CN112683886A - 利用化学发光检测羟基自由基的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用化学发光检测羟基自由基的方法。该方法包括以下步骤：在羟基自由基产生反应体系中加入过量的探针分子香豆素，以使产生的羟基自由基与香豆素反应生成羟基化香豆素；将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池以实时检测产生的化学发光；根据化学发光值确定所述羟基自由基产生反应体系中产生的羟基自由基的含量。本发明的方法不仅灵敏度高，而且能够实现传统方法难以实现的化学反应过程中羟基自由基的实时在线监测。

Description

利用化学发光检测羟基自由基的方法

技术领域

本发明涉及自由基检测方法，尤其涉及一种利用化学发光检测羟基自由基的方法。

背景技术

羟基自由基(以下简称为·OH)是一种最活泼的活性氧自由基，由于其具有很强的氧化性能够非选择性的高效氧化众多有机化合物，目前已被广泛用于污染物的高级氧化处理当中。很多反应都能产生·OH，其中最为经典的就是亚铁与双氧水(H₂O₂)在酸性条件下反应生成·OH的过程(Fenton反应)，其他过渡金属也能与H₂O₂反应发生类似的Fenton反应。TiO₂、ZnO等光敏材料在光照下也能够产生·OH，进而可用于污染物的催化降解。一些自然过程也能产生·OH，比如氧化还原界面亚铁矿物的氧化过程已被报道能够产生·OH，这是污染物在自然介质中降解转化的一个重要驱动力。·OH具有很高的化学活性，寿命短，很难直接测定，目前关于·OH的分析方法都是采用间接的方法，核心思想就是通过向体系中添加探针化合物或者捕获剂，通过定量·OH与探针化合物或者捕获剂反应形成的特征转化产物或者加和物来间接测定·OH的含量。由于选择的探针不同，检测方法也有很多种，常见的有电子自旋共振法、高效液相色谱法、荧光或紫外分光光度法等。这些方法均是离线分析方法，通常需要让探针化合物或者捕获剂与样品反应一段时间，然后和基质分离进行测定。由于·OH的产生和反应过程往往是十分快速的过程，如何原位监测·OH的产生和反应过程是目前分析方法的一大挑战，如果能够实现·OH的原位在线监测将有助于我们深入认识·OH的产生及其与污染物反应的过程和机制。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用化学发光检测羟基自由基的方法，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少一种。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种利用化学发光检测羟基自由基的方法，包括以下步骤：在羟基自由基产生反应体系中加入过量的探针分子香豆素，以使产生的羟基自由基与香豆素反应生成羟基化香豆素；将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池以实时检测产生的化学发光；根据化学发光值确定所述羟基自由基产生反应体系中产生的羟基自由基的含量。

基于上述技术内容，本发明的利用化学发光检测羟基自由基的方法至少具有以下有益效果其中之一或其中一部分：

本发明以香豆素为探针，通过香豆素与羟基自由基形成的羟基化香豆素在特定种类和浓度的过硫酸盐氧化体系中的化学发光效应，从而利用化学发光法完成对羟基自由基的实时检测。

将香豆素应用于本发明的检测方法中，相较于其他探针分子，羟基化香豆素的前述发光效应强烈且实时发生，速率甚至可以达到毫秒级别，而香豆素本身的发光效应并不明显，由此确保本发明的快速检测而适用于·OH的在线监测，且检测限较低，表现出很高的灵敏度和时间分辨率。

