CN113504220B - 一种茶叶提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶叶提取物及其制备方法和应用，属于自由基的检测技术领域。本发明采用茶叶提取物为发光试剂，与不同体系中的羟基自由基进行化学发光反应，实现了·OH的简单快速检测；本发明检测·OH不受体系pH值限制，在酸、中及碱性条件下均可进行，克服了化学发光技术在检测自由基时易受介质pH值限制的困扰。
Description
技术领域
本发明涉及自由基的检测技术领域，具体涉及的是一种茶叶提取物及其制备方法和应用。
背景技术
自由基是指化合物分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。由于单个电子的存在，自由基通常具有以下两个典型特征：一是具有较强的反应活性；二是存在寿命通常很短。目前自由基被证实广泛存在于燃烧、大气化学、有机聚合反应、生物体生化生理等过程中。近年来，随着人们对环境与健康领域的愈发重视，有关自由基的研究与应用工作也得到广泛开展。在环境治理领域，研究人员利用自由基的高反应活性去除环境介质中的某些污染物，从而达到环境净化效果；在生命健康领域，已有研究证实自由基在生命体正常的免疫及信号传导方面发挥了关键性作用，但当体内正常氧化还原平衡被打破后会使得自由基浓度升高，引起生命体的氧化应激，可能会导致生物大分子损伤以及疾病产生。由于其活性高、寿命短的特点，自由基检测是一项世界性的难题。电子自旋共振(ESR)是目前自由基检测领域最具普适性的技术，然而该技术检测自由基具有以下局限性：(1)需要预先加入探针捕获自由基生成加合物，该加合物不稳定，增加了上机检测的难度，(2)用于自旋共振检测的波谱仪价格昂贵、且所需实验条件苛刻，(3)谱图解析专业性强，以上问题严重阻碍了ESR技术在自由基检测领域的推广应用。因此针对自由基的特点发明一种操作简单、检测速度快、灵敏度高、门槛低的检测技术意义重大。
化学发光是一种优异的分析检测技术，具有条件温和、仪器装置简单、操作方便、灵敏度高等优点，在自由基检测方面具有独特优势。针对某种特定自由基选择合适的发光试剂构建相应的化学发光体系是实现自由基简单、快速、高灵敏、特异性检测的重要技术手段。
羟基自由基(·OH)是一种典型的高活性自由基，其具有非常强的氧化能力，被广泛用于环境介质中污染物的氧化降解(如芬顿反应、光催化反应、光化学反应等)；在生物体内，·OH会引起生物大分子(如DNA、蛋白质、脂质等)损伤，进而导致许多疾病发生，因此在环境与健康领域引起了极大关注。由此可见，发明一种简单快速高灵敏检测·OH的新型检测技术意义重大。
发明内容
本发明提供了一种茶叶提取物及其制备方法和应用，本发明的核心是我们首次发现茶叶提取物作为新型发光试剂，可与·OH发生高灵敏的化学发光反应，实现了·OH的简单快速高灵敏检测；本发明检测·OH不受体系pH值限制，在酸、中及碱性条件下均可进行，克服了化学发光技术在检测自由基时易受介质pH值限制的困扰。
本发明首先提供了一种茶叶提取物的制备方法，包括如下步骤：将茶叶加入溶剂中进行提取，得到所述茶叶提取物。
上述的制备方法中，所述茶叶为市场上购买得到的商品茶叶或者自己制作的茶叶；具体可为绿茶、黄茶、乌龙茶、红茶、黑茶和白茶等。
所述溶剂为甲醇和乙醇中的至少一种；
所述茶叶的质量与所述溶剂的体积比为1.0g：(10～100)mL；
所述提取为超声波提取；
具体的，所述超声波提取的条件如下：冰浴提取，时间为10min～20min，功率为200W～500W。
所述超声波提取的温度具体可为0～4℃。
上述的制备方法在所述提取之后还包括对得到的提取液进行过滤并收集滤液的步骤。
所述过滤采用滤膜。
所述滤膜可为0.45μm的有机相滤膜。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的茶叶提取物。
上述茶叶提取物在检测羟基自由基中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还进一步提供了一种检测羟基自由基的方法，包括如下步骤：采用所述茶叶提取物为发光试剂，对体系中的羟基自由基进行检测。
上述的方法中，所述体系为酸性、中性或碱性体系，其pH值为0～14之间的任意值。
上述的方法中，所述检测的仪器为微弱发光测量仪。
上述的方法中，所述体系为芬顿体系、类芬顿体系、酶催化体系、多相芬顿催化体系和卤代醌/H2O2体系中的任一种。
具体的，所述芬顿体系中的金属离子为Fe2+。
所述类芬顿体系中的金属离子为Co2+、Cd2+、Cu2+、Ag+、Mn2+或Ni2+等。
所述酶催化体系中的酶为过氧化氢酶和/或辣根过氧化物酶；
