JPH0354304B2 - - Google Patents
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- JPH0354304B2 JPH0354304B2 JP59056719A JP5671984A JPH0354304B2 JP H0354304 B2 JPH0354304 B2 JP H0354304B2 JP 59056719 A JP59056719 A JP 59056719A JP 5671984 A JP5671984 A JP 5671984A JP H0354304 B2 JPH0354304 B2 JP H0354304B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は化学発光法による過酸化水素の定量法
に関するものである。
に関するものである。
ルミノール法、ルシゲニン法などの化学発光法
による過酸化水素の定量法は旧知の方法として有
名であるが、これらの方法は反応がアルカリ性下
で行われないと、過酸化水素の定量として感度が
十分に出ないという欠点がある。また、化学発光
法を臨床検査分野における生化学検査に用いる場
合は、血清、尿などの生体試料中の成分の影響を
強く受け、発光活性が減弱するばかりでなく、測
定値にバラツキが生じ信頼がおかれていない。こ
のため生体試料を少くして用いるなど種々工夫が
なされているが、逆に試料量減少のために測定感
度を低下させるという矛盾を有する。
による過酸化水素の定量法は旧知の方法として有
名であるが、これらの方法は反応がアルカリ性下
で行われないと、過酸化水素の定量として感度が
十分に出ないという欠点がある。また、化学発光
法を臨床検査分野における生化学検査に用いる場
合は、血清、尿などの生体試料中の成分の影響を
強く受け、発光活性が減弱するばかりでなく、測
定値にバラツキが生じ信頼がおかれていない。こ
のため生体試料を少くして用いるなど種々工夫が
なされているが、逆に試料量減少のために測定感
度を低下させるという矛盾を有する。
本発明者等は生体試料の妨害を受けることな
く、化学発光法により過酸化水素を高感度に定量
する方法を見出すために、種々鋭意検討したとこ
ろ、修酸ジエステル類と螢光物質と過酸化水素と
の反応では血清成分の影響を受けることなく、発
光量を測定することが可能であることを見出し
た。ところがこの反応は有機溶媒中で行なう必要
があるため、一般に水系で行なわれる臨床検査分
野の分析に共存させることは困難である。したが
つて、水系反応で生成した過酸化水素を酸化触媒
を介して被酸化性の非螢光物質に反応させて、螢
光物質を得、この螢光物質を酸化触媒の阻害条件
下に修酸ジエステルと過酸化水素とを反応させる
と、血清中のカタラーゼの影響を受けることな
く、高感度に過酸化水素を定量することが可能で
あることを見出し、本発明に到達した。すなわし
本発明は過酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介
して被酸化性の非螢光物質を反応させて、非螢光
物質を螢光物質に転換させ、次いで酸化触媒の阻
害条件下に該螢光物質を修酸ジエステル類および
過酸化水素と反応させ、生成する発光量を測定す
ることにより、試料中の過酸化水素を定量するこ
とを特徴とする化学発光法による過酸化水素の定
量法である。
く、化学発光法により過酸化水素を高感度に定量
する方法を見出すために、種々鋭意検討したとこ
ろ、修酸ジエステル類と螢光物質と過酸化水素と
の反応では血清成分の影響を受けることなく、発
光量を測定することが可能であることを見出し
た。ところがこの反応は有機溶媒中で行なう必要
があるため、一般に水系で行なわれる臨床検査分
野の分析に共存させることは困難である。したが
つて、水系反応で生成した過酸化水素を酸化触媒
を介して被酸化性の非螢光物質に反応させて、螢
光物質を得、この螢光物質を酸化触媒の阻害条件
下に修酸ジエステルと過酸化水素とを反応させる
と、血清中のカタラーゼの影響を受けることな
