JP2001299387A - 安定な液状分析用組成物 - Google Patents
安定な液状分析用組成物Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 熱安定性、保存安定性の良い、液状分析用組
成物、特にアスコルビン酸消去能力の維持の点において
安定な、液状分析用組成物の提供。 【解決手段】 ４０℃６日後におけるアスコルビン酸４
０ｍｇ／ｄＬ添加時のアスコルビン酸消去能力が８５．
９６％を超える例えば、カボチャククルビタモスカータ
（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）由来の、ア
スコルビン酸オキシダーゼを含有する液状分析用組成
物。
成物、特にアスコルビン酸消去能力の維持の点において
安定な、液状分析用組成物の提供。 【解決手段】 ４０℃６日後におけるアスコルビン酸４
０ｍｇ／ｄＬ添加時のアスコルビン酸消去能力が８５．
９６％を超える例えば、カボチャククルビタモスカータ
（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）由来の、ア
スコルビン酸オキシダーゼを含有する液状分析用組成
物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は熱安定性、保存安定
性の良い、液状分析用組成物に関する。
性の良い、液状分析用組成物に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】アスコルビン酸オキシ
ダーゼは既に知られているように、キュウリ（キュキュ
ミス エスピー、Cucumis sp. ：東洋紡社製）及び、カ
ボチャ（ククルビタ エスピー、Cucurbita sp. ：ベー
リンガーマンハイム社製）から生産され市販されてい
る。しかしながら、従来のアスコルビン酸オキシダーゼ
では、臨床診断用試薬、殊に液状分析用組成物として用
いる場合、保存安定性が不十分であった。また最近、臨
床診断の自動分析に於て、簡便化追求の一つの方向とし
て試薬溶解の手間を不要とする液状分析用組成物が注目
され、種々の試みがなされている。本発明の目的は、上
記現状に鑑み、熱安定性、保存安定性の良い、液状分析
用組成物を提供することである。
ダーゼは既に知られているように、キュウリ（キュキュ
ミス エスピー、Cucumis sp. ：東洋紡社製）及び、カ
ボチャ（ククルビタ エスピー、Cucurbita sp. ：ベー
リンガーマンハイム社製）から生産され市販されてい
る。しかしながら、従来のアスコルビン酸オキシダーゼ
では、臨床診断用試薬、殊に液状分析用組成物として用
いる場合、保存安定性が不十分であった。また最近、臨
床診断の自動分析に於て、簡便化追求の一つの方向とし
て試薬溶解の手間を不要とする液状分析用組成物が注目
され、種々の試みがなされている。本発明の目的は、上
記現状に鑑み、熱安定性、保存安定性の良い、液状分析
用組成物を提供することである。
【０００３】一方、臨床検査分野において、検体中のア
スコルビン酸が測定系に影響を与える場合、かかる系に
アスコルビン酸オキシダーゼを共存せしめ、アスコルビ
ン酸を酸化分解して消去し、その妨害を排除することが
行われてきた。アスコルビン酸オキシダーゼは既に知ら
れているように、キュウリ（キュキュミス エスピー、C
ucumis sp. ：東洋紡社製）及び、カボチャ（ククルビ
タ エスピー、Cucurbita sp. ：ベーリンガーマンハイ
ム社製）から生産され市販されている。しかしながら、
従来のアスコルビン酸オキシダーゼでは、臨床診断用試
薬、殊に液状分析用組成物として用いる場合、保存安定
性が不十分であった。したがって、アスコルビン酸消去
能力に関してもその能力を長期間にわたって維持するこ
とは困難な状況であった。
スコルビン酸が測定系に影響を与える場合、かかる系に
アスコルビン酸オキシダーゼを共存せしめ、アスコルビ
ン酸を酸化分解して消去し、その妨害を排除することが
行われてきた。アスコルビン酸オキシダーゼは既に知ら
れているように、キュウリ（キュキュミス エスピー、C
ucumis sp. ：東洋紡社製）及び、カボチャ（ククルビ
タ エスピー、Cucurbita sp. ：ベーリンガーマンハイ
ム社製）から生産され市販されている。しかしながら、
従来のアスコルビン酸オキシダーゼでは、臨床診断用試
薬、殊に液状分析用組成物として用いる場合、保存安定
性が不十分であった。したがって、アスコルビン酸消去
能力に関してもその能力を長期間にわたって維持するこ
とは困難な状況であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討したところ、カボチャ クク
ルビタ モスカータ（Cucurbita moschata）由来のアス
コルビン酸オキシダーゼが、従来より知られているクク
ルビタ ペポ（Cucurbita pepo、米国特許第4,168,205
