CN110982771B - 一种合成对羟基扁桃酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成对羟基扁桃酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株双质粒重组菌，共表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和NADH氧化酶基因，将构建好的表达质粒导入E.coli BL21(DE3)。将对羟基苯甲醛和乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并通过NADH氧化酶辅酶再生系统，通过将NADH转化为NAD+，使得NAD+循环再生，转化能够高效进行。并通过优化底物浓度及比例，优化转化温度和pH，实现了对羟基扁桃酸的高效生产。在30℃、pH7的条件下反应24h，可将30mM的底物对羟基苯甲醛转化为28.5mM的对羟基扁桃酸，转化率可达到95％。

Description

一种合成对羟基扁桃酸的方法
技术领域
本发明涉及一种合成对羟基扁桃酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
对羟基扁桃酸，又称4-羟基扁桃酸，分子式C8H8O4，英文名称4-Hydroxyphenylglycolic acid，别名为2-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid。外观为淡黄色水合物固体，熔点109.5～110.5℃(无水物)。
对羟基扁桃酸是重要的医药、农药和香料的中间体。特别在医药上，对羟基扁桃酸是制备抗高血压新药阿替洛尔(Ateno)的中间体，也是制备广谱抗菌素新药阿莫西林的中间体。对羟基扁桃酸临床用于治疗高血压引起的颈项强痛、头痛、偏头痛、头晕、冠心病、心绞痛及早期神经感觉性耳聋，疗效显著、应用普遍；其次还用于抗高血压新药—阿替洛尔及抗癌药物、抗糖尿病药、抗动脉硬化药、抗过敏药和消炎药、β-受体阻滞药等的合成。此外，对羟基扁桃酸在农药、高分子化合物、光电、生物化学等领域都有特殊的应用。
对羟基扁桃酸的合成方法包括化学合成法和生物合成法，其中(1)-(4)为化学合成法，(5)为生物合成法。
(1)苯酚和乙醛酸在氢氧化钠存在下的缩合反应。该方法具有原料易得、工艺简单、成本低等优点，但是收率偏低。(2)苯酚与三氯乙醛反应，三氯甲基基团水解为羧酸基团。三氯乙醛与苯酚进行电化学反应，再将其水解得到成品。该方法产品质量好，但是三氯乙醛价格偏高。(3)对羟基苯甲醛氰醇水解，要使用剧毒的氰化钠和对羟基苯甲醛，该工艺对环境压力大，逐渐被淘汰。(4)对氨基扁桃酸水解，对氨基苯乙酸经重氨化、水解得到成品。该法环境污染及设备腐蚀严重，对氨基氯苄经腈化、水解同样具有上述缺点。(5)通过在大肠杆菌中过表达对羟基扁桃酸合酶，催化对羟基苯丙酮酸反应生成对羟基扁桃酸，但是底物价格昂贵，成本较高。
因此，提供一种原料易得、工艺简单、成本低、收率高、环保的对羟基扁桃酸，具有广阔的市场应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明设计了一种全新的基于C-C键连接的生物法合成对羟基扁桃酸的路径并通过构建单酶表达菌株验证了其有效性，最终通过构建双质粒将编码丙酮酸脱羧酶(PDC)的基因pdc和苯乙醛脱氢酶(ALDH)基因padA及构成其辅酶循环的NADH氧化酶(NOX)的基因noxE共表达于大肠杆菌BL21中以合成对羟基扁桃酸，并对其中的反应条件进行了优化。
本发明的第一个目的是提供一种生产对羟基扁桃酸的重组菌，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，双质粒表达系统表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述双质粒包括pETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述pETDuet-1质粒用于表达苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达丙酮酸脱羧酶。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母(Candidatropicalis)，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码丙酮酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述苯乙醛脱氢酶选自大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码苯乙醛脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述NADH氧化酶选自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码NADH氧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，构建重组菌具体包括如下步骤：以pETDuet-1为载体，将SEQ ID NO.2所示的padA和SEQ ID NO.3所示的noxE扩增后通过酶切连接的方式连接到载体上，最终构建成质粒pETDuet-padA-noxE；以pRSFDuet-1为载体，将SEQ ID NO.1所示的pdc扩增后并通过酶切连接的方式连接到载体上，最终构建成质粒pRSFDuet-pdc；将两个质粒同时导入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。
本发明的第二个目的是提供一种转化对羟基苯甲醛、乙醛酸生产对羟基扁桃酸的方法，所述方法利用上述重组菌将对羟基苯甲醛、乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并偶联辅酶再生系统。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶再生系统以NADH为底物，通过NADH氧化酶将NADH转化为NAD+的辅酶再生系统。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以上述重组菌为生物催化剂，以对羟基苯甲醛和乙醛酸为底物，并添加Mg2+和TPP及NAD+。具体反应流程见图1。
在本发明的一种实施方式中，所述的底物对羟基扁桃酸的初始反应浓度为5～30mM，对羟基扁桃酸与乙醛酸的比例为1：1～2。
在本发明的一种实施方式中，所述的丙酮酸脱羧酶所需要的辅因子Mg2+的添加量为0.5～2mM/g湿菌体。
