JP2726275B2 - グリコサミノグリカン分解酵素の精製法 - Google Patents

グリコサミノグリカン分解酵素の精製法

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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グリコサミノグリカンを分解するリアー
ゼ、グリクロニダーゼ、スルファターゼ等を精製する方
法に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） リアーゼとは、例えば微生物が産生するコンドロイチ
ン硫酸リアーゼ、デルマタン硫酸リアーゼ、ヘパラン硫
酸リアーゼなど硫酸化グリコサミノグリクロナンのヘキ
ソサミニド結合に作用してグリコサミノグリカン（以
下、GAGと略する）を分解する酵素を指す。
グリクロニダーゼとは、上記リアーゼがGAGに作用し
て生成した切断部位の非還元末端不飽和糖鎖のウロン酸
を切りはなす酵素を指す。
スルファターゼとは、上記リアーゼ及びグリクロニダ
ーゼが作用して生成した分解物の硫酸基を切りはなす酵
素を指す。
また、不溶性硫酸化多糖類とは、セルロース、デキス
トラン、キシラン、マンナン、アミロース、キチンなど
高分子多糖類の水性溶媒に不溶な糖類、あるいは水可溶
性多糖類を架橋して不溶化した糖類に対し、その糖鎖の
水酸基に硫酸基を導入したものを指す。
従来、グリコサミノグリカン分解酵素産生菌を培養し
た微生物の菌体内あるいは培地には、ほとんどの場合に
多糖類GAG分解酵素、たとえばリアーゼ、グリクロニダ
ーゼ、スルファターゼなどが産生されている。これらの
酵素を用いて糖鎖構造を分析をする際、酵素の精製が不
十分であると、その分析結果の判定に重大な誤りを生ず
る場合がある。このため、各々の酵素は互いに混入がな
いように夫々精製しておく必要がある。しかし一方、夫
々の酵素は糖鎖の分析過程においていずれも重要な役割
を果たす有用な酵素であるため、いかにこれらの酵素を
夫々高純度に効率よく回収できるかが従来からの課題と
なっている。
今までに精製法が検討されてきている微生物由来のGA
G分解酵素のリアーゼ類は、ほとんどハイドロキシアパ
タイトカラムによりその比活性を著しく上昇させること
ができた。
しかし、リアーゼ類とスルファターゼ又はグリクロニ
ダーゼとの分離は多くの場合不十分であり、イオン効果
クロマトグラフ法やゲル過法などの工程を加える必要
があった。しかし、これらの方法を重ねても分離の不十
分な酵素類、例えばフラボバクテリウム・ヘパリナム由
来のヘパリナーゼとスルファターゼ、あるいはヘパリチ
ナーゼとグリクロニダーゼなどがあり、これらの課題を
解決するため、ヘパリンあるいはデルマタン硫酸を固定
化したクロマトグラフ法などが報告されている（Carboh
ydrate Research 70 295,1979,同誌88 291,1981）。
この方法はGAGとGAG分解酵素の親和性を利用している
点で他のクロマトグラフ法より分解能は改良されている
が、酵素相互の分離はまだ完全ではなく、またGAG分解
酵素によるリガンドの減少やカラム再生操作の煩雑さな
どにも問題があった。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、これらの問題点を解決するため、微生
物由来のGAG分解酵素の各種担体に対する親和性を広く
検討した結果、これらの酵素類は、多糖類の糖鎖の水酸
基に硫酸基を導入した担体に対し、GAG類似体としての
親和性が認められること、また各酵素の親和性に差があ
るため塩濃度を種々変えることにより酵素類を極めて効
率良く分画できることを見出し、本発明を完成するに至
った。
即ち、本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素を不
溶性硫酸化多糖類担体に吸着・脱離させることを特徴と
するグリコサミノグリカン分解酵素の精製法である。
