CN104099379B - 一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用，属于生物工程技术领域。该发明在大肠杆菌中建立了一种生物合成酪醇的方法：以酪氨酸或葡萄糖为底物，经大肠杆菌编码的解氨酶催化生成4‑羟苯基丙酮酸；在酵母菌4‑羟苯基丙酮酸脱羧酶作用下生成4‑羟苯基乙醛；4‑羟苯基乙醛经乙醇脱氢酶催化生成酪醇。同时敲除大肠杆菌的苯乙醛脱氢酶基因，阻断4‑羟苯基乙醛向4‑羟苯基乙酸的转化通路，促进4‑羟苯基乙醛的积累及向酪醇的转化。本发明提供了一个新的酪醇生产途径，为酪醇的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及在大肠杆菌中生物合成酪醇的途径构建的方法及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
本发明所生物合成的酪醇具有以下特征。英文名Tyrosol，化学名称4-(2-Hydroxyethyl)phenol，别名p-Hydroxyphenethyl alcohol、2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol以及4-Hydroxyphenylethanol，分子式C8H10O2，分子量138.164，CAS号501-94-0，结构式
酪醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。酪醇可用来制备倍他索洛尔和美托洛尔，此类药物能治疗高血压、绞痛、心衰竭和青光眼；酪醇还有可能作为羟基酪醇的前体，羟基酪醇具有防治某些癌症并促进癌症后期恢复和提高化疗效果以及有效降低和抑制吸烟对人体的伤害等功能；酪醇经糖基转移酶催化生成的红景天苷，可治疗多种疾病，具有极高的药用价值。酪醇本身也具有生物活性如预防心血管疾病、骨质减少、色素沉积及抗敏活性等。酪醇最初来源于橄榄油，但是由于其在橄榄油中浓度低(25mg/kg)等问题提取过程难以实现工业化。由于工业需求，目前酪醇主要由化学合成，但其过程繁琐，污染环境。
大肠杆菌(Eschericher coli)是基因工程中常用的宿主菌，因其遗传背景清楚，目的基因表达水平高，技术操作、培养条件简单，抗污染能力强以及便于大规模发酵等优点，许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达。2012年，Satoh等人在大肠杆菌中建立了生物合成酪醇的途径(SatohY，Tajima K，Munekata M，Keasling J.D，LeeT.Engineering of a tyrosol-producing pathway，utilizing simple sugar andcentral metabolic tyrosine，in Escherichia coli.Journal of agricultural andfood chemistry，2012，60(4)：979-984)，在该途径中他们分别在大肠杆菌中异源表达了Papaver somniferum的tyrosine decarboxylase(GenBank收录号U08598)和Micrococcusluteus的tyramine oxidase(GenBank收录号AB010716)，建立了酪氨酸脱羧生成酪胺，酪胺被氧化生成4-羟苯基乙醛(4HPAA)，4HPAA脱氢生成酪醇的途径，如图1虚线框中所示。Satoh等改造过的工程菌株在以1％葡萄糖作为碳源的培养基中振荡培养48小时后可合成0.5mM(69mg/L)的酪醇。
以上途径中需要异源表达两个基因，本发明所涉及的在大肠杆菌中生物合成酪醇的途径，利用大肠杆菌本身合成的4-羟苯基丙酮酸，引入酵母菌的4-羟苯基丙酮酸脱羧酶将其转化为4HPAA，4HPAA在大肠杆菌本身的脱氢酶作用下生成酪醇，该途径在国内外都是首次报道。
发明内容
