CN117907414A - 季铵盐型化合物极其作为质谱检测敏化剂的用途、巯基检测试剂 - Google Patents

季铵盐型化合物极其作为质谱检测敏化剂的用途、巯基检测试剂 Download PDF

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CN117907414A CN202211238655.3A CN202211238655A CN117907414A CN 117907414 A CN117907414 A CN 117907414A CN 202211238655 A CN202211238655 A CN 202211238655A CN 117907414 A CN117907414 A CN 117907414A
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叶阳
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马正华
袁杰
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Abstract

本发明提供一种下式(I)表示的季铵盐型化合物，其可作为质谱检测用增敏试剂，其可以用于巯基检测的增敏，本发明的化合物能够提高MALDI‑MSI对生物样品中巯基小分子衍生物的检测能力。

Description

季铵盐型化合物极其作为质谱检测敏化剂的用途、巯基检测 试剂
技术领域
本发明属于质谱检测领域，其提供一种季铵盐型化合物极其作为质谱检测敏化剂的用途，本发明的化合物可以用于巯基的质谱检测中的增敏，本发明还提供巯基检测试剂。
背景技术
巯基是组织和细胞中最活跃的部分，人类和动物体内存在大量含巯基的小分子代谢物，包括半胱氨酸 (Cys)、N-乙酰半胱氨酸(NAc)、同型半胱氨酸(Hcy)、γ-谷氨酰半胱氨酸(Glu-Cys)、半胱氨酸甘氨酸(Cys-Gly)、谷胱甘肽(GSH)及其相应的氧化形式。硫醇代谢参与多种生理和病理过程，如胰岛素分泌、氧化应激、线粒体功能障碍、铁死亡。体内巯基代谢物的变化能影响氧化还原稳态，产生的活性氧导致不可逆的细胞损伤、机体的代谢紊乱及多种疾病的发生与发展。硫代谢是人生理病理过程中重要的代谢途径，巯基化合物的变化引起稳态失衡向二硫键形成的方向转移时，机体抗氧化能力的降低使其处于氧化应激状态，容易受到氧化损伤。因此，组织中硫醇的准确定位和相对丰度对于揭示其在疾病发生和发展中的特定功能至关重要。然而巯基代谢物因为其高还原性、挥发性、弱紫外吸收、低质谱响应、组织中基质复杂性等多种特点使其检测分析仍然是个挑战。
衍生化方法能够显著提高检测灵敏度、色谱保留及化合物稳定性，目前已经报道了多种与巯基反应的化学衍生化试剂用于巯基代谢物的定性或定量研究。
传统LC-MS分析方法中不可避免地需要对组织、血浆等样品进行匀浆处理，该步骤破坏了组织结构的完整性，导致内源性代谢物在组织中的空间分布信息缺失。鉴于巯基代谢物在疾病的生理与病理过程中的重要性，以及巯基代谢物在组织、细胞中的亚器官分布丰度与疾病存在量效关系，如何发展有效的分析方法实现代谢物含量的动态变化原位表征具有重要意义。目前涉及巯基代谢物原位成像分析的技术主要有两种(参照图1)：原位荧光成像与质谱成像，两者均具有特异性、操作简便、无组织破坏性等特点。
荧光成像是一种将待测分析物的化学信号转变为可监测的荧光信号，从而完成对分析物特异性监测的分析方法。荧光探针主要由发色团、连接基团、识别基团构成，荧光发色团是探针的重要组成部分，不仅影响本体的紫外吸收等光物理性质，而且决定探针的灵敏度；识别基团是荧光探针识别特定代谢物分析检测的关键，其种类决定了探针的选择性、抗干扰能力及检测限等；连接基团可以起到类似于桥梁的连接作用，用来传递化学信号改变荧光输出信号。针对巯基代谢物的荧光探针已经得到较好的发展，近年来主要通过利用不同的荧光发色团与特定的反应基团进行融合，从而设计出具有不同激发波长的荧光探针。Guo 等人利用香豆素并苯并噻唑衍生物制备了用于检测生物硫醇的荧光增强型小分子探针。探针利用不同的反应位点、发光机制，通过Michael加成选择性的检测Cys和GSH，并且完成对细胞中的Cys以及GSH含量的定量检测。Yin等人在此基础上修饰合成了用于检测Cys、GSH以及HCys三组分“关-开”型荧光探针。该探针具有四个反应位点，可以通过显著不同的荧光颜色改变那对三种生物硫醇的特异性检测。
尽管应用于巯基代谢物检测的方法开发研究已经比较充分，但目前的报道均局限于对常见生物硫醇的检测，对更多类型的巯基代谢物则因为荧光信号波长的相似性无法区分，且对未知巯基代谢物的鉴定存在问题。此外，由于细胞、组织之间的基质效应会引起荧光信号的干扰，从而在定性定量上受到极大影响。质谱成像检测技术已经发展成为一种新型的分子成像技术，并且已经应用了几种传统的基质来实现组织样品中GSH的可视化分析，但由于稳定性差和电离效率低，直接分析硫醇仍然具有挑战性。而反应型基质 CHC-MaI仍存在几个问题需要解决，包括多个竞争离子存在、可检测物种数量少以及定性准确性差等缺点，继续开发质谱成像检测技术中用于含有巯基的物质的增敏试剂，对于深入探索硫代谢在生理、病理过程中的机理，无疑有着重大意义。