附图说明

图1是本发明实施例1实时动态在线化学发光测定·OH的装置示意图；

图2是本发明实施例1-1利用构建的动态在线检测法测定不同PMS和H₂O₂浓度对化学发光信号的影响结果，其中：

A是不同PMS浓度下相同Fenton反应体系的化学发光信号；

B是不同H₂O₂浓度下相同Fenton反应体系的化学发光信号；

图3是本发明实施例1-2利用构建的动态在线检测法测定不同Fe²⁺剂量下Fenton反应体系的结果，其中：

A是不同Fe²⁺剂量下Fenton反应体系的化学发光信号；

B是Fe²⁺浓度与化学发光信号之间的线性相关性；

图4是本发明实施例1-2利用化学发光法测定的化学发光值与[·OH]之间的相关曲线；

图5是本发明实施例1-3利用构建的动态在线检测法对Fenton反应产生·OH的原位在线测定结果，其中：

A是在线化学发光信号随时间的变化曲线；

B是化学发光信号转化的·OH浓度信号随时间的变化曲线；

图6是本实施例1-4利用构建的动态在线检测法对TiO₂光催化过程产生·OH的原位在线测定结果，其中：

A是在线化学发光信号随时间的变化曲线；

B是化学发光信号转化的·OH浓度信号随时间的变化曲线。

图7是本发明实施例1-5利用构建的动态在线检测法对土壤溶液中Fenton反应产生·OH的原位在线测定结果，其中：

A是黑土的在线化学发光信号随时间的变化曲线；

B是黑土的化学发光信号转化的·OH浓度信号随时间的变化曲线；

C是红壤的在线化学发光信号随时间的变化曲线；

D是红壤的化学发光信号转化的·OH浓度信号随时间的变化曲线；

图8是本发明实施例2利用构建的注射法对Fenton反应产生·OH的离线测定结果，其中：

A是不同Fe²⁺剂量下Fenton反应体系的化学发光信号；

B是[·OH]与化学发光信号的峰面积之间的线性相关性；

C是[·OH]与化学发光信号的峰高之间的线性相关性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。需要说明的是，实施例中无特殊说明的百分比为质量百分比。

香豆素(苯并吡喃酮，COU)是一种常用于·OH测定的探针分子，其原理是COU与·OH反应生成羟基化香豆素(h-COU)，其中7羟基香豆素(7h-COU)能够在350nm波长光的激发下产生波长为460nm的荧光，因而能够利用液相色谱监测7h-COU来测定·OH的产生。但是液相色谱的方法，分析一个样品需要十几分钟，而且需要对样品进行前处理，只能用于离线的·OH检测。申请人首次发现COU的羟基化转化产物(h-COU)能够被过硫酸盐氧化体系氧化而产生强烈的化学发光，该过程实时发生，所产生的化学发光信号可被实时监测。

基于上述发现，本发明建立了一种利用化学发光检测羟基自由基的方法，是基于化学发光的利用COU作为探针分子的·OH检测方法，该方法不但能够离线监测而且能够实时在线监测·OH的产生。利用该方法可以实现Fenton反应、类Fenton反应、光催化反应等过程中·OH的实时在线监测。

具体而言，根据本发明的一些实施例，提供了一种利用化学发光检测羟基自由基的方法，包括以下步骤1至步骤3：

步骤1：在·OH产生反应体系中加入过量的探针分子COU，以使产生的·OH与COU反应生成h-COU。

在本发明的一些实施例中，在·OH产生反应体系中，香豆素的初始浓度为50-1000μmol/L，但并不以此为限，可基于体系中·OH的量而选择合适浓度。

在本发明的一些实施例中，·OH产生反应体系包括芬顿反应体系、类芬顿反应体系或光催化体系，由此实现多种场景下反应过程中·OH的离线或在线监测。

步骤2：将生成h-COU的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池以实时检测产生的化学发光。

在本发明的一些实施例中，过硫酸盐氧化体系为过硫酸盐或者过硫酸盐和双氧水的组合，更优选为过硫酸盐和双氧水的组合，二者的协同作用可大幅提高化学发光强度，增加检测灵敏度。

在本发明的一些实施例中，将生成h-COU的反应体系与氧化试剂混合注入化学发光检测池的方式为注射法和动态在线检测法。化学发光检测池中设置有化学发光检测器光电倍增管PMT。

更具体的，以所述生成羟基化香豆素的反应体系作为待测样品，注射法为分别将一定体积(一般为微升级)的待测样品通过手动或自动(自动进样阀)方式与氧化剂混合，同时进行化学发光的测定，结果表现为单峰模式，适合用于离线检测，优点在于样品消耗量低、检测灵敏度高；

动态在线检测法采用连续流动进样的模式将待测样品与氧化剂在线混合并实时检测化学发光信号，优点在于可以在线实时监测反应过程中羟基产生和消除的动态变化过程。

在本发明的一些实施例中，在将生成h-COU的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合时还包括：加入pH调节剂对生成h-COU的反应体系的pH值进行调整。pH调节剂例如为NaOH溶液，通过pH调整而有利于提高过硫酸盐氧化体系的反应活性。

