CN111072699A - 一种羟基自由基比率式荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过将罗丹明B(Rho)与N2O型苯并吡咯硼配合物(Bobpy)连接起来，构造了一种新型荧光共振能量转移(FRET)探针Rho‑Bob，用于·OH的比率式荧光检测和成像。Rho‑Bob表现出对环境的亲/疏水性敏感的特性，且具有出色的线粒体定位能力。Rho‑Bob已成功应用于细胞内·OH的比率式荧光成像。这些·OH可以是由Fenton反应产生，亦可由细胞内药物活化产生。Rho‑Bob探针对羟基自由基具有较高选择性和灵敏度，检测限低至纳摩尔级(680nM)。本发明利用Rho‑Bob首次观察到青蒿素分子在细胞线粒体内产生的·OH，首次发现在正常培养条件下斑马鱼胃肠道(GI)中存在内源性羟基自由基。本发明不仅为·OH检测和成像提供了一个实用探针，而且为构建其他ROS的新型比率式探针提供了重要思路。

Description

一种羟基自由基比率式荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种羟基自由基比率式荧光探针及其制备方法和应用，属于羟基自由基检测技术领域。
背景技术
羟基自由基·OH是一种具有极强的反应性和氧化性的活性氧自由基，也被认为是对生物体最有害的自由基之一。过量的·OH会对大多数生物分子(包括脂质、蛋白质、核酸等)造成氧化损伤。例如，·OH可以影响蛋白质中二硫键的形成，从而导致蛋白降解和错误折叠。神经系统疾病和癌症等许多疾病的发生和发展通常也伴随着·OH的生成。当然，·OH自由基并不总是有害且无用的。例如，在癌症的放射治疗期间，·OH却是重要的治疗性ROS。羟基自由基(·OH)可在生理和病理条件下形成，且与生物体内的各种氧化过程密切相关。由于·OH在生物环境中寿命极短，检测较为困难。内源性·OH浓度较低，更是难以检测。因此，检测·OH具有广泛而重要的意义。
迄今为止已经开发出了几种基于不同技术的·OH检测方法。其中，荧光检测响应快速、灵敏、且成本较低，在细胞内以及活体检测中具有明显的优势。众所周知，对苯二甲酸(TPA)是开发时间最早的反应型·OH荧光探针之一，其检测过程伴随着荧光产物2-羟基对苯二甲酸(hTA)的产生。然而，hTA的激发和发射波长分别位于紫外区和蓝光区域，极大地限制了其在生物体中的应用。香豆素及其衍生物也广泛应用于·OH荧光成像。近期研究报道了一种基于香豆素(Cou151)的探针，且使用双光子荧光显微镜成功实现了·OH的体内成像。氧杂蒽类染料，例如荧光素和罗丹明，是另一类常用于ROS成像(包括·OH成像)的荧光分子骨架。例如，含环状酰肼结构的罗丹明衍生物可用于荧光检测·OH。在·OH攻击下，探针螺环结构得到电子开环，从而产生强荧光产物。近期的一项研究开发了一种以邻位碘代的苯酚结构作为·OH受体的荧光素探针用于细胞内·OH成像。
总体而言，设计·OH荧光探针不仅需要理想的荧光指示剂，还需要设计良好的响应位点，使其对·OH具有较高的选择性和反应性。因此，寻找新颖的探针分子，开发高效的·OH检测技术仍然具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种羟基自由基比率式荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针对羟基自由基具有较高的选择性和灵敏度，检测限低至纳摩尔级(680nM)。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种羟基自由基比率式荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0002345734270000021
本发明设计了高灵敏且高选择性的探针Rho-Bob用于活细胞中·OH的比率式荧光成像。Rho-Bob探针由FRET对构成，由发射绿色至黄色荧光的罗丹明B(缩写为Rho)和发射深红色荧光的N2O型Bobpy组成，采用本发明的荧光探针对羟基自由基进行比率式荧光检测的示意图如图1所示。本发明首次证实这种Bobpy结构易受·OH攻击，从而导致荧光淬灭。因此，当激发罗丹明时，由于荧光共振能量转移，Rho-Bob探针只显示出来自Bobpy的深红色荧光。与·OH反应后，黄绿色发射光增强，而深红色发射光减弱。本发明进一步在活细胞和斑马鱼模型中评估了Rho-Bob探针的·OH检测能力。
第二方面，本发明提供了上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002345734270000031
将化合物4溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入化合物5、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应，即得所述羟基自由基比率式荧光探针。
作为本发明所述荧光探针的制备方法的优选实施方式，所述化合物4、化合物5、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔质量比为8:11:16:11。
作为本发明所述荧光探针的制备方法的优选实施方式，所述化合物4的制备方法为：
Figure BDA0002345734270000032
将化合物1在三溴氧磷、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、45℃的条件下制备得到化合物2；将化合物2在四(三苯基膦)钯、碳酸钠、甲苯、75℃，然后乙醇/氢氧化钠回流的条件下制备得到化合物3；将化合物3在4-二甲基-3-乙基吡咯、三氯氧磷、二氯甲烷、0℃，然后4-羧基苯硼酸、二氯甲烷、回流的条件下制备得到化合物4。
作为本发明所述荧光探针的制备方法的优选实施方式，所述化合物5的制备方法为：
Figure BDA0002345734270000041