在本发明的一种实施方式中，所1.5mM/g湿菌体，TPP的添加量为0.5～1.5mM/g湿菌体，所述的苯乙醛脱氢酶所需要的辅酶NAD+的添加量为0.5～1.5μM。
在本发明的一种实施方式中，用所述重组菌的湿细胞进行转化；湿细胞添加量为20～50g/L。
在本发明的一种实施方式中，转化过程中，以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述转化条件是：pH 6～8，转化温度为30～37℃，转化时间20～24h，摇床转速为200～220rpm。
本发明的第三个目的在于提供上述重组菌在制药或化工中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明设计的对羟基扁桃酸的合成方法是以乙醛酸和对羟基苯甲醛为底物首次通过生物法来合成对羟基扁桃酸，避免了化学法合成中出现的常见的副反应的发生。
2、本发明所述的双质粒表达菌株可以通过培养来大批量获得，且不需要细胞破碎，直接用于转化反应，操作简便。
3、本发明构建的辅酶循环系统，可以高效生产反应所需要的辅酶NAD+，降低了体外添加NAD+所需的成本，采用本方法制备对羟基扁桃酸，添加30mM的对羟基苯甲醛后，可生成28.5mM的对羟基扁桃酸，转化率可达到95％，转化周期24h。
附图说明
图1：对羟基扁桃酸的制备流程图。
图2：转化产物的HPLC及MS检测结果；(A)：对羟基扁桃酸的标准品；(B)：反应24h的转化结果；(C)：反应24h后的检测反应液中的对羟基扁桃酸的质谱图。
图3：底物比例对对羟基扁桃酸产量的影响。
图4：温度对对羟基扁桃酸产量的影响。
图5：pH对对羟基扁桃酸产量的影响。
具体实施方式
(一)丙酮酸脱羧酶的酶活定义及测定方法
丙酮酸脱羧酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟生成1μmol对羟基扁桃醛所需要的酶量。
酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将丙酮酸脱羧酶进行纯化后，在1mL反应体系中，加入过量的底物对羟基苯甲醛和乙醛酸，加入一定量的Mg2+及TPP，一定量的酶，反应30min后，HPLC测定反应后生成对羟基扁桃醛的量。
(二)苯乙醛脱氢酶的酶活定义及测定方法
苯乙醛脱氢酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟生成1μmol对羟基扁桃酸所需要的酶量。
酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将苯乙醛脱氢酶进行纯化后，在1mL反应体系中，加入过量的底物对羟基扁桃醛，一定量的酶，反应30min后，HPLC测定反应后生成对羟基扁桃醛的量。
(三)NADH氧化酶的酶活定义及测定方法
NADH氧化酶的酶活定义：一个单位酶活定义为30℃，pH为7时，每分钟消耗1μmolNADH所需要的酶量。
酶活测定方法：将构建好的全细胞进行超声破碎，将NADH氧化酶进行纯化后，在1mL的反应体系中，加入过量的NADH，一定量的纯酶，反应10min后，用分光光度法直接检测NADH在340nm下的吸光度变化。
实施例1：重组质粒pRSFDuet-pdc的构建
人工合成的经过密码子优化的含有BamHI和SalI酶切位点的pdc基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，用限制性内切酶BamHI和SalI将pdc基因和质粒pRSFDuet-1 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的pdc基因和质粒pRSFDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氨苄霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pRSFDuet-pdc。
实施例2：重组质粒pETDuet-padA的构建
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以5'CGGGATCCAATGACAGAGCCGCATGTA 3'为正向引物，以5'ACGCGTCGACTTAATACCGTACACACACCGA 3‘为反向引物(划线部分分别为BamHI和SalI的酶切位点)扩增获得padA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，用限制性内切酶BamHI和SalI将padA基因和质粒pETDuet-padA 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的padA基因和质粒pETDuet-1 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pETDuet-padA。
实施例3：重组质粒pETDuet-padA-noxE的构建
以枯草芽孢杆菌168的基因组为模板，以5'GGAAGATCTAATGACGAATACTCTGGATGTTT3'为正向引物，以5'CCGCTCGAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTT 3'为反向引物(划线部分分别为BglⅡ和XhoⅠ的酶切位点)扩增获得noxE基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)，用限制性内切酶BglⅡ和XhoⅠ将noxE基因和质粒pETDuet-padA 37℃酶切3h，用T4连接酶将酶切并胶回收后的noxE基因和质粒pETDuet-padA 16℃连接10h，连接产物经化学转化法转化至E.coli JM109感受态细胞，在含有卡纳霉素的LB平板中培养12h，将平板中长出的菌落进行PCR验证。挑选阳性转化子接种于LB培养基，37℃培养12h后提取质粒。经测序验证，构建得重组质粒pETDuet-padA-noxE。
实施例4：双质粒重组大肠杆菌的构建和表达
将实施例1构得的质粒pRSFDuet-pdc和实施例3构得的质粒pETDuet-padA-noxE经化学转化法同时转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含有氨苄青霉素和卡那霉素两种抗性的LB平板中培养12h，将平板中长出的单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的种子培养基中，37℃、200rpm过夜培养。以2％(v/v)的接种量转接到100mL含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的发酵培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，25℃、200rpm下诱导12h后收集菌体用于全细胞转化。测定酶活，结果显示，丙酮酸脱羧酶的酶活为：36.7U/mg；乙醛脱氢酶的酶活为：32.1U/mg；NADH氧化酶的酶活为：87.5U/mg。
