CN115594649A - 一种半胱氨酸残基特异性化学探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种半胱氨酸残基特异性化学探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种新颖的半胱氨酸残基特异性化学探针，涉及特异性化学探针领域，与现有的化学探针IA相比，具有类似的反应能力，更快的反应速度，由于结构与IA探针差别很大，因此在标记的蛋白质种类上有所差异。化学蛋白质组学实验证明了低浓度DNBS‑Cys探针能够定量1000个半胱氨酸位点以上，均具有重要的生物功能。该化学探针的发展将为基于化学蛋白质组学平台的共价药物筛选提供新的工具，靶向更多蛋白靶点。本发明中的探针并不采用荧光母核+猝灭基团的化合物结构，不仅具备与巯基的反应性，还能够在反应后进行半胱氨酸残基位点的2，4‑二硝基化修饰，有利于探针在蛋白质组学分析和含半胱氨酸残基的蛋白质标记中的应用。

Description

一种半胱氨酸残基特异性化学探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及特异性化学探针领域，尤其涉及一种半胱氨酸残基特异性化学探针及其制备方法和应用。
背景技术
化学蛋白质组学的主要任务就是开发具有生物活性的靶向探针，用于复杂蛋白质组中的特异性酶或蛋白质家族的功能研究。基于活性的蛋白质组学分析就是利用不同活性的化学探针研究蛋白质活性与功能的分析方法。针对特定的靶点设计合成相对应的分子探针则是实现该分析方法的核心环节之一。
蛋白质上的半胱氨酸残基具有与催化相关的功能，这是由于半胱氨酸上含有的巯基结构所带来的亲核能力和独特的反应能力。当靶点蛋白质的药物结合口袋被共价抑制剂占据后，半胱氨酸特异性化学探针则不能对该口袋中的活性半胱氨酸残基进行标记，从而信号丢失，后续利用生物大分子质谱能够对抑制剂所占据的残基位点进行读取，从而实现抑制剂与结合靶点之间信息的匹配。
然而，该过程中化学探针能否尽可能快且多的标记蛋白质组中半胱氨酸残基，是非常关键的问题。化学探针标记的靶点和半胱氨酸残基位点越多，则能够为越多的靶点开发相应的抑制剂，靶向更多“无药可及”的药物靶标。因此，科学家们一直致力于开发具有不同反应活性的半胱氨酸特异性反应化学探针，
现有技术中，基于碘乙酰胺的化学探针是一种常用的半胱氨酸反应化学探针，其能够标记蛋白质组中半胱氨酸残基，基于碘乙酰胺的化学探针在化学蛋白质组学领域得到了广泛应用，其不仅能够对蛋白质组中半胱氨酸残基活性进行检测，还能够对共价药物的靶点进行发掘。但是，基于碘乙酰胺的探针对蛋白质或多肽的N端具有反应活性，且与赖氨酸、组氨酸和甲硫氨酸等亲核残基会在碱性条件下发生反应。其次，由于碘原子较大会带来膜渗透问题，最终限制了基于碘乙酰胺的探针在活细胞层面的标记应用。
2,4-二硝基苯磺酰基的结构具有和巯基独特的反应活性，已有研究将其应用于活细胞或组织中含有巯基小分子(例如半胱氨酸，谷胱甘肽等)响应性荧光探针的开发中。然而该类结构尚未在蛋白质中半胱氨酸残基标记和鉴定中得到验证和应用，因此开发基于2,4-二硝基苯磺酰基结构的半胱氨酸残基特异性化学探针能够一定程度解决上述问题，同时给靶向半胱氨酸残基的共价药物开发提供新的工具。
如图1所示(Sci Rep.2016,6:19562；Anal Chem.2018,90(6):4119-4125)，现有的巯基特异性荧光探针以2,4-二硝基苯为离去基团，其机理是，该分子探针本身荧光强度很低，当该探针进入细胞后，2,4-二硝基苯磺酰基会与巯基发生亲核取代反应并以加成产物形式离去，而“脱保护”的分子探针产生荧光，且荧光信号与巯基浓度呈正相关关系，从而对细胞中含有巯基的分子，例如半胱氨酸，进行定量检测。该反应速度快，效率高，特异性强，因此该类探针得到了广泛应用。值得注意的是，理论上2,4-二硝基苯磺酰基也能够与蛋白质上的半胱氨酸残基发生反应，从而对该位点进行2,4-二硝基化修饰，且修饰结构稳定，利于质谱检测，因此该反应结构有潜力成为新的半胱氨酸特异性化学探针。
发明内容