号明細書参照）及び、キュキュミス エスピー（Cucumi
s sp. 、J.Biochem .,Vol.64,No.2,P189−195,1968参
照）より保存安定性がよいことを見い出し、これを液状
分析用組成物に適用することで本発明を完成した。
を達成するために鋭意検討したところ、カボチャ クク
ルビタ モスカータ（Cucurbita moschata）由来のアス
コルビン酸オキシダーゼが、従来より知られているクク
ルビタ ペポ（Cucurbita pepo、米国特許第4,168,205
号明細書参照）及び、キュキュミス エスピー（Cucumi
s sp. 、J.Biochem .,Vol.64,No.2,P189−195,1968参
照）より保存安定性がよいことを見い出し、これを液状
分析用組成物に適用することで本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明の要旨は、４０℃６日後
におけるアスコルビン酸４０ｍｇ／ｄＬ添加時のアスコ
ルビン酸消去能力が８５．９６％を超える液状分析用組
成物に存する。
におけるアスコルビン酸４０ｍｇ／ｄＬ添加時のアスコ
ルビン酸消去能力が８５．９６％を超える液状分析用組
成物に存する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の安定な液状分析用組成物
は、アスコルビン酸オキシダーゼと生化学分析に用いら
れる通常の緩衝液を含有し、使用目的に応じて、緩衝液
中にキレート剤、無機塩類、アルブミン、アミノ酸、界
面活性剤、抗生物質、４-アミノアンチピリン、トリン
ダー試薬（酸化発色色素）、ロイコ色素、ホルマザン色
素、酸化酵素、脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、異性化
酵素、りん酸化酵素、ヒドロラーゼなどを含有すること
もできる。
は、アスコルビン酸オキシダーゼと生化学分析に用いら
れる通常の緩衝液を含有し、使用目的に応じて、緩衝液
中にキレート剤、無機塩類、アルブミン、アミノ酸、界
面活性剤、抗生物質、４-アミノアンチピリン、トリン
ダー試薬（酸化発色色素）、ロイコ色素、ホルマザン色
素、酸化酵素、脱水素酵素、ペルオキシダーゼ、異性化
酵素、りん酸化酵素、ヒドロラーゼなどを含有すること
もできる。
【０００７】本発明の安定な液状分析用組成物に用いる
アスコルビン酸オキシダーゼは、特に限定されないが、
下記の理化学的性質をもつククルビタ モスカータ（Cu
curubita moschata ）由来のものが適している。 （１）作用：１モルのアスコルビン酸と１／２モルの酵
素より、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モルの水
を生ずる反応を触媒する。 （２）基質特異性：少なくともアスコルビン酸に特異的
に作用する。 （３）至適ｐＨ：５．５〜６．５ （４）ｐＨ安定性：６．０〜１０．０ （５）至適温度：約４５℃ （６）熱安定性：５０℃、１時間処理において、少なく
とも８０％の残存活性を有する。又、５５℃、１時間処
理において、少なくとも５０％の残存活性を有する。な
お、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼの他の理化学
的性質は下記の通りである。 （７）分子量：約１４０，０００（ゲル濾過法） （８）Ｋｍ値：２．７×１０-4Ｍ付近 （９）等電点：５．５±０．２ （10) 界面活性剤の影響： 0.1%Triton X-100、Briji
35、Tween 20、Span 20等の存在下で１００％の残存活
性を有する。
アスコルビン酸オキシダーゼは、特に限定されないが、
下記の理化学的性質をもつククルビタ モスカータ（Cu
curubita moschata ）由来のものが適している。 （１）作用：１モルのアスコルビン酸と１／２モルの酵
素より、１モルのデヒドロアスコルビン酸と１モルの水
を生ずる反応を触媒する。 （２）基質特異性：少なくともアスコルビン酸に特異的
に作用する。 （３）至適ｐＨ：５．５〜６．５ （４）ｐＨ安定性：６．０〜１０．０ （５）至適温度：約４５℃ （６）熱安定性：５０℃、１時間処理において、少なく
とも８０％の残存活性を有する。又、５５℃、１時間処
理において、少なくとも５０％の残存活性を有する。な
お、本発明のアスコルビン酸オキシダーゼの他の理化学
的性質は下記の通りである。 （７）分子量：約１４０，０００（ゲル濾過法） （８）Ｋｍ値：２．７×１０-4Ｍ付近 （９）等電点：５．５±０．２ （10) 界面活性剤の影響： 0.1%Triton X-100、Briji
35、Tween 20、Span 20等の存在下で１００％の残存活
性を有する。
【０００８】上記のアスコルビン酸オキシダーゼは、例
えば「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾武一、山下仁