本発明に用いる不溶性硫酸化多糖類担体としては、市
販されている硫酸化セルロファン（生化学工業製）、セ
ファデックス（ファルマシア社製）やセファロース（フ
ァルマシア社製）などの市販多糖類クロマト基剤を硫酸
化したもの、あるいは可溶性多糖類をエピクロルヒドリ
ン等を用いて架橋して水不溶性とした後硫酸化を行なっ
たものなど、いずれを用いることもでき、その多糖類の
種類、不溶化法、又は硫酸化の方法によって、何ら制限
を受けるものではない。
硫酸化の方法としては、従来知られている方法、たと
えば多糖類をピリジン、クロロホルム、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中に懸濁し、ク
ロロスルホン酸、無水硫酸等の硫酸化剤及びその有機塩
基との複合体等の量や、反応温度、反応時間を選ぶこと
により、種々の硫酸化度の異なる硫酸化多糖類を得るこ
とができる。
これら不溶性硫酸化多糖類担体を用いて酵素を精製す
る方法としては、従来のイオン交換クロマトグラフ法に
用いられている一般的手法、バッジ法、カラムクロマト
グラフ法などが適用でき、これら担体に吸着・脱離させ
ることにより行なう。使用する緩衝液としては、酢酸緩
衝液、燐酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など通常pH5.0〜
9.5の範囲で操作できる緩衝液が用いられるが、その種
類を選択することにより酵素の分離パターンを種々変化
させることも可能である。
（実施例） 以下に不溶性硫酸化多糖類の製造例及びこれを担体と
して用いたグリコサミノグリカン分解酵素の精製法の実
施例を示す。
製造例 セファデックスＧ−50（ファルマシア製）5gをホルム
アミド100mlに懸濁し、この液に予め冷却したクロロス
ルホン酸2.5mlを含むホルムアミド溶液100mlを添加し
た。この混液を攪拌しつつ30℃に５時間保持した後、約
200mlの氷水を添加し、2M炭酸ナトリウム溶液を滴下し
てpHを7.0とした。この液をグラスフィルターを用いて
過し、よく冷水で洗浄して硫酸化セファデックスを得
た。一部をエタノールで脱水後、乾燥し、得られた乾燥
物中に含まれる硫酸基の含有量は0.8％であった。
以下の実施例における酵素活性測定法は次の通りであ
る。
ａ）ヘパリナーゼ活性測定法：ブタ腸粘膜ヘパリン溶液
（10mg/ml）25μｌ、酵素液25μｌ及び2mM酢酸カルシウ
ムを含む20mM酢酸緩衝液（pH7.0）50μｌを混ぜ、37℃
で10分間反応させる。反応終了時、0.06N塩酸500μｌを
加え、232nmの吸収増大を測定する。活性力価は１分間
に１μモルの不飽和ウロン酸を形成させる酵素量を１単
位とする。
ｂ）ヘパリチナーゼ（ヘパリン硫酸リアーゼ）活性測定
法：基質としてヘパラン硫酸を用い、その他はヘパリナ
ーゼ測定法に同じ。
ｃ）２−スルファターゼ活性測定法：ΔDi−diSD（生化
学工業製）2.8mgを1mlのイミダゾール緩衝液（pH6.5）
に溶解し基質とする。この液10μｌに対し酵素液20μｌ
を加え、37℃で15分間反応後、100℃で１分加熱して反
応を停止する。この液20μｌを高速液体クロマトグラフ
ィーに負荷し、分解で生じるΔDi−6S量を232nm吸収で
測定する。活性力価は１分間に１μモルのΔDi−6Sの生
成量を１単位とする。
ｄ）グリクロニダーゼ活性測定法：ΔDi−6S（生化学工
業製）（2mg/ml）10μｌ、0.2Mトリス塩酸緩衝液pH7.5
を10μｌ及び酵素10μｌを加え、37℃で15分間反応さ
せ、次いで100℃で１分加熱して反応を停止する。この
液20μｌを高速液体クロマトグラフィーに負荷し、232n
mの吸収の低下量から活性を算出する。酵素力価は１分
当り１μモル相当の不飽和糖の分解量を１単位とする。
ｅ）コンドロイチナーゼABC及びコンドロ−４−スルフ
ァターゼの測定法:J.Biol.Chem.243 1523（1968）記載
の方法に準じて行う。