所述多相芬顿催化体系为催化材料/H2O2体系；
所述多相芬顿催化体系中的催化材料为铁基催化材料、碳基催化材料、贵金属催化材料或贵金属合金催化材料；
所述铁基催化材料具体可为Fe3O4、Fe2O3、FeS、BiFeO3、CoFe2O4或FeOCl；
所述碳基催化材料具体可为氧化石墨烯、碳纳米管或氮化碳；
所述贵金属催化材料具体可为Au、Pd、Pt或Ag；
所述贵金属合金催化材料具体可为AgPt、AgAu或AgPd；
所述卤代醌/H2O2体系中的卤代醌为TCBQ、TBrBQ、TFBQ、TCHQ、TBrHQ、O-TCBQ、2-CBQ、2,3-DCBQ、2,5-DCBQ或2,6-DCBQ；
上述的方法中，所述体系可为FeSO4/H2O2芬顿体系、TCBQ/H2O2体系或纳米FeOCl/H2O2多相芬顿催化体系。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现了茶叶提取物与·OH的化学发光现象，以茶叶提取物作为新型发光试剂，实现了·OH的简单快速检测；本发明在酸性、中性和碱性条件下都能简单快速检测·OH，在不同介质中·OH的检测具有很好的应用前景。
附图说明
图1为绿茶提取物(2.4mg/mL)与FeSO4(0.1mM)/H2O2(1.0mM)芬顿体系在酸性、中性以及碱性条件下的化学发光动力学曲线；图中，(1)pH＝3，(2)pH＝7，(3)pH＝10。
图2为绿茶提取物(2.4mg/mL)在不同浓度FeSO4/H2O2(5.0mM)体系中的化学发光动力学曲线；图中，Fe2+浓度：(1)0.1μM，(2)0.5μM，(3)1.0μM，(4)5.0μM，(5)10.0μM，(6)20.0μM，(7)50.0μM。
图3为绿茶提取物(2.4mg/mL)与FeSO4(0.1mM)/H2O2(1.0mM)芬顿体系未加入和加入不同浓度猝灭剂硫脲后的化学发光动力学曲线；图中，硫脲溶液浓度为：(1)0M(未加入)，(2)0.01M，(3)0.05M，(4)0.1M，(5)0.5M。
图4为绿茶提取物(2.4mg/mL)与TCBQ(10mM)/H2O2(0.1M)体系(1)以及纳米FeOCl(0.1mg/mL)/H2O2(1.0mM)多相芬顿催化体系(2)的化学发光动力学曲线。
图5为不同植物提取物与FeSO4(0.1mM)/H2O2(1.0mM)芬顿体系的化学发光动力学曲线；图中，(1)绿茶、(2)薄荷、(3)薰衣草、(4)艾绒。
图6为烟叶提取物(16.3mg/mL)(1)、绿茶提取物(2.4mg/mL)(2)与FeSO4(0.1mM)/H2O2(1.0mM)芬顿体系的化学发光动力学曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的发光动力学曲线是在微弱发光测量仪中(BPCL-GP15-TGC)通过静态注射的方法得到的，负高压为-1000V。
下述实施例中所用绿茶制作流程如下：茶叶鲜叶(崂山绿)采自青岛崂山景区，采摘后将鲜叶晾制2-3小时，然后在220℃的电动加热滚筒中炒青3-5min，炒青后进行手工揉捻，揉捻完成后晾制干燥，最后装入洁净干燥的广口瓶中备用。
薄荷粉末：将新鲜薄荷叶片放入50℃烘箱里烘干2h，取出后迅速研磨，持续时间2min，磨碎后过筛(40目)，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用。
薰衣草粉末：将新鲜薰衣草叶片放入50℃烘箱里烘干2h，取出后迅速研磨，持续时间2min，磨碎后过筛(40目)，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用。
艾绒粉末：将新鲜艾绒放入50℃烘箱里烘干2h，取出后迅速研磨，持续时间2min，磨碎后过筛(40目)，过筛后迅速将粉末装入洁净干燥的广口瓶密封备用。
下述实施例中的提取物的制备方法，如无特殊说明，均在自然光条件下的敞开体系、冰浴中进行。
下述实施例所用有机相滤膜的生产厂家为上海安谱实验科技股份有限公司，型号为SCAA-103。
实施例1、绿茶提取物的制备
称取1.0g绿茶，加入40mL甲醇，超声波处理(400W)20min后，过0.45μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到绿茶提取物。
所得绿茶提取物的浓度为2.4mg/mL；
绿茶提取物浓度的检测方法如下：取干燥洁净的玻璃小瓶1只，称其空瓶重，向其加入1.0mL的绿茶甲醇提取液，放置于常温水浴中进行旋蒸，待甲醇完全挥发后，将玻璃瓶外部擦拭干净后称重，利用该重量减去空瓶重，计算得到绿茶甲醇提取物的质量浓度。