く、高感度に過酸化水素を定量することが可能で
あることを見出し、本発明に到達した。すなわし
本発明は過酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介
して被酸化性の非螢光物質を反応させて、非螢光
物質を螢光物質に転換させ、次いで酸化触媒の阻
害条件下に該螢光物質を修酸ジエステル類および
過酸化水素と反応させ、生成する発光量を測定す
ることにより、試料中の過酸化水素を定量するこ
とを特徴とする化学発光法による過酸化水素の定
量法である。
本発明方法を反応式で示すと次の通りである。
非螢光物質＋H2O2酸化触媒
――――――→
螢光物質
＋2H2O …(1)
螢光物質＋修酸ジエステル＋H2O2→hγ＋生成物
…(2) すなわち被酸化性の非螢光物質を過酸化水素、
例えば生体成分より生成する過酸化水素によつ
て、酸化触媒の存在下に螢光物質に転換させ（第
１反応）、次いで酸化触媒を阻害条件下、例えば
阻害剤を加えて酸化触媒を阻害させた後、生成し
た螢光物質を修酸ジエステル類と改めて加えた過
酸化水素の存在下に発光させ（第２反応）、この
発光量を測定することにより第１段反応での過酸
化水素の定量を行なう。
…(2) すなわち被酸化性の非螢光物質を過酸化水素、
例えば生体成分より生成する過酸化水素によつ
て、酸化触媒の存在下に螢光物質に転換させ（第
１反応）、次いで酸化触媒を阻害条件下、例えば
阻害剤を加えて酸化触媒を阻害させた後、生成し
た螢光物質を修酸ジエステル類と改めて加えた過
酸化水素の存在下に発光させ（第２反応）、この
発光量を測定することにより第１段反応での過酸
化水素の定量を行なう。
本発明における過酸化水素を含む試料とは、過
酸化水素自体、または生体試料、例えば血液また
は尿中の成分、例えば尿酸、コレステロール、グ
ルコース、クレアチニン、ポリアミン等から生成
した過酸化水素を含む試料をいう。
酸化水素自体、または生体試料、例えば血液また
は尿中の成分、例えば尿酸、コレステロール、グ
ルコース、クレアチニン、ポリアミン等から生成
した過酸化水素を含む試料をいう。
本発明において使用する被酸化性の非螢光物質
としてはロイコフルオレセイン（フルオレシン）、
2′，7′―ジクロロフルオレシン―ジアセテートな
どがある。これらの化合物を他にもロイコロ―ダ
ミン、ロイコエオシンなどの還元型が酸化される
ことにより発螢光する群とホモバニリン酸、ｐ―
クレゾール、３―（ｐ―ヒドロキシフエニル）プ
ロピオン酸、チラミンなどの過酸化水素の存在下
に酸化縮合して発螢光する群どがある。非螢光物
質の使用量は一般に0.001〜5mMである。
としてはロイコフルオレセイン（フルオレシン）、
2′，7′―ジクロロフルオレシン―ジアセテートな
どがある。これらの化合物を他にもロイコロ―ダ
ミン、ロイコエオシンなどの還元型が酸化される
ことにより発螢光する群とホモバニリン酸、ｐ―
クレゾール、３―（ｐ―ヒドロキシフエニル）プ
ロピオン酸、チラミンなどの過酸化水素の存在下
に酸化縮合して発螢光する群どがある。非螢光物
質の使用量は一般に0.001〜5mMである。
本発明において使用する酸化触媒としては、ペ
ルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミ
ン、ヘマチンなどがある。酸化触媒の使用量は一
般に１〜100単位である。
ルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミ
ン、ヘマチンなどがある。酸化触媒の使用量は一
般に１〜100単位である。
本発明において使用する修酸ジエステル類とし
ては、ビス（２，４，６―トリクロロフエニル）
オキザレート（以下TCPOと略記する）、ビス
（２，４―ジニトロフエニル）オキザレートなど
がある。修酸ジエステル類の使用量は一般に0.1
〜50mMである。
ては、ビス（２，４，６―トリクロロフエニル）
オキザレート（以下TCPOと略記する）、ビス
（２，４―ジニトロフエニル）オキザレートなど
がある。修酸ジエステル類の使用量は一般に0.1
〜50mMである。