一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法。该方法以酪氨酸或葡萄糖为底物，在大肠杆菌自身编码的解氨酶催化下转化为4-羟苯基丙酮酸，经酵母菌4-羟苯基脱羧酶催化生成4-羟苯基乙醛，进一步经大肠杆菌编码的脱氢酶催化生成酪醇。因在大肠杆菌中存在苯乙醛脱氢酶，能将4-羟苯基乙醛转化为4-羟苯基乙酸，故利用λRed重组系统将苯乙醛脱氢酶编码基因FeaB敲除，阻断该途径，促进4-羟苯基乙醛的积累及向酪醇的转化。
本发明的技术方案：一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法，具体途径如图1实线框所示。简述如下：
(1)酵母菌4-羟苯基脱羧酶基因克隆及大肠杆菌表达载体构建
以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组DNA为模板，PCR克隆4-羟苯基脱羧酶基因ARO10，连入大肠杆菌表达载体pTrcHisB，构建成pTrcHisB-ARO10。
(2)苯乙醛脱氢酶基因敲除
利用λRed重组系统敲除大肠杆菌MG1655苯乙醛脱氢酶基因FeaB，该基因敲除菌株命名为MG1655f。
(3)重组大肠杆菌发酵生产酪醇
将构建好的表达载体pTrcHisB-ARO10转化上述已敲除FeaB基因的大肠杆菌MG1655f，命名为MG1655fA；同时将空载体pTrcHisB转化大肠杆菌MG1655f，命名为MG1655fCK，作为对照菌株。
以酪氨酸或葡萄糖为底物，发酵生产酪醇。具体发酵条件详见实施例3重组菌株的发酵培养。
(4)酪醇检测
将发酵液离心，收集上清，利用超低温冷冻干燥浓缩。通过安捷伦高效液相色谱仪对发酵产物进行分析。并与酪醇标准品对比。LC-MS分析验证。在重组菌株MG1655fA中可检测到酪醇的生产。
本发明的有益效果
本发明所涉及的在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法，提供了一个以酪氨酸或葡萄糖为底物发酵生产酪醇的新途径，为酪醇的大规模工业生产奠定了基础，也为以酪醇为原料生产下游产物如红景天苷等提供了新的思路和案例参考，具有重要的经济价值和社会效益。
附图说明：
图1以酪氨酸或葡萄糖为底物生产酪醇途径示意图；
图2FeaB敲除菌株PCR验证电泳图；
图3PCR扩增酵母菌ARO10的电泳图；
图4表达质粒pTrcARO10的SacI/NcoI双酶切电泳图；
图5pTrcARO10转化菌株MG1655fA的PCR验证电泳图；
图6发酵产物的HPLC分析结果；
图7发酵产物的LC-MS分析图谱。
具体实施方式
下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的技术范围并不限于所列出的几个实施例，在不改变其要点的前提下可做各种改变进行实施。本发明的技术范围涉及均等的范围。
实施例1大肠杆菌苯乙醛脱氢酶编码基因FeaB的敲除
(1)大肠杆菌MG1655，质粒pKD46(温度敏感型，含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet和gam基因，Ampr)、pKD4(含有两端带有FRT位点的卡那抗性基因，Kanr)、pCP20(温度敏感型，编码能够识别FRT位点的FLP重组酶，Ampr)均由本实验室保存。
(2)引物设计与合成：根据GenBank中FeaB和质粒pKD4中的Kan基因序列信息，设计引物并由深圳华大基因科技有限公司合成，引物序列见表1，其中下划线部分为同源臂序列。引物FeaB-5FPL/FeaB-3RPL用于扩增Kan基因以替换FeaB基因编码区；引物MG1655-5FP/MG1655-3RP为FeaB基因敲除后重组菌鉴定引物，两条引物各位于打靶序列区的左右两侧。
表1
反应体系为：
反应程序为：初始变性98℃30sec；98℃8sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；终延伸72℃10min。