发明内容
发明人为了开发高反应性、高灵敏度的用于质谱成像检测技术中用于含有巯基的物质的增敏试剂不断深入研究，结果成功开发了本发明的技术方案。具体而言，本发明提供下式(I)表示的季铵盐型化合物作为质谱检测用巯基增敏试剂的用途，
G-为碘离子或者三氟甲磺酸离子。
本发明还提供基于上述用途开发的巯基检测试剂，其含有同位素标记策略，具体含有
和
其中，D表示氘。
与现有技术相比，本发明能提供具有高反应性、高选择性、无竞争离子生成等特点，用于MALDI-MSI 中，对于巯基的检测进行增敏。
附图说明
图1是巯基代谢物原位成像效果图；
图2是稳定同位素标记分析策略应用于生物样本分析示意图；
图3是巯基代谢物衍生化试剂实验流程图；
图4表示能与巯基反应速率常数的图；
图5为基于巯基反应基团考察的衍生化试剂结构设计的示意图；
图6是显示反应基团考察的衍生化试剂的结果的图；
图7是基于发色团片段的结构设计的示意图；
图8是发色团考察中衍生化产物的质谱信号响应柱状图及UV-Vis谱图分析图；
图9是衍生化产物竞争性金属加和离子与对应质谱图；
图10是永久性带电荷引入的结构设计示意图；
图11是季铵盐型试剂对应产物消除竞争离子分析及MaI-MADA紫外可见光谱图；
图12是MaI-ADA与MaI-MADA在金属靶板上沉积效果分析；
图13是稳定同位素标记分析策略应用于生物样本分析的示意图；
图14为专属巯基代谢物数据库建立工作流程；
图15是专属巯基代谢物数据库建立工作流程示意图；
图16是基于SIL-LC-MS策略实现对组织巯基代谢物的识别与鉴定的代表性质谱图像。
具体实施方式
以下说明本发明其他各要素进行更加详细的说明，除非在下文中另有定义，本文中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。本发明中使用的术语，“巯基衍生化试剂”、“增敏剂”等，是指与待检测的含有巯基的化合物能够反应并且反应之后的衍生化产物能够在质谱成像检测技术中被更加清晰的观测的试剂，其普遍存在于巯基的化学反应位点和用于质谱成像的发色基团部分。本发明中，“衍生化”有时特指本发明的化合物与含巯基化合物中的巯基反应的过程。术语“MALDI”是指基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted LaserDesorption Ionization)，MALDI质谱分析是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相，是质谱成像技术的核心技术之一。
本发明化合物获得的方法
本发明通式(I)所示的化合物可以通过后述实施例中公知方法获得，或者通过公知的有机合成方法进行合成。本领域人员根据后述的实施例也可以通过公知的知识改变原料和合成方法，获得本发明的其他化合物。需要说明的是季胺盐化可以通过对应的叔胺化合物与过量甲基化试剂反应，例如与碘甲烷、对甲苯磺酸甲酯、三氟甲磺酸甲酯、硫酸二甲酯等试剂反应，获得相应的季铵盐化合物。上述反应优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、水、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、乙二醇二乙醚、四氯化碳及其混合物。
本发明化合物的用途
本发明提供的上述季铵盐型化合物，可以作为质谱检测用增敏试剂用于巯基检测的增敏的用途。所谓的增敏的含义是，基于MALDI MS技术本身已经可以检测含义巯基的物质，本发明的试剂使得该检测过程高反应性、高选择性、高灵敏度的实现，并且本发明的季铵盐型化合物中的优选例，还能实现无竞争离子生成、良好溶解度及较宽的线性范围等。
基于同位素标记的巯基检测试剂
本发明还提供一种巯基检测试剂，其含有权利要求1所述的式(I)表示的季铵盐型化合物中的一种，还含有所述式(I)表示的季铵盐型化合物中的一种的同位素标记物。
基于代谢物或其衍生化产物的精确分子量的识别与鉴定在LC-MS中会受到仪器精确度、多种加和离子等因素干扰，导致对代谢物快速识别受到很大影响。同位素标记衍生化试剂，将同位素标签引入到衍生化产物中。通过不同同位素质荷比差异和质谱信号，能够实现对某一类物质的快速识别，大大提高了此类化合物的分析能力。基于这样的研究背景，发明人合成了上述试剂对应的同位素标记版本，并将其组合应用于对生物样本中巯基代谢物的识别、鉴定与定量研究当中(参照图2)。
本发明的巯基检测试剂可以非常高兴的实现含巯基物质的检测，特别适合组织中巯基代谢物检测。
实施例
