CN114315733A - 一类光诱导的细胞共价标记荧光分子、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类光诱导的细胞共价标记荧光分子、其制备方法及应用，具体涉及一类下式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，它们可以用于制备光诱导的共价标记荧光探针，用于细胞生物学中亚细胞器的定位及成像。所述的光诱导共价标记荧光探针在细胞生物学研究、蛋白质组学研究及生物大分子的动态变化研究中具有重要应用潜力和突出的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞标记成像及其分析其中蛋白质相互作用研究技术领域，主要涉及一种光诱导的多功能共价标记荧光探针及其在细胞生物学成像中的应用及质谱中分析中的应用。
背景技术
荧光分子探针极大地提升了探索细胞结构和细胞过程的能力，它是指能够吸收某个特定波长的光并发射出更长波长的光(荧光)的化学基团。活细胞成像技术正是利用这些荧光分子探针，比如小分子有机染料或者量子点来特异性的标记感兴趣的分子。能与蛋白质天然或者人工连接的荧光探针都会在荧光成像中用到。使用荧光探针的另外一个要点是要确保它们在进入细胞时不会对细胞造成损伤。探针进入细胞的方法包括：将染料脂化以促进细胞对其吸收，使用合成囊泡来包裹探针以及使用机械的方法例如显微注射和电穿孔等。
近年来，随着细胞器靶向荧光探针被不断开发，亚细胞成像领域取得了巨大进展，细胞器本身也可以用特异的荧光标签选择性的特异标记(Chem.Sci.,2019,10,6035-6071)。常见的细胞器探针有MitoTracker和MitoFluor，这两种探针主要用来标记线粒体的荧光探针。另外的细胞器探针如LysoTracker和LysoSensor常用来标记溶酶体，BODIPY及其衍生物常用来标记高尔基体。然而，这些已经开发的荧光分子探针，主要是在靶向细胞器后，在细胞器中以非成键方式的积累；另一类具有靶向细胞器的功能，但是这类分子探针具有自发的反应活性，能够在靶向细胞器的过程中，与细胞内的亲核体形成共价键的方式，进而产生了在还未到达细胞器之前在细胞中不同的部位可能产生背景信号。此外，这类能够与细胞内的亲核体小分子或者具有亲核性部位的生物大分子发生自发的反应，产生了潜在的细胞毒性，进而能够影响细胞的状态和产生假阳性的成像结果。因此，如果能够发展一种能够在特异性地靶向特定的细胞器，并且在未达到细胞器之前，该类荧光分子探针是惰性的，即不能与细胞内各类亲核体小分子或者具有亲核部位的生物大分子反应的荧光分子探针可以解决上述的成像背景信号干扰以及可能产生的假阳性结果。
光诱导的化学反应官能团在不光照时不与细胞器内各类分子反应，即是惰性的反应官能团；一旦在特定波长的光照射下，该类反应官能团产生高活性的中间体，与其靶向的蛋白质上的作用位点形成不可逆共价键结合的化学反应。由于光交联反应具有速度快、条件简单、适合于原位反应等优点，光诱导的化学反应官能团被应用于研究蛋白与小分子、生物大分子、蛋白或受体间的相互作用。目前该技术已经成为生物化学家和分子生物学家研究生物体系中空间相邻组分及生物大分子间相互作用的一个重要工具。
常见的光诱导的化学反应官能团根据其在光照射下生成活性中间体的不同，大致分为四类：氮宾(Nitrenes)类、卡宾(Carbenes)类、碳正离子(Carbocations)和自由基(Radicals)类。目前应用最为广泛的光交联基团有苯甲酮、叠氮苯和3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶(3-trifluoromethyl-3-phenyldiazir ine，TFMD)，(Mol Biosyst,2008,4,473-480；Curr.Opin.Chem.Biol.2013,17,90-101；Chem.Soc.Rev.2013,42,3289–3301)。理想的光诱导的化学反应官能团应具备以下几个特征：(1)具有一定的化学稳定性，耐受普通的化学反应；(2)在自然光中具有合理的稳定性；(3)无相应的光照条件下稳定，在紫外光照下很容易光解；(4)光解后的活性中间体既能与X-H(X为杂原子，X＝N,S,O)官能团反应，也能与C-H官能团反应；(5)光解中间体与受体作用得到的产物应该比较稳定，能够耐受分离、纯化和分析等操作。
然而，到目前为止在荧光分子中引入具有光诱导活性的化学反应官能团并没有被开发出来。而如果能够将具有光诱导活性的化学反应官能团与具有细胞器特异性靶向性质的荧光基团结合起来，开发一种具有特定的细胞器靶向性、又能够产生荧光信号，并且该类分子在光诱导前是惰性的，不能够与细胞内其他亲核性分子反应，而在光照诱导的条件下，又能够与靶向的细胞器反应，与该细胞器中的生物大分子，如蛋白质形成共价键。这类探针分子不但能够解决上述常见的自发反应的荧光分子背景信号的干扰，同时形成的共价键具有一定的稳定性，能够提高荧光成像的质量和准确性。
综上所述，在细胞器特异性靶向的荧光分子中引入具有光诱导活性的化学反应官能团，在光诱导条件下能够与相应的细胞器共价成键，应用于细胞生物学中亚细胞器的定位及成像，该类光诱导共价标记荧光探针在细胞生物学研究、蛋白质组学研究及生物大分子的动态变化研究中具有重要应用潜力和的非常突出的特点和珍贵的实用价值。
发明内容
本发明的发明人通过设计一类结构简单以及容易合成的具有光诱导活性的反应官能团，该类具有光诱导活性的反应官能团能够与细胞器靶向特异性的荧光基团整合在一起，形成一类结构新颖的光诱导共价标记荧光分子探针。该类光光诱导活性官能团主要含有邻硝基苄醇的结构。该类反应官能团在光诱导条件下，主要和胺基反应，在蛋白质复合物中主要和蛋白质中的赖氨酸的侧链胺基反应，形成吲唑酮(Indazolone),进而形成结构稳定的共价连接。我们通过邻硝基苄醇被光激活机理深入解析和苯环上电子效应、取代基位置的考察，设计合成了一系列含有邻硝基苄醇官能团以及其他具有细胞器靶向性的荧光基团，发展成多种不同细胞器靶向特异性和不同荧光发射信号的性质和功能的组合；根据不同生物大分子的特点以及研究目的的需要，这些多功能的光诱导共价标记荧光探针可以实现不同方式的交联和时间可控的蛋白质交联，实现高灵敏性的细胞成像。
另一方面，邻硝基苄醇官能团与赖氨酸交联反应得到的交联片段非常稳定，与赖氨酸反应可以在非常温和的条件下实现，反应速度非常快，反应效率高(Chem.,2019,5,2955-2968.RSC Adv.,2019,9,13249-13253)。因此，本发明开发的光诱导的共价标记荧光探针具有很好的连接蛋白质的能力，能够对相应的蛋白质的赖氨酸进行特异性标记，形成吲唑酮(Indazolone),因此该类探针在蛋白质组学和蛋白质相互作用和生物大分复合物相互作用的研究中，也同样具有重要应用潜力和的实用价值，实现相互作用的复合物被交联并被富集、解析及确认。
本发明的一个目的是提供通式(I)所示的化合物、其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、及各种形式的盐或其水合物。
本发明的另一个目的是提供该类化合物的制备方法。
本发明的另一个目的是提供该类化合物用于制备光诱导的共价标记荧光探针的应用。所述光诱导的共价标记荧光探针用在靶向亚细胞器的成像研究、细胞生物学动态变化的成像研究、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一种相互作用的成像研究中，或者用在靶向亚细胞器、细胞生物学动态变化、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一种相互作用的蛋白质的研究中和/或用于后续蛋白质富集、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质质谱分析中。
本发明提供如下通式(Ⅰ)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，其中
X可选自以下基团：
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12和R13各自独立地任选自氢、甲基或乙基；
R10和R11各自独立地任选自氢或甲基；
R14和R15各自独立地任选自氢或卤素；
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、-C(Ra)2-、-NRb-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、-C(Ra)2-、-NRb-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Ra、Rb各自独立地为氢、氘、C1-4烷基；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在,其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的3、4、5或6位相连；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-5烷氧基、C1-6烷胺基或氨基烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷胺基羰基、C5-8杂环基、C6-10芳基、C5-6杂芳基、
其中n0和n1为1、2、3、4或5，所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基取代基所取代。
优选地，通式(Ⅰ)所示的化合物中，
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连，