本申请旨在基于以上的调研分析，申请人设计了化学探针DNBS-Cys，结构如图2所示，合成路线及结构表征数据如图3-7所示。该探针以2,4-二硝基苯为核心，磺酰基为反应离去基团，在苯环上引入了生物正交基团炔基，当DNBS-Cys与蛋白质上的半胱氨酸残基反应后，磺酰基离去，该氨基酸位点被修饰，后续通过“点击化学”反应(Angew Chem Int EdEngl.2001,40(11):2004-2021.)，将荧光素或者生物素报告基团连接到炔基上，能够实现蛋白质的荧光检测或富集分离。
本申请提供了一种半胱氨酸特异性化学探针，结构式如下：
Figure BDA0003904388030000021
一种用于制备上述半胱氨酸特异性化学探针的化合物，结构如式V所示：
Figure BDA0003904388030000022
其中，X为卤素。
一种上述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，包括利用式V化合物制备式I化合物：
Figure BDA0003904388030000031
优选地，所述化合物V中X为Cl、Br、I中的一种；所述碱为有机碱或无机碱，所述有机碱为三乙胺、二乙胺、哌啶、吡啶、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种；所述无机碱为金属氢氧化物；所述溶剂二为二氯甲烷、二氯乙烷、二氯丙烷、三氯乙烷、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
优选地，所述式V化合物：碱：炔丙胺的摩尔比为40～80：80～180：50～100；所述式V化合物合成式I化合物的反应条件为：式V化合物采用溶剂二溶解后，再向其中依次加入碱和炔丙胺后，室温反应。
半胱氨酸特异性化学探针的制备方法还包括：
Figure BDA0003904388030000032
优选地，所述有机碱一：式IV化合物：N-甲基哌嗪的摩尔比为9～1:1～3:30～60；所述有机碱一为三乙胺、二乙胺、哌啶、吡啶、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种；所述有机碱一与有机碱二相同或不同；
所述式IV化合物合成式V化合物的反应条件为：式IV化合物溶于溶剂二，在冰水浴下加入有机碱得混合溶液一，另取N-甲基哌嗪溶于溶剂二中，缓慢滴入至混合溶液一中，室温下反应。
一种上述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质半胱氨酸残基标记中的应用，具体方法为在细胞裂解液中加入工作浓度的式I化合物，室温避光反应后，按顺序加入Rhodamine-azide、TBTA、硫酸铜和TCEP，将混合溶液在室温震荡反应。
优选地，所述细胞裂解液的浓度为0.5～5mg/ml，所述式I化合物的工作浓度为5～15μM，室温避光反应0.5-60分钟，所述Rhodamine-azide的终浓度为100～300μM，所述TBTA的终浓度为50～150μM，所述硫酸铜的终浓度为0.5～2mM，所述TCEP的终浓度为0.2～2mM。
一种上述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定中的应用。
优选地，蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定具体方法为：采用式I化合物标记活性细胞裂解液，再将式I化合物分别偶联“轻”和“重”的可切割生物素标签，合并，富集，酶切和探针修饰肽段洗脱，将肽段样品进行高分辨质谱分析，对数据进行搜库，定量分析，获得鉴定到的蛋白质和位点信息结果。
优选地，所述式I化合物标记活性细胞裂解液的方法为：将活细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至1～10mg/ml待用；在一定体积的细胞裂解液中，加入工作浓度10～500μM式I化合物，室温避光反应6～120分钟。
优选地，式I化合物采用点击化学反应偶联可切割生物素标签，所述点击化学反应的具体步骤为：向式I化合物标记后的细胞裂解液中按顺序加入终浓度为50～150μM H-TEV-Tag或者L-TEV-Tag，终浓度为50～150μM TBTA，0.5～1.5mM硫酸铜和0.5～1.5mMTCEP，将混合溶液在室温震荡反应0.5～1.5小时。
本发明取得的有益效果：