平編、南江堂、1982）に記載された方法に準じて、原料
であるククルビタ モスカータ（Cucurbita moschata）
を破砕し、緩衝液等で抽出した後、硫安塩析、吸着クロ
マトグラフィー等により精製することによって得られ
る。具体的には、例えば次のような手順を経る。原料で
あるククルビタ モスカータ（Cucurubita moschata ）
を破砕し、ホウ酸緩衝液で抽出した後、濾過を行い固形
物を除き、上澄みを得る。硫酸アンモニウムで塩析処理
し、塩析沈殿物を得る。これを緩衝液にて再懸濁し、更
に塩析処理を行い、塩析沈殿物を得る。これを緩衝液に
て再懸濁し、同緩衝液で平衡化したイオン交換クロマト
グラフィー、疎水クロマトグラフィーに供し、NaClグラ
ジエント、飽和度を下げるなどしてアスコルビン酸オキ
シダーゼ画分を得る。このアスコルビン酸オキシダーゼ
画分をセファデックスＧ−２５などで脱塩し、酵素を得
る。
えば「蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾武一、山下仁
平編、南江堂、1982）に記載された方法に準じて、原料
であるククルビタ モスカータ（Cucurbita moschata）
を破砕し、緩衝液等で抽出した後、硫安塩析、吸着クロ
マトグラフィー等により精製することによって得られ
る。具体的には、例えば次のような手順を経る。原料で
あるククルビタ モスカータ（Cucurubita moschata ）
を破砕し、ホウ酸緩衝液で抽出した後、濾過を行い固形
物を除き、上澄みを得る。硫酸アンモニウムで塩析処理
し、塩析沈殿物を得る。これを緩衝液にて再懸濁し、更
に塩析処理を行い、塩析沈殿物を得る。これを緩衝液に
て再懸濁し、同緩衝液で平衡化したイオン交換クロマト
グラフィー、疎水クロマトグラフィーに供し、NaClグラ
ジエント、飽和度を下げるなどしてアスコルビン酸オキ
シダーゼ画分を得る。このアスコルビン酸オキシダーゼ
画分をセファデックスＧ−２５などで脱塩し、酵素を得
る。
【０００９】本発明に用いる緩衝液種及びその濃度は特
に限定されるものではないが、pH5.5 〜8.5 の間で緩衝
能を有し、且つ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定され
ていることが望ましい。この様な緩衝液種として汎用的
なリン酸バッファーやトリスバッファーを使用すること
もできるし、ＢＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＴＥＳ等のグッドバ
ッファーを使用することもできる。緩衝液濃度は好まし
くは10ｍＭ〜0.5 Ｍ、更に好ましくは50ｍＭ〜0.1 Ｍで
ある。キレート剤としては、EDTA等を、無機塩類として
はNaCl、MgCl2等を、アルブミンとしては、牛血清、人
血清、馬血清などの由来のものを、アミノ酸としては、
アルギニン、リジン、ヒスチジン等を、含有することが
できる。
に限定されるものではないが、pH5.5 〜8.5 の間で緩衝
能を有し、且つ必要十分な緩衝能を保つ濃度に設定され
ていることが望ましい。この様な緩衝液種として汎用的
なリン酸バッファーやトリスバッファーを使用すること
もできるし、ＢＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＴＥＳ等のグッドバ
ッファーを使用することもできる。緩衝液濃度は好まし
くは10ｍＭ〜0.5 Ｍ、更に好ましくは50ｍＭ〜0.1 Ｍで
ある。キレート剤としては、EDTA等を、無機塩類として
はNaCl、MgCl2等を、アルブミンとしては、牛血清、人
血清、馬血清などの由来のものを、アミノ酸としては、
アルギニン、リジン、ヒスチジン等を、含有することが
できる。
【００１０】又、本発明は、場合によって、Ｉ液組成物
でも、ＩＩ液組成物、ＩＩＩ液組成物でもよく、その選
択は、測定する物質や、測定を実施する自動分析機の性
能に従って、好適に組み合わせることが出来る。
でも、ＩＩ液組成物、ＩＩＩ液組成物でもよく、その選
択は、測定する物質や、測定を実施する自動分析機の性
能に従って、好適に組み合わせることが出来る。
【００１１】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 実施例１および比較例１
る。 実施例１および比較例１
【００１２】液状分析用組成物の一例として、グッドバ
ッファー、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリ
ン、トリンダー試薬、基質、酸化酵素、界面活性剤など
から構成されるアスコルビン酸オキシダーゼを含有する
下記組成の無機リン測定液状試薬を調製し、アスコルビ
ン酸消去能を測定し、比較した。なお、本発明の液状分
析用組成物においては、アスコルビン酸オキシダーゼと
して、ククルビタ モスカータ（Cucurubita moschata
）由来のものを用いた。比較例として、ククルビタ