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-5烷氧基、C1-6烷胺基或氨基烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷胺基羰基、C5-8杂环基、C6-10芳基、C5-6杂芳基、
其中n0和n1为1、2、3、4或5，其中所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基取代基所取代。
更优选地，通式(Ⅰ)所示的化合物中，
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5。
进一步优选地，通式(Ⅰ)所示的化合物中，
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-、-(CH2)n2-L2-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-、-(CH2)n2-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-、-L1-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-或-(CH2)n2-L2-(CH2)n5-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连；
其中R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5。
在一优选实施方式中，通式(Ⅰ)的化合物选自如下通式：
X和Z的定义与上述定义中相同；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5；
n7至n43可选自0、1、2、3、4或5。
更优选地，通式(I)的化合物选自下列化合物：
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“烃基”是指只含有碳原子和氢原子的取代基，非限制性地包括甲基、乙基、异丙基、丙基、环己基、苯基等。
术语“C1-C6烷基”是指链上具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
术语“环烷基”是指由碳原子组成的饱和环状烷基，非限制性地包括环丁基、环戊基、环己基等。
术语“C1-C3烷氧基”非限制性地包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基。
术语“C1-C5烷氧基”非限制性地包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基、异丁氧基、新丁氧基等。
术语“C1-C6烷基羰基”非限制性地包括甲酰基、甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、异丙基羰基、丁基羰基、仲丁基羰基、异丁基羰基、新丁基羰基等。
术语“C2-C6烷氧基羰基”非限制性地包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、异丁氧基羰基、新丁氧基羰基等。
术语“C2-C6烷胺基羰基”非限制性地包括甲胺基羰基、乙胺基羰基、丙胺基羰基、异丙胺基羰基、丁胺基羰基、仲丁胺基羰基、异丁胺基羰基、新丁胺基羰基等。
术语“C3-C6脂肪环”是指含3至6个碳原子的饱和单环系，其中环原子可选自一个或多个氮、氧或硫的杂原子，环原子也可全为碳；非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、哌啶基、哌嗪基等。
术语“C3-C10环烷基”是指含3至10个碳原子的饱和单-或多-环系，非限制性地包括环丙基，环丁基，环戊基或环己基等。
术语“C6-C10芳基”是指包含6-10个环原子但环原子中不含杂原子的芳香族环基，如苯基、萘基。
术语“5-8元杂环基”是指含有一个或多个饱和和/或部分饱和环，其包括5至8个环原子，其中一个或多个环原子选自氮、氧或硫的杂原子，其余环原子为碳；例如，环氧丙烷、四氢呋喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基。
术语“5-6元杂芳基”是指包含5-6个环原子且在环原子中含有1-4个杂原子作为环成员的芳香环基团。杂原子可以选自氮、氧或硫。
术语“互变异构体”是指容易通过互为异构体的化学反应互变的结构异构体，该反应一般导致伴随单键和相邻双键转变的氢原子或质子的形式移动。
术语“对映体”是指互为镜像而不可重叠的立体异构体。
“非对映体”是指具有两个或者两个以上的手性中性，并且不成镜像的立体异构体。
“消旋体”是指两个互为镜像的立体异构体，旋光性相反，互相抵消了旋光性。
盐是指分子与对应的有机酸、无机酸或者有机碱、无机碱形成相应的盐，例如化合物的盐酸、甲酸、三氟乙酸、琥珀酸、甲磺酸盐等。
“水合物”是指含有水的化合物。
本发明也包含这里公布的任何一种新的中间体。
本发明有一个方面提供了通式(I)所示的化合物的制备方法，所述方法选自如下方法之一：
合成方法一：
步骤3-1：化合物3-A溶于DMF，在碳酸钾碱性条件下和(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯反应生成化合物3-B；
步骤3-2：化合物3-B溶于二氯甲烷后加入三氟乙酸，室温条件下反应1h后，将体系旋干得到固体残渣，溶于DMF后加入DIPEA调至PH为8～9,再加入NHS-o-NBA,室温条件下反应1h,反应完成后直接旋干，柱层析，得到化合物3。
合成方法二：
步骤9-1：将1-溴-2,4,5-三氟苯溶于无水四氢呋喃(THF)中，在-78℃下加入异丙基氯化镁(i-PrMgCl)的无水THF(2.0M，15mL，30mmol)溶液，相同温度下搅拌10min，升至0℃再搅拌30min后，在-78℃下加入2,4,5-三氟苯甲醛。将所得混合物再搅拌10min，然后室温搅拌24h。添加饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，Et2O萃取，有机干燥并除去溶剂，得到产物9-A。
步骤9-2：向9-A的CH2Cl2溶液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，KBr，NaHCO3，饱和NaCl水溶液，剧烈搅拌反应混合物，然后将NaOCl水溶液加入到混合物中。将反应混合物搅拌18h，萃取洗涤，干燥，过滤并蒸发溶剂，柱层析得化合物9-B。
步骤9-3：在封管中加入9-B，10M KOH溶液，并将混合物在190℃下反应2h。将反应混合物冷却至4℃，倒入浓盐酸中，过滤，沉淀用水洗涤，真空干燥，得到化合物9-C。
步骤9-4：将9-C溶于无水THF中加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、2-甲氧基乙氧基甲基氯(MEM-Cl)。将反应混合物在50℃下搅拌5h。浓缩，残余物通过硅胶柱色谱法纯化得到化合物9-D。
步骤9-5：在干燥的烧瓶中将2-碘甲苯溶于无水THF溶液，氮气保护，并在0℃下加入i-PrMgCl，室温搅拌2.5h。然后，向该溶液中加入9-D的无水THF溶液，并在室温搅拌24h。通过加入MeOH淬灭反应，并蒸发溶剂。将残余物溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸(TFA)，并在室温搅拌1h。蒸发溶剂，柱层析得化合物9-E。
步骤9-6：在干燥的烧瓶中加入9-E，N，N-双(三氟甲基磺酰基)苯胺，无水四氢呋喃，三乙胺，在氮气保护下60℃反应2h。蒸发溶液柱层析得到化合物9-F。
步骤9-7：在干燥烧瓶中加入9-F，N-Boc-1,2-二氨基乙烷，Pd(OAc)2，xantphos，Cs2CO3。在氮气保护下加入无水甲苯。将烧瓶密封90℃反应过夜。蒸发溶剂，残余物通过柱层析得到化合物9-G。
步骤9-8：向9-G的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和三乙胺，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物9。
合成方法三：
步骤21-1：将4-溴甲基-7-甲氧基香豆素溶于无水DCM，在N2保护，-78℃下滴加BBr3，于-78℃下继续搅拌0.5h，升至室温过夜。反应完全后，加入水淬灭反应，过滤，用DCM洗涤，得到浅黄色固体粗产品，直接用于下一步。
步骤21-2:将化合物21-A溶于2-甲氧基乙醇，加入吗啉，回流6h。反应完全后，浓缩，柱层析得化合物21-B。
步骤21-3:化合物21-B溶于DMF，加入碳酸钾和N-Boc-3-氨基丙基溴，在60℃下反应6h。反应完全后，浓缩，柱层析的化合物21-C。
步骤21-4:向21-C的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和DIPEA，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物21。
合成方法四：
步骤41-1：化合物41-A先在氢氧化钠溶液下生成41-A的碱，再在AlMe3条件下与哌嗪回流反应生成化合物41-B；
步骤41-2：化合物41-B溶于DMF后加入CDI,室温下反应生成化合物41。
合成方法五：
步骤54-1:将化合物1,1,3,3-四甲氧基丙烷添加到盐酸水溶液中，并在50℃下搅拌1h。然后将苯胺的盐酸水溶液滴加到上述反应液中，并在50℃继续搅拌2h。冷却后，过滤，干燥，得到化合物54-A。