实施例5：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化的验证
以NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液作为全细胞转化的介质，转化的条件：
取实施例4中获得的湿菌体，离心收集菌体后作为催化剂进行全细胞转化。在对羟基苯甲醛浓度为30mmol/L，乙醛酸浓度为60mmol/L，硫酸镁浓度为5mmol/L，TPP浓度为5mmol/L，NAD+浓度为1mmol/L时，30℃转化24h。向上述反应液中加入等体积的1M HCl终止反应。12000rpm离心10min后，用0.22μm的滤膜过滤后，稀释10倍，用HPLC检测反应液，为了进一步验证结果的可靠性，并用LC-MS检测反应液中对羟基扁桃酸的存在。结果见图2。
实施例6：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化的底物浓度的优化
在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为1:1的比例下进行底物浓度的优化，其中对羟基苯甲醛的浓度为(5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM和80mM)，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，30℃转化24h，结果如图3a所示，当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为1:1时，对羟基苯甲醛浓度为5～80mM，转化率为2～92％，产量达0.1～28.8mM；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：30mM时，转化率为82.2％；当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为40mM：40mM时，产物的量为28.8mM，此时转化率为72.0％。
在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，优化对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比例。硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，30℃转化24h，结果如图3b所示，对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比例为1:1～1:3时，转化率为26.7％～84.5％，产量为8.01～25.35mM。当对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度比为30mM：60mM时，转化率为84.5％，产量为25.35mM。
实施例7：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化温度的优化
在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：60mM的比例下进行温度的优化，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，分别25℃、30℃、37℃下转化24h，结果如图4所示，当温度为30℃时，相对转化率最高(相对转化率：以最佳转化条件下的转化率为100％，实际转化率相对于最佳转化率的比率)。
实施例8：双质粒重组大肠杆菌全细胞转化pH的优化
在1mL的反应体系中加入30g/L的重组菌株，在对羟基苯甲醛与乙醛酸的浓度为30mM：60mM的比例下进行温度的优化，硫酸镁浓度为5mM，TPP浓度为5mM，NAD+浓度为1mM时，分别在pH为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9条件下30℃下转化24h，结果如图5所示，当pH为7时，相对转化率最高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种合成对羟基扁桃酸的方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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cctcatgttg cgaaaatcag ttttaccggt tcaaccgcga cgggaaaagg tattgccaga 780
actgctgctg atcacttaac gcgtgtaacg ctggaactgg gcggtaaaaa cccggcaatt 840
gtattaaaag atgctgatcc gcaatgggtt attgaaggct tgatgaccgg aagcttcctg 900
aatcaagggc aagtatgcgc cgccagttcg cgaatttata ttgaagcgcc gttgtttgac 960
acgctggtta gtggatttga gcaggcggta aaatcgttgc aagtgggacc ggggatgtca 1020
cctgttgcac agattaaccc tttggtttct cgtgcgcact gcgacaaagt gtgttcattc 1080
ctcgacgatg cgcaggcaca gcaagcagag ctgattcgcg ggtcgaatgg accagccgga 1140
gaggggtatt atgttgcgcc aacgctggtg gtaaatcccg atgctaaatt gcgcttaact 1200
cgtgaagagg tgtttggtcc ggtggtaaac ctggtgcgag tagcggatgg agaagaggcg 1260
ttacaactgg caaacgacac ggaatatggc ttaactgcca gtgtctggac gcaaaatctc 1320
tcccaggctc tggaatatag cgatcgctta caggcaggga cggtgtgggt aaacagccat 1380
accttaattg acgctaactt accgtttggt gggatgaagc agtcaggaac gggccgtgat 1440
tttggccccg actggctgga cggttggtgt gaaactaagt cggtgtgtgt acggtattaa 1500
