JPS6349081A - アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 - Google Patents
アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯと略
する）の安定化法に関し、より詳しくはＡＳＯを含有す
る溶液に適当な塩を主として使用することによ’）ＡＳ
Ｏを安定化する方法に関するものである。
する）の安定化法に関し、より詳しくはＡＳＯを含有す
る溶液に適当な塩を主として使用することによ’）ＡＳ
Ｏを安定化する方法に関するものである。
臨床化学分析における生体成分を酵素的に測定する方法
は数多く開発されている。この方法には、ウリカーゼ、
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロ−３−
リン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼが広く用いられ
でいる。これらのオキシダーゼの作用で生皮された過酸
化水素はパーオキシダーゼと水素供与体の発色系を用い
る方法で比色定量されるのが一般的である。
は数多く開発されている。この方法には、ウリカーゼ、
アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリセロ−３−
リン酸オキシダーゼなどのオキシダーゼが広く用いられ
でいる。これらのオキシダーゼの作用で生皮された過酸
化水素はパーオキシダーゼと水素供与体の発色系を用い
る方法で比色定量されるのが一般的である。
この場合、パーオキシダーゼを用いる反応系においでは
、生体試料中に存在するアスコルビン酸の干渉を著しく
受は易い。そこで、この解決策のひとつとして測定試薬
中にＡＳＯを共存させることによって７スコルビン酸を
酸化分解して、その干渉を排除することが一般的に行な
われている。
、生体試料中に存在するアスコルビン酸の干渉を著しく
受は易い。そこで、この解決策のひとつとして測定試薬
中にＡＳＯを共存させることによって７スコルビン酸を
酸化分解して、その干渉を排除することが一般的に行な
われている。
しかしながら、溶液中のＡＳＯは極めて不安定であるこ
とから、試薬保存中にＡＳＯの失活が起こる。
とから、試薬保存中にＡＳＯの失活が起こる。
従来、ＡＳＯの失活防止にカタラーゼ、ゼラチン、グロ
ブリン、パーオキシダーゼ、メトヘモグロビン又はへマ
マチン等を添加すると有効であることが報告されている
〔化学：第１７巻、第１０号、第８４４頁及び第６回臨
床化学分析談話会夏期セミナー講演予講集：第１０６頁
〕。しかし、これらの報告にみられるカタラーゼ又はパ
ーオキシダーゼは、ＡＳＯ安定化効果のうえで不十分な
ものである。
ブリン、パーオキシダーゼ、メトヘモグロビン又はへマ
マチン等を添加すると有効であることが報告されている
〔化学：第１７巻、第１０号、第８４４頁及び第６回臨
床化学分析談話会夏期セミナー講演予講集：第１０６頁
〕。しかし、これらの報告にみられるカタラーゼ又はパ
ーオキシダーゼは、ＡＳＯ安定化効果のうえで不十分な
ものである。
本発明者らは、溶液中に含有されるＡＳＯの安定性を向
上する目的で、種々検討を行った結果、塩を使用するこ
とにより、ＡＳＯの失活防止が可能になることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
上する目的で、種々検討を行った結果、塩を使用するこ
とにより、ＡＳＯの失活防止が可能になることを見い出
し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明はＡＳＯを含有する溶液に、金属または陽
性の塩基性基と陰性の酸基とから成る化合物、もしくは
該化合物とカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼと酸
化性色素カップラーを併用して添加することを特徴とす
るＡＳＯの安定化法である。
性の塩基性基と陰性の酸基とから成る化合物、もしくは
該化合物とカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼと酸
化性色素カップラーを併用して添加することを特徴とす
るＡＳＯの安定化法である。
本発明の化合物とは、適当な塩を意味し、金属はナトリ
ウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マクネシウム
、ストロンチウム、マンガン、銅、ニッケル、コバルト
及び鉄等から選ばれる陽イオンであり、また陽性の塩基
性基はアンモニウムであり、陰性の酸基は塩素、臭素、
ヨウ素、硫酸、酢酸及びリン酸から選ばれる陰イオンと
から成る安定化剤である。
ウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マクネシウム
、ストロンチウム、マンガン、銅、ニッケル、コバルト
及び鉄等から選ばれる陽イオンであり、また陽性の塩基
性基はアンモニウムであり、陰性の酸基は塩素、臭素、
ヨウ素、硫酸、酢酸及びリン酸から選ばれる陰イオンと
から成る安定化剤である。
カタラーゼとパーオキシダーゼは、上記安定化剤と併用
して使用する。この場合、両酵素は別々に、或いは一緒
