CN114354582B - 一种双信号放大电化学发光适配体传感器的制备方法及其检测Pb2+的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感检测技术领域，具体涉及一种双信号放大电化学发光适配体传感器的制备方法及其检测Pb2+的应用；本发明旨在结合AuNCs的聚集诱导电化学发光和共振能量转移的双信号放大策略提高传感器的灵敏度，通过适配体传感技术提高选择性，构筑一种基于AuNCs/TEA体系的Pb2+适配体传感器；AuNCs的聚集诱导发光行为提供高的初始ECL信号，结合共振能量转移策略猝灭AuNCs的ECL信号，提供了高的“信号‑背景”比，从而提高了检测灵敏度，即铅离子一个数量级的变化使得ECL信号变化521a.u.；检测灵敏度高、选择性好、线性范围宽，为1.0×10‑10～1.0×10‑4mol/L。
Description
技术领域
本发明属于生物传感检测技术领域，具体涉及一种双信号放大电化学发光适配体传感器的制备方法及其检测Pb2+的应用。
背景技术
Pb2+是一种具有积蓄性的有害重金属离子。目前，全国每年受重金属污染的土地达0.3亿亩，受污染的粮食达1200多万吨，造成经济损失约200亿元。其中，Pb2+可以通过食物链进入人体，破坏人体神经系统和消化系统，特别对大脑处于发育敏感期的儿童，易造成发育迟缓等严重后果。2018年，我国颁布了农用地土壤污染风险管控标准，严格规定农用地土壤中铅离子的风险管控值为400mg/kg。目前检测Pb2+的方法有X射线荧光光谱法、电感耦合等离子体-质谱法、火焰原子吸收光谱法、比色-原子荧光光谱法等，这些方法准确高效，但是仪器昂贵，专业要求高。
荧光法、电化学法、电化学发光法由于成本低、操作简便的优点而受到广泛关注。其中，电化学发光法(ECL)是在化学发光基础上发展的一种分析方法，是一种电化学与化学发光相结合的技术。虽然目前已发展的多种发光体拓展了ECL的应用，由于其自身的不足而限制了其进一步发展。金纳米团簇作为近些年新发展的发光体，由于其良好的生物相容性、优越的催化活性和独特的光物理性质成为一种很有前途的材料。然而，金纳米团簇(AuNCs)ECL效率较低和机制不清楚而限制了其应用。近年来，AuNCs的ECL机理已得到初步研究。研究发现：刚性小分子配体功能化的金纳米团簇在水溶液里有微弱的ECL信号，而通过干燥使其聚集在电极上后，ECL信号增强了1200倍，显著增强了AuNCs的ECL发光效率。目前还没有基于AuNCs的ECL构建传感器用于重金属的检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明在结合AuNCs的AIECL效应，引入Pb2+适配体，以罗丹明B作为能量受体，构建聚集诱导电化学发光适配体传感器，用于实际样品中Pb2+的快速、灵敏检测分析。
本发明旨在结合AuNCs的聚集诱导电化学发光和共振能量转移的双信号放大策略提高传感器的灵敏度，通过适配体传感技术提高选择性，构筑一种基于AuNCs/TEA体系的Pb2+适配体传感器。具体涉及基于AuNCs/TEA体系的Pb2+电化学发光传感器的制备及应用。
一种Pb2+聚集诱导电化学发光适配体传感器的制备方法，步骤如下：
(1)AuNCs的合成
首先将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、氢氧化钠加入纯化水A中混合均匀，得到混合液A；然后将氯金酸加入纯化水B中混合均匀，得到混合液B；将混合液A加入混合液B中得到混合溶液C，在一定温度条件下避光反应后，将得到的产物装入透析袋中进行透析，透析后的产物再经冷冻干燥处理得到粉末，即为AuNCs；
(2)将玻碳电极(GCE)依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，打磨后依次在水、乙醇和水中超声后在室温下干燥，干燥后得到预处理的玻碳电极；
(3)将步骤(1)制备得到的粉末状AuNCs溶于纯化水中，得到AuNCs溶液；然后将AuNCs溶液修饰到步骤(2)预处理的GCE表面，并在室温下干燥，干燥后的产品标记为AuNCs/GCE；
(4)取巯基功能化的互补DNA，记为cDNA；将cDNA修饰在步骤(3)制备的电极AuNCs/GCE表面，在一定温度下孵育，孵育后的产品标记为cDNA/AuNCs/GCE；
(5)在室温条件下，取6-巯基己醇溶液修饰在步骤(4)制备的自组装电极cDNA/AuNCs/GCE表面，室温条件下孵育后得到MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(6)取Pb2+适配体，记为Apt；在一定温度下将Apt修饰在步骤(5)制备的电极MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，通过与cDNA互补固定在传感界面，在一定温度条件下反应后的产品标记为Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(7)将罗丹明B(RhB)溶液修饰在步骤(6)制备的电极Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，并在室温下孵育一段时间，形成自组装传感器，产品标记为RhB/Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE。