本发明公开了一种新颖的半胱氨酸残基特异性化学探针DNBS-Cys，与之前的化学探针IA相比，具有类似的反应能力，更快的反应速度，由于结构与IA探针差别很大，因此在标记的蛋白质种类上有所差异。化学蛋白质组学实验证明了低浓度DNBS-Cys探针能够定量1000个半胱氨酸位点以上，均具有重要的生物功能。该化学探针的发展将为基于化学蛋白质组学平台的共价药物筛选提供新的工具，靶向更多蛋白靶点。
本发明中的化学探针相比现有的含2,4-二硝基苯基的巯基特异性荧光探针，并不是将2,4-二硝基苯基作为离去基团，即猝灭剂，探针分子中也不含有荧光母核，本发明转而将2,4-二硝基苯基作为标记基团，在与巯基反应后直接对半胱氨酸位点进行2,4-二硝基化修饰，完成标记，再利用2,4-二硝基苯基携带的炔基与荧光素或荧光标记进行点击化学反应，继而完成荧光检测和标记蛋白质或肽段的富集分离。本发明中的探针并不是采用荧光母核+猝灭基团的化合物结构，导致本发明与现有的巯基特异性荧光探针发光原理不同，不仅具备与巯基的反应性，还能够在反应后标记半胱氨酸位点，有利于探针在蛋白质组学分析和含半胱氨酸残基的蛋白质标记中的应用，继而能够更广泛地应用于共价药物的筛选。
附图说明
图1为现有技术中巯基特异性荧光探针检测机理。
图2为半胱氨酸特异性化学探针DNBS-Cys与蛋白质上半胱氨酸残基发生亲核取代反应，从而对该半胱氨酸残基进行化学标记的原理示意图。
图3为实施例1中DNBS-Cys的合成路线。
图4为实施例1中化合物V的1H NMR谱图。
图5为实施例1中化合物V的13C NMR谱图。
图6为DNBS-Cys-1的1H NMR谱图。
图7为DNBS-Cys-1的13C NMR谱图。
图8为IA探针结构。
图9小分子模型反应中，DNBS-Cys-1和IA探针对N-BOC-L-半胱氨酸甲酯的反应能力比较。
图10细胞裂解液模型中，DNBS-Cys-1和IA探针分别进行蛋白质标记，偶联荧光素，最后进行探针标记信号检测。左图Rhodamine-azide：荧光信号；右图Coomassie blue：蛋白质考马斯蓝信号。
图11不同反应时间，DNBS-Cys-1和IA探针的荧光标记信号定量结果(图10Rhodamine信号)。该强度分析利用ImageJ软件，分析数据来自于三次生物学重复。
图12基于质谱的化学蛋白质组学技术平台对DNBS-Cys-1的标记位点进行定量分析。
图13 1270个DBNS-Cys-1探针标记半胱氨酸残基比值分布。
图14 DBNS-Cys-1探针标记蛋白质分子功能分类。
图15 DBNS-Cys-1探针标记蛋白质药物可及性分析。
具体实施方式
以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1：半胱氨酸特异性化学探针DNBS-Cys-1的合成：
Figure BDA0003904388030000051
S1、在反应瓶中加入1,5-二氯-2,4-二硝基苯(4.7克，20毫摩尔)用100毫升乙醇溶解。另取亚硫酸钠(2.5克，20毫摩尔)溶于50毫升水中，将两种溶液加入反应瓶中，接上回流管，在70℃下反应2小时。反应结束后，将反应液在水中重结晶两次，得到黄色固体。用冷水洗涤产物除去无机盐，最后加甲苯旋蒸除水，得到化合物III(4.5毫克，15毫摩尔)。
S2、将化合物III(3克，10毫摩尔)溶于24毫升氯磺酸，在97℃下加热回流4小时。反应结束后待体系冷却至室温，缓慢将反应液滴入冰水中，用二氯甲烷萃取。接着用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤有机层，再用无水硫酸钠除水后旋干得到化合物IV(2.1克，6毫摩尔)。
S3、取化合物IV(1.2克，3.5毫摩尔)溶于20毫升二氯甲烷，在冰水浴下加入三乙胺(530毫克，5.3毫摩尔)得混合溶液一。另取N-甲基哌嗪(350毫克，3.5毫摩尔)溶于1毫升二氯甲烷中，缓慢滴入至混合溶液一中。室温下反应14小时后，通过柱层析提纯得到黄色固体产物化合物V。(洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝50:1)1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.19(d,J＝2.9Hz,2H),3.48-3.33(m,4H),2.57-2.42(m,4H),2.32(s,3H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ149.18,146.16,136.74,134.82,131.10,122.04,54.52,46.33,46.01。