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度，除非另有指明，各种起始原料和试剂来自市售或者是根据已知的方法合成，市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用。
试剂与仪器
试剂：1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐购自上海皓鸿生物医药科技有限公司，9-吖啶羧酸、9- 羧酸蒽、丹磺酰氯、2-溴-6-羧酸苯并噻唑、甲基亚磺酸钠、7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羧酸、甲基三氟甲磺酸酯、HATU购自上海毕得医药科技股份有限公司，9-AA购自TCI，碘甲烷、D3-碘甲烷购自上海泰坦科技股份有限公司，合成纯化所用溶剂购自国药集团化学试剂有限公司，无水反应所用超干溶剂则从百灵威、安耐吉公司购买。硫醇标准品GSH、Cys、Cys-Gly、Glu-Cys、NAc和Hcy购自百灵威和 Sigma-Aldrich公司。HPLC级乙腈、甲醇、乙醇购自美国Fisher Chemical公司，去离子超纯水(<18.2MΩ·cm电阻率)在Milli-Q水系统上净化获得，2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，三氟乙酸钠、氧化铟锡(ITO)涂层载玻片(75mm*25mm，表面电阻率8-12Ω/m2)购自Bruker公司，苏木精和伊红购自于上海碧云天生物技术有限公司。
仪器：海道夫或IKA磁力搅拌器；
BUCHI旋转蒸发仪；
Waters 2695型HPLC/MS(配备2998PDA及ELSD两种检测器)；
Waters Auto P反相色谱分离系统，配备有Waters Sunfire RP C18色谱柱(5μm,30mm×150mm)
玻片扫描仪(PrimeHisto XE，Germany)；
配备MALDI离子源的Scima X磁共振质谱仪(MRMS)；
HTX-TM喷雾仪(HTX technologies，USA)；
Leica CM1950冷冻切片机；
多模微型酶标仪(Infinite M 200PRO,Tecan,Switzerland)；
UPLC-Q/TOF MS质谱(Synapt G2-Si Q/TOF MS,Waters,US)；
FT-MS control(Bruker Daltonics)数据采集软件；
Data Analysis(Bruker Daltonics)数据处理软件；
FlexImaging(Bruker Daltonics)成像分析软件；
SCiLS Lab software(Bruker,version 5.12.2)成像分析软件。
式(I)化合物合成方法举例
本发明的实施例中使用的具体化合物(MALDI衍生化试剂)的合成通过以下方法实现。合成的衍生化试剂的结构经1H和13C NMR以及HR-MALDI-MS确认。以下流程中也标注了相应化合物的简称，这些简称也用于下文中。
方法A：将1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(93mg,0.50mmol)、相应的羧酸(0.60mmol, 1.2eq)和缩合剂HATU(0.75mmol,1.5eq)置于15mL耐压管中，加入5mL超干DMF以及搅拌子后，于室温空气气氛下搅拌5分钟，随后加入DIPEA(3.00mmol,6.0eq)。反应混合物搅拌过夜，TLC检测原料无剩余，反应完全。反应混合溶液加水稀释，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩有机相，并拌入适量的200-300目硅胶，真空下除去溶剂，通过不同的色谱洗脱体系直接柱层析得到目标化合物。
方法B：酰胺中间体的合成方法与方法A相同，将中间体2-溴-苯并噻吩酰胺吖啶(91mg,0.20mmol) 置于15mL耐压管中，加入甲基亚磺酸钠(0.60mmol,3.0eq)、搅拌子以及5mL超干DMF，旋紧塞子回流搅拌反应4小时，TLC检测原料完全转化，反应结束。真空浓缩除去大部分DMF后直接在Waters Auto P反相纯化得到产物，洗脱体系为30分钟内含0.1％ FA的25-45％的乙腈水溶液梯度洗脱，合并含有目标化合物的组分，旋干溶剂得到淡黄色固体。
方法C(候选衍生化试剂的季铵化)：将中性衍生化试剂MaI-ADA或MaI-DNSA置于15mL耐压管中，分别加入过量的甲基化试剂(1mL碘甲烷或三氟甲磺酸甲酯)，加入2mL超干乙腈和二氯甲烷后，旋紧塞子在回流或0℃下将混合溶液搅拌过夜，浓缩得到固体残渣，用大量乙醚洗涤固体除去未反应的原料，得到试剂对应的季铵盐，直接应用无需进一步纯化。
候选MALDI衍生化试剂的所有紫外-可见吸收光谱均在酶标仪上以全扫描模式采集，将四种MALDI 衍生化试剂的2×10-4M溶液溶解在相应的溶剂中，扫描波长为230至580nm。
小鼠肝癌模型的建立