(3)将过夜培养12h的含有pKD46的大肠杆菌MG1655按1∶100的量接种，振荡培养至OD600值约为0.2，加入终浓度为100mmol/L的阿拉伯糖继续培养至OD600为0.5-0.6。制备电转感受态，取50μL感受态菌液与约200ng的打靶分子DNA片段进行电转化。电击后立即加入1mL LB液体培养液，37℃，振荡培养2h，涂布于LB平板(Kanr)筛选阳性克隆。随后第二轮体内重组过程中，将编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20转入FeaB敲除菌株，中，将Kan抗性基因剔除。然后37℃培养，丢掉pCP20。得到FeaB基因敲除的大肠杆菌MG1655f。
利用引物MG1655-5FP/MG1655-3RP进行PCR验证，如图2所示，得到FeaB缺失的菌株MG1655f。
实施例2酵母菌4-羟苯基丙酮酸脱羧酶编码基因ARO10的扩增及表达载体构建和转化
(1)根据NCBI中提供的酵母菌4-羟苯基丙酮酸脱羧酶编码基因ARO10的基因序列，设计引物ARO10-5FP和ARO10-3RP，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组DNA为模板进行PCR，扩增得到ARO10的ORF，如图3所示。引物序列如下(下划线示酶切位点)：
反应体系：
反应程序：初始变性98℃30sec；98℃8sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；终延伸72℃10min。
(2)将步骤(1)扩增得到的ARO10和质粒pTrcHisB分别经SacI和NcoI酶切，回收，将酶切后的ARO10连入pTrcHisB，得ARO10表达质粒pTrcARO10。用SacI和NcoI双酶切pTrcARO10表明质粒构建正确，如图4所示。测序结果表明所用ARO10与GenBank一致。
(3)将步骤(2)得到的表达质粒pTrcARO10转入实施例1中得到的FeaB缺失的大肠杆菌MG1655f，通过抗性筛选到阳性克隆，并利用引物ARO10-5FP和ARO10-3RP进行了PCR验证，如图5所示，得到表达ARO10的重组菌株MG1655fA。同时将空载体pTrcHisB转入MG1655f，构建得到对照菌株MG1655fCK。
实施例3重组菌株的发酵培养
摇瓶发酵：重组菌株在2mL LB培养基中37℃培养过夜，之后按1％的接种量转接入50mL新鲜LB培养基37℃培养至OD600约为0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，30℃培养5小时后收集细胞，将细胞用M9Y(M9培养基添加0.125％Yeast extract)，洗一次后悬浮在50mL加入含1％葡萄糖的M9Y培养基中30℃继续培养20个小时。共三组样品，MG1655fCK(对照组)、MG1655fA+T(实验组，饲喂1mM酪氨酸)、MG1655fA(实验组，不饲喂酪氨酸)。M9Y培养基具体配方如下：
实施例4酪醇的检测
(1)将实施例3最终的发酵液离心，收集上清，利用超低温冷冻干燥浓缩。通过安捷伦高效液相色谱仪对发酵产物进行分析，结果见图6。与转入空载体pTrcHisB的对照菌株MG1655fCK相比，转入pTrcARO10的重组菌株MG1655fA+T及MG1655fA在22min时出现一个新峰(箭头所示)，并与酪醇标准品的出峰时间一致。
(2)对步骤(1)中看到的新峰进行LC-MS分析，结果见附图7。该峰的MS图谱上有酪醇MS的特征峰121.07，表明步骤(1)中看到的新峰是目标产物酪醇。
(3)定量分析表明酪醇的产量MG1655fA+T约为155mg/L，MG1655fA约为125mg/L。
Claims (3)
1.一种利用大肠杆菌生物合成酪醇的方法，该方法在大肠杆菌中建立一条新的酪醇合成通路：以酪氨酸和葡萄糖或者葡萄糖为底物，在大肠杆菌自身转氨酶催化下，生成4-羟苯基丙酮酸；在酵母菌4-羟苯基丙酮酸脱羧酶作用下生成4-羟苯基乙醛；进一步经大肠杆菌自身乙醇脱氢酶的催化生成酪醇，并阻断4-羟苯基乙醛生成4-羟苯基乙酸通路，促进4-羟苯基乙醛的积累及向酪醇的转化。
2.如权利要求1的方法在酪醇合成及利用该方法在酪醇下游产物合成中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述下游产物为红景天苷。
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