S4、最后称取化合物V(230毫克，0.63毫摩尔)溶于5毫升二氯甲烷中。再向其中依次加入三乙胺(95毫克，0.95毫摩尔)和炔丙胺(38毫克，0.69毫摩尔)后室温反应20小时。反应结束后柱层析分离得到化合物I，即半胱氨酸小分子探针DNBS-Cys-1(25毫克，0.07毫摩尔)。(洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝50:1)1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.76(s,1H),7.67(s,1H),4.32-4.26(m,2H),3.52-3.45(m,4H),3.42-3.24(m,1H),2.51(t,J＝4.8Hz,4H),2.40(s,1H),2.34(s,3H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ145.26,140.05,136.28,131.78,125.58,118.10,76.99,74.17,54.71,46.19,46.00,33.29。
实施例2：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
Figure BDA0003904388030000061
反应原料采用化合物II。S1中醇溶剂为甲醇，以甲醇替换乙醇。
S3和S4中采用二氯乙烷替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为二乙胺，所述S4中三乙胺替换为二乙胺。
S3中二乙胺：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为9:3:30。反应时间为12小时。
S4中化合物V：二乙胺：炔丙胺的摩尔比为40：80：100。反应时间为18小时。
实施例3：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
Figure BDA0003904388030000071
反应原料采用化合物II。S1中醇溶剂为丙醇，以丙醇替换乙醇。
S3和S4中采用四氢呋喃替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为N,N-二异丙基乙胺，所述S4中三乙胺替换为哌啶。
S3中N,N-二异丙基乙胺：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为1:1:30。反应时间为16小时。
S4中化合物V：哌啶：炔丙胺的摩尔比为80：180：100。反应时间为22小时。
实施例4：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
S3和S4中采用二氯丙烷替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为吡啶，所述S4中三乙胺替换为N-甲基吗啉。
S3中吡啶：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为9:3:60。
S4中化合物V：N-甲基吗啉：炔丙胺的摩尔比为40：180：50。
实施例5：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
S3和S4中采用三氯乙烷替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为N,N-二异丙基乙胺，所述S4中三乙胺替换为二乙胺。
S3中N,N-二异丙基乙胺：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为7:2:45。
S4中化合物V：二乙胺：炔丙胺的摩尔比为60：100：80。
实施例6：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
