JP7131009B2 - アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中で、コレステロールオキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化物をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯと略す）を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般に行われている。しかし、溶液中のＡＳＯは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物およびカタラーゼ及び／またはペルオキシダーゼの添加でＡＳＯの保存安定性が向上することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む溶液に糖アルコールを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、亜硝酸若しくはその塩又は亜硝酸エステルを水性媒体中で共存させる方法（例えば、特許文献３参照）、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、ビリルビン酸（塩）を配合させる方法（例えば、特許文献５参照）が開示されている。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうるようＡＳＯを安定化する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＳＯをある種の界面活性剤および緩衝液と共存させることにより、またＡＳＯをある種の緩衝液と共存させることにより、ＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］アスコルビン酸オキシダーゼを、オクチルフェノールエトキシレートおよびアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項２］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項３］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１または項２に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項４］アスコルビン酸オキシダーゼを、アミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項５］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項４に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項６］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項４または項５に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項７］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）オクチルフェノールエトキシレート
（２）アミンを含む緩衝液。
［項８］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（２）アミンを含む緩衝液。
［項９］項７または項８に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
［項２］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項３］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１または項２に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項４］アスコルビン酸オキシダーゼを、アミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項５］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項４に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項６］前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、項４または項５に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項７］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（１）および以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）オクチルフェノールエトキシレート
（２）アミンを含む緩衝液。
［項８］アスコルビン酸オキシダーゼ、以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（２）アミンを含む緩衝液。
［項９］項７または項８に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
本発明により、安定なＡＳＯ含有液状製剤を提供でき、長期間または過酷な条件下での保管後の液状製剤においてもアスコルビン酸の影響を受けることなく、正確な測定値を得ることができる。
（界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、特定の界面活性剤（オクチルフェノールエトキシレート）及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。
本発明の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、特定の界面活性剤（オクチルフェノールエトキシレート）及びアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。
例えば、オクチルフェノールエトキシレートとして、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（「Ｔｒｉｔｏｎ」は登録商標。以下同様）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（「Ｎｏｎｉｄｅｔ」は登録商標。以下同様）、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（「Ｉｇｅｐａｌ」は登録商標。以下同様）が挙げられる。
本発明の方法において、使用されるアミンを含む緩衝液は特に限定されないが、例えば、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸〔Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）〕、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン〔Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｂｉｃｉｎｅ）〕、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン〔Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）〕、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ－Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）〕、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔３－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）〕、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸〔２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）〕、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸〔２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＰＳＯ）〕、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物〔２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＭＥＳ）〕、３－モルホリノプロパンスルホン酸〔３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）〕、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸〔２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）〕、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）〕、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｄｉｈｙｄｒａｔｅ（ＰＯＰＳＯ）〕、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸〔Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）〕、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸〔Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＥＳ）〕、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｔｒｉｃｉｎｅ）〕およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミンが挙げられる。
本発明の方法において、前記アミンを含む緩衝液は、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸〔２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）〕およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）〕からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
本発明のＡＳＯの安定化方法において使用する前記アミンを含む緩衝液と前記界面活性剤の組合せは特に限定されない。
ＡＳＯを含む溶液中のアミンを含む緩衝液の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２００ｍＭさらに好ましくは１００ｍＭ、範囲の下限は２０ｍＭさらに好ましくは５ｍＭで、使用されるのが望ましい。
また、アミンを含む緩衝液のｐＨ調整範囲は特に限定されないが、一般に生体試料の測定に必要な酵素等がいずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発明においても中性付近の緩衝液を用いることが好ましい。範囲の上限は、好ましくは９．５さらに好ましくは７．５、範囲の下限は、好ましくは４．５さらに好ましくは６．０で、調整されるのが望ましい。
本発明で用いられるＡＳＯとは、ＥＣ１．１０．３．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６－２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１～５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６－２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１～５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
本発明のＡＳＯの安定化方法においては、さらに防腐剤などを共存させてもよい。防腐剤は特に限定されないが、例えば、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
また、本発明のＡＳＯの安定化方法は、種々の生化学診断方法に適用できる。該生化学診断方法としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する方法が挙げられる。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。