肝脏肿瘤组织取自BALB/c(nu/nu)裸鼠移植瘤，肿瘤模型建立的详细过程如下：首先，在6周龄的雄性裸鼠的腋窝中后部皮下注射100μL 1×106细胞数的MHCC97-H细胞，4周后取出皮下肿瘤组织，然后剪碎约为2mm3大小颗粒，原位移植至另一只6周龄裸鼠肝右叶包膜下。4周后，明显触及肝原位肿瘤时，则取出含肿瘤的肝脏组织，并用CMCNa包埋固定储存与-80℃冰箱待用。
同位素标记策略结合LC/MS方法建立数据库
用去离子水分别配制6种市售硫醇标准品Cys、Hcy、NAc、Cys-Gly、Glu-Cys、GSH的储备液，浓度均为100μM，分别取100μL储备液，再加入400μL 50％ ACN后最终形成10μM浓度的硫醇标准品混合溶液。向装有191mg肝肿瘤组织的匀浆管中加入50％ ACN(1:5,w/v)，加入三粒磁珠涡旋匀浆提取肝组织中的巯基代谢物，然后在4℃和11000g下离心5分钟，随后取出75μL匀浆上清液与75μL硫醇标准溶液(10μM)混合形成巯基代谢物种类相对完整的混合溶液。将50μL硫醇混合溶液分别与100μL 2.5mM 衍生化试剂D3-MaI-MADA和D0/D3-MaI-MADA(1:1)混合物衍生化反应30分钟，取65μL加入至384 孔板，使用超高效液相色谱-四极飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF MS，H-class UPLC和Synapt G2 Si Q/TOF MS， Waters，US)分析反应溶液。对比两种总离子流色谱图，准确识别组织中可能存在的巯基代谢物。将获取的MS数据转换为可读的mzML文件中，然后识别出成对离子峰，此类成对质谱信号具有以下特点：3Da 的质量差异及其强度比为0.75-1.33。然后将其中较轻的衍生化产物的分子量转化为衍生前的准确硫醇质量 (MS1-360.13427)。最后，基于HMDB和METLIN数据库搜索已识别分子的准确质量，以形成包含硫醇的专属数据库。
质谱成像样品准备与数据采集
在组织切片样品衍生化之前，将其置于在真空中干燥30分钟。由D0/D3-MaI MADA混合溶液(50％ ACN 中的5mM)组成的衍生化溶液通过HTX TM喷雾器以约0.2μg/cm2的密度直接喷洒在干燥切片上。 MaI-MADA喷雾的流速设置为25μL/min，喷嘴N2气体温度和压力设置为50℃和10psi。喷嘴高度、轨道速度、轨道间距和干燥时间分别设置为40mm、900mm/min、1.5mm和10s。喷雾沉积结束后，将组织切片置于被MeOH:ACN:H2O(1:1:2，v/v/v)混合溶剂饱和的封闭盒子中，37℃孵育10分钟。随后，将基质 DHB(15mg/mL,90％ ACN中含有0.3％TFA)重复沉积15层，速度为900mm/min，流速为75μL/min，线距离为2mm，使得DHB在组织中含量为2.31μg/mm2。喷嘴N2温度设定为60℃，其他参数与衍生化试剂喷雾沉积参数一致。处理后的小鼠肝肿瘤组织切片随后进行MALDI MS数据采集，实验流程如图3。
所有MALDI MS实验均在7.0TFT-ICR MRMS上进行，该仪器使用SmartBeamII紫外激光器在正模式下进行MALDI电离。将MALDI激光器设置为1000Hz的频率，23％的激光功率，80次累积激光发射，数据采集的空间分辨率为100μm，数据大小为2M。在m/z 50-1200Da的质量范围内采集，并将离子累积时间设置为0.03s。首先使用三氟乙酸钠作为内标离线校准质谱，并在测量期间使用 [MaI-MADA]+(m/z 360.13427)的准确质量在线校准质谱。使用Ftmscontrol 2.2.0设置离子源和质谱仪的这些参数，并将组织切片的光学图像上传到FlexImaging 5.0以划分扫描范围。然后使用SCiLS Lab 2021a 对图像进行总离子计数归一化分析。
应用SCiLS Lab软件进行数据处理，对于高分辨质谱采集的MS1数据，发明人将其导入后采用Total ion count进行归一化处理。在此基础上，将处理后的数据转化成METASPACE平台可识别的文件，设置数据采集的离子模式及可能存在的加和离子形式，通过软件实现自动化标注分析。
实验例1反应基团选择
为实现质谱成像实验中巯基代谢物靶向分析，应用于组织样本的MALDI衍生化试剂必须具有足够的反应性和良好的选择性。除此以外，巯基代谢物较差的稳定性要求衍生化试剂与分析物之间具有很高的反应速率。目前很多肿瘤小分子药物的作用机制是靶向靶标蛋白口袋中关键位置的氨基酸Cys残基，形成稳定的共价键而发挥抗肿瘤的药效。发明人在已知与巯基反应的反应基团中进行选择，具体试验如下(如图 4)：
发明人拟选择在经典共价抑制剂的设计中所报道的反应基团，将其作为检测巯基代谢物的MALDI衍生化试剂的片段，设计并合成了两种衍生化试剂(图5)，合成过程如上所述，结构及波谱数据如下：
