JP4288559B2 - アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中でグリセロリン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ(以下ASOと略す)を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般的に行なわれている。しかし、溶液中のASOは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。
【0003】
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物及びカタラーゼ及び/またはペルオキシダーゼの添加でASOの保存安定性が向上することが開示されている(例えば、特許文献1参照。)。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。
【0004】
【特許文献1】
特開昭63−49081号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するASOを提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、ASOに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることにより、ASOを液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
(1)アスコルビン酸オキシダーゼに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
(2)pH6〜7.5に調製された(1)のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
(3)2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が0.01〜3mMの濃度で用いられる(1)のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
(4)アスコルビン酸オキシダーゼに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
(5)pH6〜7.5に調製された(4)のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
(6)2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質が0.01〜3mMの濃度で用いられる(4)のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
(7)中性脂肪測定試薬で用いられる(4)のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、酵素を 0.5〜10 IU/mL(好ましくは1〜5 IU/mL)の濃度になるよう溶解した液(pH 6〜7.5(好ましくはPIPES緩衝液、pH6.6))の液を、30〜40℃(好ましくは 35℃±2℃)で7日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、75%以上(好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上)維持されていることをいう。
【0009】
本発明の一実施態様として、ASOに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることを特徴とするASOの安定化方法がある。
【0010】
本発明に使用される2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンは、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、塩酸塩、アンモニウム塩の形で用いてもよい。また、2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンと5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンの混合物としてスペルコ社よりProClin150、ProClin300が市販されているがこれらは好適に用いられる。ASOを含む溶液中の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは3.0mMさらに好ましくは0.6mM、範囲の下限は、好ましくは0.01mMさらに好ましくは0.05mMで、使用されるのが望ましい。
【0011】
本発明に係るASO溶液には緩衝剤が含まれてよい。緩衝剤としては、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、GOOD緩衝剤などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤は濃度、温度によってpHが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、GOOD緩衝剤にはMES、Bis−Tris、ADA、ACES、BES、MOPS、PIPES、TES、HEPES、Tricine、Bicine、POPSO、TAPS、CHES、CAPSなどが例示される。該緩衝液のpH調整範囲は特に限定されないが、一般に生体試料の測定に必要な酵素等がいずれも中性付近で安定な性質を示しており、本発明においても中性付近の緩衝液を用いることが好ましい。一方、ASOの反応至適pHは概ね弱酸性域にあるが、安定性は低下する傾向にある。しかし、本発明により酸性側でも安定に保つことができることから、pH調整範囲は中世付近から更にASOの反応至適pHまで広く選択することができる。範囲の上限は、好ましくは9.5さらに好ましくは7.5、範囲の下限は、好ましくは4.5さらに好ましくは6.0で、調整されるのが望ましい。
【0012】
本発明に用いられるASOとはEC1.10.3.3に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
L-アスコルビン酸+1/2O2→デヒドロアスコルビン酸+H2O
上記酵素はキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるASOには特開平6−209770に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
L-アスコルビン酸+O2→デヒドロアスコルビン酸+H2O2
上記酵素は微生物などから採取されるものなどを含有する。微生物としてはトリコデルマ(Trichoderma)属、モルティエレラ(Mortierella)属またはユペニシリニウム属(Eupenicillium属)が挙げられる。
ASOを含む溶液中のASOの濃度は、酵素の起源によっても異なり、通常0.1〜50U/mLの範囲で好適に用いられる。
【0013】
本発明において、ASO溶液には、さらに防腐剤、界面活性剤などを添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。
【0014】
また、該ASO溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。該診断用試薬としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する試薬、が挙げられる。これらの診断用試薬は2つ以上に分包されていてもよく、その場合ASOはそのいずれかに含まれていればよい。
【0015】
例えば中性脂肪測定試薬としては、一般にASOの他、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ATP、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有される。
【0016】
本発明における上記安定化剤を含むASO組成物は水溶液であっても、凍結乾燥したものであってもよい。
【0017】
ASOの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈反応液〉
100mM リン酸緩衝液 pH5.6
0.5mM L−アスコルビン酸
〈測定条件〉
(1)上記反応液1mLをキュベットにとり、30℃で約5分間予備加温する。
(2)酵素溶液0.1mLを添加し反応を開始する。正確に5分間反応させた後に、0.2N塩酸溶液3.0mLを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計 で245nmの吸光度を測定する。
(3)盲検は反応液を30℃で5分放置後、0.2N塩酸溶液3.0mLを加えて混和し、次いで酵素溶液0.1mLを加えて調製する。この液を同様に吸光度を 測定する。
【0018】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【0019】
実施例1:ASO(東洋紡績製ASO−311)1U/mLを含む下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に▲1▼2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン 0.2mM、▲2▼5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン 0.2mM、▲3▼1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オン 0.2mMを添加した試薬をを調製し、無添加を対照として、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0020】
(試薬の調製)
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
PIPES緩衝剤 100mM pH6.6
MgCl2 1mmol/L
アデノシン3リン酸2Na塩 1mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.4mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド2Na塩 8μmol/L
グリセロールキナーゼ(東洋紡社製GYK−311) 3U/mL
カタラーゼ(東洋紡社製) 200U/mL
グリセロリン酸オキシダーゼ(東洋紡社製G3O−321) 3U/mL
ASO(東洋紡績製ASO−311)1U/mL
【0021】
【表1】
【0022】
結果 表1に示す。2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンのいずれかを添加することで無添加に対し良好な安定性が得られた。
【0023】
実施例2:ASO(東洋紡績製ASO−311)1U/mLを含む実施例▲1▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンを濃度を0.01、0.05、0.1、0.5、1、3mMに変えて調製し、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0024】
【表2】
【0025】
結果 表2に示す。5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンを低濃度で共存させても良好な安定性が得られた。
【0026】
実施例3:ASO(東洋紡績製ASO−311)1U/mLを含む実施例▲1▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬のpHを6.0、6.5、7.0、7.5に調製し、各々の試薬において5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンの添加(0.2mM)または無添加の試薬を調製し、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0027】
【表3】
【0028】
結果 表3に示す。5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンの添加により広範なpH域で安定化効果が確認されたが、ASOの反応至適pHである弱酸性域、特にpH6、または6.5の弱酸性域で良好な安定性が確認され、好ましい結果が得られた。
【0029】
なお、弱酸性域はグリセロリン酸オキシダーゼの反応至適pHでもあるので、弱酸性域で安定であることは、中性脂肪測定の際にはさらに好ましいといえる。
【0030】
実施例4:ASO(東洋紡績製ASO−311)1U/mLを含む実施例▲1▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬に2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンおよび5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オンを有効成分とするプロクリン300(スペルコ社製)を0.04%になるように添加調製し、10℃で12ヶ月間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0031】
【表4】
【0032】
結果 表4に示す。実施例では比較例に対しな良好な長期保存安定性が確認された。
【0033】
【発明の効果】
本発明においては、ASOを含有する組成物中に2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を共存させることにより、従来よりも液状状態で長期間安定な組成物が得られる。
Claims (3)
- アスコルビン酸オキシダーゼに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を、0.01〜3mMの濃度で、pH6.0〜7.5に調製された溶液中に共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
- アスコルビン酸オキシダーゼに2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン、1,2−ベンズイソチアゾリン−3−オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を、0.01〜3mMの濃度で、pH6.0〜7.5に調製された溶液中に共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
- 中性脂肪測定試薬で用いられる請求項2記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化組成物。
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