过硫酸盐优选为单过硫酸氢钾，过硫酸盐的浓度越高检测灵敏度越高，在采用动态在线检测法时，过硫酸盐的浓度优选为100-300mmol/L，例如100、150、200、250或者300mmol/L，双氧水的影响相对较小，浓度优选为100-400mmol/L，例如100、150、200、250、300、350、400mmol/L，NaOH浓度为1-2mol/L，例如为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mol/L；在采用注射法时，总体积5mL条件下，NaOH浓度为100-1000mmol/L，例如100、200、400、600、800、1000mmol/L，过硫酸盐的浓度为20-60mmol/L，例如20、30、40、50、60mmol/L，双氧水的浓度为20-80mmol/L，例如20、30、40、50、60、70、80mmol/L。可以根据对检测灵敏度的要求来设定具体浓度。

在本发明的一些实施例中，生成h-COU的反应体系为纯溶液体系或颗粒物悬浊液体系；

当生成h-COU的反应体系为纯溶液体系或者颗粒物浓度小于1000mg/L的悬浊液体系时，可直接将生成h-COU的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池；

当生成h-COU的反应体系为颗粒物浓度大于1000mg/L的悬浊液时，在将生成h-COU的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合之前还包括：对生成h-COU的反应体系进行离线或在线过滤以去除颗粒物干扰。

步骤3：根据化学发光值确定·OH产生反应体系中产生的·OH的含量。根据该化学发光值对·OH的含量进行定量分析时，可利用标准曲线法将化学发光值转化为·OH的浓度。

以下列举多个具体实施例来对本发明的技术方案作详细说明。需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。

实施例1：建立检测·OH的动态在线检测方法

(1)构建动态在线化学发光装置如图1所示，A为加入香豆素的羟基产生反应体系，B为浓度为2.0mol/L的NaOH载液，C为浓度为400mmol/L的助氧化剂H₂O₂，D为浓度为300mmol/L的氧化剂Oxone单过硫氢钾(2KHSO₅·KHSO₄·K₂SO₄，PMS)，E为陶瓷滤头过滤器(孔径0.2μm)。P为蠕动泵，PMT为化学发光检测器光电倍增管。

(2)羟基产生反应体系可以为纯溶液体系、颗粒物悬浊液体系。当反应体系为溶液体系或者浓度小于1000mg/L的颗粒物悬浊液体系时，可直接进样；当反应体系为浓度大于1000mg/L的颗粒物悬浊液时，需采用微孔滤头(孔径0.45或0.2μm)离线或者在线过滤以去除颗粒物的干扰。

(3)样品以3ml/min的流速与相同流速的NaOH载液混合，之后与3ml/min流速的H₂O₂助氧化剂混合，最后与3ml/min流速的氧化剂PMS混合后立刻进入化学发光检测池，通过光电倍增管检测化学发光信号(CL值)，光电倍增管高压及放大系数可根据样品信号大小而设定。

实施例1-1：以实施例1构建的方法测定PMS和H₂O₂浓度对化学发光信号的影响

以实施例1构建的流动检测方法为基础考察了PMS和H₂O₂浓度对·OH引起的化学发光信号的影响。首先，利用经典Fenton反应(5μmol·L^-1Fe²⁺与20μmol·L^-1H₂O₂反应)产生·OH，加入0.2mmol·L^-1COU进行捕获，反应1h后加入甲醇终止反应，同时用构建的流动化学发光方法测定不同PMS和H₂O₂浓度下反应后溶液的化学发光值CL。其中，测定不同PMS浓度下的化学发光值CL时，D为依次通入的0、10、20、50、100、200、300mmol/L的PMS；测定不同H₂O₂浓度下的化学发光值时，C为依次通入的0、40、100、400、600mmol/L的H₂O₂。

如图2所示，单独400mmol·L^-1的H₂O₂(此时PMS浓度为0)也能产生一定的CL信号(～220)，但是CL信号随着PMS浓度的增加而线性增加(如图2A所示)，表明增加PMS浓度可显著提高检测灵敏度，考虑到PMS的溶解度和经济性，最终选择300mmol·L^-1作为优化浓度。单独300mmol·L^-1的PMS(此时H₂O₂浓度为0)能产生～350左右的CL信号，加入H2O₂可大幅增加CL信号强度，二者联用产生的CL信号要大大高于二者单独使用之和，表明PMS与H₂O₂之间存在协同氧化作用。与PMS不同，CL信号的增加与H₂O₂浓度不呈线性关系(如图2B所示)，100mmol·L^-1-400mmol·L^-1之间产生的CL信号无显著差别，但是600mmol·L^-1时CL信号反而降低，因此将400mmol·L^-1作为H₂O₂的优化浓度。