试剂MSBT-ADA.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.45(s,1H),9.19(s,1H),8.50(d,2H),8.22(d,4H), 7.89(d,2H),7.67(d,2H),3.66(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ165.30,164.61,156.91,155.73,142.30, 129.72,127.81,126.33,126.05,123.91,121.73,121.07,114.81,47.45.HR-MALDI-MS:C22H16N3O3S2 +(Da, calc./found)434.0628/434.0648.
试剂MaI-ADA.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.17(s,1H),8.18(d,J＝8.7Hz,2H),7.98(d,J＝8.6Hz, 2H),7.88(ddd,J＝8.5,6.6,1.2Hz,2H),7.66(ddd,J＝7.8,6.6,1.0Hz,2H),7.08(s,2H),3.74(s,4H).13C NMR (126MHz,DMSO)δ171.10,166.30,148.12,141.92,134.66,130.60,129.16,126.59,125.81,121.63,37.47, 37.31.HR-MALDI-MS:C20H16N3O3 +(Da,calc./found)346.1186/346.1194.
为考察所设计的MALDI衍生化试剂在巯基代谢物中的分析效果，发明人利用过量的GSH与所合成的试剂在溶液中进行反应，反应体系中无其他酸碱催化剂辅助。反应产率时间曲线表明：以马来酰亚胺为反应基团的衍生化试剂在30min内即能实现与巯基代谢物的完全转化，相比2-甲磺酰苯并噻唑作为反应基团的衍生化试剂，两者之间的转化率差异可达11倍。即使将反应时间延长到8h，该试剂的转化率也仅能达到40％左右(见图6)。如若反应未能完全转化，加上组织中复杂的基质环境，可能会引起组织不同区域的反应差异。除此以外，在MALDI MSI的组织衍生化过程中，较长的反应时间会引起组织中内源性代谢物的移位，造成后期成像数据空间位置准确度的大大降低。从衍生化试剂与GSH反应8h的质谱图中可以发现，试剂MSBT-ADA反应液中仍存在大量的原料(见图6)。事实上，文献报道的反应基团2-甲磺酰苯并噻唑能够在四氢呋喃-磷酸缓冲盐(pH＝7.4)的体系中表现很高的反应性和特异性，而本研究中所采用乙腈-水体系使环境呈现相对酸性，进一步限制了巯基代谢物对MSBT弹头的芳香亲核取代反应发生。从反应试剂的MS1质谱图中发现，还存在断裂酰胺键形成的9-氨基吖啶的[M+H]+碎片峰，提示发明人后期结构优化过程中应注意酰胺的方向。
以MSBT为反应基团的衍生化试剂在生物兼容性的溶剂中具有较差的溶解度，而改用良好溶解性的 DMSO、DMF时，对于现行基质及衍生化试剂沉积反应方式，高沸点难以挥发的特点不便于组织样本的衍生化处理。此外，试剂MSBT-ADA在乙腈-水体系中较差的溶解度会形成非均相体系，从而引起反应效率的降低。反应快速的弹头MaI还能有效避免巯基代谢物在组织衍生化过程中长时间引起的氧化反应发生。
综上所述，反应基团MaI在巯基代谢物的衍生化试剂设计中具有非常高的可信度及选择性，因此MaI 被确定为试剂下一步的开发中的反应基团。
实验例2发色团的改善
在确定马来酰亚胺作为反应基团后，发明人进一步评价在MALDI衍生化试剂中起能量传递桥梁作用的发色团片段的影响。综合前期文献报道，具有较强紫外吸收能力的发色团对激光能量的吸收及传递能够促进分析物的离子化进程。因此发明人选择在质谱成像基质及荧光成像探针中常用的发色团作为衍生化试剂中的片段，例如吖啶、香豆素及丹磺酰基等。在此基础上另外设计合成了三种试剂(见图7)，结构及波谱数据如下：
试剂MaI-DEACA.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.70(t,J＝6.0Hz,1H),8.60(s,1H),7.67(d,J＝9.0 Hz,1H),6.99(s,2H),6.79(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),6.59(d,J＝2.2Hz,1H),3.58(t,J＝5.6Hz,2H),3.47(q,J＝ 6.7,6.3Hz,6H),1.13(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.96,162.65,161.32,157.20,152.43, 147.67,134.49,131.55,110.10,109.22,107.54,95.83,44.31,37.51,37.14,12.28.HR-MALDI-MS: C20H22N3O5 +(Da,calc./found)384.1554/384.1536.