本発明の酸化触媒の阻害剤としては、シアン化
カリウム、シアン化ナトリウム、ナトリウムアジ
ド、スルフアイド、フルオライド、フエロシアナ
イド、ヒドロキシフエニルヒドラジン、２，３―
ジメルカプトプロパノール、酢酸エテル、アセト
ニトリル、エタノール、アセトンなどがある。
カリウム、シアン化ナトリウム、ナトリウムアジ
ド、スルフアイド、フルオライド、フエロシアナ
イド、ヒドロキシフエニルヒドラジン、２，３―
ジメルカプトプロパノール、酢酸エテル、アセト
ニトリル、エタノール、アセトンなどがある。
本発明では第１反応を水系で行なうことが必要
である。この反応は通常約20〜40℃、PH５〜９で
行なう。第１反応終了後、酸化触媒は阻害されな
ければならない。失活されない酸化触媒が存在し
ていると第２反応において、改めて加えられた過
酸化水素と残存する非螢光物質が反応して、過剰
量の螢光物質を生成してしまう。第１反応系には
10-5〜10-1Mのシクロデキストリンを添加する
と、非螢光物質の安定化ならびに生成した螢光物
質の発光性の増加が見られる。
である。この反応は通常約20〜40℃、PH５〜９で
行なう。第１反応終了後、酸化触媒は阻害されな
ければならない。失活されない酸化触媒が存在し
ていると第２反応において、改めて加えられた過
酸化水素と残存する非螢光物質が反応して、過剰
量の螢光物質を生成してしまう。第１反応系には
10-5〜10-1Mのシクロデキストリンを添加する
と、非螢光物質の安定化ならびに生成した螢光物
質の発光性の増加が見られる。
また本発明では酸化触媒（ペルオキシダーゼ）
存在下に、非螢光物質（ロイコフルオレセイン）
の酸化を防ぐために、硫酸亜鉛・７水和物を望ま
しくは約0.04mg／ml終濃度になるように、第１反
応系に添加することが好ましい。
存在下に、非螢光物質（ロイコフルオレセイン）
の酸化を防ぐために、硫酸亜鉛・７水和物を望ま
しくは約0.04mg／ml終濃度になるように、第１反
応系に添加することが好ましい。
本発明の第２反応は水を含む有機溶媒中で行な
う。有機溶媒としては、例えば酢酸エチル、アセ
トン、アセトニトリルなどが挙げられる。有機溶
媒は単独でもあるいは２種以上の混合物であつて
もよい。第２反応は通常約20〜40℃、アルカリ性
下、PH８〜12で行なう。
う。有機溶媒としては、例えば酢酸エチル、アセ
トン、アセトニトリルなどが挙げられる。有機溶
媒は単独でもあるいは２種以上の混合物であつて
もよい。第２反応は通常約20〜40℃、アルカリ性
下、PH８〜12で行なう。
第２反応系に添加する過酸化水素の量は一般に
0.1〜50mMである。
0.1〜50mMである。
第２反応系で生じた発光活性は通常の測定法に
従つて測定する。例えばピークの発光量をルミフ
オトメーターTD4000（ラボサイエンス社製）に
てカウントする。発光活性では発光値は常に反応
の時間あたりで表現されるため、そのまま反応速
度を表現している。
従つて測定する。例えばピークの発光量をルミフ
オトメーターTD4000（ラボサイエンス社製）に
てカウントする。発光活性では発光値は常に反応
の時間あたりで表現されるため、そのまま反応速
度を表現している。
本発明では生体試料の妨害を受けることなく、
化学発光法により過酸化水素を高感度に定量する
ことができる。
化学発光法により過酸化水素を高感度に定量する
ことができる。
従来の知見ではビス（２，４，６―トリクロロ
フエニル）オキザレートと螢光物質による過酸化
水素の定量性は感度が悪く、通常10-7〜10-6M以
上でないと検出されない。ところが本発明では被
酸化性の非螢光物質を選択することで、10-9まで
過酸化水素を測定することが可能となる。また本
発明では第１反応を水系中で行ない螢光物質を生
成するに際し、ペルオキシダーゼなどの酵素によ
る酸化を行なえば、付随する過酸化水素生成系反
応、例えばグルコース定量におけるグルコースオ
キシダーゼなどを損うことなく、温和な条件で過
酸化水素、ひいてはグルコースの定量を行なうこ
とができる。
フエニル）オキザレートと螢光物質による過酸化