S3和S4中采用二甲基亚砜替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为20％氢氧化钠水溶液，所述S4中三乙胺替换为二乙胺。
S3中NaOH：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为9～1:1～3:30～60。
S4中化合物V：二乙胺：炔丙胺的摩尔比为40～80：80～180：50～100。
实施例7：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
S3和S4中采用N，N-二甲基甲酰胺替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为20％氢氧化钠水溶液，所述S4中三乙胺替换为20％氢氧化钾水溶液。
S3中NaOH：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为9:1:60。反应时间为10小时。
S4中化合物V：KOH：炔丙胺的摩尔比为70：100：100。反应时间为14小时。
实施例8：其余均与实施例1相同，不同之处在于：
S3和S4中采用二甲基亚砜替换二氯甲烷作为溶剂。
所述S3中三乙胺替换为二乙胺，所述S4中三乙胺替换为20％氢氧化钠水溶液。
S3中二乙胺：化合物IV：N-甲基哌嗪的摩尔比为6:3:60。
S4中化合物V：NaOH：炔丙胺的摩尔比为40：180：100。
实施例9：DNBS-Cys-1和IA探针与N-BOC-L-半胱氨酸甲酯的反应：
500μL PBS-乙腈(1:1)溶液含有100μM N-BOC-L-半胱氨酸甲酯，分别加入工作浓度为1mM的DNBS-Cys-1和IA，将反应混合溶液置于震荡混匀器中，室温避光反应。在反应进行10,20,30,40,50和60分钟时，每次取出50μL反应混合物，加入终浓度为20mM的二硫苏糖醇将反应终止，37℃涡旋反应10分钟。之后，加入终浓度为50mM的碘乙酰胺将未反应的N-BOC-L-半胱氨酸甲酯进行封闭，37℃避光反应10分钟。反应结束后，所得样品进行液相色谱-质谱(Thermo Scientific LCQ Fleet)分析。每个条件进行三次重复。数据分析时，对目标分子碘乙酰胺封闭的N-BOC-L-半胱氨酸甲酯进行强度提取，对每个样品中该目标分子信号进行相对强度计算。
实施例10：DNBS-Cys-1和IA探针对细胞裂解液的标记：
HeLa细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至2mg/ml待用。在50μL细胞裂解液中，分别加入10μM DNBS-Cys或者IA探针，室温避光反应0.5-60分钟。标记结束后，进行点击化学反应(Angew Chem Int Ed Engl.2001,40(11):2004-2021.)，按顺序加入终浓度为200μM Rhodamine-azide；终浓度为100μM Tris(benzyltriazolylmethyl)amine(TBTA)，1mM硫酸铜和1mM tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)。将混合溶液在25℃震荡反应1小时。反应结束后，加入蛋白质上样缓冲液，高温加热5分钟后，冷却至室温。用10％浓度的蛋白凝胶分析，并对荧光信号进行检测(Bio-Rad Chemidoc MP)。最后用考马斯亮蓝染色液染色。
化合物I与IA反应活性比较：
基于碘乙酰胺活性反应基团的IA探针(如图8)已经在化学蛋白质组学领域得到了广泛应用，例如功能性半胱氨酸残基的发掘，共价药物靶点鉴定和共价先导化合物的筛选。为了评估化合物I的反应活性，申请人分别在小分子和细胞裂解液模型上对二者进行了比较。
首先，在小分子反应模型中，申请人以N-BOC-L-半胱氨酸甲酯为底物，在相同反应条件下，监测底物分别被DNBS-Cys-1和IA的消耗速度。利用质谱，分别对10,20,30,40,50,和60分钟时两个反应体系中N-BOC-L-半胱氨酸甲酯的剩余量进行检测，结果如图9所示，二者反应速度相似，且在60分钟反应时间内对底物的消耗量相同，该结果表明DNBS-Cys-1和小分子荧光探针相同，对小分子巯基具有高度反应活性，与IA探针活性相当。