试剂MaI-APA.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.68(dd,J＝1.6Hz,1H),8.54(dd,J＝8.6, 1.2Hz,2H),8.12(dd,J＝8.7,1.5Hz,2H),7.64(ddd,J＝8.5,6.6,1.2Hz,2H),7.55(ddd,J＝7.8,6.6,1.0Hz, 2H),7.24(s,2H),3.66(s,4H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.50,167.51,137.18,131.66,131.23,129.96, 129.41,128.64,127.32,125.96,124.63,39.37,38.91.HR-MALDI-MS:C21H17N2O3 +(Da,calc./found) 345.1234/345.1217.
试剂MaI-DNSA.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(d,J＝8.5Hz,1H),8.20-8.12(m,2H),8.02(dd, J＝7.3,1.0Hz,1H),7.58(ddd,J＝16.5,8.5,7.6Hz,2H),7.24(d,J＝7.5Hz,1H),6.81(s,2H),3.40(t,J＝6.1 Hz,2H),2.97(q,J＝6.2Hz,2H),2.82(s,6H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.69,151.32,135.76,134.09, 129.45,129.11,128.88,128.16,127.85,123.54,119.04,115.14,45.06,37.37.HR-MALDI-MS:C18H20N3O4S+ (Da,calc./found)374.1169/374.1158.
并在同样条件下考察其对衍生化效率及巯基小分子衍生化后产物的质谱行为影响，发现并解释发色团与质谱行为之间的相关性。从GSH与衍生化试剂反应后的衍生化产物的质谱信号发现(如图8中的A)：含氮原子杂环类衍生化试剂MaI-ADA、MaI-DNSA和MaI-DEACA能使其衍生化产物的质谱信号强度远高于发色团上没有杂原子的衍生化试剂MaI-APA。此外，试剂MaI-ADA对应产物的信号强度要显著高于其余两种杂环型试剂的产物。在常规基质的开发过程中，试剂本身的紫外可见光吸收波长与MALDI离子化源中激光器波长的匹配程度决定其是否具有作为基质的潜力。因此发明人尝试从衍生化试剂的紫外-可见光吸收光谱来解释衍生化产物的质谱信号强度与发色团之间的关联。如图8中的B所示，试剂MaI-ADA在同一浓度下具有最高的吸光度，且其紫外波长与本研究中所用激光器波长355nm最为契合，而试剂 MaI-DNSA在337nm(氮气激光器)处具有最大吸收。当试剂的紫外吸收波长增大到420nm时，对应的衍生化产物的信号有所降低。这一发现从侧面证明了试剂的紫外吸收与衍生化产物的质谱信号强度存在较大相关性。
另外从图中发现试剂MaI-APA在300nm以上的紫外信号与对应衍生化产物都很弱，在溶液配制过程中发现该化合物在乙腈/甲醇(v/v,1:1)的混合溶剂中溶解度很差，这提示发明人反应过程中形成的非均相体系会大大影响衍生化产物的形成。因此在后续设计过程中，试剂在生物兼容性溶剂中良好的溶解度是成为具有潜在应用价值的衍生化试剂特征之一。
除此以外，如图9所示，在质谱数据的采集过程中观察到有多种其他类型的竞争加和离子，如[M+H]+、 [M+Na]+、[M+K]+峰。由于MALDI MS数据中缺少常规LC-MS分析中保留时间这一维度，同一化合物不可避免地会受到其他小分子代谢物不同加和离子之间的相互干扰，影响单一分析的准确度，增加代谢物鉴定的难度，并且发明人发现金属加和离子的信号强度比例与发色团之间存在相关性。综上所述，发明人需要在已确定的发色团和弹头基础上进一步对试剂进行优化，尽可能降低此类离子的干扰。
实验例3永久性带电荷取代基的优势