に、通常０．０１（Ｊ／ｍＩ１以上を使用する。パーオ
キシダーゼと一緒に用いる酸化性色素カップラーは、ア
ニリン系、ツーノール糸導公知のものを使用する。
して使用する。この場合、両酵素は別々に、或いは一緒
に、通常０．０１（Ｊ／ｍＩ１以上を使用する。パーオ
キシダーゼと一緒に用いる酸化性色素カップラーは、ア
ニリン系、ツーノール糸導公知のものを使用する。
本発明のＡＳＯを含有する溶液とは、ＡＳＯと緩衝液を
溶解させた、ＰＨ４〜９．５の溶液を意味する。
溶解させた、ＰＨ４〜９．５の溶液を意味する。
この溶液の中に安定化剤をＩＴｒＬＭ以上を、場合によ
りカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼと酸化性色素
カップラーを併用して添加する。
りカタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼと酸化性色素
カップラーを併用して添加する。
ＡＳＯ含有溶液は、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルーｙ
−ス、中性脂肪、コレステロ−／Ｌ＝、 リン脂質、
乳酸等の測定を目的とする酵素的測定法における各々の
基質とオキシダーゼが作用して過酸化水素を生成させる
酵素反応系、及び過酸化水素をパーオキシダーゼと水素
供与体の発色系により比色定量を行なうに必要な測定試
薬を含む。通常、この試薬形態は１試薬系タイプか、ま
たは２試薬系タイプにまとめられているので、後者の場
合にはＡＳＯを含有する試薬中に安定化剤を添加する。
−ス、中性脂肪、コレステロ−／Ｌ＝、 リン脂質、
乳酸等の測定を目的とする酵素的測定法における各々の
基質とオキシダーゼが作用して過酸化水素を生成させる
酵素反応系、及び過酸化水素をパーオキシダーゼと水素
供与体の発色系により比色定量を行なうに必要な測定試
薬を含む。通常、この試薬形態は１試薬系タイプか、ま
たは２試薬系タイプにまとめられているので、後者の場
合にはＡＳＯを含有する試薬中に安定化剤を添加する。
しかし、酵素反応系で使用する共役酵素が金属を必要と
する場合には、その金属使用量は通常１．Ａ／〜１０ｍ
Ａ／程度で酵素触媒作用が行われており、それ以上の濃
度を添加して本発明の目的とすることはできない。
する場合には、その金属使用量は通常１．Ａ／〜１０ｍ
Ａ／程度で酵素触媒作用が行われており、それ以上の濃
度を添加して本発明の目的とすることはできない。
緩衝液は、一般的にＰＨ４〜９．５の範囲で維持できる
リン酸塩、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥ
Ｓ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰ
ＥＳ等を用いる。
リン酸塩、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥ
Ｓ、イミダゾール、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰ
ＥＳ等を用いる。
ＡＳＯを含有する溶液に、本発明の安定化剤を添加する
ことにより無添加に比べ、ＡＳＯの安定化が極めて大き
い。
ことにより無添加に比べ、ＡＳＯの安定化が極めて大き
い。
なお、溶液中のＡＳＯの酵素活性は以下の方法で測定す
る。
る。
１、反応液の組成
（１） ０．２Ｍリン酸カリウム及び１７７１Ｍエチ
レンジアミンテトラ酢酸・２ナトリウム塩を含む１ｍｋ
ｆアスコルビレ酸溶液。
レンジアミンテトラ酢酸・２ナトリウム塩を含む１ｍｋ
ｆアスコルビレ酸溶液。
（２） １０ｍＭリン酸２ナトリウム溶液。
（３） ＩＬＩ／ｍ１ＡｓＯを含有する溶液（ＡＳＯ
Ｂよ使用時０．０８〜０．３５１Ｊ／ｍｌｉ、：ｏ、ｏ
５％ＢＳＡ含有１１０７１Ｉリン酸２ナトリウムで希釈
する）。
Ｂよ使用時０．０８〜０．３５１Ｊ／ｍｌｉ、：ｏ、ｏ
５％ＢＳＡ含有１１０７１Ｉリン酸２ナトリウムで希釈
する）。
２９反応条件及びＡＳＯの力価
試験管にアスコルビン酸溶液０ 、５ｍＡ？とリン酸２
ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、３０℃で５分間予備
加温する。次に、ＡＳＯを含有する溶液０．１７７Ｌｌ
を加え、３０°Ｃで５分間反応させた後、０・２Ｎ塩酸
溶液を３．０ｙｎｌ加えて反応を停止させる。この時、
分解されるアスコルビン酸量を２４５７１ｍの吸光度の
減少量から求める。この際のアスコルビン酸の分子吸光
係数は〔ε−１０ＸＩＯ−３１を用い、ＡＳＯの力価を
算出する。
ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、３０℃で５分間予備
加温する。次に、ＡＳＯを含有する溶液０．１７７Ｌｌ
を加え、３０°Ｃで５分間反応させた後、０・２Ｎ塩酸
溶液を３．０ｙｎｌ加えて反応を停止させる。この時、
分解されるアスコルビン酸量を２４５７１ｍの吸光度の
減少量から求める。この際のアスコルビン酸の分子吸光
係数は〔ε−１０ＸＩＯ−３１を用い、ＡＳＯの力価を
算出する。
ＡＳＯ力価の表示は、上記条件下で１分間に１μモルの
アスコルビン酸が分解されるＡ Ｓ Ｏａミラ単位とし
て行う。
アスコルビン酸が分解されるＡ Ｓ Ｏａミラ単位とし