优选的，步骤(1)中所述混合溶液C中氯金酸、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、氢氧化钠、纯化水A和纯化水B用量比例为0.15g：0.17g：0.12g：15mL：15mL；所述一定温度条件为25℃，避光反应的时间为1h；所述透析的时间为24h。
优选的，步骤(2)中所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
优选的，步骤(3)中，AuNCs溶液的浓度为1mg/mL，用量为8μL。
优选的，步骤(4)中，所述cDNA的浓度为2μM，用量为6μL；所述孵育时间为12h，孵育温度为4℃。
优选的，步骤(5)中，所述6-巯基己醇溶液的浓度为2μM，修饰用量为6μL；所述孵育的时间为40min。
优选的，步骤(6)中，所述Apt溶液的浓度为2μM，修饰用量为6μL；所述孵育的时间为40min，所述一定温度为37℃。
优选的，步骤(7)中，所述罗丹明B溶液的浓度为2mM，用量为6μL；所述孵育一段时间为40min。
检测步骤：
(1)将V1体积不同浓度的Pb2+标准溶液修饰在步骤(7)制备的RhB/Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，室温下孵育后用纯化水对电极进行清洗；一个浓度的Pb2+溶液对应修饰一个传感器，溶液浓度和传感器呈一一对应关系；此时制备的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，检测AuNCs的ECL信号强度，以ECL信号强度为纵坐标，Pb2+浓度的log值为横坐标，建立相应标准曲线用于实际样品中Pb2+浓度的检测；
(2)样品Pb2+的检测：首先获取样品液，修饰V2体积的样品液于传感器表面，通过电化学发光测试得到相应的ECL信号强度；将信号强度值代入步骤(1)构建的标准曲线，即可获知样品中Pb2+的浓度；实现未知样品中Pb2+检测的用途。
步骤(1)中所述Pb2+溶液的浓度为1×10-10～1×10-4mol/L；所述孵育时间为10～50min；所述检测ECL信号具体是利用MPI-EII电化学发光分析仪，条件为：在0.1M、pH＝7的PBS缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围0～1.4V，扫描速度0.1V/s，实验中光电倍增管的高压为450V；步骤(1)-(2)中所述V1、V2体积均为6μL。
本发明的有益效果
(1)金纳米团簇的聚集诱导电化学发光效应可以提高传感器的稳定性和重现性。
(2)AuNCs的聚集诱导发光行为提供高的初始ECL信号，结合共振能量转移策略猝灭AuNCs的ECL信号，提供了高的“信号-背景”比，从而提高了检测灵敏度，即铅离子一个数量级的变化使得ECL信号变化521a.u.。
(3)本发明构建的ECL适配体传感器用于Pb2+的检测，灵敏度高、选择性好、线性范围宽，为1.0×10-10～1.0×10-4mol/L。
附图说明
图1为是基于AuNCs-TEA体系的Pb2+电化学发光适配体传感器制备工艺过程图；
图2为本发明实施中对不同浓度Pb2+检测的校正曲线；其中(A)为加入不同浓度Pb2 +检测的电化学发光信号图；(B)为加入不同浓度Pb2+检测的校正曲线图；
图3为本发明实施中传感器的选择性与稳定性；其中(A)为适配体传感器的选择性能图；(B)为连续测量15天的稳定性能图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和说明书附图，进一步阐明本发明；所使用的cDNA、Apt购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1：
按照图1所述的制备工艺：
(1)AuNCs的制备
首先，将0.17g 6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶和0.12g氢氧化钠加入到15mL纯化水中搅拌至完全溶解，得到含有氢氧化钠的ATT溶液；然后将0.15g HAuCl4溶于15mL纯化水中，得到HAuCl4溶液；再将含有氢氧化钠的ATT溶液倒入HAuCl4溶液中混合均匀，在25℃条件下避光反应1h，得到的产物装入50kDa的透析袋中透析24h，透析后的溶液冷冻干燥，得到固体产物AuNCs，储存在4℃冰箱中备用；
(2)将玻碳电极(GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，在水、乙醇和水中超声后在室温下干燥，所述玻碳电极的直径d＝3mm；
(3)首先取步骤(1)制备的AuNCs加入纯化水中，得到AuNCs溶液；取8μL浓度为1mg/mL AuNCs溶液修饰到步骤(2)处理后的GCE表面，并在空气中干燥，干燥后产品标记为AuNCs/GCE；
(4)然后将6μL 2μM巯基功能化的互补DNA(cDNA)溶液修饰到步骤(3)制备的电极表面，在4℃冰箱中孵育12h，cDNA通过Au-S共价键固定在电极表面；此时，产品标记为cDNA/AuNCs/GCE；