实施例2、绿茶提取物与·OH在不同pH值条件下的化学发光现象
取100μL实施例1制备的绿茶提取物分别放入石英杯中，然后向以上石英杯中分别加入100μL硫酸(1.0mM)、纯水以及氢氧化钠溶液(0.1mM)，调节发光反应体系为酸性(pH＝3)、中性(pH＝7)和碱性(pH＝10)，再分别向石英杯中加入100μL H2O2溶液(浓度为1.0mM)。对于一次测量，将石英杯放入测量仪的暗室中并开启仪器，使用微量注射器吸取100μLFeSO4溶液(浓度为0.1mM)通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后停止测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
图1考察了绿茶提取物在不同pH条件下与·OH的化学发光反应。如图1所示，绿茶提取物在酸性、中性及碱性条件下均能与·OH产生化学发光信号，表明绿茶提取物作为发光试剂能够在不同pH值条件下检测·OH，克服了以往化学发光技术检测自由基时易受体系pH值制约的不利影响。
实施例3、绿茶提取物与不同浓度·OH化学发光强度的变化趋势
分别取100μL实施例1制备的绿茶提取物和H2O2溶液(浓度为5.0mM)加入到石英杯中，对于一次测量，将石英杯放入测量仪的暗室中并开启仪器，使用微量注射器分别吸取100μL不同浓度的FeSO4溶液通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后暂停测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
图2考察了绿茶提取物在FeSO4/H2O2体系中化学发光强度随·OH生成数量的变化趋势。如图2所示，随着反应体系中FeSO4浓度增大，·OH生成数量随之增加。相应地，绿茶提取物的化学发光强度也逐渐升高，表明绿茶提取物的化学发光信号强度与·OH浓度具有正相关性，可用于·OH的半定量测定。
实施例4、绿茶提取物与·OH化学发光反应的猝灭实验
取100μL实施例1制备的绿茶提取物加入到石英杯中，再分别将100μL水(空白组)和不同浓度硫脲溶液(实验组)加入到不同石英杯中，然后分别向石英杯中加入100μL H2O2溶液(浓度为1.0mM)，将石英杯放入测量仪的暗室中，并开启仪器进行测量，使用微量注射器吸取100μL FeSO4溶液(浓度为0.1mM)通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后暂停测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
图3考察了绿茶提取物检测·OH的可靠性。如图3所示，加入·OH猝灭剂硫脲后，化学发光信号强度受到抑制，且抑制程度随猝灭剂浓度增加而增大，当硫脲浓度为0.5M时，发光信号几乎被完全抑制，表明化学发光信号来自于绿茶提取物与·OH的化学发光反应，证明了绿茶提取物作为发光试剂检测·OH的可行性。
实施例5、绿茶提取物与不同·OH生成体系的化学发光强度比较
分别取100μL实施例1制备的绿茶提取物和H2O2溶液(TCBQ/H2O2体系，加入的H2O2溶液浓度为0.1M；纳米FeOCl/H2O2多相芬顿催化体系，加入的H2O2溶液浓度为1.0mM)加入到不同石英杯中，对于一次测量，将石英杯放入测量仪的暗室中并开启仪器，使用微量注射器分别吸取100μL不同的促发剂(TCBQ、FeOCl)通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后暂停测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
图4考察了绿茶提取物与其它·OH生成体系的化学发光反应情况。如图4所示，绿茶提取物与TCBQ/H2O2体系以及纳米FeOCl/H2O2多相芬顿催化体系都具有化学发光响应，说明绿茶提取物可用于不同体系中·OH的简单快速检测。
实施例6、不同植物提取物与·OH的化学发光强度响应比较
该实施例所用绿茶提取物为实施例1制备；
1、薄荷提取物的制备
称取1.0g薄荷粉末，加入40mL甲醇，超声波处理(400W)20min后，过0.45μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到薄荷提取物。
2、薰衣草提取物的制备
称取1.0g薰衣草粉末，加入40mL甲醇，超声波处理(400W)20min后，过0.45μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到薰衣草提取物。
3、艾绒提取物的制备