<210> 3
<211> 549
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 3
gccccgatct ctaaggagga gctgactgag ctattagacc ttgccactaa agcgccttct 60
gcttggaacc ttcagcattg gcattttaca gtattccaca gcgatgaatc aaaagcggag 120
cttcttcctg tagcgtataa tcaaaaacaa atcgttgagt cttctgctgt tgttgccatt 180
ttaggcgatt taaaggcaaa tgaaaacggt gaagaagttt atgctgaatt agcaagccaa 240
ggctatatta cggatgaaat caaacaaaca ttgctcggcc aaatcaacgg tgcttaccaa 300
agcgagcaat tcgcacgtga ttccgctttc ttaaatgctt ctttagctgc tatgcagctt 360
atgattgccg caaaagcaaa aggttatgac acttgcgcaa tcggcggatt taacaaagag 420
cagttccaaa agcaatttga tatcagtgag cgctatgttc cggttatgct tatttcaatc 480
ggcaaagcag tgaagcctgc gcatcaaagc aaccgtctgc cgctttcaaa agtatcaact 540
tggctgtaa 549
<210> 4
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Arg Phe Phe Phe Glu Arg Leu His Gln
1 5 10 15
Leu Gln Val Asp Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ala
20 25 30
Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Asp Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn
35 40 45
Ala Asn Glu Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Val
50 55 60
Asn Pro Asn Gly Leu Ala Ala Leu Val Ser Thr Phe Gly Val Gly Glu
65 70 75 80
Leu Ser Leu Thr Asn Ala Ile Ala Gly Ser Tyr Ser Glu His Val Gly
85 90 95
Ile Ile Asn Leu Val Gly Val Pro Ser Ser Ser Ala Gln Ala Lys Gln
100 105 110
Leu Leu Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His
115 120 125
Arg Met Phe Lys Asn Ile Ser Gln Thr Ser Ala Phe Ile Ser Asp Pro
130 135 140
Asn Thr Ala Ala Ser Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Asp Ala Tyr Val
145 150 155 160
Tyr Gln Arg Pro Val Tyr Ile Gly Leu Pro Ser Asn Leu Val Asp Val
165 170 175
Lys Val Pro Lys Ser Leu Leu Asp Lys Lys Ile Asp Leu Ser Leu His
180 185 190
Pro Asn Glu Pro Glu Ser Gln Ala Glu Val Ile Glu Thr Val Glu Lys
195 200 205
Phe Ile Ser Glu Ala Ser Asn Pro Val Ile Leu Val Asp Ala Cys Ala
210 215 220
Ile Arg His Asn Cys Leu Lys Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Glu Thr
225 230 235 240
Gln Phe Pro Val Phe Thr Thr Pro Met Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu
245 250 255
Ser Asn Pro Arg Phe Gly Gly Val Tyr Val Gly Ser Leu Ser Ser Pro
260 265 270
Asp Val Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Val Leu Ser Val Gly
275 280 285
Ala Met Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ala Phe Ser Tyr Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Arg Asn Val Val Glu Phe His Ser Asp Tyr Thr Lys Ile Arg Gln
305 310 315 320
Ala Thr Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Glu Ala Leu Gln Val Leu Leu
325 330 335
Lys Thr Val Lys Lys Ser Val Asn Pro Lys Tyr Val Pro Ala Pro Val
340 345 350
Pro Ala Thr Lys Ala Ile Thr Thr Pro Gly Asn Asn Asp Pro Val Ser
355 360 365
Gln Glu Tyr Leu Trp Arg Lys Val Ser Asp Trp Phe Gln Glu Gly Asp
370 375 380
Val Ile Ile Ser Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Val Gln Ser
385 390 395 400
Lys Phe Pro Lys Asn Ala Ile Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser
405 410 415
Ile Gly Tyr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Met Ala Ala Gln
420 425 430
Glu Ile Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Thr Gly Asp Gly Ser
435 440 445
Leu Gln Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Cys Lys Trp Asp Cys
450 455 460
Tyr Asn Thr Tyr Leu Tyr Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu
465 470 475 480
Arg Leu Ile His Gly Glu Lys Ala Gln Tyr Asn Asp Ile Gln Pro Trp
485 490 495
Asn Asn Leu Gln Leu Leu Pro Leu Phe Asn Ala Lys Lys Tyr Glu Thr
500 505 510
Lys Arg Ile Ser Thr Val Gly Glu Leu Asn Asp Leu Phe Thr Asn Lys
515 520 525
Glu Phe Ala Val Pro Asp Arg Ile Arg Met Val Glu Ile Met Leu Pro
530 535 540
Val Met Asp Ala Pro Ala Asn Leu Val Ala Gln Ala Lys Gln Ser Ala
545 550 555 560
Ala Thr Asn Ala Ala Gln Glu
565
<210> 5
<211> 499
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 5
Met Thr Glu Pro His Val Ala Val Leu Ser Gln Val Gln Gln Phe Leu
1 5 10 15
Asp Arg Gln His Gly Leu Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gln
20 25 30
Ser Glu Lys Arg Leu Ala Ile Phe Asp Pro Ala Thr Gly Gln Glu Ile
35 40 45
Ala Ser Thr Ala Asp Ala Asn Glu Ala Asp Val Asp Asn Ala Val Met
50 55 60
Ser Ala Trp Arg Ala Phe Val Ser Arg Arg Trp Ala Gly Arg Leu Pro
65 70 75 80
Ala Glu Arg Glu Arg Ile Leu Leu Arg Phe Ala Asp Leu Val Glu Gln
85 90 95
His Ser Glu Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Glu Gln Gly Lys Ser
100 105 110
Ile Ala Ile Ser Arg Ala Phe Glu Val Gly Cys Thr Leu Asn Trp Met
115 120 125
Arg Tyr Thr Ala Gly Leu Thr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Thr Leu Asp
130 135 140
Leu Ser Ile Pro Leu Pro Gln Gly Ala Arg Tyr Gln Ala Trp Thr Arg
145 150 155 160
Lys Glu Pro Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro
165 170 175
Leu Met Ile Gly Met Trp Lys Val Met Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys
180 185 190
Ser Ile Val Ile Lys Pro Ser Glu Thr Thr Pro Leu Thr Met Leu Arg
195 200 205
Val Ala Glu Leu Ala Ser Glu Ala Gly Ile Pro Asp Gly Val Phe Asn
210 215 220
Val Val Thr Gly Ser Gly Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Thr Ser His
225 230 235 240
Pro His Val Ala Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Lys
245 250 255
Gly Ile Ala Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Arg Val Thr Leu Glu
260 265 270
Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ala Ile Val Leu Lys Asp Ala Asp Pro Gln
275 280 285
Trp Val Ile Glu Gly Leu Met Thr Gly Ser Phe Leu Asn Gln Gly Gln
290 295 300
Val Cys Ala Ala Ser Ser Arg Ile Tyr Ile Glu Ala Pro Leu Phe Asp
305 310 315 320
Thr Leu Val Ser Gly Phe Glu Gln Ala Val Lys Ser Leu Gln Val Gly
325 330 335
Pro Gly Met Ser Pro Val Ala Gln Ile Asn Pro Leu Val Ser Arg Ala
340 345 350
His Cys Asp Lys Val Cys Ser Phe Leu Asp Asp Ala Gln Ala Gln Gln
355 360 365
Ala Glu Leu Ile Arg Gly Ser Asn Gly Pro Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr
370 375 380
Val Ala Pro Thr Leu Val Val Asn Pro Asp Ala Lys Leu Arg Leu Thr
385 390 395 400
Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Val Asn Leu Val Arg Val Ala Asp
405 410 415
Gly Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Asn Asp Thr Glu Tyr Gly Leu Thr
420 425 430
Ala Ser Val Trp Thr Gln Asn Leu Ser Gln Ala Leu Glu Tyr Ser Asp
435 440 445
Arg Leu Gln Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Ser His Thr Leu Ile Asp
450 455 460
Ala Asn Leu Pro Phe Gly Gly Met Lys Gln Ser Gly Thr Gly Arg Asp
465 470 475 480
Phe Gly Pro Asp Trp Leu Asp Gly Trp Cys Glu Thr Lys Ser Val Cys
485 490 495
Val Arg Tyr
<210> 6
<211> 202
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 6
Met Thr Asn Thr Leu Asp Val Leu Lys Ala Arg Ala Ser Val Lys Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Thr Asn Ala Pro Ile Ser Lys Glu Glu Leu Thr Glu Leu Leu
20 25 30
Asp Leu Ala Thr Lys Ala Pro Ser Ala Trp Asn Leu Gln His Trp His
35 40 45
Phe Thr Val Phe His Ser Asp Glu Ser Lys Ala Glu Leu Leu Pro Val
50 55 60
Ala Tyr Asn Gln Lys Gln Ile Val Glu Ser Ser Ala Val Val Ala Ile
65 70 75 80
Leu Gly Asp Leu Lys Ala Asn Glu Asn Gly Glu Glu Val Tyr Ala Glu
85 90 95
Leu Ala Ser Gln Gly Tyr Ile Thr Asp Glu Ile Lys Gln Thr Leu Leu
100 105 110
Gly Gln Ile Asn Gly Ala Tyr Gln Ser Glu Gln Phe Ala Arg Asp Ser
115 120 125
Ala Phe Leu Asn Ala Ser Leu Ala Ala Met Gln Leu Met Ile Ala Ala
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Tyr Asp Thr Cys Ala Ile Gly Gly Phe Asn Lys Glu
145 150 155 160
Gln Phe Gln Lys Gln Phe Asp Ile Ser Glu Arg Tyr Val Pro Val Met
165 170 175
Leu Ile Ser Ile Gly Lys Ala Val Lys Pro Ala His Gln Ser Asn Arg
180 185 190
Leu Pro Leu Ser Lys Val Ser Thr Trp Leu
195 200
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgggatccaa tgacagagcc gcatgta 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgcgtcgac ttaataccgt acacacaccg a 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaagatcta atgacgaata ctctggatgt tt 32
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccgctcgagt tacagccaag ttgatacttt t 31

Claims (10)

1.一种生产对羟基扁桃酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主，双质粒表达系统表达丙酮酸脱羧酶、苯乙醛脱氢酶和NADH氧化酶，所述双质粒为pETDuet-1质粒和pRSFDuet-1质粒。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述pETDuet-1质粒用于表达苯乙醛脱氢酶、NADH氧化酶，所述pRSFDuet-1质粒用于表达丙酮酸脱羧酶。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶选自热带假丝酵母（Candida tropicalis），所述苯乙醛脱氢酶选自大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655，所述NADH氧化酶选自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。
5.一种转化对羟基苯甲醛和乙醛酸生成对羟基扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-4任一所述的重组菌将对羟基苯甲醛和乙醛酸转化为对羟基扁桃酸，并偶联辅酶再生系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统以NADH为底物，通过NADH氧化酶将NADH转化为NAD+。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化的条件是：pH 6~8，转化温度为30~37℃，转化时间20~24 h。
8.根据权利要求5所述的方法，所述对羟基苯甲醛的初始反应浓度为5～30mM，对羟基苯甲醛与乙醛酸的比例为1：1~2。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，用所述重组菌的湿细胞进行转化；所述转化体系中添加了Mg2+、TPP和NAD+。
10.权利要求1-4任一所述的重组菌在制药或化工领域中生成对羟基扁桃酸的应用。
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