步骤54-2:将在封管中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚和N-Boc-3-氨基丙基溴，再加入到甲苯中，120℃下反应2h，蒸发溶剂，加入无水THF和三乙胺，在0℃下滴加二碳酸二叔丁酯，升至室温反应过夜，浓缩得化合物54-B，直接投下一步。
步骤54-3:将化合物54-A和化合物1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物添加至乙酸酐和乙酸混合液中中，并将混合物搅拌并回流1h。将溶液冷却至室温，加入上述粗产物54-B和吡啶，反应在110℃回流1h。反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭至无气泡产生，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl洗涤，干燥，柱层析得到产物54-C。
步骤54-4:向54-C的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和三乙胺，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物54。
合成方法六：
步骤61-1：化合物61-A先在氢氧化钠溶液下生成61-A的碱，再在AlMe3条件下与哌嗪回流反应生成化合物61-B；
步骤61-2：化合物61-B溶于DMF后加入CDI,室温下反应生成化合物61。
本发明提供了如式(I)的化合物或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、同位素化合物、各种形式的盐或水合物用于制备光诱导的共价标记探针的应用。
所述光诱导的共价标记探针用在靶向细胞器的成像研究、细胞生物学动态变化的成像研究、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一种相互作用的成像研究中的应用。
所述光诱导的共价标记探针还用在靶向细胞器、细胞生物学动态变化、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一种相互作用的蛋白质的研究中、并用于后续蛋白质富集、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质质谱分析中。
附图说明
图1是在光诱导条件下，荧光分子探针与线粒体共价成键的荧光成像图。
具体实施方式
在所有实施例中，1H NMR由Bruker Avance III-300或Avance III-400型核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；质谱由MS质谱UPLC-MS(ESI)测定；其中UPLC型号是Waters HPLC H-CLASS，MS(ESI)的型号是Waters SQ Detector 2；无水四氢呋喃由二苯甲酮/金属钠回流干燥除氧制得，无水甲苯和无水二氯甲烷由氯化钙回流干燥制得；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等用于柱层析流动相的溶剂均购置于国药集团化学试剂有限公司；反应检测中使用的薄层层析硅胶板(HSGF254)来自国药集团化学试剂有限公司；化合物分离选用国药集团化学试剂有限公司的200-300目硅胶。本发明中原料可以从商业途径获得，如主要试剂购买于国药集团化学试剂有限公司，或者通过本领域已知的方法制备，或者根据本发明中所述方法制备。
实施例3：4-(羟甲基)-N-(3-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)丙基)-3-硝基苯甲酰胺(3)
步骤3-1：化合物3-A(10mg，0.01873mmol)溶于1mL DMF，加入碳酸钾(13mg，0.09365mmol)和(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(6.7mg，0.0282mmol),50℃下过夜反应，反应完成后直接旋干柱层析，产物为黄绿色固体(10.1mg,92％).ESI-MS[M-H]-m/z＝580.47.[M+H]+m/z＝582.46.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.55(s,1H),8.23(m,3H),8.14(d,J＝8.7Hz,2H),8.00(d,J＝8.4Hz,1H),7.66(m,1H),7.44(m,1H),7.12(d,J＝8.8Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,2H),4.08(t,J＝6.2Hz,2H),3.11(dd,J＝13.1,6.5Hz,8H),2.52(m,2H),2.25(s,3H),1.91–1.83(m,2H),1.38(s,9H).
步骤3-2：化合物3-B溶于2mL二氯甲烷后加入0.5mL三氟乙酸，室温条件下反应1h后，将体系旋干得到固体残渣，溶于DMF后加入DIPEA调至PH为8～9,再加入NHS-o-NBA(6mg，0.01892mmol),室温条件下反应1h,反应完成后直接旋干柱层析,产物为淡黄色固体(10.2mg,90％).ESI-MS[M-H]-m/z＝659.41.[M+H]+m/z＝661.44.1H NMR(600MHz,DMSO)δ12.96–12.33(m,1H),8.91(t,J＝5.5Hz,1H),8.53(d,J＝1.7Hz,1H),8.28(m,1H),8.24(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),8.20(m,2H),8.15(d,J＝8.7Hz,2H),8.00(d,J＝8.2Hz,1H),7.94(d,J＝8.1Hz,1H),7.67(m,1H),7.44(m,1H),7.14(d,J＝8.8Hz,2H),6.94(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),4.88(s,2H),4.17(t,J＝6.1Hz,2H),3.14(m,6H),2.55–2.52(m,4H),2.26(s,3H),2.09–2.02(m,2H).
实施例9：N-(2-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)乙基)-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺(9)
步骤9-1：将1-溴-2,4,5-三氟苯(3.5mL，30mmol)溶于无水四氢呋喃(THF)中，在-78℃下加入异丙基氯化镁(i-PrMgCl)的无水THF(2.0M，15mL，30mmol)溶液，相同温度下搅拌10min，升至0℃再搅拌30min后，在-78℃下加入2,4,5-三氟苯甲醛(2.9mL，20mmol)。将所得混合物再搅拌10min，然后室温搅拌24h。添加饱和NH4Cl水溶液淬灭反应，Et2O萃取，有机相经Na2SO4干燥并蒸发，得到粗产物9-A(6.7g，77％)，为棕色油状物。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.63–7.43(m,4H),6.49(d,J＝4.6Hz,1H),6.06(d,J＝4.5Hz,1H).
步骤9-2：向9-A(6.6g，22.6mmol)的CH2Cl2溶液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)(117mg，1.13mmol)，KBr(540mg，4.5mmol)，NaHCO3(3.8g，45.2mmol)，饱和NaCl水溶液，剧烈搅拌反应混合物，然后将NaOCl水溶液(64mL)加入到混合物中。将反应混合物搅拌18h，萃取洗涤，干燥，过滤并蒸发，柱层析得化合物9-B(3.25g，55％)，为黄色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.72–7.49(m,2H),7.00(td,J＝9.6,6.1Hz,2H).
步骤9-3：在封管中加入9-B(1.33g，4.6mmol)，10M KOH溶液(12mL，120mmol)，并将混合物在190℃下反应2h。将反应混合物冷却至4℃，倒入浓盐酸中，过滤，沉淀用水洗涤，真空干燥，得到化合物9-C(1.21g，4.5mmol)，为棕色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ11.54(s,2H),7.76(d,J＝10.8Hz,2H),7.06(d,J＝7.0Hz,2H).
步骤9-4：将9-C(1.2g，4.5mmol)溶于无水THF中加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(2.3mL，13.6mol)，2-甲氧基乙氧基甲基氯(MEM-Cl)(1.6ml，13.6mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌5h。浓缩，残余物通过硅胶柱色谱法纯化得到化合物9-D(840mg，1.9mmol，42％)，为浅黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.87(d,J＝10.7Hz,2H),7.47(d,J＝6.7Hz,2H),5.54(s,4H),3.86–3.77(m,4H),3.52–3.46(m,4H),3.22(s,6H).