（アミンを含む緩衝液によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、アミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼを、アミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。
本実施態様に用いるアミンを含む緩衝液の種類や濃度、ｐＨ調整範囲等は、前記の界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化の項において説明したものと同じであり得る。
より効果的にアスコルビン酸オキシダーゼを安定化できるという観点から、好ましくは、本実施態様に用いるアミンを含む緩衝液は、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸〔Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＡＤＡ）〕、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸〔Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＥＳ）〕、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸〔２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）〕またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）〔Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）〕であり、より好ましくは、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）であり、中でも好ましくは、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）である。
（アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）よび以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）オクチルフェノールエトキシレート、
（２）アミンを含む緩衝液。
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）よび以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）オクチルフェノールエトキシレート、
（２）アミンを含む緩衝液。
前記界面活性剤（オクチルフェノールエトキシレート）およびアミンを含む緩衝液の詳細については、前記の界面活性剤と緩衝液との組合せによるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化の項で説明したとおりである。
本発明の更に別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（２）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（２）アミンを含む緩衝液。
（２）アミンを含む緩衝液。
前記アミンを含む緩衝液の詳細については、前記のアミンを含む緩衝液によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化の項で説明したとおりである。
具体的に、本実施態様に用いるアミンを含む緩衝液としては、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）が好ましく、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）がより好ましく、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）が、なかでも好ましい。
具体的に、本実施態様に用いるアミンを含む緩衝液としては、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）が好ましく、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）がより好ましく、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）が、なかでも好ましい。
本発明は、前記のいずれかに記載の組成物を含む、生体成分分析用キットであってもよい。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含むほうの組成物にアミンを含む緩衝液を共存させればよい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含むほうの組成物にアミンを含む緩衝液を共存させればよい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。
（アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法）
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．６
０．５ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液を同様に急高度を測定する。
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．６
０．５ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液を同様に急高度を測定する。
本発明において「アスコルビン酸オキシダーゼが安定である」とは、アスコルビン酸オキシダーゼの経時的な失活が抑制され、長期的な保存安定性が改善されていることをいう。具体的には、界面活性剤もアミンを含む緩衝液も含まない蒸留水（但し、塩化マグネシウムを１ｇ／Ｌを含んでいてもよい）で保存した場合に比べて、３５℃で７日間保存後のＡＳＯの残存酵素活性が高められていることをいう。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
実施例１：アスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水、ＡＤＡ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＰＩＰＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＢＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、またはＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、この水溶液にＴｒｉｔｏｎ Ｘ―１００を１ｇ／Ｌ加え、蒸留水にＴｒｉｔｏｎ Ｘ―１００を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水、ＡＤＡ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＰＩＰＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＢＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）、またはＨＥＰＥＳ（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解し、この水溶液にＴｒｉｔｏｎ Ｘ―１００を１ｇ／Ｌ加え、蒸留水にＴｒｉｔｏｎ Ｘ―１００を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
結果を表１に示す。
界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）およびアミンを含む緩衝液（ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、またはＨＥＰＥＳ）の組み合せ効果を調べた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００単独での使用では、安定化効果－４％と安定化効果が見られないにも関わらず、アミンを含む緩衝液（ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、またはＨＥＰＥＳ）と組み合わせて使用することにより、緩衝液単独の場合よりもアスコルビン酸オキシダーゼの安定性が向上することを見出した。また、本試験において、緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼの安定化についてもデータを取得したところ、ＡＳＯをＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳまたはＨＥＰＥＳに溶解することで、蒸留水に対し良好な安定性が得られることが確認された。この緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果は、特に、緩衝液としてＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳを用いた場合に高いことが明らかとなった。
界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）およびアミンを含む緩衝液（ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、またはＨＥＰＥＳ）の組み合せ効果を調べた。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００単独での使用では、安定化効果－４％と安定化効果が見られないにも関わらず、アミンを含む緩衝液（ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、またはＨＥＰＥＳ）と組み合わせて使用することにより、緩衝液単独の場合よりもアスコルビン酸オキシダーゼの安定性が向上することを見出した。また、本試験において、緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼの安定化についてもデータを取得したところ、ＡＳＯをＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳまたはＨＥＰＥＳに溶解することで、蒸留水に対し良好な安定性が得られることが確認された。この緩衝液単独でのアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果は、特に、緩衝液としてＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳを用いた場合に高いことが明らかとなった。
本発明により、ＡＳＯを含有する、より長期間安定な液状試薬を供することができる。
Claims (6)
- アスコルビン酸オキシダーゼを、オクチルフェノールエトキシレートおよびアミンを含む緩衝液と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２－モルホリノエタンスルホン酸，一水和物（ＭＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸），二水和物（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 前記アミンを含む緩衝液が、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は請求項２に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- ３５℃で７日間保存しても安定である、請求項１～３のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 液状組成物におけるアスコルビン酸オキシダーゼの濃度が０．１～５０Ｕ／ｍＬとなるように共存させる、請求項１～４のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 液状組成物におけるアミンを含む緩衝液の濃度が５～２００ｍＭとなるように共存させる、請求項１～５のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
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