(1)将罗丹明B溶于N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入N-Boc哌嗪、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应，制备得到罗丹明-N-哌嗪-N-Boc；
(2)将步骤(1)制得的罗丹明-N-哌嗪-N-Boc、三氟乙酸溶于二氯甲烷中搅拌反应，即得化合物5。
第三方面，本发明提供了上述荧光探针的应用，所述荧光探针用于生物体或水环境中羟基自由基的检测。
第四方面，本发明提供了一种羟基自由基的检测方法，所述检测方法使用上述荧光探针。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述检测方法为将荧光探针加入待检测溶液或培养基中，用酶标仪进行荧光测量，记录加入羟基自由基前后的荧光发射光谱，根据荧光强度的变化确定羟基自由基的存在。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，根据590nm处和630nm处发射的荧光强度的变化确定羟基自由基的存在。
作为本发明所述检测方法的优选实施方式，590nm处和630nm处发射的荧光强度比与羟基自由基的浓度成线性关系。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过将罗丹明B(Rho)与N2O型苯并吡咯硼配合物(Bobpy)连接起来，构造了一种新型荧光共振能量转移(FRET)探针Rho-Bob，用于·OH的比率式荧光检测和成像。Rho-Bob表现出对环境的亲/疏水性敏感的特性，且具有出色的线粒体定位能力。Rho-Bob已成功应用于细胞内·OH的比率式荧光成像。这些·OH可以是由Fenton反应产生，亦可由细胞内药物活化产生。Rho-Bob探针对羟基自由基具有较高选择性和灵敏度，检测限低至纳摩尔级(680nM)。本发明利用Rho-Bob首次观察到青蒿素分子在细胞线粒体内产生的·OH，首次发现在正常培养条件下斑马鱼胃肠道(GI)中存在内源性羟基自由基。本发明不仅为·OH检测和成像提供了一个实用探针，而且为构建其他ROS的新型比率式探针提供了重要思路。
附图说明
图1为采用本发明的荧光探针对羟基自由基进行比率式荧光检测的示意图。
图2为化合物2的1H NMR谱图。
图3为化合物3的1H NMR谱图。
图4为化合物4的1H NMR谱图。
图5为化合物4的HRMS谱图。
图6为N-Boc哌嗪的1H NMR谱图。
图7为罗丹明-N-哌嗪-N-Boc的1H NMR谱图。
图8为罗丹明-N-哌嗪-N-Boc的13C NMR谱图。
图9为荧光探针Rho-Bob的1H NMR谱图。
图10为荧光探针Rho-Bob的HRMS谱图。
图11为化合物4的光物理性质测试结果图；其中，A为ACN/H2O混合溶液中化合物4(20μM)的荧光光谱图；B为·OH反应前后，化合物4(20μM)在ACN/PBS＝2：1溶液中的荧光光谱图；C为·OH反应前后，化合物4的UV-vis吸收光谱图。
图12为化合物4与·OH的反应机理图。
图13为化合物4与·OH的反应产物的1H NMR谱图。
图14为化合物4与·OH的反应产物的13C NMR谱图。
图15为化合物4与·OH的反应产物的HRMS谱图。
图16为化合物4与·OH的反应动力学研究图；其中，A为3-羧基香豆素与·OH反应生成荧光产物的反应图；B为化合物4在·OH进攻下分解成非荧光片段的反应图；C为在化合物4存在和不存在的情况下，通过测量荧光强度I454监测·OH与3-羧基香豆素反应的曲线图；D为在3-羧基香豆素存在和不存在的情况下，通过测量610nm处的UV-vis吸光度，监测·OH与化合物4之间反应的曲线图。
图17为化合物4的UV-vis吸收光谱和罗丹明B的荧光光谱图(在510nm处激发)。
图18为理论计算估算化合物4和罗丹明B两个荧光团之间的距离图。
图19为Rho-Bob反应产物的HPLC和HRMS分析图。
图20为Rho-Bob反应产物的HRMS谱图。
图21为实施例4中溶液相中的羟基自由基检测结果图；其中，A为在ACN/PBS为1：9溶液中检测·OH的荧光图；B为I590荧光光谱与·OH浓度关系的线性图；C为在ACN/PBS＝2：1溶液中检测·OH的荧光图；D为荧光强度的比值(I590/I630)对·OH浓度的曲线图，插图代表根据滴定曲线得到的线性拟合图；E为H2O2光解产生的·OH的比率荧光检测图；F为Rho-Bob与·OH反应后相应的UV-vis吸光光谱变化图。
图22为荧光探针Rho-Bob对·OH检测的选择性研究测试的结果图。
图23为Rho-Bob在细胞内定位的荧光图，其中，A为来自Rho-Bob的红色荧光图；B为商品化绿色线粒体探针Mito Tracker Green发出的绿色荧光图；C为来自红色和绿色通道的合并图；D为通过Image J进行的共定位分析图。
图24为活细胞中·OH的比率式荧光成像图。
图25为DHA-TPP的1H NMR谱图。
图26为DHA-TPP的13C NMR谱图。
图27为利用Rho-Bob检测青蒿素分子在细胞线粒体内产生的·OH的结果图，其中，A为双氢青蒿素(DHA)和DHA-TPP的结构式图；B为利用Rho-Bob在活细胞中对药物诱导的·OH进行比率式荧光成像图及通过Image J进行定量分析的结果图。
图28为DHA和DHA-TPP的细胞毒性测试结果图，其中，A为DHA的细胞毒性测试结果图，B为DHA-TPP的细胞毒性测试结果图。
图29为Rho-Bob的细胞毒性测试结果图。
图30为斑马鱼内源性·OH的比率式荧光成像图。
图31为每组随机选取四条鱼进行内源·OH的比例荧光成像图。
图32为使用Image J进行荧光定量分析的操作步骤流程图。
图33为斑马鱼图像荧光强度的定量分析图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1荧光探针的合成
荧光探针的合成路线如下所示：
Figure BDA0002345734270000071
Figure BDA0002345734270000081