(5)在步骤(4)制备的电极上滴加6μL 2μM 6-巯基己醇(MCH)溶液，室温下孵育40min，以阻断剩余的非特异结合位点，产品标记为MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(6)在步骤(5)修饰好的电极滴加6μL2μM Pb2+适配体(Apt)，在37℃下孵育40min，适配体通过与DNA互补杂交固定在电极表面，形成自组装电极。此时，产品标记为Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(7)6μL 2mM罗丹明B(RhB)在步骤(6)修饰好的电极上室温下作用40min，使罗丹明B嵌入DNA双链中作为共振能量转移的受体，形成自组装电极。此时，产品标记为RhB/Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE。
将6μL不同浓度Pb2+溶液修饰在上述制得的传感器中，室温下绑定时间为40min，Pb2+的浓度依次为1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5和1×10-4mol/L用纯化水冲洗后，制得的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由MPI-EII电化学发光分析仪记录和检测ECL信号。在0.1M PBS(pH＝7)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围0～1.4V，扫描速度0.1V/s，实验中光电倍增管的高压为450V。
同样的方法，测试未知浓度的Pb2+溶液的ECL信号为3278a.u.，代入标准曲线，得到未知溶液的浓度1.04×10-8mol/L。
从图2中(A)图，可以看出，随着Pb2+浓度的增加(从下到上的浓度依次为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5和1×10-4mol/L)，ECL信号逐渐增加，这应归因于Pb2+与其适配体的特异性结合，将罗丹明B从电极表面释放出来。从图2中(B)图，可以看出，适配体传感器的ECL信号(IECL)与Pb2+浓度的对数值(CPb2+)绘制的标准曲线为IECL＝7356+521×logCPb 2+，线性范围为1.0×10-10～1.0×10-4mol/L，检测限为2.4×10-11mol/L。
从图3中(A)图，其中blank是指无目标物存在时的信号，定义为空白样；其中K+，Na+，Ni+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Mn2+，Cu2+，Cd2+，Fe2+和Fe3+作为干扰物；其相应浓度均为100nM；其中Pb2+为目标物，浓度为1nM；Mix为上述干扰物与目标物扰物的混合物，相应的干扰物浓度均为100nM，目标物的浓度为1nM。
可以看出，Pb2+的干扰物质(K+,Na+,Ni+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Mn2+,Cu2+,Cd2+,Fe2+和Fe3+以及其混合物)引起的ECL改变值可以忽略不计，证明该传感器具有优异的选择性能。
从图3中(B)图，可以看出，Pb2+适配体传感器在进行连续15天ECL测试后，ECL强度为初始强度的89.4％，表明该传感器具有良好的长期稳定性。
基于共振能量转移策略的双放大电化学发光适配体传感器对实际样品进行分析，步骤如下(土壤采集地点：镇江京口区)：
(1)在土壤提取液中分别加入浓度为1nM，10nM，100nM的Pb2+后，计算出农田土壤回收率为94.0～104％，相对标准偏差(RSD)为0.89～1.26％，化工厂周围土壤回收率为101～108％，RSD值为1.21～1.63％；说明该传感器可以用于传感器检测。
(2)进一步通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)标准方法对检测结果进行验证，回收率为98.4～104％，表明所构建的传感器在实际样品中具有良好的可靠性。
表1：本发明构建的传感器以及电感耦合等离子体质谱法分别检测农田土壤和化工厂周围土壤中铅的检测结果
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (9)
1.一种双信号放大电化学发光适配体传感器用于检测Pb2+的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)首先将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、氢氧化钠加入纯化水A中混合均匀，得到混合液A；然后将氯金酸加入纯化水B中混合均匀，得到混合液B；将混合液A加入混合液B中得到混合溶液C，在一定温度条件下避光反应后，将得到的产物装入透析袋中进行透析，透析后的产物再经冷冻干燥处理得到粉末，即为AuNCs；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，打磨后依次在水、乙醇和水中超声后在室温下干燥，干燥后得到预处理的玻碳电极；