实施例1-2：以实施例1构建的方法对不同F广剂量下Fenton反应产生·OH的测定

通过调控Fe²⁺浓度利用经典Fenton反应产生不同剂量的·OH，考察方法对·OH的线性响应范围，并与传统方法比较，建立了化学发光·OH浓度之间的标准曲线。具体实验如下，首先配制0.1mmol·L^-1Fe²⁺母液(pH＝3.0)、5.0mmol·L^-1H₂O₂溶液和1.0mmol·L^-1COU储备液，然后再依次加入一定量的超纯水(pH＝3.0)，COU储备液，H₂O₂溶液和Fe²⁺母液至50mL烧杯(总溶液体积40mL)，使试剂浓度分别达到如下设定：[H₂O₂]＝0.2mmol·L^-1，[COU]＝0.2mmol·L^-1，[Fe²⁺]分别为0，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μ mol·L^-1。避光反应2h后加入甲醇终止反应，用HPLC测定探针分子转化产物(7h-COU)的浓度，同时用构建的化学发光方法测定反应后溶液的化学发光值CL。

如图3所示，Fenton反应体系中溶液的CL值随着[Fe²⁺]的增加而增加，二者呈现显著正相关性，线性相关系数达到0.998(如图3B)。通过HPLC方法可以测定COU羟基化产物7h-COU的浓度，文献报道的COU与·OH反应产生7-hCOU的产率为14.5％，由此可以计算出反应所产生的·OH浓度，按此方法可获得的[Fe²⁺]与[·OH]之间的线性相关方程(y＝0.292x，R²＝0.983)。利用获得的[Fe²⁺]与[·OH]之间线性方程，将[Fe²⁺]转化为[·OH]即可获得CL与[·OH]之间的相关曲线，结果表明二者显著正相关性，线性系数相关达到0.998(图4)，表明可以利用COU作为探针以化学发光法直接测定体系中的[·OH]。另一方面，由标准曲线可以看出该方法对于[·OH]的检测限可以达到0.05μmol·L^-1，表现出很好的灵敏度。

实施例1-3：以实施例1构建的方法对Fenton反应产生·OH的原位在线测定

本发明所构建的方法不仅能检测·OH的浓度(以下简写为[·OH])，而且能够实现反应过程的实时在线监测。本实施例中利用该方法实时在线监测了50μmol·L^-1的Fe²⁺(pH＝3.0)与200μmol·L^-1H₂O₂反应在开始的5min内生成·OH的动力学过程。其中，本实施例是以实施例1-1所建立的CL与[·OH]之间的相关曲线作为标准曲线，将在线监测的化学发光信号CL随时间的变化曲线(图5A)转化为[·OH]随时间的变化曲线(图5B)，可以看出，5min内·OH的产生速率随着时间增加逐渐降低，但是随后一周的非连续测定结果表明体系的化学发光值一直持续缓慢的增加，表明体系中有·OH的持续产生，但是其产生速率远低于初始阶段。

实施例1-4：以实施例1构建的方法对TiO₂光催化体系中·OH的测定

本发明所构建的方法通过直接进样实时在线监测了不同浓度(1，10，25mg·L^-1)TiO₂(P25)在模拟太阳光体系下产生·OH的动力学过程，并通过之前建立的标准曲线对·OH浓度进行了定量分析。如图6所示，TiO₂光催化产生·OH的能力与颗粒物浓度呈正比。25min内TiO₂光催化产生的·OH随时间增加而增加，与Fenton反应相比起初始阶段·OH产生速率较低，但是其持续产生·OH的速率较Fenton反应强，特别的25mg·L^-1的TiO₂在25min仍然保持高的·OH增长速率，表明TiO₂光催化产生·OH的活性没有明显降低。这一动力学过程的对比，有利于我们认识Fenton反应与TiO₂光催化过程中·OH的产生过程，以及如何利用二者不同的特点进行污染物的去除。

