CN110554026B - 一种用于检测羟基自由基的化学发光方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测羟基自由基的新型化学发光技术。以烟草提取物为发光探针检测酸性、中性及碱性介质中羟基自由基的化学发光新技术。该技术具有操作简单、检测速度快、不受介质pH值干扰等优点，在羟基自由基检测技术领域具有很好的应用前景。

Description

一种用于检测羟基自由基的化学发光方法

技术领域

本发明涉及化学发光检测技术领域，具体涉及一种用于检测羟基自由基的化学发光技术。

背景技术

羟基自由基(·OH)作为一种非常活泼的活性氧物种在自然界和生物体中广泛存在。由于·OH具有非常强的氧化能力，在自然界环境污染物降解过程中发挥了重要作用(如芬顿反应、光催化反应、光化学反应等)，而在生物体内，·OH会引起生物大分子(如DNA、蛋白质、脂质等)损伤，进而导致许多疾病发生。因此对·OH检测具有很大的现实需求。然而，·OH寿命非常短(微秒级)，导致对其进行精确检测一直是一项技术难题。目前，·OH检测方法主要有电子自旋共振(ESR)、荧光法等。这些方法都存在各自的缺点和不足，如操作繁琐耗时、检测成本高、灵敏度低、特异性差等，无法完全满足·OH的检测需求。

化学发光技术具有操作简单、检测速度快、成本低、灵敏度高等优点，在活性氧检测方面具有独特优势。然而，目前化学发光技术在·OH检测方面应用很少，主要原因是现有探针对·OH检测的特异性较差，而且易受体系pH的干扰。因此发展新型的化学发光技术用于·OH检测具有重要的科学意义和现实需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测羟基自由基的化学发光技术。

本发明所提供的用于检测羟基自由基的化学发光技术，为，采用烟叶提取物为发光探针，对含有·OH的体系中的·OH进行检测。

所述烟叶提取物通过包括下述步骤的方法制备得到：将烟叶加入试剂中进行提取，得到所述烟叶提取物。

所述烟叶为烤烟型卷烟用烟叶，如云烟87、云烟85、K326、红花大金元、中烟100。

所述方法在加入所述试剂之前还包括对烟叶进行烘干并研磨成粉末的步骤。

所述烘干后的含水率≤3％；所述烘干的温度为40～60℃，时间为2～4h；所述粉末的粒径为20～100目。

所述试剂为甲醇、水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮和氯仿中的至少一种。

所述烟叶的质量与所述试剂的体积比为1.0g：(10～100)mL。

所述提取为超声波提取。

所述超声波提取的条件如下：温度为小于70℃，时间为10min～30min，功率为200W～500W。

所述方法在所述提取之后还包括对得到的提取液进行过滤并收集滤液的步骤。

所述过滤采用滤膜。

所述滤膜的孔径小于420μm。

所述含有·OH的体系可为酸性、中性或碱性体系，其pH值可为0-14之间的任意值。

所述含有·OH的体系可为Fenton体系、类Fenton体系、光Fenon体系、电Fenton体系、过氧化物酶催化体系、纳米材料/H₂O₂“类过氧化物酶”催化体系以及卤代醌/H₂O₂体系。

所述类Fenton体系中替代Fe(Ⅱ)离子的物质可为Fe(Ⅲ)、含铁矿物以及其他过渡金属离子如Co、Cd、Cu、Ag、Mn、Ni等。

所述过氧化物酶催化体系中：过氧化物酶包括过氧化氢酶、辣根过氧化物酶。

所述纳米材料/H₂O₂“类过氧化物酶”催化体系中，纳米材料包括铁基纳米材料(Fe₃O₄、Fe₂O₃、FeS、BiFeO₃、CoFe₂O₄)，碳基纳米材料(氧化石墨烯、碳纳米管)，贵金属及其合金纳米颗粒(Au、AgPt、AgAu、AgPd)。

所述卤代醌/H₂O₂体系中，卤代醌可为TCBQ、TBrBQ、TCHQ、TBrHQ、O-TCBQ、2-CBQ、2,3-DCBQ、2,5-DCBQ、2,6-DCBQ。

所述含有·OH的体系具体可为：Fenton体系(FeSO₄/H₂O₂)、辣根过氧化物酶(HRP)/H₂O₂体系和/或金纳米颗粒/H₂O₂体系。

烟叶提取物在羟基自由基检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明成功发展了一种以烟叶提取物为发光探针，在酸性、中性和碱性溶液中都能检测·OH的新型化学发光技术。该技术在各种介质的·OH检测方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为烟叶提取物(16.3mg/mL)与FeSO₄(0.1mmol/L)/H₂O₂(1.0mmol/L)体系在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)0.1mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-5mol/L NaOH。

图2为烟叶提取物(16.3mg/mL)与HRP(1.0mg/mL)/H₂O₂(0.1mol/L)体系在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-4mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)0.01mol/L NaOH。

图3为烟叶提取物(16.3mg/mL)与纳米金颗粒(5μg/mL)/H₂O₂(0.1mol/L)体系在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-5mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-4mol/L NaOH。