水素の定量性は感度が悪く、通常10-7〜10-6M以
上でないと検出されない。ところが本発明では被
酸化性の非螢光物質を選択することで、10-9まで
過酸化水素を測定することが可能となる。また本
発明では第１反応を水系中で行ない螢光物質を生
成するに際し、ペルオキシダーゼなどの酵素によ
る酸化を行なえば、付随する過酸化水素生成系反
応、例えばグルコース定量におけるグルコースオ
キシダーゼなどを損うことなく、温和な条件で過
酸化水素、ひいてはグルコースの定量を行なうこ
とができる。
本発明では、生体試料中の成分から共存する反
応によつて生成する微量の過酸化水素を高感度
に、特に10-9〜10-5Mの範囲で測定することが可
能である。また生体成分分析に際して、水系の反
応を阻害することなく、安定な螢光物質を生成さ
せ、かつ生体試料中のカタラーゼなどの妨害によ
り生成した過酸化水素を減じることなく、真に定
量的にかつ高感度に生体成分の分析を行なうこと
ができる。本発明では特に第２反応が生体試料中
の妨害物質の影響を受けないので、感度の高い発
光活性を得ることができる。
応によつて生成する微量の過酸化水素を高感度
に、特に10-9〜10-5Mの範囲で測定することが可
能である。また生体成分分析に際して、水系の反
応を阻害することなく、安定な螢光物質を生成さ
せ、かつ生体試料中のカタラーゼなどの妨害によ
り生成した過酸化水素を減じることなく、真に定
量的にかつ高感度に生体成分の分析を行なうこと
ができる。本発明では特に第２反応が生体試料中
の妨害物質の影響を受けないので、感度の高い発
光活性を得ることができる。
本発明の方法は、試料中の過酸化水素の定量の
みならず、種々の酸化酵素反応を共存させて、生
体試料中の種々の成分、例えば尿酸、コレステロ
ール、クレアチニン、ポリアミン等の微量成分の
定量を行なうことができる。
みならず、種々の酸化酵素反応を共存させて、生
体試料中の種々の成分、例えば尿酸、コレステロ
ール、クレアチニン、ポリアミン等の微量成分の
定量を行なうことができる。
次に本発明を実施例により説明する。
実施例 １
バイヤルに0.1mlの濃度既知の過酸化水素、0.1
mlの10単位／mlのペルオキシダーゼ、0.1mlの0.2
mg／mlの硫酸亜鉛・７水和物、0.2mlの1mMフル
オレシンを加えた25mMのリン酸緩衝液を加え、
2.5℃で５分間反応させた。反応後、直ちに混合
溶媒（酢酸エチル：ホウ酸緩衝液：アセトニトリ
ル＝１：１：８、容量比）に、2mM過酸化水素、
40mMホウ酸緩衝液（PH10.5）、0.5mM TCPOを
溶解させた溶液0.5mlを加えた。次いで３秒後、
発光強度を測定した。その結果を第１図に示す。
図中、縦軸は発光強度（相対値）、横軸は過酸化
水素濃度（Ｍ）を示す。
mlの10単位／mlのペルオキシダーゼ、0.1mlの0.2
mg／mlの硫酸亜鉛・７水和物、0.2mlの1mMフル
オレシンを加えた25mMのリン酸緩衝液を加え、
2.5℃で５分間反応させた。反応後、直ちに混合
溶媒（酢酸エチル：ホウ酸緩衝液：アセトニトリ
ル＝１：１：８、容量比）に、2mM過酸化水素、
40mMホウ酸緩衝液（PH10.5）、0.5mM TCPOを
溶解させた溶液0.5mlを加えた。次いで３秒後、
発光強度を測定した。その結果を第１図に示す。
図中、縦軸は発光強度（相対値）、横軸は過酸化
水素濃度（Ｍ）を示す。
第１図から明らかなように、10-9M〜10-5Mの
過酸化水素の定量が可能である。
過酸化水素の定量が可能である。
実施例 ２
バイヤルに0.4mlの脱イオン水にといた10mMp
―クレゾールを加えたあと2.6mlの25mMリン酸
バツフアーPH7.0を加える。これに１mlの5U／ml
ペルオキシダーゼを上記バツフアーにといて加
え、各濃度に希釈したH2O2をサンプルとして加
え、１時間30℃でインキユベートする。かくして
発螢光した溶液0.5mlに0.5mlの0.1mM TCPO＋
0.4mM H2O2をアセトニトリル中で混合した溶
液を注射器を使つて注入し、25℃にてその発光の
ピークをカウントする。こうして得られた発光活