为了将化合物I应用于蛋白质组中半胱氨酸残基的鉴定分析，申请人在活性细胞裂解液中对化合物I的标记能力进行了评估，并与IA探针进行了比较。首先将化学探针分别与HeLa细胞裂解液孵育，标记结束后，通过铜催化的炔基-叠氮生物正交偶联反应，将荧光素叠氮偶联到探针上，从而对探针标记的蛋白质进行荧光修饰。借助于凝胶电泳将蛋白质组分离，即可对荧光修饰的蛋白质进行检测分析，结果如图10所示。随着探针标记时间的增加，荧光标记信号逐渐提高，在40-60分钟左右接近饱和，其相应荧光强度定量数据见图11，该结果表明，与IA探针类似，化合物I也能够对活性蛋白质组进行标记，且达到相同标记强度所需的时间更短，即化合物I与蛋白质组中半胱氨酸残基反应速度更快，这也与文献报道相符。值得注意的是，化合物I与IA探针的荧光条带有所不同(箭头标注)，表明二者所标记的蛋白质种类有差异，而化合物I与IA探针的结构差异也较大，因此化合物I有可能能够标记更多新颖的半胱氨酸残基。
实施例11：其余均与实施例10相同，不同之处在于：
所述细胞裂解液的浓度为0.5mg/ml，所述式I化合物的工作浓度为5μM，室温避光反应0.5分钟，所述Rhodamine-azide的终浓度为100μM，所述TBTA的终浓度为50μM，所述硫酸铜的终浓度为0.5mM，所述TCEP的终浓度为0.2mM。
实施例12：其余均与实施例10相同，不同之处在于：
所述细胞裂解液的浓度为5mg/ml，所述式I化合物的工作浓度为15μM，室温避光反应60分钟，所述Rhodamine-azide的终浓度为300μM，所述TBTA的终浓度为150μM，所述硫酸铜的终浓度为2mM，所述TCEP的终浓度为2mM。
实施例13：DNBS-Cys-1标记位点的化学蛋白质组学分析：
MCF7细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至2mg/ml待用。在2000μL细胞裂解液中，加入工作浓度100μM DNBS-Cys-1，室温避光反应60分钟。标记结束后，将反应溶液平均分为两份，分别进行点击化学反应，按顺序加入终浓度为100μM H-TEV-Tag或者L-TEV-Tag(由吉尔生化(上海)有限公司合成)，终浓度为100μM TBTA，1mM硫酸铜和1mM TCEP，将混合溶液在25℃震荡反应1小时。点击化学反应结束后，甲醇-氯仿沉淀，将蛋白质复溶在0.2％ SDS/PBS溶液中，通过链霉亲和素琼脂糖凝胶对生物素修饰蛋白质进行富集，胰酶酶切。带有探针标记肽段的链霉亲和素琼脂糖凝胶经过PBS(3×0.6mL)和H2O(3×0.6mL)洗涤后，转移至新的管子中，并用150μL 1×TEV缓冲液(140μL H2O,7.5μL20×TEV缓冲液and 1.5μL 100μM DTT)清洗，之后加入5μL Ac-TEV protease(2.5mg/mL)，反应溶液置于29℃过夜反应，收集上清即为DNBS-Cys-1标记肽段样品。加入甲酸酸化并用C18柱除盐后旋干。
将样品重悬于10μL含有0.1％(v/v)甲酸的水中，然后进行LC-MS/MS分析，LC采用低pH流动相分离，使用仪器为Ultimate 3000液相串联Q-Exactive plus Orbitrap massspectrometer(Thermo Fisher Scientific)。首先将样品在吸附柱(100μm内径，360μm外径×3cm,5μm C18)上负载，然后再经过分析柱(75μm内径,360μm外径×15cm,3μm C18)分离，流动相A为含有0.1％formic acid的水溶液，B为含有0.1％formic acid乙腈溶液，以350nL/min流速梯度洗脱。质谱采集条件为：正离子模式，Orbitrap质量分析器，一级谱扫描范围350到1800Da，分辨率为70000，二级谱数据采集方式为数据依赖型，取强度最高的20个离子峰进行二级HCD(high-energy collision induced dissociation)碎裂，二级谱分辨率为17500。其它需设置参数有centroid format，isolation window,2.0m/z units；default charge,2+；normalized collision energy,28％；maximum IT,50ms；dynamicexclusion,20.0s。