图4为烟叶提取物(16.3mg/mL)与不同浓度的TCBQ(1mM、2mM、5mM、10mM)/H₂O₂(0.1mol/L)体系在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-3mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-4mol/L NaOH。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的发光动力学曲线是在微弱发光测量仪中(BPCL-GP15-TGC)通过静态注射的方法得到的，负高压为-1000V。

下述实施例中的烟叶提取物的制备方法，如无特殊说明，均在自然光条件下的敞开体系、室温条件下(25℃)进行。

下述实施例中的烤烟型卷烟用烟叶(烘烤调制后的烟叶)可采用“三段式(变黄、定色及干筋三个阶段)”烘烤工艺制备得到，具体步骤如下：在变黄阶段，将田间采集的成熟新鲜烟叶(如：云烟87、云烟85、K326、红花大金元、中烟100等)编绑、装炕，点火后以每小时1℃的速率将烤房温度升至38℃，保持湿球温度比干球温度低1.5℃，直到底棚烟叶80％以上变到八成黄左右，然后将烤房温度升高到42℃，保持湿球温度37℃)，并适当排湿，确保烟叶达到变黄变软状态；在定色阶段，加大排湿量，以2小时升1℃的速率将烤房温度升至55℃，湿球温度缓慢升高保持在38℃，使叶片干燥并将黄色固定下来；在干筋阶段，以每小时1℃的速率将烤房温度升至69℃，保持湿球温度在42℃左右，保证叶片定色干燥后停火。

按照如下步骤制备烟叶提取物：

将烤烟型卷烟用烟叶(烘烤调制后的烟叶)去除主脉，剪成片，放入60℃烘箱里烘干2h，此时其含水率为3％左右，取出烟叶后迅速研磨，持续时间2min，磨碎后过筛(40目)，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用。称取1.0g烟叶粉末，加入40mL甲醇，超声波(功率为400W)处理20min后，过0.45μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到烟叶提取物。

实施例

首先考察了烟叶提取物与以下三种有H₂O₂参与的产生·OH体系的化学发光现象

(1)Fenton体系(FeSO₄/H₂O₂)：Fenton体系是强氧化体系，目前在高级氧化技术(AOP)中被广泛应用，其中·OH是主要的氧化物种，因此检测不同pH条件下的·OH有利于更好认识Fenton反应在AOP中的作用机制。为此我们考察了烟叶提取物与FeSO₄/H₂O₂体系的化学发光信号。

在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下，以所述烟叶提取物(16.3mg/mL)为发光探针，检测FeSO₄(0.1mmol/L)/H₂O₂(1.0mmol/L)体系中·OH及加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)0.1mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-5mol/L NaOH。

如图1所示，在酸性、中性和碱性条件下烟叶提取物与FeSO₄/H₂O₂都能产生化学发光信号，并且加入·OH猝灭剂硫脲后发光信号消失，说明无论在酸性、中性和碱性条件下，Fenton体系中的·OH都可以诱导烟草提取物产生化学发光信号，因此本发明以烟草提取物为发光探针在酸性、中性和碱性条件下都能检测Fenton体系中的·OH。

(2)辣根过氧化物酶(HRP)/H₂O₂体系：H₂O₂在某些过氧化物酶(如HRP)的催化下分解成·OH等强氧化性物种，目前基于HRP/H₂O₂酶催化体系的化学发光生化检测(如ELISA检测)得到广泛应用。然而，某些检测体系pH值呈中性甚至偏酸性，而现有大多数发光探针的发光反应在碱性甚至强碱性环境中进行，从而限制了化学发光技术的应用。为此我们考察了烟草提取物与HRP/H₂O₂体系在酸性、中性和碱性条件下的化学发光现象。

在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下，以烟叶提取物(16.3mg/mL)为发光探针，检测HRP(1.0mg/mL)/H₂O₂(0.1mol/L)体系中的·OH及加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-4mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)0.01mol/L NaOH。

如图2所示，烟草提取物在酸性、中性和碱性条件下均能与HRP/H₂O₂体系产生化学发光信号，当加入·OH猝灭剂硫脲后发光信号消失，表明烟草提取物与·OH发生了化学发光反应。基于此，我们可以借助烟草提取物在酸性、中性和碱性条件下与HRP/H₂O₂酶催化体系中·OH的化学发光现象建立烟草提取物-HRP/H₂O₂的化学发光体系用于分析检测。

(3)金纳米颗粒/H₂O₂体系：已有研究表明某些纳米材料(纳米四氧化三铁、纳米金)表面具有“类过氧化物酶”性质，能够催化分解H₂O₂生成·OH等高活性物种。在此我们考察了烟草提取物与纳米金/H₂O₂体系在酸性、中性以及碱性条件下的化学发光现象。

在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下，以烟叶提取物(16.3mg/mL)为探针检测纳米金颗粒(5μg/mL)/H₂O₂(0.1mol/L)体系中的·OH及加入硫脲(1.0mol/L)前后的化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-5mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-4mol/L NaOH。