性を測定しようとしたH2O2濃度に対してプロツ
トし、５×10-7M―10-4Mの範囲だ直線をえた。
上記の反応は、ｐ―クレゾールの酸化縮合による
発螢光物質のTCPO＋H2O2を添加した時の発光
反応に基づいている。
―クレゾールを加えたあと2.6mlの25mMリン酸
バツフアーPH7.0を加える。これに１mlの5U／ml
ペルオキシダーゼを上記バツフアーにといて加
え、各濃度に希釈したH2O2をサンプルとして加
え、１時間30℃でインキユベートする。かくして
発螢光した溶液0.5mlに0.5mlの0.1mM TCPO＋
0.4mM H2O2をアセトニトリル中で混合した溶
液を注射器を使つて注入し、25℃にてその発光の
ピークをカウントする。こうして得られた発光活
性を測定しようとしたH2O2濃度に対してプロツ
トし、５×10-7M―10-4Mの範囲だ直線をえた。
上記の反応は、ｐ―クレゾールの酸化縮合による
発螢光物質のTCPO＋H2O2を添加した時の発光
反応に基づいている。
実施例 ３
バイヤルに25mMリン酸バツフアーにといた
1.5mMロイコローダミンＢを３ml加え、１mlの
5U／mlペルオキシダーゼを加えて、サンプルと
して各濃度のH2O21mlを加えて、30℃１時間イン
キユベートした。かくして発螢光したサンプル
0.5mlをとり、0.1mM TCPO＋0.4m H2O2のアセ
トリトリルに溶解させた発光試薬を注入し、その
発光ピークを測定した。結果は５×10-8M〜
10-4Mの範囲で直線であつた。上記の方法は、ロ
イコローダミンＢの酸化反応による発螢光物質の
生成とTCPO＋H2O2による発光反応に基づいて
いる。
1.5mMロイコローダミンＢを３ml加え、１mlの
5U／mlペルオキシダーゼを加えて、サンプルと
して各濃度のH2O21mlを加えて、30℃１時間イン
キユベートした。かくして発螢光したサンプル
0.5mlをとり、0.1mM TCPO＋0.4m H2O2のアセ
トリトリルに溶解させた発光試薬を注入し、その
発光ピークを測定した。結果は５×10-8M〜
10-4Mの範囲で直線であつた。上記の方法は、ロ
イコローダミンＢの酸化反応による発螢光物質の
生成とTCPO＋H2O2による発光反応に基づいて
いる。
参考例 １
混合溶媒（酢酸エチル：ホウ酸緩衝液：アセト
ニトリル＝１：１：８、容量比）に、2mM過酸
化水素、4mMホウ酸緩衝液（PH10.5）、0.5mM
TCPOおよび0.005％の８―アニリノナフタレン
スルホン酸および種々の濃度の血清を添加した。
３秒後に発光強度を測定した。その結果を第２図
に示す。図中、縦軸は発光強度（相対値）、横軸
は血清濃度（希釈率）を示す。
ニトリル＝１：１：８、容量比）に、2mM過酸
化水素、4mMホウ酸緩衝液（PH10.5）、0.5mM
TCPOおよび0.005％の８―アニリノナフタレン
スルホン酸および種々の濃度の血清を添加した。
３秒後に発光強度を測定した。その結果を第２図
に示す。図中、縦軸は発光強度（相対値）、横軸
は血清濃度（希釈率）を示す。
第２図から明らかなように、修酸ジエステル類
（TCPO）と螢光物質（８―アニリノナフタレン
スルホン酸）による過酸化水素の反応では、発光
活性は１／100容以下の濃度の血清量まで影響を
受けない。この１／100容の血清量は通常の臨床
検査に用いる試料として十分である。このことは
修酸ジエステルと螢光物質と過酸化水素との反応
による発光が血清中の成分から生成する過酸化水
素の定量において、好ましい化学発光分析法であ
ることを示している。
（TCPO）と螢光物質（８―アニリノナフタレン
スルホン酸）による過酸化水素の反応では、発光
活性は１／100容以下の濃度の血清量まで影響を
受けない。この１／100容の血清量は通常の臨床
検査に用いる試料として十分である。このことは
修酸ジエステルと螢光物質と過酸化水素との反応
による発光が血清中の成分から生成する過酸化水
素の定量において、好ましい化学発光分析法であ
ることを示している。
第１図は本発明方法による過酸化水素濃度
（Ｍ）と発光強度（相対値）との関係を示す。第