利用RAW Xtractor将所得到的RAW格式数据转化为MS2格式，并用ProLuCID算法进行搜库分析，数据库为Human UniProt database(release 2012_11)249。搜库参数设置为：半胱氨酸上固定修饰carboxyamidomethylation(+57.02146Da)，可变修饰“重”H-TEV-Tag(+552.2437Da)或者“轻”L-TEV-Tag(+546.2299Da)。ProLuCID数据结果通过DTASelect(version 2.0)过滤并控制假阳性率为1％。CIMAGE软件用于“轻”“重”修饰比值定量计算，具体参数设置与文献中保持一致。
利用R包clusterprofiler对DBNS-Cys-1探针标记蛋白质进行分子功能注释分类；根据Therapeutic Target Database将DBNS-Cys-1探针标记蛋白质分为TTD蛋白和非TTD蛋白。
化合物I标记位点的化学蛋白质组学分析：
为了鉴定DNBS-Cys-1探针所标记的蛋白质和半胱氨酸残基的种类，申请人进行了位点水平的化学蛋白质组学分析。如流程图12所示，在活性细胞裂解液中，用100μM DNBS-Cys-1标记，通过“点击化学”反应，分别偶联“轻”和“重”的可切割生物素标签，合并，富集，酶切和探针修饰肽段洗脱，将肽段样品进行高分辨质谱分析，对数据进行搜库，定量分析，所鉴定到的蛋白质和位点信息结果见图13。DNBS-Cys-1探针一共定量到了1270个半胱氨酸残基位点，比值均分布在0.5-2，来自于938个蛋白质，例如XPO1，ABL1等重要的药物靶点。对其分子功能进行注释分析，如图14所示，主要分布在biological regulation，cellularprocess，developmental process，metabolic process等通路中。值得一提的是，利用Therapeutic Target Database(TTD)对化合物I标记蛋白质的药物可及性进行分析，如图15，发现仅有16.1％的蛋白质有已经报道的药物分子或者配体，而绝大部分仍处于未开发状态，化合物I作为探针的开发将为这些蛋白质小分子配体的开发提供新的工具。
实施例14：其余均与实施例13相同，不同之处在于：
式I化合物标记活性细胞裂解液的方法为：将活细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至1mg/ml待用；在一定体积的细胞裂解液中，加入工作浓度10μM式I化合物，室温避光反应6分钟。
所述点击化学反应的具体步骤为：向式I化合物标记后的细胞裂解液中按顺序加入终浓度为50μM H-TEV-Tag或者L-TEV-Tag，终浓度为50μM TBTA，0.5mM硫酸铜和0.5mMTCEP，将混合溶液在室温震荡反应0.5小时。
实施例15：其余均与实施例13相同，不同之处在于：
式I化合物标记活性细胞裂解液的方法为：将活细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至10mg/ml待用；在一定体积的细胞裂解液中，加入工作浓度500μM式I化合物，室温避光反应120分钟。
所述点击化学反应的具体步骤为：向式I化合物标记后的细胞裂解液中按顺序加入终浓度为150μM H-TEV-Tag或者L-TEV-Tag，终浓度为150μM TBTA，1.5mM硫酸铜和1.5mMTCEP，将混合溶液在室温震荡反应1.5小时。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种半胱氨酸特异性化学探针，其特征在于，结构如式I所示：
Figure FDA0003904388020000011
2.一种用于制备权利要求1所述半胱氨酸特异性化学探针的化合物，其特征在于，结构如式V所示：
Figure FDA0003904388020000012
其中，X为卤素。
3.一种如权利要求1所述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，其特征在于，包括利用式V化合物制备式I化合物：
Figure FDA0003904388020000013