如图3所示，在酸性、中性以及碱性条件下烟草提取物与纳米金/H₂O₂体系能够产生化学发光信号，并且当加入硫脲后发光信号完全消失，证明纳米金表面催化产生的·OH参与了烟草提取物的化学发光反应。因此该技术可以用于研究各种纳米材料表面的“类过氧化物酶”效应，具有很好的应用前景。

通过以上烟草提取物与三种产生·OH的氧化体系的化学发光实验表明，烟草提取物与·OH能够在酸性、中性和碱性条件下发生化学发光反应，从而为检测不同pH值介质中的·OH奠定了坚实理论基础。

(4)此外，已有研究证明四氯苯醌(TCBQ)与H₂O₂反应可以产生·OH，为了进一步验证本发明检测·OH的可行性，我们对在酸性、中性和碱性条件下该体系中产生的·OH进行了检测，由于·OH寿命很短无法用标准曲线进行定量，我们通过改变体系中TCBQ浓度进而产生不同数量的·OH进行半定量检测。

在酸性(a)、中性(b)和碱性(c)条件下，以烟叶提取物(16.3mg/mL)为发光探针，检测不同浓度的TCBQ(1mM、2mM、5mM、10mM)/H₂O₂(0.1mol/L)体系中·OH时的化学发光动力学曲线：其中，(a)1.0×10^-3mol/L H₂SO₄,(b)H₂O,(c)1.0×10^-4mol/L NaOH。

如图4所示，在酸性、中性和碱性条件下烟草提取物与TCBQ/H₂O₂能够产生化学发光信号，而且发光强度随TCBQ浓度增加而呈线性增强(R²＝0.99)，表明无论在酸性、中性还是碱性条件下烟草提取物发光强度与·OH数量呈线性关系，从而可以在不同pH值条件下对·OH进行半定量检测。

Claims (5)

1.一种用于检测羟基自由基的化学发光方法，为采用烟叶提取物为发光探针，对含有•OH的体系中的•OH进行检测；

按照如下步骤制备烟叶提取物：

将烤烟型卷烟用烘烤调制后的烟叶去除主脉，剪成片，放入60℃烘箱里烘干2 h，此时其含水率为3%左右，取出烟叶后迅速研磨，持续时间2 min，磨碎后过筛，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用，称取1.0 g烟叶粉末，加入40 mL甲醇，超声波处理20 min后，过0.45 μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到烟叶提取物；

其中，烤烟型卷烟用烟叶采用“三段式，即变黄、定色及干筋三个阶段”烘烤工艺制备得到，步骤如下：在变黄阶段，将田间采集的成熟新鲜烟叶编绑、装炕，点火后以每小时1℃的速率将烤房温度升至38℃，保持湿球温度比干球温度低1.5℃，直到底棚烟叶80%以上变到八成黄左右，然后将烤房温度升高到42℃，保持湿球温度37℃，并排湿，确保烟叶达到变黄变软状态；在定色阶段，加大排湿量，以2小时升1℃的速率将烤房温度升至55℃，湿球温度缓慢升高保持在38℃，使叶片干燥并将黄色固定下来；在干筋阶段，以每小时1℃的速率将烤房温度升至69℃，保持湿球温度在42℃左右，保证叶片定色干燥后停火。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有•OH的体系为酸性、中性或碱性体系，其pH值为0-14之间的任意值。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有•OH的体系为Fenton体系、类Fenton体系、光Fenon体系、电Fenton体系、过氧化物酶催化体系、纳米材料/ H₂O₂“类过氧化物酶”催化体系或卤代醌/ H₂O₂体系。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当待测体系含有羟基自由基时，加入烟叶提取物后，会有化学发光现象发生；

当待测体系不含羟基自由基时，加入烟叶提取物后，无化学发光现象发生。

5.烟叶提取物在羟基自由基检测中的应用；

按照如下步骤制备烟叶提取物：

将烤烟型卷烟用烘烤调制后的烟叶去除主脉，剪成片，放入60℃烘箱里烘干2 h，此时其含水率为3%左右，取出烟叶后迅速研磨，持续时间2 min，磨碎后过筛，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用，称取1.0 g烟叶粉末，加入40 mL甲醇，超声波处理20 min后，过0.45 μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到烟叶提取物；

其中，烤烟型卷烟用烟叶采用“三段式，即变黄、定色及干筋三个阶段”烘烤工艺制备得到，步骤如下：在变黄阶段，将田间采集的成熟新鲜烟叶编绑、装炕，点火后以每小时1℃的速率将烤房温度升至38℃，保持湿球温度比干球温度低1.5℃，直到底棚烟叶80%以上变到八成黄左右，然后将烤房温度升高到42℃，保持湿球温度37℃，并排湿，确保烟叶达到变黄变软状态；在定色阶段，加大排湿量，以2小时升1℃的速率将烤房温度升至55℃，湿球温度缓慢升高保持在38℃，使叶片干燥并将黄色固定下来；在干筋阶段，以每小时1℃的速率将烤房温度升至69℃，保持湿球温度在42℃左右，保证叶片定色干燥后停火。

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