步骤9-5：在干燥的烧瓶中将2-碘甲苯(1.2mL，9.4mmol)溶于无水THF溶液，氮气保护，并在0℃下加入i-PrMgCl(2.7mL，9.4mmol)，室温搅拌2.5h。然后，向该溶液中加入9-D(830mg，1.88mmol)的无水THF(10mL)溶液，并在室温搅拌24h。通过加入MeOH淬灭反应，并蒸发溶剂。将残余物溶于二氯甲烷(14mL)，加入三氟乙酸(TFA)(3mL)，并在室温搅拌1h。蒸发溶剂，柱层析得化合物9-E(570mg，89％)，为橙色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.53–7.43(m,2H),7.40(t,J＝7.3Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),6.46–6.24(m,4H),2.02(s,3H).
步骤9-6：在干燥的烧瓶中加入9-E(169mg，0.5mmol)，N，N-双(三氟甲基磺酰基)苯胺(268mg，0.75mmol)，无水四氢呋喃(7mL)，三乙胺(248μL，1.5mmol)，在氮气保护下60℃反应2h。蒸发溶液柱层析得到化合物9-F(110mg，66％)，为橙红色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.33(d,J＝6.3Hz,1H),7.57(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),7.52(d,J＝7.5Hz,1H),7.46(t,J＝7.3Hz,1H),7.31(d,J＝7.1Hz,1H),7.03(d,J＝10.1Hz,1H),6.61(d,J＝11.0Hz,1H),6.55(d,J＝6.9Hz,1H),2.07(s,3H).
步骤9-7：在干燥烧瓶中加入9-F(50mg，0.106mmol)，N-Boc-1,2-二氨基乙烷(17mg，0.106mmol)，Pd(OAc)2(2.4mg，0.01mmol)，xantphos(6.1mg，0.01mmol)，Cs2CO3(52mg，0.16mmol)。在氮气保护下加入无水甲苯(4mL)。将小瓶密封90℃反应过夜。蒸发溶剂，残余物通过柱层析得到化合物9-G(28mg，55％)，为红色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.58–7.37(m,4H),7.25(d,J＝7.3Hz,1H),7.03–6.97(m,2H),6.52(d,J＝11.9Hz,1H),6.47(d,J＝11.6Hz,1H),6.41(d,J＝7.2Hz,1H),3.21–3.11(m,4H),2.02(s,3H),1.35(s,9H).
步骤9-8：向9-G(15mg，30μmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入TFA(0.5mL)，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(9.7mg，33μmol)和三乙胺(20μl，0.15mmol)，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物9(7mg，41％)，为红色固体。1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.00(t,J＝5.3Hz,1H),8.45(d,J＝1.7Hz,1H),8.20(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.92(d,J＝8.1Hz,1H),7.87–7.82(m,1H),7.54(dd,J＝11.3,3.8Hz,1H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),7.44(t,J＝7.4Hz,1H),7.25(d,J＝7.5Hz,1H),7.13(d,J＝7.1Hz,1H),6.61–6.49(m,3H),5.32(t,J＝4.7Hz,1H),4.83(s,2H),3.68–3.63(m,4H),2.00(s,3H).ESI-MS[M-H]-m/z＝558.32.[M+H]+m/z＝560.76.
实施例21：4-(羟甲基)-N-(5-((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)戊基)-3-硝基苯甲酰胺(21)
步骤21-1：将4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(1.0g，3.7mmol)溶于无水DCM，在N2保护，-78℃下滴加BBr3(9.3mmol)，于-78℃下继续搅拌0.5h，升至室温过夜。反应完全后，加入水淬灭反应，过滤，用DCM洗涤，得到浅黄色固体粗产品925mg，直接用于下一步。
步骤21-2:将化合物21-A(410mg，2.35mmol)溶于2-甲氧基乙醇，加入吗啉(410mg，4.7mmol)，回流6h。反应完全后，浓缩，柱层析得化合物21-B(610mg，99％)，为黄色固体。1HNMR(500MHz,DMSO)δ10.51(s,1H),7.76(d,J＝8.7Hz,1H),6.79(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),6.71(d,J＝2.3Hz,1H),6.24(s,1H),3.62(s,2H),3.60–3.56(m,4H),2.49–2.41(m,4H).
步骤21-3:化合物21-B(100mg，0.38mmol)溶于DMF，加入碳酸钾(80mg，0.57mmol)和N-Boc-3-氨基丙基溴(331mg，1.15mmol)，在60℃下反应6h。反应完全后，浓缩，柱层析的化合物21-C(142mg，89％)，为浅黄色固体。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.85(d,J＝8.7Hz,1H),6.97–6.87(m,3H),6.31(s,1H),4.12–4.05(m,2H),3.65(s,2H),3.62–3.54(m,4H),3.08(dd,J＝12.7,6.7Hz,2H),2.49–2.43(m,4H),1.85(p,J＝6.5Hz,2H),1.37(s,9H).
步骤21-4:向21-C(133mg，0.32mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入TFA(0.5mL)，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(94mg，0.32mol)和DIPEA(160μl，0.96mmol)，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物21(112mg，71％)，为黄色固体。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.87(t,J＝5.3Hz,1H),8.50(d,J＝1.8Hz,1H),8.22(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.92(t,J＝12.3Hz,2H),7.09–6.93(m,2H),4.87(s,2H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.60(s,2H)，3.59–3.52(m,4H)，3.47(dd,J＝12.5,6.7Hz,2H),2.49–2.42(m,4H)，2.04(p,J＝6.5Hz,2H).ESI-MS[M+H]+m/z＝498.36
实施例41：N-(6-(二乙氨基)-9-(2-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)-3H-黄嘌呤-3-亚烷基)-N-乙基乙基氯化铵(41)
步骤41-1：将化合物41-A(5.0g，10.4mmol)溶解分散在1M NaOH(100mL)：乙酸乙酯(100mL)＝1:1的溶液中，然后水层用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋走溶剂，得到粗产品41-A的碱为红色油状液体(4.89g，86％)；室温下将哌嗪(1.89g，21.92mmol)溶于无水二氯甲烷溶液中，将其加入AlMe3的甲苯溶液(2.0M,5.48mL,10.96mmol)，搅拌一个小时之后出现白色固体，室温下将粗产品41-A的碱(3.00g,5.48mmol)溶于无水二氯甲烷溶液中逐滴加入上述溶液，反应体系回流过夜，反应完成后，冷却至室温，向反应体系中滴加0.1M的HCl直至无气泡产生，将体系过滤，并用DCM和DCM/MeOH(4∶1)洗涤，将滤液浓缩后溶解在DCM中，过滤除去不溶的盐并再次浓缩，将固体残余物溶解分散在NaHCO3(0.02％)和乙酸乙酯中，并将水层用乙酸乙酯洗涤5次，水层再加入NaCl使饱和，然后用1M的HCl酸化后并用异丙醇/二氯甲烷(4∶1)萃取3次，合并有机层后用无水Na2SO4干燥并浓缩,固体残余物通过硅胶柱色谱进行纯化，得到化合物41-B，为粉红色固体(2.11g,53％).1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.83–7.74(m,3H),7.53(dd,J＝5.8,2.9Hz,1H),7.27(d,J＝9.5Hz,2H),7.09(dd,J＝9.5,2.4Hz,2H),6.98(d,J＝2.4Hz,2H),3.74–3.66(m,12H),3.13(d,J＝4.5Hz,4H),1.36–1.28(m,12H).