其中，上述反应条件为：a.POBr3，DMF/DCM，45℃；b.Pd(PPh3)4，Na2CO3，甲苯，75℃，EtOH/NaOH回流；c.4-二甲基-3-乙基吡咯，POCl3，DCM，0℃，然后4-羧基苯硼酸，DCM，回流；d.EDC，HOBt，DMF，室温。
(1)根据已报道的方法合成化合物3
Figure BDA0002345734270000082
化合物2：黑色固体(84％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53–7.49(m,2H),7.26–7.22(m,1H),7.18–7.13(m,2H),3.62(s,3H),3.27(s,3H).ESI[M+H]+m/z calcd.for[C11H12BrN2]251.01,found 251.00[M+H]+.化合物2的1H NMR谱图如图2所示。
化合物3：黄色固体(75％).1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ13.39(s,1H),10.24(s,1H),9.91(s,1H),8.18(s,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.62–7.60(m,1H),7.38–7.30(m,2H),7.21–7.19(s,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.02–6.98(m,1H).ESI[M+H]+m/z calcd.for[C15H12NO2]238.08,found 238.10[M+H]+.化合物3的1H NMR谱图如图3所示。
(2)化合物4的合成
Figure BDA0002345734270000091
在0℃下，将POCl3(0.01mL，0.13mmol)加入到2，4-二甲基-3-乙基吡咯(32mg，0.26mmol)的二氯甲烷溶液(5mL)中。然后在0℃下将3(35mg，0.13mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液滴加到反应混合物中。将反应混合物在室温搅拌4h。然后在0℃下将4-羧基苯基硼酸(158mg，1.3mmol)加入到混合物中。将反应混合物在室温下进一步搅拌2小时，然后将反应溶液40℃加热5小时。蒸发溶剂后，残余物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱液：甲醇/二氯甲烷(v/v，1：60)，得到蓝色粉末化合物4(39mg，63％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝8.5Hz,1H),7.88–7.82(m,2H),7.63(d,J＝7.6Hz,2H),7.43–7.39(m,1H),7.36–7.32(m,2H),7.2–7.21(m,4H),6.91–6.87(m,1H),2.36(s,3H),2.31–2.26(m,2H),2.19(s,3H),0.97–0.93(m,3H).Mass spectrometry(ESI-HRMS,m/z):[M+H]+calcd.for[C30H26BN2O3]+473.2036；found 473.2039.化合物4的1H NMR谱图如图4所示，HRMS谱图如图5所示。
(3)化合物5的合成
Figure BDA0002345734270000092
N-Boc哌嗪：根据已报道的方法合成N-Boc哌嗪获得白色固体(90％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.54–3.22(m,4H),2.88–2.57(m,4H),1.82(s,1H),1.39(s,9H).ESI[M+H]+m/z calcd.for[C9H19N2O2]187.14,found 187.14[M+H]+.N-Boc哌嗪的1H NMR谱图如图6所示。
罗丹明-N-哌嗪-N-Boc：向罗丹明B(0.20mmol)DMF(5mL)溶液中，依次加入N-Boc哌嗪(0.41mmol)，HOBt(0.25mmol)和EDC(0.41mmol)。室温搅拌，TLC监测反应。反应完成后，加入水(30mL)，EtOAc萃取(3×30mL)，并用水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化，以甲醇/二氯甲烷(v/v，1：50)作为洗脱剂，得到目标化合物，为粉红色固体(87mg)，产率80％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.64–7.62(m,2H),7.48–7.46(m,1H),7.30–7.27(m,1H),7.16(s,1H),7.14(s,1H),6.84(d,J＝8.9Hz,2H),6.73(d,J＝1.8Hz,2H),3.61–3.51(m,8H),3.32–3.19(m,8H),1.34(s,9H),1.27–1.23(m,12H).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ168.17,157.88,155.80,155.63,154.62,135.21,131.84,130.86,130.36,129.94,129.89,114.02,113.46,95.97,80.37,45.54,27.18,11.49.ESI[M+H]+m/z calcd.for[C37H48N4O4]612.36,found 612.36[M+H]+.罗丹明-N-哌嗪-N-Boc的1H NMR谱图如图7所示，13C NMR谱图如图8所示。
化合物5：将罗丹明-N-哌嗪-N-Boc(1mmol)和TFA(3mL)在DCM(7mL)中搅拌30分钟。除去溶剂后，加入乙醚使产物沉淀并离心。化合物5无需进一步纯化即可直接用于下一步(粉红色固体，产率91％)。ESI[M]+m/z calcd.for[C32H39N4O2]511.31,found 511.40[M]+.