て行う。
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例 １
（１）方法
２ Ｕ／ｍｌ Ａ Ｓ ＯＣベーリンガー・マンハイム
社製〕を含有する５０ｍＡ／ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ＰＨ７、０）を１００１Ｌｌ調整した。
社製〕を含有する５０ｍＡ／ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ＰＨ７、０）を１００１Ｌｌ調整した。
これに、第１表に示される塩類を５ Ｑ ｍ Ｍずつ添
加して、２５°Ｃで１２日間保存した場合のＡＳＯ活性
の残存率を測定した。この結果を第１表に示す。
加して、２５°Ｃで１２日間保存した場合のＡＳＯ活性
の残存率を測定した。この結果を第１表に示す。
（２）結果
第１表から明らかなように、いずれのＡＳＯ溶液も無添
加に比べ、本発明の塩類の添加で、ＡＳＯの保存安定性
が著しく向上した。
加に比べ、本発明の塩類の添加で、ＡＳＯの保存安定性
が著しく向上した。
第１表
実施例 ２
（１）方法
２１Ｊ／ｍ１ＡｓＯ及び５０ｍＡｆ塩化カリウムを含有
する次の緩衝液を各々１００ｍ１調整した。これに、ロ
キシー３−スルホプロピル） −ｍ、 −トルイジンの
ＡＳＯ活性の残存率を測定した。この結果を第２表に示
す。
する次の緩衝液を各々１００ｍ１調整した。これに、ロ
キシー３−スルホプロピル） −ｍ、 −トルイジンの
ＡＳＯ活性の残存率を測定した。この結果を第２表に示
す。
■ ５０ｒｎＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）。
■ ５０−Ａ／ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（
ＰＩＩ７．（Ｊ）。
ＰＩＩ７．（Ｊ）。
■ ５０ｍｋｆビスートリスー塩酸緩衝液（ＰＨ７、０
）。
）。
（２）結果
第２表から明らかなように、いずれの緩衝液も無添加に
比べ、酵素カタラーゼとパーオキ７ダーゼを併用して添
加することで、ＡＳＯの保存安定性が向上した。
比べ、酵素カタラーゼとパーオキ７ダーゼを併用して添
加することで、ＡＳＯの保存安定性が向上した。
第２表
※塩は塩ｆヒカリウム、ＣＡＴはカタラーゼ、ＰＯＤは
パーオキシダーゼ（３ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン含）実
施例 ３ （１）方法 遊離脂肪酸測定試薬（２試薬系）のうち、ＡＳＯを含有
する方の試薬、即ち０．３ｍ＆コエンザイムＡ、１．５
ｍ、Ａ／アデノシントリフオスフェート、０．４Ｕ／ｍ
ｌアシルコエンザイムＡシンセターゼ、１ｍＡ／塩化マ
グネシウム、２ｍＭ４−アミノアンチピリン１、 Ｕ／
ｍｌ Ａ Ｓ Ｏを含有する５ ０ ｍ Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ＰＪｆ７．Ｏ＞を１００ｍＡ調整した。こ
れに５０ ｍ、 ｌ塩化カリウムまたは１００ＬＩ／ｍ
Ａカタラーゼと１０Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼを添加し
て、２〜８℃で７日間保存した場合のＡＳＯ活性の残存
率を測定した。この結果を第３表に示す。
パーオキシダーゼ（３ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン含）実
施例 ３ （１）方法 遊離脂肪酸測定試薬（２試薬系）のうち、ＡＳＯを含有
する方の試薬、即ち０．３ｍ＆コエンザイムＡ、１．５
ｍ、Ａ／アデノシントリフオスフェート、０．４Ｕ／ｍ
ｌアシルコエンザイムＡシンセターゼ、１ｍＡ／塩化マ
グネシウム、２ｍＭ４−アミノアンチピリン１、 Ｕ／
ｍｌ Ａ Ｓ Ｏを含有する５ ０ ｍ Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ＰＪｆ７．Ｏ＞を１００ｍＡ調整した。こ
れに５０ ｍ、 ｌ塩化カリウムまたは１００ＬＩ／ｍ
Ａカタラーゼと１０Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼを添加し
て、２〜８℃で７日間保存した場合のＡＳＯ活性の残存
率を測定した。この結果を第３表に示す。
（２）結果
第３表から明らかなように、ＡＳＯを含有した生体成分
を測定する試薬系においても無添加に比べ、塩及びカタ
ラーゼあるいはパーオキシダーゼの添加で、ＡＳＯの保
存安定性が著しく向上した。
を測定する試薬系においても無添加に比べ、塩及びカタ
ラーゼあるいはパーオキシダーゼの添加で、ＡＳＯの保
存安定性が著しく向上した。
第３表
Claims (4)
- （１）アスコルビン酸オキシダーゼを含有する溶液に、
金属または陽性の塩基性基と陰性の酸基とから成る化合
物、もしくは該化合物とカタラーゼ及び／又はパーオキ
シダーゼと酸化性色素カップラーを併用して添加するこ
とを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化法
。 - （２）金属がナトリウム、カリウム、リチウムまたはマ
グネシウムである、特許請求の範囲第１項記載の安定化
法。 - （３）陽性の塩基性基がアンモニウムである、特許請求