步骤41-2：将化合物41-B(132mg,0.241mmol)溶于DMF中，再加入CDI(41mg，0.253mmol)搅拌1h,再加入4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸(47mg，0.241mmol)并搅拌过夜，反应完成后真空除去溶剂，并将固体残余物通过硅胶柱色谱进行纯化，得到粉红色固体(59mg,34％).1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.07(d,J＝1.5Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.77(s,2H),7.73(dd,J＝8.0,1.6Hz,2H),7.52(d,J＝4.9Hz,1H),7.28(d,J＝8.7Hz,2H),7.07(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(d,J＝2.4Hz,2H),4.96(s,2H),3.70(q,J＝7.1Hz,8H),3.49(s,8H),1.31(t,J＝7.1Hz,12H).13C NMR(126MHz,MeOD)δ170.0,169.7,159.3,157.3,156.9,148.4,141.4,136.5,136.0,133.2,133.1,132.2,131.8,131.4,131.3,130.0,128.9,124.5,115.4,114.9,97.4,61.7,46.9,12.8.ESI-MS[M-Cl]+m/z＝690.3274。
实施例54：2-(3-(1-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)-3,3-二甲基吲哚-2-亚基)丙-1-烯-1-基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-氯化铵(54)
步骤54-1:将化合物1,1,3,3-四甲氧基丙烷(4.9g，29.84mmol)添加到盐酸水溶液中，并在50℃下搅拌1h。然后将苯胺(4.9g，52.61mmol)的盐酸水溶液滴加到上述反应液中，并在50℃继续搅拌2h。冷却后，过滤，干燥，得到化合物54-A(6.2g，80％)，棕红色固体。1HNMR(500MHz,DMSO)δ12.53(d,J＝12.3Hz,2H),8.82(t,J＝12.5Hz,2H),7.49(t,J＝7.9Hz,4H),7.41(d,J＝7.7Hz,4H),7.27(t,J＝7.3Hz,2H),6.43(t,J＝11.5Hz,1H).
步骤54-2:将在封管中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚(956mg，6.0mmol)和N-Boc-3-氨基丙基溴(1.43g，6.0mmol)，再加入到甲苯中，120℃下反应2h，蒸发溶剂，加入无水THF和三乙胺(2.5ml，18mmol)，在0℃下滴加二碳酸二叔丁酯(1.44g，6.6mmol)，升至室温反应过夜，浓缩得化合物54-B，直接投下一步。
步骤54-3:将化合物54-A(336mg，1.3mmol)和化合物1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物(391mg，1.3mmol)添加至乙酸酐和乙酸混合液中(6mL)中，并将混合物搅拌并回流1h。将溶液冷却至室温，加入上述粗产物54-B(6.0mmol)和吡啶(1ml)，反应在110℃回流1h。反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭至无气泡产生，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl洗涤，干燥，柱层析到深蓝色固体310mg，收率43％。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.33(td,J＝13.1,5.7Hz,2H),7.62(dd,J＝7.3,4.1Hz,2H),7.43–7.33(m,4H),7.30–7.20(m,2H),7.02(t,J＝5.2Hz,1H),6.53(t,J＝12.3Hz,1H),6.27(dd,J＝25.8,13.8Hz,2H),4.09(t,J＝7.3Hz,2H),3.61(s,3H),3.07–2.98(m,2H),1.86–1.77(m,2H),1.68(s,12H),1.38(s,9H).
步骤54-4:向54-C(200mg，0.38mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中加入TFA(0.5mL)，并在室温搅拌0.5h。蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(112mg，0.38mol)和三乙胺(264μl，1.9mmol)，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物54(122mg，53％)，为深蓝色固体。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.91(t,J＝5.4Hz,1H),8.54(d,J＝1.7Hz,1H),8.34–8.26(m,2H),8.23(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),7.96(d,J＝8.2Hz,1H),7.65–7.58(m,2H),7.45–7.35(m,4H),7.31–7.20(m,2H),6.36(t,J＝12.3Hz,1H),6.24(d,J＝13.8Hz,1H),6.16(d,J＝13.9Hz,1H),5.68(t,J＝5.4Hz,1H),4.88(d,J＝5.4Hz,2H),4.19(t,J＝7.2Hz,2H),3.61(s,3H),3.41(d,J＝5.9Hz,2H),2.07–1.95(m,2H),1.67(d,J＝4.4Hz,12H).ESI-MS[M+H]+m/z＝605.93.
实施例61：N-(6-(二乙氨基)-9-(2-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)-3H-黄嘌呤-3-亚烷基)-N-乙基乙基氯化铵(61)
步骤61-1：将化合物61-A(5.0g，10.4mmol)溶解分散在1M NaOH(100mL)：乙酸乙酯(100mL)＝1:1的溶液中，然后水层用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后旋走溶剂，得到粗产品61-A的碱为红色油状液体(4.89g，86％)；室温下将哌嗪(1.89g，21.92mmol)溶于无水二氯甲烷溶液中，将其加入AlMe3的甲苯溶液(2.0M,5.48mL,10.96mmol)，搅拌一个小时之后出现白色固体，室温下将粗产品61-A的碱(3.00g,5.48mmol)溶于无水二氯甲烷溶液中逐滴加入上述溶液，反应体系回流过夜，反应完成后，冷却至室温，向反应体系中滴加0.1M的HCl直至无气泡产生，将体系过滤，并用DCM和DCM/MeOH(4∶1)洗涤，将滤液浓缩后溶解在DCM中，过滤除去不溶的盐并再次浓缩，将固体残余物溶解分散在NaHCO3(0.02％)和乙酸乙酯中，并将水层用乙酸乙酯洗涤5次，水层再加入NaCl使饱和，然后用1M的HCl酸化后并用异丙醇/二氯甲烷(4∶1)萃取3次，合并有机层后用无水Na2SO4干燥并浓缩,固体残余物通过硅胶柱色谱进行纯化，得到化合物61-B，为粉红色固体(2.11g,53％).1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.83–7.74(m,3H),7.53(dd,J＝5.8,2.9Hz,1H),7.27(d,J＝9.5Hz,2H),7.09(dd,J＝9.5,2.4Hz,2H),6.98(d,J＝2.4Hz,2H),3.74–3.66(m,12H),3.13(d,J＝4.5Hz,4H),1.36–1.28(m,12H).
步骤61-2：将化合物61-B(132mg,0.241mmol)溶于DMF中，再加入CDI(41mg，0.253mmol)搅拌1h,再加入4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸(47mg，0.241mmol)并搅拌过夜，反应完成后真空除去溶剂，并将固体残余物通过硅胶柱色谱进行纯化，得到粉红色固体(59mg,34％).1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.53(s,1H),8.09(s,1H),7.76(d,J＝14.8Hz,4H),7.50(s,2H),7.12(s,4H),6.95(s,2H),4.83(s,2H),3.61–3.23(m,8H),3.10(s,8H),1.25–1.14(m,12H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ167.5,166.6,157.1,155.5,155.1,147.0,140.2,139.0,135.1,131.8,130.7,130.4,129.8,127.5,126.8,126.2,124.7,117.8,115.4,114.3,113.0,95.9,59.7,45.6,45.4,12.4.ESI-MS[M-Cl]+m/z＝690.3271。
根据合成方法一至方法六，以及实施例3、9、21、41、54和61的合成方法，可以合成以下化合物。
实施例1：N-(4-(羟甲基)-3-硝基苄基)-4-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)丁酰胺(1)
ESI-MS[M+H]+m/z＝675.76，实测值为675.64.
实施例2：(羟甲基)-3-硝基苄基(2-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-乙氧基苯甲酸乙酯)氨基甲酸酯(2)
ESI-MS[M+H]+m/z＝677.73，实测值为677.56.
实施例4：4-(羟甲基)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-硝基苯甲酰胺(4)
ESI-MS[M+H]+m/z＝779.87，实测值为779.58.