(4)荧光探针Rho-Bob的合成
Figure BDA0002345734270000101
向化合物4(0.08mmol)和DMF(5mL)的混合物中，加入化合物5(0.11mmol)，EDC(0.16mmol)和HOBt(0.11mmol)。室温搅拌，TLC监测反应。反应完成后，将反应用EtOAc稀释并用水(3×30mL)洗涤。有机相经Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化，以甲醇/二氯甲烷(v/v，1：80)为洗脱剂，得到荧光探针Rho-Bob，为蓝色固体(55mg)，收率71％。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.21–7.91(m,4H),7.79–7.74(m,4H),7.61–7.39(m,5H),7.26–7.22(m,4H),7.04–6.98(m,4H),6.92(s,2H),3.71–3.62(m,10H),3.59–3.57(m,2H),3.43–3.42(m,4H),2.43–2.33(m,8H),1.28–1.24(m,12H),1.07–1.04(m,3H).Mass spectrometry(ESI-HRMS,m/z):[M]+calcd.for[C62H62BN6O4]+965.4920；found 965.4928.荧光探针Rho-Bob的1H NMR谱图如图9所示，HRMS谱图如图10所示。
实施例2化合物4的光物理性质
对化合物4的光物理性质进行测试，测试结果如图11所示。其中，A为ACN/H2O混合溶液中化合物4(20μM)的荧光光谱图；B为·OH反应前后，化合物4(20μM)在ACN/PBS 2：1溶液中的荧光光谱图，580nm激发；C为·OH反应前后，相应的化合物4的UV-vis吸收光谱图，·OH由以下条件产生(H2O250μM，EDTA-Fe2+200μM)。图11A中的荧光光谱表明，化合物4的荧光强度对溶剂疏水性/亲水性变化高度敏感。化合物4在纯水中荧光较弱，而在乙腈(ACN)/H2O混合溶剂中发射强度随ACN与H2O体积比的增加而增加。该特性为探针的膜结构细胞器靶向成像提供了潜在可能。化合物4对·OH的反应性强，反应导致荧光强度和UV-vis吸光度的降低，如图11B和图11C。
如图11B所示，·OH和化合物4之间的反应能够释放出非荧光的4-羟基苯甲酸，该反应产物已通过质谱ESI-MS和核磁共振波谱NMR证实；其他产物碎片也是非荧光的，其结构还暂时未能鉴定。因此推测其反应机理为：·OH对化合物4的碳-硼键进行了自由基加成形成不稳定的碳正中间体，该中间体不稳定，继而水解产生苯酚结构，如图12所示。反应产物已通过NMR和质谱鉴定，反应产物的1H NMR谱图、13C NMR谱图、HRMS谱图分别如图13～15所示。
在密度泛函理论(DFT)的基础上，使用软件Gaussian 09和Multiwfn进行的理论计算和分析进一步支持了该推测。在计算中，采用Fukui函数(方程式S1)描述化合物4对自由基的局部化学反应性。Condensed Fukui函数用于预测化合物4的自由基反应位点如表1所示，C-B键中的原子3(C)表现出最大的正值，表明对·OH的反应性最大。理论结果与实验观察一致。
表1
Figure BDA0002345734270000121
注意：FREQ计算由高斯09执行。基于密度泛函理论(DFT)和G-311G(d)基组，方法：RM062X。波函数采用Multifwn进行分析[3]。
用于预测自由基反应的Fukui函数可以描述为
Figure BDA0002345734270000131
对于Fukui函数，正值较大的区域更容易受到自由基的攻击。表1中列出了化合物4中除氢原子以外的所有原子的f0。如表1所示，原子3(C)表现出最大的正值，表明该位点对羟基自由基具有最高的反应性。
实施例3化合物4与·OH的反应动力学研究
香豆素-3-羧酸(Coumarin-CA)是用于·OH检测的商业化荧光探针。本发明选择Coumarin-CA与化合物4进行比较。·OH和Coumarin-CA之间的反应生成荧光产物7-羟基香豆素-3-羧酸，其在400nm激发下具有峰值在454nm的发射光。因此，检查荧光强度I454即可监测该反应。同时，·OH与化合物4反应可以降低其在610nm处的吸收值，从而提供了一种监测反应的简单方法。测试时将Coumarin-CA(100μM)或化合物4(40μM)与Fenton试剂EDTA-Fe2+(100μM)/H2O2(10mM)在硼酸钠缓冲液(pH 9.0)中孵育。竞争性实验中，将Coumarin-CA和化合物4预先混合，再进行·OH反应。反应在96孔板中进行，每隔10秒间隔记录400nm激发下的发射强度I454，同时记录610nm处UV-vis吸光值I610。
测试结果如图16所示，其中，A为商品化3-羧基香豆素与·OH反应生成荧光产物；B为合成化合物4在·OH进攻下分解成非荧光片段；C为在化合物4存在和不存在的情况下，通过测量荧光强度I454(400nm激发)监测·OH与3-羧基香豆素的反应；D为在3-羧基香豆素存在和不存在的情况下，通过测量610nm处的UV-vis吸光度，监测·OH与化合物4之间的反应。
由图16可知，荧光的动力学变化表明，当化合物4不存在的情况下，将3-羧基香豆素与·OH的反应导致I454明显增加；而3-羧基香豆素、化合物4与·OH共孵育体系中，3-羧基香豆素和·OH的反应速率明显降低。相反，3-羧基香豆素的存在却没有对化合物4和·OH之间的反应速率产生影响。结果表明，N2O型Bobpy对·OH具有较高的反应活性，并且通过荧光淬灭方式实现对·OH的检测。
