JP6672581B2 - サルコシンオキシダーゼの安定化方法 - Google Patents
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Description
反応:サルコシン+O2+H2O→グリシン+ホルムアルデヒド+H2O2
項1.
酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定方法において、測定対象成分以外の成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解し、次いで、測定対象成分に由来する過酸化水素を定量することにより前記測定対象成分を定量するに際し、前記カタラーゼとして微生物由来のカタラーゼを用いることを特徴とする、カタラーゼ共存下におけるサルコシンオキシダーゼの安定化方法。
項2.
前記カタラーゼが、ポドスポラ(Podospora)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、クラドスポリウム(Cladosporium)属、エメリセラ(Emericella)属、プレウロタス(Pleurotus)属、デイノコッカス(Deinococcus)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ボトリオチニア(Botryotinia)属、クラビセプス(Claviceps)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、アジェロミセス(Ajellomyces)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属、メソリゾビウム(Mesorhizobium)属、ノゼマ(Nosema)属、キサントモナス(Xanthomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属およびアルスロバクター(Arthrobacter)属からなる群より選択される少なくとも1種の微生物に由来するものである、項1に記載の方法。
項3.
前記カタラーゼが、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)の微生物に由来するものである、項2に記載の方法。
項4.
前記測定対象成分が、クレアチニン又はクレアチンである、項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
項5.
酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定試薬であって、微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含み、かつ、前記カタラーゼと前記サルコシンオキシダーゼとが共存する、生体成分測定試薬。
項6.
測定対象がクレアチンまたはクレアチニンである、項5に記載の生体成分測定試薬。
項7.
項5または6に記載の生体成分測定試薬を用いて、生体成分を測定する方法。
本発明によれば、カタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含む酸化酵素−ペルオキシダーゼ−酸化還元発色試薬系による生体成分測定において、長期間安定して確度高く測定することができる。
CRE測定方法は以下の通りである。まず、CREを基質とするクレアチニンアミジノヒドロラーゼの反応で生じたクレアチンを、さらにクレアチンアミドヒドロラーゼと反応させてサルコシンを生じさせる。次に、サルコシンをサルコシンオキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせる。さらに、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することによりCRE濃度を測定する。
CR測定は、CRを基質とするクレアチンアミドヒドロラーゼの反応で生じたサルコシンをサルコシンオキシダーゼを用いて過酸化水素を生じさせ、さらに、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ−発色剤系により定量することによりCR濃度を測定する。
上記のように、測定対象に直接作用する酸化酵素として好適なものがないときは、いわゆる共役反応を適宜設計することにより、ペルオキシダーゼ−発色剤系による濃度測定を可能にすることができる。
例えば、CRE測定の場合は、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ以外の酵素(クレアチンアミドヒドロラーゼおよびサルコシンオキシダーゼ)を試料に作用させて、反応中間体(クレアチンなど)に起因して発生した過酸化水素をカタラーゼで消去した後、クレアチニンアミジノヒドロラーゼを反応系に追加して、測定対象であるCREに起因して発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する(このとき、同時に、カタラーゼの作用を実質的に停止させる。)。
(1)微生物由来のカタラーゼ
(2)サルコシンオキシダーゼ
(3)ペルオキシダーゼ
(4)酸化還元発色試薬
前記試薬(またはキット)は、上記の形態のほか、適当な担体に酵素などを担持させた形態のいわゆるドライシステム等と呼ばれるキットやセンサーを用いる方法など、種々の形態をとることができる。
また、色原体としては、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−スルホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−スルホプロピルアニリン、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−2,5−ジメチルアニリン等が挙げられるが特に限定されるものではない。
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、コリネバクテリウム属由来またはアルスロバクター属由来のカタラーゼを試薬中終濃度で50U/mLになるように調製して測定試薬とし、調製直後および10℃保存後の試薬について下記測定条件で測定した。試料としては精製水および標準液として5mg/dLクレアチニン水溶液を測定し、標準液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度を標準液測定感度として求めた。調製直後の標準液測定感度を100%として10℃保存後の標準液測定感度を相対%として算出した。比較例として、カタラーゼを牛由来の東洋紡社製CAO−509を各々試薬中終濃度で50U/mLになるように調製した測定試薬で同様の検討を行なった。
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製ASO−311) 5U/mL
サルコシンオキシダーゼ(東洋紡社製SAO−341) 5U/mL
クレアチンアミジノヒドロラーゼ(東洋紡社製CRH−221) 30U/mL
N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン 0.05g/L
第二試薬
PIPES−NaOH 50mM pH7.5
クレアチニンアミドヒドロラーゼ(東洋紡社製CNH−311) 300U/mL
ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO−301) 20U/mL
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
日立7170形自動分析機を用いた。試料4μLに第一試薬 180μL添加し37℃にて5分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を60μL添加し5分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる2ポイントエンド法で546nmにおける吸光度を測定した。
実施例1の第一試薬のサルコシンオキシダーゼの活性測定を次の方法で実施し、活性残存率(調製直後の活性値に対する活性値の割合)を調べた。活性残存率(安定性)を表2に示す。
A液:0.2M サルコシン溶液、B液:0.1%4−アミノアンチピリン水溶液、C液:0.1%フェノール水溶液、D液:25U/ml ペルオキシダーゼ水溶液を各々調製し、A液10mlに、B液2ml、C液およびD液各4mlを添加混合し、活性測定試薬とする。当該試薬2mlに対し、被検の酵素溶解液0.1mlを添加後、37℃でインキュベートし、添加3分後から1分間当たりの波長500nmにおける吸光度の増加速度から活性を算出する。活性値はU/ml= ΔOD(ODtest−ODblank)×3.05×希釈倍率/(13.5 ×0.5 ×1 ×10×0.05) 式から算出した。
Claims (5)
- コリネバクテリウム(Corynebacterium)属又はアルスロバクター(Arthrobacter)属の微生物に由来するカタラーゼを共存させることを特徴とする、サルコシンオキシダーゼを保存する方法(但し、サルコシンオキシダーゼ及び/又はカタラーゼを、脱水縮合剤を用いて多数個のカルボキシル基を有する多糖類又は多数個のカルボキシル基を有するポリアミノ酸に結合させたものを用いて共存させる場合を除く)。
- クレアチニン又はクレアチン測定試薬においてサルコシンオキシダーゼを保存する、請求項1に記載の方法。
- 検体中の測定対象物質を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下で発色剤と反応させて比色定量する方法を利用する測定法のための生体成分測定試薬であって、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属又はアルスロバクター(Arthrobacter)属の微生物由来のカタラーゼとサルコシンオキシダーゼとを含み、かつ、前記カタラーゼと前記サルコシンオキシダーゼとが共存する、生体成分測定試薬(但し、サルコシンオキシダーゼ及び/又はカタラーゼを、脱水縮合剤を用いて多数個のカルボキシル基を有する多糖類又は多数個のカルボキシル基を有するポリアミノ酸に結合させたものを用いて共存させる場合を除く)。
- 測定対象がクレアチンまたはクレアチニンである、請求項3に記載の生体成分測定試薬。
- 請求項3または4に記載の生体成分測定試薬を用いて、生体成分を測定する方法。
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