实施例5：4-(羟甲基)-N-(2-(2-(2-(4-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)丁酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-硝基苯甲酰胺(5)
ESI-MS[M+H]+m/z＝820.92，实测值为830.01.
实施例6：4-(羟甲基)-3-硝基苄基4-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)丁酸酯(6)
ESI-MS[M+H]+m/z＝676.75，实测值为676.80.
实施例7：4-(羟甲基)-3-硝基苄基3-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)丙酸酯(7)
ESI-MS[M+H]+m/z＝662.26，实测值为662.66.
实施例8：N-(4-(羟甲基)-3-硝基苄基)-5-(4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)戊酰胺(8)
ESI-MS[M+H]+m/z＝689.79，实测值为689.86.
实施例10：N-(3-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)-3-氧代丙基)-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺(10)
ESI-MS[M+H]+m/z＝588.54，实测值为588.68.
实施例11：3-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)-N-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基)丙酰胺(11)
ESI-MS[M+H]+m/z＝560.53，实测值为560.80.
实施例12：4-(羟甲基)-3-硝基苄基3-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)丙酸酯(12)
ESI-MS[M+H]+m/z＝575.54，实测值为575.63.
实施例13：1-(4-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)丁基)-3-(4-(羟甲基)-3-硝基苄基尿素(13)
ESI-MS[M+H]+m/z＝617.62，实测值为617.58.
实施例14：N-(16-(((2,7-二氟-3-氧-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-氨基))-13-氧-3,6,9-三氧-12-氮杂十六烷基)-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺(14)
ESI-MS[M+H]+m/z＝777.79，实测值为777.82.
实施例15：N-(2-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)乙基)-2-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基乙酰胺(15)
ESI-MS[M+H]+m/z＝574.55，实测值为574.65.
实施例16：4-(羟甲基)-3-硝基苄基(4-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)苯乙基)氨基甲酸酯(16)
ESI-MS[M+H]+m/z＝666.65，实测值为666.78.
实施例17：4-(羟甲基)-3-硝基苯基3-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄嘌呤-6-基)氨基)丙酸酯(17)
ESI-MS[M+H]+m/z＝561.51，实测值为561.62.
实施例18：4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基-4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(18)
ESI-MS[M+H]+m/z＝441.41，实测值为441.65.
实施例19：4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸2-(2-(3-((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基(19)
ESI-MS[M+H]+m/z＝601.58，实测值为601.63
实施例20：N-(4-(羟甲基)-3-硝基苄基)-3-((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)丙酰胺(20)
ESI-MS[M+H]+m/z＝498.50，实测值为498.76.
实施例22：4-(羟甲基)-N-(2-(2-(2-(2-(((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基))-3-硝基苯甲酰胺(22)
ESI-MS[M+H]+m/z＝616.64，实测值为616.52.
实施例23：4-(羟甲基)-3-硝基苄基3-((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)丙酸酯(23)
ESI-MS[M+H]+m/z＝499.49，实测值为499.65.
实施例24：(E)-4-((4-((2,7-二氟-3-氧代-9-(邻甲苯基)-3H-黄体酮-6-基)氨基甲酰基)苯基)二氮烯基)苯基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(24)
ESI-MS[M+H]+m/z＝741.68，实测值为741.96.
实施例25：(E)-4-((4-(((4-(吗啉代甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氧基)羰基)苯基)二氮烯基)苯基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(25)
ESI-MS[M+H]+m/z＝665.63，实测值为665.72.
实施例26：(E)-4-((4-((4-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并[d]咪唑]-2'-基)苯氧基)羰基)苯基)二氮烯基)苯基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(26)
ESI-MS[M+H]+m/z＝828.86，实测值为828.70.
实施例27：(E)-4-((4-((2-(3'，6'-双(乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤]-2-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰二氮烯基)苯基酯(27)
ESI-MS[M+H]+m/z＝832.89，实测值为832.76.
实施例28：(E)-4-((4-((2-(3'，6'-双(二乙基氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤]-2-基)乙基)氨基甲酰基)苯基)4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰二氮烯基)苯基酯(28)
ESI-MS[M+H]+m/z＝888.99，实测值为888.86.
实施例29：3'，6'-双(二乙氨基)-2-(2-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)乙基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤](29)
ESI-MS[M+H]+m/z＝733.88，实测值为734.05.
实施例30：4-(羟甲基)-3-硝基苄基4-((2-(3'，6'-双(二乙氨基)-3-氧代螺[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤]-2-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸酯(30)
ESI-MS[M+H]+m/z＝750.87，实测值为750.69.
实施例31：6-((4-(羟甲基)-3-硝基苄基氧基)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并异喹啉-1,3(2H)-二酮(31)
ESI-MS[M+H]+m/z＝492.50，实测值为492.39.
实施例32：6-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并异喹啉-1,3(2H)-二酮(32)
ESI-MS[M+H]+m/z＝574.61，实测值为574.53.
实施例33：4-(羟甲基)-3-硝基苄基4-(2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基)哌嗪-1-甲酸(33)
ESI-MS[M+H]+m/z＝604.63，实测值为604.78.
实施例34：(E)-4-((4-(4-(2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基)哌嗪-1-羰基)苯基)二氮烯基)苯基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(34)
ESI-MS[M+H]+m/z＝798.83，实测值为798.86.
实施例35：2-(3-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)-6-(((2-吗啉代乙基)氨基)-1H-苯并异喹啉-1,3(2H)-二酮(35)
ESI-MS[M+H]+m/z＝645.69，实测值为645.80.
实施例36：N1-(4-(羟甲基)-3-硝基苄基)-N4-(2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基)琥珀酰胺(36)
ESI-MS[M+H]+m/z＝590.61，实测值为590.74.
实施例37：4-(羟甲基)-3-硝基苄基4-((2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基)氨基)-4-氧代丁酸酯(37)
ESI-MS[M+H]+m/z＝560.59，实测值为560.71.
实施例38：2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基4-((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氨基)-4-氧代丁酸酯(38)
ESI-MS[M+H]+m/z＝591.59，实测值为591.74.
实施例39：2-((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氧基)-1-(9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-基)乙-1-酮(39)
ESI-MS[M+H]+m/z＝493.53，实测值为493.65.
实施例40：2-(2-吗啉代乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并异喹啉-6-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯(40)
ESI-MS[M+H]+m/z＝506.48，实测值为506.42.
实施例42：(E)-N-(6-(二乙氨基)-9-(2-(4-(4-((4-(((4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)氧基)苯基)二氮烯基]苯甲酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)-3H-噻吨-3-亚烷基)-N-乙基乙基氯化铵(42)
ESI-MS[M+H]+m/z＝951.49，实测值为951.34.
实施例43：N-(6-(二乙氨基)-9-(2-(4-((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基)苯基)-3H-黄嘌呤-3-亚烷基)-N-乙基乙基氯化铵(43)
ESI-MS[M+H]+m/z＝756.31，实测值为756.70.
实施例44：N-(6-(二乙氨基)-9-(2-((3-((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氧基)-3-氧代丙氧基)羰基)苯基)-3H-黄嘌呤-3-亚基)-N-乙基乙基氯化铵(44)
ESI-MS[M+H]+m/z＝717.23，实测值为717.30.
实施例45：6-(4-((5-(羟甲基)-2,4-二硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并异喹啉-1,3(2H)-二酮(45)
ESI-MS[M+H]+m/z＝655.65，实测值为655.70.
实施例46：6-(4-((5-(羟甲基)-2,4-二硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-2-(2-吗啉代乙基)-1H-苯并异喹啉-1,3(2H)-二酮(46)
ESI-MS[M+H]+m/z＝655.65，实测值为655.70.