化合物4对·OH的高反应活性激励我们构建FRET探针用于·OH的比率式荧光成像。本发明选用罗丹明B(Rho)做为FRET供体，原因有二：一是Rho生物传感中最广泛使用的荧光分子之一，二是它的发射光谱与FRET受体化合物4的吸收光谱可以很好地重叠，如图17所示。两种荧光团通过双官能团哌嗪连接形成目标探针Rho-Bob。当激发Rho时，可观察到来自Bobpy而不是Rho发出的深红色荧光，这主要是由于共振能量从Rho传递到Bobpy。
分别测量了Rho-Bob中的罗丹明B和化合物4的相对量子产率。待测化合物分别溶于乙醇配成20μM溶液。罗丹明B的在乙醇中的量子产率
Figure BDA0002345734270000141
甲酚紫在乙醇中的量子产率
Figure BDA0002345734270000142
分别作为Rho-Bob和化合物4的参照，用于相对量子产率的计算。计算公式为：
Figure BDA0002345734270000143
下标R和S分别指参考和样本。Abs和Area分别是溶液在激发波长(罗丹明B和Rho-Bob的激发波长均为510nm；甲酚紫和化合物4的激发波长为565nm)的吸光度和荧光光谱的积分面积，n是溶剂的折光系数。室温下纯乙醇的折光系数(n)为1.36。
使用稳态荧光数据计算FRET效率(E)
Figure BDA0002345734270000144
Figure BDA0002345734270000148
Figure BDA0002345734270000149
因此E＝(1-0.010/0.65)×100％＝98.5％
从理论上讲，E可以根据以下公式计算：
Figure BDA0002345734270000147
在乙醇中，Rho-Bob中Rho的相对量子产率为0.010，而Rho单独存在时的量子产率为0.65，如表2和公式S2所示，表明Bobpy对Rho荧光淬灭作用明显。根据公式2，使用稳态荧光数据，如表2和表3所示，FRET效率计算为98.5％。结果表明，Rho-Bob中Rho和Bobpy之间的能量转移非常高效，如图18和公式S3所示。
基于化合物4的吸收光谱和罗丹明B的荧光光谱，使用PhotoChemCAD 2.1软件进行理论计算。由图18可知，理论计算估算两个荧光团之间的距离(R)为
Figure BDA0002345734270000151
(分子几何优化通过软件SYBYL-X-2.2.1基于MMFF94的能量最小化进行)。乙醇的折射率为n＝1.36，k2为2/3，FRET供体的荧光寿命为2.72ns，实验测量得到受体的摩尔吸收系数(45850M-1cm-1)和供体的量子产率(0.65，表1)。其他参数可从软件自带数据库中获取。根据PhotoChemCAD的结果，FRET极限距离R0计算为
Figure BDA0002345734270000152
FRET效率E计算为99.996％。
表2
Figure BDA0002345734270000153
表3
Figure BDA0002345734270000154
Rho-Bob上的·OH反应导致Bobpy分解并释放Rho偶联的苯酚结构，产物已通过HPLC和HRMS证实，如图19～20所示。
实施例4溶液相中的·OH检测
将1x PBS缓冲液(137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH 7.4)做为测试用的水溶液。使用温和的EDTA-Fe2+络合物在水相和生物体系中进行Fenton反应产生·OH。测试时将Rho-Bob荧光探针与EDTA-Fe2+在溶液中混合，然后加入H2O2使其终浓度分别为0、2、5、10、15、20、25、50、100μM。Rho-Bob和EDTA-Fe2+的终浓度分别为20μM和200μM。用96孔板测量时，每孔加入200μL反应混合物室温反应2.5小时，然后通过酶标仪进行荧光测量。每组测试设置三个重复。为了检测H2O2光解产生的·OH，将Rho-Bob(20μM)与H2O2(10mM)在ACN/PBS(2：1和1：9)溶液中混合。通过紫外光(254nm，5W)照射该混合溶液产生·OH，并记录荧光和吸收光谱。采用标准的计算方法(S/N＝3)得出在溶液中·OH的最低检出限(LOD)。
LOD＝3σ/B 公式1
其中σ是当·OH不存在时，三次独立测得的荧光强度I590的标准偏差。B是滴定曲线进行线性拟合后的斜率。
使用稳态荧光数据通过以下公式计算FRET效率(E)：
Figure BDA0002345734270000161
Figure BDA0002345734270000162
在混合溶剂(ACN/PBS为1：9和2：1)中进行·OH定量检测。测试结果如图21所示，其中，A为在ACN/PBS为1：9溶液中检测·OH；B为荧光光谱显示I590随着·OH浓度的增加增强，插图代表根据滴定曲线得到的线性拟合；C为在ACN/PBS 2：1溶液中·OH的比例荧光检测；D为荧光强度的比值(I590/I630)对·OH浓度的做曲线图，插图代表根据滴定曲线得到的线性拟合；E为H2O2光解产生的·OH的比率荧光检测；F为Rho-Bob与·OH反应后相应的UV-vis吸光光谱变化。