モスカータと同様の精製法で調整したククルビタ ペポ
（Cucurbita pepo）、キュキュミス エスピー（Cucumi
s sp. ）及びククルビタ エスピー（Cucurbita sp. ）
由来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いて、同様に液
状分析用組成物を調製した。
ッファー、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリ
ン、トリンダー試薬、基質、酸化酵素、界面活性剤など
から構成されるアスコルビン酸オキシダーゼを含有する
下記組成の無機リン測定液状試薬を調製し、アスコルビ
ン酸消去能を測定し、比較した。なお、本発明の液状分
析用組成物においては、アスコルビン酸オキシダーゼと
して、ククルビタ モスカータ（Cucurubita moschata
）由来のものを用いた。比較例として、ククルビタ
モスカータと同様の精製法で調整したククルビタ ペポ
（Cucurbita pepo）、キュキュミス エスピー（Cucumi
s sp. ）及びククルビタ エスピー（Cucurbita sp. ）
由来のアスコルビン酸オキシダーゼを用いて、同様に液
状分析用組成物を調製した。
【００１３】 試薬組成 Ｒ１ ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ６．８） ５０ｍＭ トリトンＸ−１００（界面活性剤） ０．１ ％ アスコルビン酸オキシダーゼ（ククルビタ モスカータ（実施例）、ク クルビタ ペポ（比較例）、キュキュミス エスピー（比較例）及びククルビタ エスピー（比較例）由来） ７．０ Ｕ／ｍｌ ＸＴＯ（キサンチンオキシダーゼ） ２．０Ｕ／ｍｌ ＰＥＯ（ペルオキシダーゼ） ５．０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰＳ（トリンダ−試薬） ０．２ｍｇ／ｍｌ Ｒ２ ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ６．８） ５０ｍＭ ＰＮＰ（プリンヌクレオシドりん酸化酵素）１．０Ｕ／ｍｌ ４−ＡＡ（４−アミノアンチピリン） ０．２ｍｇ／ｍｌ イノシン（基質） ８．０ｍｇ／ｍｌ トリトンＸ−１００（界面活性剤） ０．１％
【００１４】上記液状分析用組成物のアスコルビン酸消
去能を表２に示す。表２より、本発明の場合、４０℃、
２週間後においても十分なアスコルビン酸の消去能力が
維持されており、本発明の安定性が優れていることが認
められる。
去能を表２に示す。表２より、本発明の場合、４０℃、
２週間後においても十分なアスコルビン酸の消去能力が
維持されており、本発明の安定性が優れていることが認
められる。
【００１５】
【表１】 ４０℃、２週間保存前後のアスコルビン酸消去能（％） （アスコルビン酸 40mg/dl 添加時）
【００１６】実施例２ 実施例１と同様にアスコルビン酸オキシダーゼを含有す
る下記組成の尿酸測定液状試薬を調製し、４０℃で６日
間保存し、３日目、６日目にアスコルビン酸消去能を測
定した。なお、本発明の液状分析用組成物においては、
アスコルビン酸オキシダーゼとして、ククルビタ モス
カータ（Cucurubita moschata ）由来のものを用いた。
比較例として、ククルビタ モスカータと同様の精製法
で調整したククルビタ ペポ（Cucurbita pepo）、キュ
キュミス エスピー（Cucumis sp. ）及びククルビタ
エスピー（Cucurbita sp. ）由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼを用いて、同様に液状分析用組成物を調製し
た。
る下記組成の尿酸測定液状試薬を調製し、４０℃で６日
間保存し、３日目、６日目にアスコルビン酸消去能を測
定した。なお、本発明の液状分析用組成物においては、
アスコルビン酸オキシダーゼとして、ククルビタ モス
カータ（Cucurubita moschata ）由来のものを用いた。
比較例として、ククルビタ モスカータと同様の精製法
で調整したククルビタ ペポ（Cucurbita pepo）、キュ
キュミス エスピー（Cucumis sp. ）及びククルビタ
エスピー（Cucurbita sp. ）由来のアスコルビン酸オキ
シダーゼを用いて、同様に液状分析用組成物を調製し
た。
【００１７】 試薬組成 Ｒ１ ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ６．８） ５０ｍＭ トリトンＸ−１００ ０．１％ アスコルビン酸オキシダーゼ ７．０Ｕ／ｍｌ ＰＥＯ ５．０Ｕ／ｍｌ ４−ＡＡ（４−アミノアンチピリン） ０．２ｍｇ／ｍｌ Ｒ２ ＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ６．８） ５０ｍＭ ＵＡＯ（ウリカーゼ） ０．２Ｕ／ｍｌ ＥＨＳＰＴ ０．２Ｕ／ｍｌ （N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-m-トルイジン):トリンダー 試薬） トリトンＸ−１００ ０．１％