实施例47：3'，6'-双(二乙氨基)-2-(2-(4-((5-(羟甲基)-2,4-二硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)乙基)螺[异吲哚啉-1,9'-黄嘌呤](47)
ESI-MS[M+H]+m/z＝814.93，实测值为814.80.
实施例48：N-(6-(二乙氨基)-9-(2-((((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氧基)羰基)苯基)-3H-黄嘌呤-3-亚烷基)-N-乙基乙基氯化铵(48)
ESI-MS[M+H]+m/z＝645.17，实测值为645.28.
实施例49：(6-(3-氨基-8-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺基)-6-苯基菲啶-5(6H)-基)己基)三苯基氯化磷(49)
ESI-MS[M+H]+m/z＝848.39，实测值为848.67.
实施例50：4-(羟甲基)-3-硝基-罗斯明盐酸盐(50)
ESI-MS[M+H]+m/z＝559.08，实测值为559.19.
实施例51：2-((2-((2-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺基)乙基)氨基)-1-苯基喹啉-4(1H)-亚烷基)甲基)-3-甲基苯并噻唑-3-氯化铵(51)
ESI-MS[M+H]+m/z＝641.16，实测值为641.32.
实施例52：2-((2-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)哌嗪-1-基)-1-苯基喹啉-4(1H)-亚烷基)甲基)-3-甲基苯并噻唑-3-氯化铵(52)
ESI-MS[M+H]+m/z＝667.19，实测值为667.35.
实施例53：氨基(2-(2-(5-((((2-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺基)乙基)氨基)(亚氨基)甲基)-2,3-二氢-1H-茚满-2-基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)甲铵(53)
ESI-MS[M+H]+m/z＝569.63，实测值为569.85.
实施例55：2-(3-(1-(2-(4-(羟甲基)-3-硝基苯基)乙酰基)-3,3-二甲基吲哚-2-亚烷基)丙-1-烯-1-基)-1,3，3-三甲基-3H-吲哚-1-氯化物(55)
ESI-MS[M+H]+m/z＝573.10，实测值为573.41.
实施例56：(4-(3,6-双(二甲基氨基)-9H-黄嘌呤-9-基)-2-硝基苯基)甲醇(56)
ESI-MS[M+H]+m/z＝420.48，实测值为420.56.
实施例57：4-(羟甲基)-3-硝基-罗斯明(57)
ESI-MS[M+H]+m/z＝524.63，实测值为524.58.
实施例58：5,6-二氯-3-(4-(氯甲基)苄基)-1-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰基)-2-(3-(3-甲基苯并[d]恶唑-2(3H)-亚烷基)丙-1-烯-1-基)-1H-苯并咪唑-3-氯化铵(58)
ESI-MS[M+H]+m/z＝713.41，实测值为713.52.
实施例59：2'-(4-(4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酰胺基)苯基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并咪唑]-3,3'-二鎓(59)
ESI-MS[M+H]+m/z＝606.68，实测值为606.85.
实施例60：2'-(4-(4-(((4-(羟甲基)-3-硝基苄基)氧基)-4-氧杂烟酰胺基)苯基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基-1-基)-1H，1'H-[2,5'-联苯并咪唑]-3,3'-二鎓(60)
ESI-MS[M+H]+m/z＝692.77，实测值为693.01.
实施例62：
光诱导条件下，荧光分子探针与线粒体共价成键的荧光成像实验
在该实验条件下分别用本发明发展的具有光诱导活性的化合物(41)和在光诱导条件下，不能共价成键的商业化的靶向线粒体的特异性荧光分子探针罗丹明123，开展细胞成像分析。在37℃条件下，MDA-MB-468细胞用化合物(41)和罗丹明123(1μM)在DMEM培养基中孵育30分钟，分别用Hoechst 33342(800nM)孵育15分钟(图1顶部)，细胞没有进行洗脱；另一个实验是在365nm波长光下曝光15分钟的条件下，并用4％PFA固定(图1底部)，用PBS洗涤两次并在共聚焦荧光显微镜下观察(552nm，488nm和405nm)。
通过该实验成像分析发现，在无光诱导条件下并且细胞不进行洗脱的条件下，化合物(41)和罗丹明123均能够对线粒体进行成像，同时这两个荧光分子探针均显示很好地靶向线粒体，并且具有很好的重合特点(图1上半部分，各自成像信号叠合，Hoechst 33342为染细胞核试剂)。然而在进行光诱导的条件下并且对细胞进行洗脱的条件下，洗去了与线粒体没有共价连接的分子探针；该实验结果发现，在化合物(41)的作用下，荧光成像信号依然保留在线粒体上(图1下半部分，Hoechst 33342为染细胞核试剂)，说明化合物(41)在光照条件下能够和线粒体形成很好的共价成键。而罗丹明123相关的荧光信号消失，表明该类在光照条件下，不能和线粒体共价结合的荧光分子探针被彻底洗去。
综上所述，本发明开发的在细胞器特异性靶向的荧光分子中引入具有光诱导活性的化学反应官能团，在光诱导条件下能够与相应的细胞器中的蛋白质中赖氨酸的侧链氨基形成吲唑酮(Indazolone),实现共价标记。这类光诱导共价标记荧光探针在靶向细胞器的成像研究、细胞生物学动态变化的成像研究、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任意一种相互作用能够实现共价荧光成像。此外，这类光诱导共价标记荧光探针在靶向细胞器、细胞生物学动态变化、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任意一种相互作用的蛋白质的研究中、也将能够用于后续蛋白质富集、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质质谱分析中的应用。
因此本发明开发的光诱导共价标记荧光探针应用于细胞生物学中亚细胞器的定位及成像，该类光诱导共价标记荧光探针在细胞生物学研究、蛋白质组学研究及生物大分子的动态变化研究中具有重要应用潜力和的非常突出的实用价值。
Claims (10)
1.一种通式(Ⅰ)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，
其中X可选自以下基团：
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R12和R13各自独立地任选自氢、甲基或乙基；
R10和R11各自独立地任选自氢或甲基；
R14和R15各自独立地任选自氢或卤素；
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、-C(Ra)2-、-NRb-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、-C(Ra)2-、-NRb-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Ra、Rb各自独立地为氢、氘、C1-4烷基；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在,其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的3、4、5或6位相连；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-5烷氧基、C1-6烷胺基或氨基烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷胺基羰基、C5-8杂环基、C6-10芳基、C5-6杂芳基、
其中n0和n1为1、2、3、4或5，所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基取代基所取代。
2.如权利要求1所述的通式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或其水合物，其中
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连，
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、硝基、氰基、C1-6烷基、C3-10环烷基、C1-5烷氧基、C1-6烷胺基或氨基烷基、C1-C6烷基羰基、C2-C6烷氧基羰基、C2-C6烷胺基羰基、C5-8杂环基、C6-10芳基、C5-6杂芳基、
其中n0和n1为1、2、3、4或5，其中所述的烷基、环烷基、烷氧基、烷胺基或氨基烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷胺基羰基、杂环基、芳基、杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、C1-C6烷氧基、氰基、硝基取代基所取代。
3.如权利要求1所述的通式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，其中
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