由图21可知，当·OH不存在时，Rho-Bob的溶液(ACN/PBS为1：9)中只观察到微弱的荧光。当增加·OH的浓度时，Rho的荧光强度增加(图21A)。将荧光强度I590对·OH浓度进行线性拟合，发现在0-20μM浓度范围内存在极好的线性关系(图21B)。根据公式1，最低检测限(LOD)计算为0.68μM，信噪比(S/N)为3。当在ACN/PBS为2：1溶液中激发Rho-Bob中的罗丹明时，Bobpy结构发出了明显的红色荧光。而·OH反应可导致Bob发射光强度(I630)降低和Rho发射光强度(I590)升高，进而实现了·OH的比率式荧光检测(图21C)。荧光强度比I590/I630与·OH浓度的线性范围在10至50μM之间(图21D)。在进一步的研究中，本发明还发现Rho-Bob对H2O2的UV光解产生的·OH也具有响应性。如图21E所示，随着照射时间的增加，荧光有连续的比率式变化。相应的UV-vis光谱表明，增加·OH的浓度导致Bobpy吸光度降低，而Rho吸光度没有明显变化(图21F)。结果表明·OH导致的分解反应只发生在Bobpy结构上。实施例5Rho-Bob FRET探针的选择性
本发明评估了Rho-Bob FRET探针的选择性。选择性研究使用20μM Rho-Bob在ACN/PBS为1：9溶液中进行，将多种生物相关的阴离子(NO2 -，HSO4 -和H2PO4 -)、活性氧和活性氮(H2O2，TBHP，O2·-和ONOO-)设置为对照分子。测试结果如图22所示，在所有的测试分子中，只有·OH可以导致I590的显著增强，当·OH浓度为50μM时可以观察到26倍的荧光增强。尽管其他测试物浓度(500μM)10倍于·OH，也仅产生背景水平的信号。DMSO是一种广泛使用的·OH特异性淬灭剂。本发明将DMSO(终浓度5％)加入该检测体系，发现荧光强度大大降低，这是因为过量的DMSO与Rho-Bob竞争·OH。结果表明Rho-Bob可以通过FRET-off方式选择性响应·OH。
实施例6活细胞成像和细胞内·OH检测
将HeLa细胞在DMEM培养基中培养，加入10％FBS和1％(v/v)青霉素/链霉素混合物。将HeLa细胞接种在带有盖玻片的培养皿中进行细胞成像。将Rho-Bob(10μM)添加到培养基中，培养30分钟。置换新鲜的培养基，通过Leica共聚焦显微镜(TCS-SPE-II)对细胞成像，采用532nm激光激发荧光分子。为了更好的区分两个荧光团的发射光，Rho和Bobpy的检测窗口分别设置为580nm至600nm和640nm至660nm。为了便于观察和分析，将Rho发出的荧光信号标记为绿色，Bobpy发出的信号标记为红色。通过与5μM商品化绿色线粒体探针共孵育来验证Rho-Bob的细胞定位。使用软件Image J和插件Coloc-2计算皮尔逊相关系数(PCC)，用于定量分析共定位的程度。
活细胞内·OH成像时，将Rho-Bob(10μM)与细胞孵育30分，然后将培养基替换为新鲜的DMEM，依次添加H2O2(1mM)和EDTA-Fe2+(200μM)。加入完毕，每隔几分钟拍摄一次荧光图像。用Rho-Bob对青蒿素活化产生的·OH进行观察时，先将细胞与Rho-Bob(10μM)和双氢青蒿素(DHA)或双氢青蒿素-三苯基膦衍生物DHA-TPP(均为20μM)共培养。4小时后，将培养基替换为新鲜的DMEM，并在显微镜下观察细胞并拍照。使用Image J软件对图像进行定量分析。
将Rho-Bob与商品化绿色线粒体探针Mito Tracker Green共同孵育，研究活细胞中Rho-Bob的亚细胞定位。测试结果如图23所示，其中，A为来自Rho-Bob的红色荧光；B为商品化绿色线粒体探针Mito Tracker Green发出的绿色荧光；C为来自红色和绿色通道的合并图像；D为通过Image J进行的共定位分析显示Pearson相关系数(PCC)＝0.88，比例尺代表25μm。
如图23所示，Rho-Bob发出的红色荧光与Mito Tracker Green发出的绿色荧光很好地重叠(图23C)。由image J计算出Pearson相关系数(PCC)来量化Rho-Bob和Mito green之间的共定位程度。我们发现红色和绿色信号共定位的PCC值为0.88，表明Rho-Bob具有很好的线粒体定位。为了在活细胞中诱导产生·OH，首先加入H2O2(1mM)，然后加入EDTA-Fe2+(200μM)。用激光共聚焦显微镜拍摄荧光图像，将来自Rho的荧光标记为绿色，来自Bobpy的荧光标记为红色。在Fenton试剂刚加入时，细胞中观察到明显的红色荧光，以及非常弱的绿色荧光，这表明Rho和Bobpy之间存在高效率的FRET。随着孵育时间的增加，红色荧光强度降低，绿色荧光逐渐变亮。
通过Image J对荧光强度进行定量分析，测试结果如图24所示，OH由EDTA-Fe2+(200μM)/H2O2(1mM)生成，Rho-Bob的使用量为10μM。在添加Fenton试剂后每隔几分钟拍摄一次图像。使用Image J进行定量分析，显示沿选择线(黄色线)的荧光强度，比例尺代表25μm。结果清楚地显示了随着细胞内·OH的产生，Rho-Bob荧光的发生了比率式变化。
实施例7利用Rho-Bob检测青蒿素分子在细胞线粒体内产生的·OH
越来越多的研究关注荧光技术在药物的药理和毒理研究中的应用，尤其对于那些涉及ROS产生的药物。青蒿素及其衍生物是一类重要的抗疟药物，除抗疟活性以外，其在体内外均被证明具有优异的抗癌活性。青蒿素的生物活性依赖于过氧桥的催化活化，进而导致具有生物毒性的ROS和烷基自由基的产生。本发明的发明人曾揭示青蒿素在血红素的催化下可以释放·OH。但是，目前尚不清楚在细胞内环境中青蒿素的活化是否会形成·OH。基于以上考虑，本发明尝试使用Rho-Bob来探究此细胞内过程。