季铵化是液相色谱中常用的解决竞争离子化的策略之一，该方法通过在衍生化试剂上引入永久性带电荷，使内源性小分子在衍生化后直接带电，从而在质谱中无需离子化直接进行分析，有效避免金属加和离子的干扰，实现组织中丰度较低的小分子代谢物的痕量检测。通过MeI或MeOTf进行季铵化处理(图10)，合成得到了两种季铵盐型试剂MaI-MADA和MaI-MDNSA，结构与波谱数据如下：
试剂MaI-MDNSA.1H NMR(400MHz,CD3CN)δ8.86(d,J＝8.7Hz,1H),8.67(d,J＝9.0Hz,1H),8.32 (d,J＝7.3Hz,1H),8.15(d,J＝8.1Hz,1H),7.90-7.84(m,1H),7.79(t,J＝8.4Hz,1H),6.49(s,2H),6.30(t,J＝ 6.6Hz,1H),3.89(s,9H),3.43(t,J＝5.8Hz,2H),3.17(q,J＝6.5Hz,2H).13C NMR(126MHz,CD3CN)δ 171.62,142.94,139.05,134.85,131.57,130.41,129.79,129.04,127.68,127.63,126.36,121.86,59.25,41.75, 38.34.HR-MALDI-MS:C19H22N3O4S+(Da,calc./found)388.1326/388.1319.
试剂MaI-MADA.1H NMR(400MHz,CD3CN)δ8.57(d,J＝8.9Hz,2H),8.39(d,J＝7.2Hz,4H), 8.01-7.96(m,2H),6.81(s,2H),4.77(s,3H),3.86(s,4H),3.07(s,1H).13C NMR(126MHz,CD3CN)δ172.20, 165.20,154.99,143.05,140.16,135.50,129.86,129.51,124.01,119.68,54.16,39.94,38.33.HR-MALDI-MS: C21H18N3O3 +(Da,calc./found)360.1343/360.1343.
在获得对应季铵盐型衍生化试剂后，发明人进一步考察其对改善金属离子加和物的同时出现的影响。实验结果表明：两种衍生化试剂均能极大程度降低竞争电离的影响，集中性地形成GSH对应衍生化产物的分子离子峰，且在MALDI MS的检测限度内未能发现Na、K离子的加和物信号(图11)。与其未季铵化的中性试剂相比，永久性带电荷的引入使产物的质谱信号有很大提升，试剂MaI-MADA要比 MaI-MDNSA使其具有更高的质谱响应。随后发明人测试了MaI-MADA的紫外可见光吸收光谱，并发现在355nm附近的最大紫外吸收无明显变化，而在420nm处出现一定强度的吸收信号，这些特征证明了其在MALDI应用中与激光器参数相匹配的紫外吸收，同时表现了一定的荧光性能，表明其可被用于巯基荧光探针的开发与利用(图11)。
在365nm紫外下观察到四种试剂之间的荧光性能有所差异，对于丹磺酰胺类试剂MaI-DNSA的季铵化，发明人并未发现有荧光信号的出现；而试剂吖啶酰胺MaI-ADA的季铵化则有明显的荧光产生，分析其结构上的差异发明人初步认为通过乙基相连的马来酰亚胺是一种缺电子的片段，与富电子的吖啶环正好形成基态稳定的HOMO-LUMO轨道体系，而季铵化的结构破坏了吖啶环上的电荷分布引起质子诱导的电荷转移，因此结构表现出较强的荧光特性(图11)。发明人进一步研究了两者在金属靶板上的沉积效果，如图12所示，发明人发现两者之间存在较大差异，MaI-MADA的沉积均匀性明显要高于MaI-ADA，形成的微小晶粒有助于衍生化试剂与组织中分析物之间相互作用的形成。
此外在MALDI数据中线性范围的考察对后期组织成像分析应用的定量分析具有较大的影响，因此利用衍生化试剂与不同浓度的GSH标准溶液反应考察其在MALDI MS中的检测限度，发明人发现：GSH在 1.0-10,000.0μM的浓度范围内，其衍生化产物的MALDI质谱信号与浓度具有很好的相关性(图12的C 和D)。因此发明人确定季铵盐型MaI-MADA是一种具有高反应性、高选择性、高灵敏度、无竞争离子生成、良好溶解度及较宽的线性范围等特点的巯基衍生化试剂。
实验例4同位素标记策略应用于组织中巯基代谢物库的建立