n6＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5。
4.如权利要求1所述的通式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，其中
Y选自：-(CH2)n2-L1-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-、-(CH2)n2-L2-(CH2CH2O)n3-(CH2)n4-、-(CH2)n2-L2-(CH2)n5-(CH2CH2O)n6-L3-、-L1-(CH2)n4-L2-(CH2)n5-或-(CH2)n2-L2-(CH2)n5-，其中L1、L3分别独立选自-NH-、-O-、-CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；L2选自-O-、-S-、-S-S-、-NH-、-N(Me)-、CO-、-OCO-、-COO-、-NHCO-、-CONH-、
五元杂芳环、六元杂芳环、C3-6脂肪环或者不存在；
n2＝0、1、2或3；
n3＝0、1、2、3、4或5；
n4＝0、1、2、3、4或5；
n5＝0、1、2、3、4或5；
Z选自：-CO-、-NH-CO-、-NH-CH2-、-O-CO-CH2-、-NH-COO-CH2-、-NH-CO-NH-CH2-、-COOCH2-、-CO-NH-、-O-CH2-、-CH2-、-COO-、-OCO-、-O-、-S-、-SO2-、-C≡C-、-C＝C-、-SO2NH-、-NHCONH-、-NHCSNH-、-NH-、-CONH-CH2-或者不存在，其中Z一端可与邻硝基苄醇结构中苯环的4或5位相连；
其中R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5。
5.如权利要求1所述的通式(I)所示的化合物、其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，其中通式(Ⅰ)的化合物选自如下通式：
X和Z的定义与权利要求1中相同；
R1为邻硝基苄醇结构中3、4、5或6位上除Z取代位置的任意位置取代，R1选自氢、氘、氨基、卤素、C1-3烷氧基、硝基或
其中n0和n1为1、2、3、4或5；
n7至n43可选自0、1、2、3、4或5。
6.如权利要求1所述的通式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物，其中通式(Ⅰ)的化合物选自以下化合物：
7.一种制备权利要求1所述的通式(I)所示的化合物的方法，所述方法选自如下方法：
合成方法一：
步骤3-1：化合物3-A溶于DMF，在碳酸钾碱性条件下和(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯反应生成化合物3-B；
步骤3-2：化合物3-B溶于二氯甲烷后加入三氟乙酸，室温条件下反应1h后，将体系旋干得到固体残渣，溶于DMF后加入DIPEA调至PH为8～9，再加入NHS-o-NBA，室温条件下反应1h,反应完成后直接旋干，柱层析，得到化合物3；
合成方法二：
步骤9-1：将1-溴-2,4,5-三氟苯溶于无水四氢呋喃(THF)中，在-78℃下加入异丙基氯化镁(i-PrMgCl)的无水THF(2.0M，15mL，30mmol)溶液，相同温度下搅拌10min，升至0℃再搅拌30min后，在-78℃下加入2,4,5-三氟苯甲醛，将所得混合物再搅拌10min，然后室温搅拌24h，添加饱和NH 4Cl水溶液淬灭反应，Et 2O萃取，有机相干燥并除去溶剂，得到产物9-A；
步骤9-2：向9-A的CH2Cl2溶液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，KBr，NaHCO3，饱和NaCl水溶液，剧烈搅拌反应混合物，然后将NaOCl水溶液加入到混合物中，将反应混合物搅拌18h，萃取洗涤，干燥并除去溶剂，柱层析得化合物9-B；
步骤9-3：在封管中加入9-B，10M KOH溶液，并将混合物在190℃下反应2h，将反应混合物冷却至4℃，倒入浓盐酸中，过滤，沉淀用水洗涤，真空干燥，得到化合物9-C；
步骤9-4：将9-C溶于无水THF中加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、2-甲氧基乙氧基甲基氯(MEM-Cl)，将反应混合物在50℃下搅拌5h，浓缩，残余物通过硅胶柱色谱法纯化得到化合物9-D；
步骤9-5：在干燥的烧瓶中将2-碘甲苯溶于无水THF溶液，氮气保护，并在0℃下加入i-PrMgCl，室温搅拌2.5h，然后，向该溶液中加入9-D的无水THF溶液，并在室温搅拌24h，通过加入MeOH淬灭反应，除去溶剂，将残余物溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸(TFA)，并在室温搅拌1h，柱层析得化合物9-E；
步骤9-6：在干燥的烧瓶中加入9-E，N，N-双(三氟甲基磺酰基)苯胺，无水四氢呋喃，三乙胺，在氮气保护下60℃反应2h，蒸发溶液柱层析得到化合物9-F；
步骤9-7：在干燥烧瓶中加入9-F，N-Boc-1,2-二氨基乙烷，Pd(OAc)2，xantphos，Cs2CO3，在氮气保护下加入无水甲苯，将烧瓶密封90℃反应过夜，残余物通过柱层析得到化合物9-G；
步骤9-8：向9-G的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h，除去溶剂后将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和三乙胺，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物9；
合成方法三：
步骤21-1：将4-溴甲基-7-甲氧基香豆素溶于无水DCM，在N2保护，-78℃下滴加BBr3，于-78℃下继续搅拌0.5h，升至室温过夜，反应完全后，加入水淬灭反应，过滤，用DCM洗涤，得到浅黄色固体粗产品，直接用于下一步；
步骤21-2:将化合物21-A溶于2-甲氧基乙醇，加入吗啉，回流6h，反应完全后，浓缩，柱层析得化合物21-B；
步骤21-3:化合物21-B溶于DMF，加入碳酸钾和N-Boc-3-氨基丙基溴，在60℃下反应6h，反应完全后，浓缩，柱层析的化合物21-C；
步骤21-4:向21-C的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h，蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和DIPEA，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物21；
合成方法四：
步骤41-1：化合物41-A先在氢氧化钠溶液下生成41-A的碱，再在AlMe3条件下与哌嗪回流反应生成化合物41-B；
步骤41-2：化合物41-B溶于DMF后加入CDI,室温下反应生成化合物41；
合成方法五：
步骤54-1:将化合物1,1,3,3-四甲氧基丙烷溶于盐酸水溶液中，并在50℃下搅拌1h，然后将苯胺的盐酸水溶液滴加到上述反应液中，并在50℃继续搅拌2h，冷却后，过滤，干燥，得到化合物54-A；
步骤54-2:将在封管中加入2,3,3-三甲基-3H-吲哚和N-Boc-3-氨基丙基溴，再加入到甲苯中，120℃下反应2h，干燥并除去溶剂，加入无水THF和三乙胺，在0℃下滴加二碳酸二叔丁酯，升至室温反应过夜，浓缩得化合物54-B，直接投下一步；
步骤54-3:将化合物54-A和化合物1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚碘化物加入乙酸酐和乙酸混合液中，并将混合物搅拌并回流1h，将溶液冷却至室温，加入上述粗产物54-B和吡啶，反应在110℃回流1h，反应完成后，用饱和碳酸氢钠溶液淬灭至无气泡产生，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl洗涤，干燥，柱层析得到产物54-C；
步骤54-4:向54-C的二氯甲烷溶液中加入TFA，并在室温搅拌0.5h，蒸发后，将残余物溶于DMF中，并加入2,5-二氧杂吡咯烷-1-基4-(羟甲基)-3-硝基苯甲酸酯和三乙胺，将混合物在室温搅拌1h，反应完全后，柱层析得到化合物54；
合成方法六：
步骤61-1：化合物61-A先在氢氧化钠溶液下生成61-A的碱，再在AlMe3条件下与哌嗪回流反应生成化合物61-B；
步骤61-2：化合物61-B溶于DMF后加入CDI,室温下反应生成化合物61。
8.权利要求1至6中任一项所述的通式(I)所示的化合物，或其互变异构体、对映异构体、对映体、非对映体、消旋体、前体化合物、同位素化合物、各种形式的盐或水合物用于制备光诱导的共价标记探针的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述光诱导的共价标记探针用在靶向细胞器的成像研究、细胞生物学动态变化的成像研究、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一一种相互作用的成像研究中。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述光诱导的共价标记探针用在靶向细胞器、细胞生物学动态变化、细胞器之间以及蛋白质与细胞器之间的任一种相互作用的蛋白质的研究中，和/或用于后续蛋白质富集、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、蛋白质质谱分析中。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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