実施例１ ヘパリンを誘導剤として培養したフラボバクテリウム
・ヘパリナム菌体から得られた粗酵素抽出液の凍結乾燥
粉末を原料とした。この粉末5gを50mMリン酸緩衝液（pH
6.8）に溶解し、同緩衝液で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラム６×20cmに負荷した。カラムを2lの同緩
衝液で洗浄後、同緩衝液及びその0.5M食塩液各3lずつの
溶液による直線的濃度勾配法で溶出を行い、ヘパリンを
基質として活性を測定した。ヘパリナーゼの活性画分
（溶出食塩濃度約0.12M〜0.2M）を集め、限外過膜を
用い脱塩濃縮し、続いて50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）で洗浄した後100mlとした。この液に同緩衝液で平衡
化した硫酸化セファデックスＧ−50の20g（湿重量）を
加え、５℃で１時間ゆっくり攪拌した後、２×10cmのカ
ラムに移し同溶媒で洗浄、２−スルファターゼを通過さ
せ、次いで0.2M食塩液で洗浄後、0.5M食塩液でヘパリナ
ーゼを溶出した。得られた活性画分を表に示す。
実施例２ 実施例１において、ハイドロキシアパタイトカラムか
らの溶出画分をヘパラン硫酸基質で追跡し、ヘパリチナ
ーゼ画分（食塩濃度約0.25〜0.32M）を集め、限外過
膜を用いて濃縮脱塩及び50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
2）で洗浄した。この液を同緩衝液で平衡化した硫酸化
セルファインカラム（2.2×30cm）に通した後、同緩衝
液で洗浄、次いで0.4M食塩を含む同緩衝液を終濃度とす
る直線的濃度勾配法で溶出を行った。
このヘパリチナーゼ画分のカラム負荷前の試料にはグ
リクロニダーゼが混入していたため、ΔDi−6Sを基質と
してその活性を追跡した。クロマトグラフィーの溶出パ
ターンを図１に示す。
このクロマトグラフィーによりヘパリチナーゼ及びグ
リクロニダーゼの比活性はクロマトグラフィー前に較べ
夫々６倍及び18倍上昇した。
実施例３ コンドロイチン硫酸を誘導剤としてプロテウス・ブル
ガリスの培養を行い、その菌体内からプロタミン処理、
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーを行った
後、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に対し透析し、部
分精製したコンドロイチナーゼABC溶液40mlを得た。こ
の液を硫酸化セルロファインカラム（2.2×22cm）に負
荷し、洗浄後、同緩衝液中で食塩濃度を０から0.4Mまで
上昇させてコンドロ−４−スルファターゼを除去し、コ
ンドロイチナーゼABCの比活性を約12倍上昇させた。ク
ロマトグラフィーの溶出パターンを図２に示す。
コンドロイチナーゼABCの活性収量及び比活性を下表
に示す。
（発明の効果） 本発明の精製法によれば、多種類の有用な酵素を夫々
効率的に分画精製できる。更に、従来のグリコサミノグ
リカン固定化担体を用いてGAGそのものを固定化したリ
ガンドは酵素分解を受けやすいのに対し、本発明の不溶
性硫酸化多糖類担体は安定であり、カラムは塩を洗うだ
けで容易に再生可能であり、且つ担体は非常に廉価であ
るため多量に使用することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例２のクロマトグラフィーの溶出パターン
を示し、図２は、実施例３のクロマトグラフィーの溶出
パターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グリコサミノグリカン分解酵素を不溶性硫
    酸化多糖類担体に吸着・脱離させることを特徴とするグ
    リコサミノグリカン分解酵素の精製法。
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