２図は本発明の第２反応における血清濃度（希釈
率）と発光強度（相対値）との関係を示す。
（Ｍ）と発光強度（相対値）との関係を示す。第
２図は本発明の第２反応における血清濃度（希釈
率）と発光強度（相対値）との関係を示す。
Claims (1)
- １ 過酸化水素を含む試料に、酸化触媒を介して
被酸化性の非螢光物質を反応させて、非螢光物質
を螢光物質に転換させ、次いで酸化触媒の阻害条
件下に該螢光物質を修酸ジエステル類および過酸
化水素と反応させ、生成する発光量を測定するこ
とにより、試料中の過酸化水素を定量することを
特徴とする化学発光法による過酸化水素の定量
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59056719A JPS60200167A (ja) | 1984-03-24 | 1984-03-24 | 化学発光法による過酸化水素の定量法 |
| US06/714,743 US4647532A (en) | 1984-03-21 | 1985-03-22 | Method for determination of hydrogen peroxide by chemiluminescence analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59056719A JPS60200167A (ja) | 1984-03-24 | 1984-03-24 | 化学発光法による過酸化水素の定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60200167A JPS60200167A (ja) | 1985-10-09 |
| JPH0354304B2 true JPH0354304B2 (ja) | 1991-08-19 |
Family
ID=13035292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59056719A Granted JPS60200167A (ja) | 1984-03-21 | 1984-03-24 | 化学発光法による過酸化水素の定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4647532A (ja) |
| JP (1) | JPS60200167A (ja) |
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| JPS63163164A (ja) * | 1986-12-25 | 1988-07-06 | Konica Corp | 多層分析素子 |
| JPH0630628B2 (ja) * | 1987-12-16 | 1994-04-27 | キング醸造株式会社 | 生細胞数及び活力の測定方法 |
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| US5238610A (en) * | 1988-10-06 | 1993-08-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method of detecting oxidizing agents in aqueous media through the use of chemiluminescent microemulsions |
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| CN114002207A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-02-01 | 浙江大学 | 抗坏血酸过氧化物酶1在催化鲁米诺化学发光反应中的应用 |
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1985
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