基于代谢物或其衍生化产物的精确分子量的识别与鉴定在LC-MS中会受到仪器精确度、多种加和离子及多种同位素峰重叠等因素干扰，导致对代谢物鉴定的准确度受到很大影响。良好的内标应当具有与待测分析物相似的理化性质及质谱行为，其中内标的最佳选择是稳定的同位素标记类似物。将同位素标记的内标(SIL-IS)用于每种分析物非常困难，相对地在对内源性代谢物分析过程中通过在衍生化试剂上引入稳定的同位素标记标签较为容易，从而实现对某一类代谢物的定性与定量分析。通过这种方法可以快速高通量地识别某一类化合物，大大提高了此类化合物的分析能力。基于这样的研究背景，发明人合成了上述试剂对应的同位素标记版本，并将其组合应用于对生物样本中巯基代谢物的识别、鉴定与定量研究当中(图 13)，结构和质谱数据如下所示。
同位素标记试剂D3-MaI-MADA.合成步骤与MaI-MADA的路线相同，结构信息通过MALDI-MS检测的分子量信息确定。HR-MALDI-MS:C21H15D3N3O3 +(Da,calc./found)363.1531/363.1533.
发明人通过将待测组织匀浆处理并与商品化的巯基代谢物标准溶液进行混合，构建相对完整的巯基代谢物小分子混合溶液，然后将其与上述合成的成对衍生化试剂D0/D3-MaI-MADA进行反应形成具有稳定同位素标记的硫醇衍生化产物。通过检测限度更灵敏的LC-MS进行色谱分离分析，由于非同位素标记和同位素标记的同一代谢物具有相似的色谱、质谱行为，发明人通过一系列算法从采集的数据中挖掘出符合以下要求的质谱配对峰：(1)衍生化代谢产物的分子量MW＞360；(2)具有一定的质量差，当前研究中仅考虑包含一个巯基的化合物，则其质量差为3Da；(3)具有相近的峰强度，峰强度比的容差范围在0.75-1.33。从中获得的质谱配对峰导入数据分析软件，对其进行代谢物鉴定。专属数据库的建立需要经过MS1转化和数据库搜索两个步骤，首先需要将MS1数据转化为衍生化之前的精确分子量，然后与常用小分子数据库 HMDB、METLIN和METASPACE平台比对搜索，从而确定巯基代谢物的结构信息，研究思路如图14所示。
在前期分析NEM衍生化巯基代谢物方法的基础上，发明人建立了UPLC-HRMS方法。色谱洗脱梯度如表1所示，质谱分析是在正离子模式下进行，从而相对有效地降低极性差异较小的代谢物之间的相互干扰。
表1UPLC-HRMS分析巯基标准品与肝癌组织匀浆衍生化产物的色谱条件
色谱柱信息:ACQUITYHSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm),柱温:45℃
UPLC-HRMS结果如图15所示，由于巯基代谢物本身的极性较大，带正电荷试剂MaI-MADA衍生化后极性更大，并且发现衍生化产物与组织中基质内的代谢物之间色谱保留时间相差很大，从而更好地将巯基代谢物的鉴定截取范围集中到0-15min内。
通过对商品化巯基化合物标准品的衍生化产物精确分子量信息搜索，发明人发现该方法具有较高的可信度，除此之外还有一些尚需鉴定但符合特征的质谱成对峰，代表性质谱如图16所示。不难发现在衍生物分子离子峰附近存在其他质谱信号，表明在同一保留时间内可能存在其他不同种类的巯基代谢物，由此说明对于组织中内源性代谢物的复杂性，发明人需要进一步优化色谱及质谱条件，实现对多种巯基代谢物的有效分离与分析。
表2肝癌组织匀浆样品中巯基代谢物内部数据库
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基于以上的分析策略，发明人共计从小鼠肝癌组织中分析并鉴定出26种巯基代谢物，如表2所示。根据确定组织中所包含的巯基代谢物而建立相对完整的巯基小分子代谢数据库，并在此基础与MALDI MSI实验中所采集的数据比对，从而鉴定组织中所存在的巯基小分子，说明本发明的化合物有着很好的巯基检测增敏作用，是良好的衍生化试剂。
但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (2)

1.下式(I)表示的季铵盐型化合物作为质谱检测用巯基增敏试剂的用途，
G-为碘离子或者三氟甲磺酸离子。
2.一种巯基检测试剂，其含有
其中，D表示氘。
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