【００１８】上記液状分析用組成物のアスコルビン酸消
去能を表２に示す。表２に示すように、本発明では４０
℃で６日保存後も９５．１７％と充分なアスコルビン酸
消去能が存在するのに対し、比較例の場合、最高でも８
５．９６％の消去能しかなく、充分とは言えず、本発明
のアスコルビン酸オキシダーゼが保存安定性において優
れていることが認められる。
去能を表２に示す。表２に示すように、本発明では４０
℃で６日保存後も９５．１７％と充分なアスコルビン酸
消去能が存在するのに対し、比較例の場合、最高でも８
５．９６％の消去能しかなく、充分とは言えず、本発明
のアスコルビン酸オキシダーゼが保存安定性において優
れていることが認められる。
【００１９】
【表２】 40 ℃, ３、６日保存前後のアスコルビン酸消去能
（％） （アスコルビン酸 40mg/dl 添加時）
（％） （アスコルビン酸 40mg/dl 添加時）
【００２０】
【発明の効果】本発明により、熱安定性、保存安定性の
良い、液状分析用組成物、特にアスコルビン酸消去能力
の維持の点において安定な、液状分析用組成物が提供さ
れる。
良い、液状分析用組成物、特にアスコルビン酸消去能力
の維持の点において安定な、液状分析用組成物が提供さ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 愛水 重典 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 ４０℃６日後におけるアスコルビン酸４
０ｍｇ／ｄＬ添加時のアスコルビン酸消去能力が８５．
９６％を超える液状分析用組成物
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001068808A JP2001299387A (ja) | 2001-03-12 | 2001-03-12 | 安定な液状分析用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001068808A JP2001299387A (ja) | 2001-03-12 | 2001-03-12 | 安定な液状分析用組成物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23472992A Division JP3216735B2 (ja) | 1992-09-02 | 1992-09-02 | 新規なアスコルビン酸オキシダーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299387A true JP2001299387A (ja) | 2001-10-30 |
Family
ID=18926940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001068808A Pending JP2001299387A (ja) | 2001-03-12 | 2001-03-12 | 安定な液状分析用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001299387A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019165680A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JP2019165679A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
-
2001
- 2001-03-12 JP JP2001068808A patent/JP2001299387A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019165680A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JP2019165679A (ja) * | 2018-03-23 | 2019-10-03 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JP7131009B2 (ja) | 2018-03-23 | 2022-09-06 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
| JP7131008B2 (ja) | 2018-03-23 | 2022-09-06 | 東洋紡株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040305 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040624 |