4.根据权利要求3所述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，其特征在于，所述化合物V中X为Cl、Br、I中的一种；所述碱为有机碱或无机碱，所述有机碱为三乙胺、二乙胺、哌啶、吡啶、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种；所述无机碱为金属氢氧化物；所述溶剂二为二氯甲烷、二氯乙烷、二氯丙烷、三氯乙烷、二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，其特征在于，所述式V化合物：碱：炔丙胺的摩尔比为40～80：80～180：50～100；所述式V化合物合成式I化合物的反应条件为：式V化合物采用溶剂二溶解后，再向其中依次加入碱和炔丙胺后，室温反应。
6.根据权利要求4所述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，其特征在于，包括
Figure FDA0003904388020000021
7.根据权利要求6所述半胱氨酸特异性化学探针的制备方法，其特征在于，所述有机碱一：式IV化合物：N-甲基哌嗪的摩尔比为9～1:1～3:30～60；所述有机碱一为三乙胺、二乙胺、哌啶、吡啶、N-甲基吗啉、N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种；所述有机碱一与有机碱二相同或不同；
所述式IV化合物合成式V化合物的反应条件为：式IV化合物溶于溶剂二，在冰水浴下加入有机碱得混合溶液一，另取N-甲基哌嗪溶于溶剂二中，缓慢滴入至混合溶液一中，室温下反应。
8.一种如权利要求1所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质半胱氨酸残基标记中的应用。
9.根据权利要求8所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质半胱氨酸残基标记中的应用，其特征在于，在细胞裂解液中加入工作浓度的式I化合物，室温避光反应后，按顺序加入Rhod amine-azide、TBTA、硫酸铜和TCEP，将混合溶液在室温震荡反应。
10.根据权利要求9所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质半胱氨酸残基标记中的应用，其特征在于，所述细胞裂解液的浓度为0.5～5mg/ml，所述式I化合物的工作浓度为5～15μM，室温避光反应0.5-60分钟，所述Rhodamine-azide的终浓度为100～300μM，所述TBTA的终浓度为50～150μM，所述硫酸铜的终浓度为0.5～2mM，所述TCEP的终浓度为0.2～2mM。
11.一种如权利要求1所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定中的应用。
12.根据权利要求11所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定中的应用，其特征在于，具体方法为：采用式I化合物标记活性细胞裂解液，再将式I化合物分别偶联“轻”和“重”的可切割生物素标签，合并，富集，酶切和探针修饰肽段洗脱，将肽段样品进行高分辨质谱分析，对数据进行搜库，定量分析，获得鉴定到的蛋白质和位点信息结果。
13.根据权利要求12所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定中的应用，其特征在于，所述式I化合物标记活性细胞裂解液的方法为：将活细胞在冷PBS溶液中超声破碎，高速离心后取上清，稀释至1～10mg/ml待用；在一定体积的细胞裂解液中，加入工作浓度10～500μM式I化合物，室温避光反应6～120分钟。
14.根据权利要求13所述半胱氨酸特异性化学探针在蛋白质组中活性半胱氨酸残基鉴定中的应用，其特征在于，式I化合物采用点击化学反应偶联可切割生物素标签，所述点击化学反应的具体步骤为：向式I化合物标记后的细胞裂解液中按顺序加入终浓度为50～150μM H-TEV-Tag或者L-TEV-Tag，终浓度为50～150μM TBTA，0.5～1.5mM硫酸铜和0.5～1.5mMTCEP，将混合溶液在室温震荡反应0.5～1.5小时。
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