称取1.0g艾绒粉末，加入40mL甲醇，超声波处理(400W)20min后，过0.45μm的有机相滤膜，最后收集滤液得到艾绒提取物。
4、不同植物提取物与·OH的化学发光强度响应
分别取100μL不同植物(绿茶、薄荷、薰衣草、艾绒)提取物和H2O2溶液(浓度为1.0mM)加入到石英杯中，对于一次测量，将石英杯放入测量仪的暗室中并开启仪器，使用微量注射器分别吸取100μL FeSO4溶液(浓度为0.1mM)通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后暂停测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
图5考察了不同植物提取物与FeSO4/H2O2体系的化学发光信号强度。如图5所示，绿茶提取物与·OH具有最强的化学发光响应，而薄荷提取物、薰衣草提取物、艾绒提取物与·OH的化学发光信号强度仅为绿茶提取物的1/10左右；由此可见，植物提取物对·OH的化学发光响应具有特殊性，茶叶提取物对·OH具有很好的化学发光响应，而其它植物发光响应较差。
对比例1
采用201711429450.2中实施例1的方法制备烟叶提取物，所得烟叶提取物的浓度为16.3mg/mL；所述浓度检测方法同实施例1绿茶提取物浓度检测方法。
分别取100μL烟叶提取物和实施例1制备的绿茶提取物加入到石英杯中，然后分别加入100μL H2O2溶液(浓度为1.0mM)，对于一次测量，将石英杯放入测量仪的暗室中并开启仪器，使用微量注射器吸取100μL FeSO4溶液(0.1mM)通过暗室顶部的橡胶塞快速注射到石英杯中促发化学发光反应，同时仪器原位快速实时测量发光信号强度的动力学曲线，一次实验结束后暂停测量，打开暗室更换石英杯重复上述操作。为保证实验重现性，相同处理条件实验进行平行测定。
结果如图6所示，相同FeSO4和H2O2浓度条件下，烟叶提取物的化学发光强度仅为绿茶提取物的1/7左右，而且烟叶提取物的质量浓度(16.3mg/mL)大约是绿茶提取物质量浓度的(2.4mg/mL)7倍；由此可见，绿茶提取物作为发光试剂比烟叶提取物具有更好的发光性能。
Claims (7)
1.一种检测羟基自由基的方法，包括如下步骤：采用茶叶提取物为发光试剂，对体系中的羟基自由基进行检测；
所述茶叶提取物的制备方法，包括如下步骤：将茶叶加入溶剂中进行提取，得到所述茶叶提取物；所述溶剂为甲醇和乙醇中的至少一种；
所述体系为芬顿体系、类芬顿体系、酶催化体系、多相芬顿催化体系和卤代醌/H2O2体系中的任一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述茶叶为绿茶、黄茶、乌龙茶、红茶、黑茶和白茶中的至少一种；
所述茶叶的质量与所述溶剂的体积比为1.0g：(10～100)mL；
所述提取为超声波提取。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述超声波提取的条件如下：温度为0～4℃，时间为10min～20min，功率为200W～500W。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述体系为酸性、中性或碱性体系，其pH值为0～14之间的任意值。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述芬顿体系中的金属离子为Fe2+；所述类芬顿体系中的金属离子为Co2+、Cd2+、Cu2+、Ag+、Mn2+或Ni2+；
所述酶催化体系中的酶为过氧化氢酶和/或辣根过氧化物酶；
所述多相芬顿催化体系中的催化材料为铁基催化材料、碳基催化材料、贵金属催化材料或贵金属合金催化材料；
所述卤代醌/H2O2体系中的卤代醌为TCBQ、TBrBQ、TFBQ、TCHQ、TBrHQ、O-TCBQ、2-CBQ、2,3-DCBQ、2,5-DCBQ或2,6-DCBQ。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述铁基催化材料为Fe3O4、Fe2O3、FeS、BiFeO3、CoFe2O4或FeOCl；
所述碳基催化材料为氧化石墨烯、碳纳米管或氮化碳；
所述贵金属催化材料为Au、Pd、Pt或Ag；
所述贵金属合金催化材料为AgPt、AgAu或AgPd。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述体系为FeSO4/H2O2芬顿体系、TCBQ/H2O2体系或纳米FeOCl/H2O2多相芬顿体系。
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