法又は電気化学的手法により測定される、請求項５～８のいずれか１項記載のアナライトの測定方法。
  10. 　カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定する測定キットであって、
    　前記アナライトを酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、及び、
    　請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤、
    を含む、測定キット。
  11. 　カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを測定する測定キットであって、
    　基質を酸化させて過酸化水素を生成させる反応を触媒する第１酵素、
    　請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤、及び、
    　前記アナライトから前記基質を生成させる反応を触媒する第２酵素、
    を含む、測定キット。
  12. 　ペルオキシダーゼをさらに含む、請求項１０又は１１に記載のキット。
  13. 　請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤を含む、電気化学的手法による測定のための試料前処理用試薬。
  14. 　第１酵素での基質の酸化による過酸化水素の生成に基づいて、カタラーゼが含まれる試料中のアナライトを電気化学的手法により測定するための、試料前処理用キットであって、
    　請求項１～４のいずれか１項記載のカタラーゼ阻害剤、及び、
    　前記アナライトから前記基質を生成させる反応を触媒する第２酵素、
    を含む、キット。
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