实施例1-5：以实施例1构建的方法对土壤溶液中Fenton反应产生·OH的在线测定

本发明实时在线监测了100μmol·L^-1的Fe²⁺与200μmol·L^-1H₂O₂在两种土壤颗粒悬浮液(土壤颗粒浓度20g/L)中反应产生·OH的动力学过程。由于颗粒物浓度高，利用微孔滤头采样器进行原位过滤采样。本实施例中利用实施例1-1所建立的CL与[·OH]之间的相关曲线作为标准曲线，将在线监测的化学发光信号CL转化为[·OH]，结果如图7所示，图7A和图7B为有机质含量高的黑土中·OH的在线监测结果，·OH在1min之内即达到平衡，浓度约为1.2μmol；图7C和图7D为有机质含量低的红壤中·OH的在线监测结果，·OH的生成动力学与溶液中类似，在监测时间段内(15min)仍在持续上升最高浓度达10μmol，表明反应仍在继续进行。不同土壤中同样试剂芬顿反应生成·OH的速率和浓度截然不同，这样土壤有机质的含量有关，土壤有机质会分解双氧水同时猝灭·OH，因此不利于·OH的生成。

实施例2：建立注射法化学发光检测·OH的方法

除了动态在线检测，本发明同样适用于注射法化学发光检测·OH。注射方法如下，将5mL NaOH-H₂O₂-PMS混合液(浓度分别为0.2mol L^-1，25mmol L^-1，30mmol L^-1)加入石英皿或石英烧杯并至于检测器之上，然后关闭检测室，将光电倍增管高压设置为900V，开始记录CL值，通过正上方的加样口将利用微量注射器将100μL样品溶液注入上述混合液，加入样品瞬间产生强烈化学发光信号，该信号在60s内完全衰减，待信号衰减至基线可直接注入下一个样品进行分析。为提高效率和节省溶液，不用每个样品更换NaOH-H₂O₂-PMS混合液，每间隔5-10个样品检测一次标样，当发现样品信号出现明显衰减之后再进行更换NaOH-H₂O₂-PMS混合液。

利用注射方法检测了不同Fe²⁺浓度调控的Fenton反应([H₂O₂]＝0.2mmol·L^-1，[COU]＝0.2mmol·L^-1，[Fe²⁺]分别为0.8，2.0，4.0，6.0，8.0μmol·L^-1)所产生的·OH，采用与实施例1-2类似的数据处理方法绘制标准曲线，如图8所示，羟基浓度与峰面积和峰高之间均存在很好的线性相关性(R2＝0.99)。相同·OH浓度下利用注射方法检测的CL信号更高，表明注射法具有更高的灵敏度。

对比例1：

其他常用羟基探针分子如苯、对苯二甲酸(钠)、苯甲酸(钠)等与·OH反应的转化产物均不能产生强烈化学发光信号，故不能作为化学发光检测的·OH探针。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用化学发光检测羟基自由基的方法，包括以下步骤：

在羟基自由基产生反应体系中加入过量的探针分子香豆素，以使产生的羟基自由基与香豆素反应生成羟基化香豆素；

将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池以实时检测产生的化学发光；

根据化学发光值确定所述羟基自由基产生反应体系中产生的羟基自由基的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述羟基自由基产生反应体系中所述香豆素的初始浓度为50-1000μmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟基自由基产生反应体系包括芬顿反应体系、类芬顿反应体系或光催化体系。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合注入化学发光检测池的方式为注射法或动态在线检测法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过硫酸盐氧化体系为过硫酸盐或者过硫酸盐和双氧水的组合，过硫酸盐优选为单过硫酸氢钾。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合时还包括：加入pH调节剂对所述生成羟基化香豆素的反应体系的pH值进行调整。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

在采用动态在线检测法的情况下，过硫酸盐的浓度为100-300mmol/L，双氧水的浓度为100-400mmol/L，NaOH浓度为1-2mol/L；

在采用注射法的情况下，以总体积5mL为例，NaOH浓度为100-1000mmol/L，过硫酸盐的浓度为20-60mmol/L，双氧水的浓度为20-80mmol/L。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述注射法为分别将一预设体积的所述生成羟基化香豆素的反应体系通过手动或自动方式与过硫酸盐氧化体系混合，并实时测定化学发光；

所述动态在线检测法为采用连续流动进样的模式将所述生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合，并实时测定化学发光。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生成羟基化香豆素的反应体系为纯溶液体系或颗粒物悬浊液体系；

在所述生成羟基化香豆素的反应体系为颗粒物浓度大于1000mg/L的颗粒物悬浊液时，在将生成羟基化香豆素的反应体系与过硫酸盐氧化体系混合之前还包括：对所述生成羟基化香豆素的反应体系进行在线或离线过滤以去除颗粒物干扰。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据化学发光值确定所述羟基自由基产生反应体系产生的羟基自由基的含量包括：利用标准曲线法将化学发光值转化为羟基自由基的浓度。

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