の範囲第１項の安定化法。 - （４）陰性の酸基が塩素、臭素、ヨウ素、硫酸、酢酸ま
たはリン酸である、特許請求の範囲第１項記載の安定法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61191972A JPH0815430B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61191972A JPH0815430B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6349081A true JPS6349081A (ja) | 1988-03-01 |
| JPH0815430B2 JPH0815430B2 (ja) | 1996-02-21 |
Family
ID=16283502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61191972A Expired - Lifetime JPH0815430B2 (ja) | 1986-08-19 | 1986-08-19 | アスコルビン酸オキシダ−ゼの安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0815430B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0466087A (ja) * | 1990-07-05 | 1992-03-02 | Sunstar Inc | 安定化されたアスコルビン酸酸化酵素組成物 |
| JPH0455022U (ja) * | 1990-09-14 | 1992-05-12 | ||
| US5891660A (en) * | 1995-05-10 | 1999-04-06 | Dojindo Laboratories | Method of inhibiting the activity of the reducing substances in oxidative chromogenic analysis |
| WO2013176225A1 (ja) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52143285A (en) * | 1976-05-26 | 1977-11-29 | Kikkoman Corp | Stabilization of cholesterol-oxydase |
| JPS5783296A (en) * | 1980-09-19 | 1982-05-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for measuring glycerine |
-
1986
- 1986-08-19 JP JP61191972A patent/JPH0815430B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52143285A (en) * | 1976-05-26 | 1977-11-29 | Kikkoman Corp | Stabilization of cholesterol-oxydase |
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| JPH0466087A (ja) * | 1990-07-05 | 1992-03-02 | Sunstar Inc | 安定化されたアスコルビン酸酸化酵素組成物 |
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| JP2521097Y2 (ja) * | 1990-09-14 | 1996-12-25 | シャープ株式会社 | 液晶表示装置 |
| US5891660A (en) * | 1995-05-10 | 1999-04-06 | Dojindo Laboratories | Method of inhibiting the activity of the reducing substances in oxidative chromogenic analysis |
| WO2013176225A1 (ja) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JPWO2013176225A1 (ja) * | 2012-05-25 | 2016-01-14 | 協和メデックス株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| US9546363B2 (en) | 2012-05-25 | 2017-01-17 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for stabilizing ascorbic acid oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0815430B2 (ja) | 1996-02-21 |
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