双氢青蒿素-三苯基膦衍生物(DHA-TPP)的合成步骤如下：
Figure BDA0002345734270000191
向化合物7(0.17mmol)的DMF(5mL)溶液中，加入DHA(0.21mmol)、DMAP(0.21mmol)、HOBT(0.21mmol)和EDC(0.23mmol)，室温搅拌12h。反应完成后，将反应用EtOAc稀释并用水(3×30mL)洗涤。有机相经Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化，以甲醇/二氯甲烷(v/v，1：25)为洗脱剂，得到DHA-TPP。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82–7.77(m,6H),7.74–7.71(m,3H),7.66–7.62(m,6H),5.64(d,J＝9.9Hz,1H),5.35(s,1H),3.99–3.82(m,2H),3.01–2.93(m,1H),2.76–2.71(m,1H),2.47–2.44(m,1H),2.32–2.35(m,1H),1.95–1.81(m,4H),1.69–1.62(m,2H),1.56–1.53(m,2H),1.30–1.18(m,7H),0.89(d,J＝5.8Hz,3H),0.77(d,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.87,135.04,133.76,130.52,118.56,117.70,104.43,92.25,91.86,80.10,51.51,45.16,37.29,36.17,34.04,31.56,25.85,24.57,21.98,20.23,17.96,12.22.ESI[M-Br]+m/z calcd.for[C37H44O6P]615.29,found615.28[M-Br]+.DHA-TPP的1H NMR谱图如图25所示，13C NMR谱图如图26所示。
双氢青蒿素(DHA)或双氢青蒿素-三苯基膦衍生物(DHA-TPP)与Rho-Bob一同加入HeLa细胞培养体系，如图27所示，其中，A为双氢青蒿素(DHA)和DHA-TPP的结构式；B为利用Rho-Bob在活细胞中对药物诱导的·OH进行比率式荧光成像，通过Image J进行定量分析，从每组中选择三个独立的细胞进行分析，计算平均值和标准偏差，比例尺代表25μm。通过共聚焦显微镜拍摄活细胞图像，并通过Image J定量分析。随机选择细胞进行平均灰度值分析，并计算来自三个独立细胞的平均值与标准偏差(图27B)。如预期，在未经药物处理的对照细胞中Rho-Bob显示出弱的绿色荧光和明亮的红色荧光，绿色和红色通道的平均灰度值分别为7.09和32.12。DHA处理使绿色荧光的灰度值增加到10.66，而红色荧光平均灰度值(31.15)略有下降。有趣的是，用DHA-TPP处理明显增加了绿色荧光，同时减少了红色荧光，绿色和红色通道的平均灰度值分别为34.41和25.16。
众所周知，三苯基膦是广泛应用的线粒体靶向基团我们发现DHA-TPP的IC50为11.01μM，而DHA的IC50为24.09μM，如图28所示。其细胞毒性的测试方法为：在96孔板中以6000个细胞/孔的密度培养HeLa细胞24小时。然后将培养基更换为具有各种浓度的DHA和DHA-TPP的新鲜DMEM。温育72小时后，将培养基换成新鲜的RPMI-1640(不含酚红)，其中包含细胞活力测试试剂刃天青(70μM)，然后将平板在37℃孵育2小时。通过多功能酶标仪Varioskan LUX(Thermo Fisher)测量570nm处的UV-vis吸光度。把没有细胞但有刃天青测试试剂的孔设为空白，将没有DHA和DHA-TPP的处理的细胞活力设为100％。
线粒体靶向的DHA衍生物显示出增强的体外抗肿瘤活性，这与先前报道的现象一致。细胞线粒体含有亚铁离子，因此成为青蒿素活化的潜在场所。DHA活化导致·OH的产生，并被Rho-Bob探针捕捉到。简而言之，Rho-Bob可以成像DHA-TPP产生的·OH，为研究青蒿素及其衍生物的作用机理提供了新的分子工具。此外，对Rho-Bob也进行了细胞毒性测试，在细胞活力评估之前，将HeLa细胞与不同浓度的Rho-Bob孵育24小时，Rho-Bob的细胞毒性评估遵循上述相同步骤，测试结果如图29所示，结果表明Rho-Bob的毒性较低，进一步增强了其对活细胞成像的实用性。
实施例8斑马鱼体内的·OH比率式荧光成像
参照文献报道的方法进行斑马鱼的培养。野生型斑马鱼幼鱼于28.0℃下恒温培养箱中进行培养，培养基构成为：540μM KCl，13.7mM NaCl，300μM CaCl2、44μM KH2PO4、25μMNa2HPO4、420μM NaHCO3、100μM MgSO4，pH 7.4。使用5天大的斑马鱼对·OH进行体内成像。向培养基中添加Rho-Bob(5μM)，于28.0℃孵育24小时。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是经典的活性氧自由基清除剂，因此，在对照试验中将NAC(100μM)与Rho-Bob(5μM)和斑马鱼一起孵育。孵育后，除去培养基，将斑马鱼用PBS缓冲液洗涤两次后用含三氯甲烷(150μg/mL)的甘油(10％在PBS中)溶液固定在盖玻片上进行麻醉和荧光成像。斑马鱼成像与活细胞成像设置相同，通过相同的Leica共聚焦显微镜进行。