(3)将步骤(1)制备得到的粉末状AuNCs溶于纯化水中，得到AuNCs溶液；然后将AuNCs溶液修饰到步骤(2)预处理的玻碳电极表面，并在室温下干燥，干燥后的产品标记为AuNCs/GCE；
(4)取巯基功能化的互补DNA，记为cDNA；将cDNA修饰在步骤(3)制备的电极AuNCs/GCE表面，在一定温度下孵育，孵育后的产品标记为cDNA/AuNCs/GCE；
(5)在室温条件下，取6-巯基己醇溶液修饰在步骤(4)制备的自组装电极cDNA/AuNCs/GCE表面，室温条件下孵育后得到MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(6)取Pb2+适配体，记为Apt；在一定温度下将Apt修饰在步骤(5)制备的电极MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，通过与cDNA互补固定在传感界面，在一定温度条件下反应后的产品标记为Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(7)将罗丹明B溶液修饰在步骤(6)制备的电极Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，并在室温下孵育一段时间，形成自组装传感器，产品标记为RhB/Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE；
(8)将V1体积不同浓度的Pb2+标准溶液修饰在RhB/Apt/MCH/cDNA/AuNCs/GCE表面，室温下孵育后用纯化水对电极进行清洗；一个浓度的Pb2+溶液对应修饰一个传感器，溶液浓度和传感器呈一一对应关系；此时制备的传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，检测AuNCs的ECL信号强度，以ECL信号强度为纵坐标，Pb2+浓度的log值为横坐标，建立相应标准曲线用于实际样品中Pb2+浓度的检测；
(9)样品Pb2+的检测：首先获取样品液，修饰V2体积的样品液于传感器表面，通过电化学发光测试得到相应的ECL信号强度；将信号强度值代入步骤(1)构建的标准曲线，即可获知样品中Pb2+的浓度；实现未知样品中Pb2+检测的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液C中氯金酸、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、氢氧化钠、纯化水A和纯化水B用量比例为0.15g：0.17g：0.12g：15mL：15mL；所述一定温度条件为25℃，避光反应的时间为1h；所述透析的时间为24h。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(2)中所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm和0.05μm。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(3)中，AuNCs溶液的浓度为1mg/mL，用量为8μL。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(4)中，所述cDNA的浓度为2μM，用量为6μL；所述孵育时间为12h，孵育温度为4℃。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(5)中，所述6-巯基己醇溶液的浓度为2μM，修饰用量为6μL；所述孵育的时间为40min。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(6)中，所述Apt的浓度为2μM，修饰用量为6μL；所述孵育的时间为40min，一定温度为37℃。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(7)中，所述罗丹明B溶液的浓度为2mM，用量为6μL；所述孵育一段时间为40min。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(8)中所述Pb2+溶液的浓度为1×10-10～1×10-4mol/L；所述孵育时间为10～50min；所述检测ECL信号具体是利用MPI-EII电化学发光分析仪，条件为：在0.1M、pH＝7的PBS缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围0～1.4V，扫描速度0.1V/s，实验中光电倍增管的高压为450V；步骤(8)-(9)中所述V1、V2体积均为6μL。
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| 基于无标记金纳米簇的新型荧光生物传感器在赭曲霉毒素A快速检测中的应用;孔德莉等;食品科学;第42卷(第4期);263-270 * |
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