内源性·OH存在于正常和健康的组织中，有助于维持细胞内环境的稳态。内源性OH含量少且寿命短，因此体内检测·OH仍然面临挑战。我们选择斑马鱼作为小动物活体模型研究在正常培养条件下使用Rho-Bob作为荧光探针对·OH成像的可能性。在5天大的斑马鱼中加入Rho-Bob(5μM)，培养24小时后对鱼进行成像。在对照实验中，将自由基中和剂NAC(100μM)与Rho-Bob一起加入。
斑马鱼内源性·OH的比率式荧光成像图如图30所示。由图30可知，Rho-Bob荧光信号主要存在于鱼的胃肠道。鱼的体表也有些部分被随机染色。对于仅用Rho-Bob处理的鱼，在胃肠道中观察到明亮的绿色荧光，同时来自相同位置的红色信号相对较弱。相反，在其他染色区域绿色和红色荧光的亮度却相反。与NAC一起孵育会减弱胃肠道中的绿色荧光并增强红色荧光。
每组随机选取四条鱼成像并进行定量分析，内源·OH的比例荧光成像图如图31所示，鱼1至鱼4仅用Rho-Bob处理，鱼5至鱼8用Rho-Bob和NAC共同处理，使用Image J进行荧光定量分析的操作步骤如图32所示。
图33列出了胃肠道的荧光平均强度的比率(绿色/红色)，纵坐标为斑马鱼胃肠道的平均荧光强度的比值(绿色/红色)，鱼1至鱼4仅用Rho-Bob(5μM)处理，鱼5至鱼8用Rho-Bob(5μM)和NAC(100μM)共同处理。对于所有仅有Rho-Bob处理的鱼，绿色/红色比例(均在1以上)表明绿色荧光的平均强度高于红色荧光。相比之下，用Rho-Bob和NAC共处理的鱼，其相同部位的绿色与红色荧光强度比例均低于1。成像结果表明在正常生长条件下斑马鱼的胃肠道中存在·OH，而抗氧化剂处理可以减少·OH的含量。值得一提的是，斑马鱼实际上是一个常用的动物模型，已经被用于研究宿主与微生物的相互作用以及细菌触发的免疫反应。据报道，胃肠道内皮细胞中的NADPH氧化酶介导了ROS的产生，且ROS被认为在调节斑马鱼肠道炎症中起重要作用。尽管·OH产生的确切机制仍不清楚，但是宿主－微生物相互作用是可能的因素之一。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种羟基自由基比率式荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下：
Figure FDA0002345734260000011
2.如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Figure FDA0002345734260000012
将化合物4溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入化合物5、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，室温搅拌反应，即得所述羟基自由基比率式荧光探针。
3.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物4、化合物5、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔质量比为8:11:16:11。
4.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物4的制备方法为：
Figure FDA0002345734260000021
将化合物1在三溴氧磷、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、45℃的条件下制备得到化合物2；将化合物2在四(三苯基膦)钯、碳酸钠、甲苯、75℃，然后乙醇/氢氧化钠回流的条件下制备得到化合物3；将化合物3在4-二甲基-3-乙基吡咯、三氯氧磷、二氯甲烷、0℃，然后4-羧基苯硼酸、二氯甲烷、回流的条件下制备得到化合物4。
5.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物5的制备方法为：
Figure FDA0002345734260000022
(1)将罗丹明B溶于N,N-二甲基甲酰胺中，依次加入N-Boc哌嗪、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应，制备得到罗丹明-N-哌嗪-N-Boc；
(2)将步骤(1)制得的罗丹明-N-哌嗪-N-Boc、三氟乙酸溶于二氯甲烷中搅拌反应，即得化合物5。
6.如权利要求1所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针用于生物体或水环境中羟基自由基的检测。
7.一种羟基自由基的检测方法，其特征在于，所述检测方法使用如权利要求1所述的荧光探针。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为将荧光探针加入待检测溶液或培养基中，用酶标仪进行荧光测量，记录加入羟基自由基前后的荧光发射光谱，根据荧光强度的变化确定羟基自由基的存在。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，根据590nm处和630nm处发射的荧光强度的变化确定羟基自由基的存在。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，590nm处和630nm处发射的荧光强度比与羟基自由基的浓度成线性关系。
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