KR950012901B1

KR950012901B1 - 스트렙토키나제 유전자 및 그의 발현

Info

Publication number: KR950012901B1
Application number: KR1019920017406A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 박영우
Original assignee: 주식회사엘지화학; 최근선
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1995-10-23
Also published as: KR940007184A

Abstract

내용 없음.

Description

스트렙토키나제 유전자 및 그의 발현

제 1 도는 본 발명의 스트렙토키나제 유전자의 염기서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열이고,

제 2 도는 본 발명의 스트렙토키나제 유전자로부터 유추된 아미노산 서열을 기존의 다른 스트렙토키나제와 비교하여 나타낸 것이며,

제 3 도는 스트렙토키나제 유전자의 클로닝 과정을 도시한 것이고,

제 4 도는 스트렙토키나제 발현벡터의 변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기연동한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 신규한 스트렙토키나제 유전자 및 그의 발현에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 용혈성 스트렙토코커스 H46(ATCC35556)으로부터 클로닝된 신규한 스트렙토키나제 유전자와 이를 함유하는 대장균용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 이 미생물을 배양하여서 스트렙토키나제를 생상하는 방법에 관한 것이다.

스트렙토키나제(streptokinase)는 용혈성 스트렙토코커스(Streptococcus)에 의해서 생성되어 분비되는 분자량 약 47000달톤의 단백질이다. 스크렙토키나제는 혈전용해 물질로서 혈액중에 존재하는 플라스미노젠(plasminogen)과 특이적으로 결합하여, 이 결합된 스트렙토키나제-플라스미노젠이 비결함된 플라스미노젠을 효소학적으로 활성도를 갖는 플라스민(plasmin)으로 변형시킨다. 플라스민은 일종의 세린 프로테아제(serine protease)로서 혈전을 구성하고 있는 피브린 망(fibrin network)을 분해하는 기능을 갖고 있다(Christensen, L. R., J. Gen. Physiol. 28, 363-383(1945) ; Castellino, F. T., Trends Biochem. Sci. 4, 1-5(1975)). 따라서, 스트렙토키나제는 혈전을 용해시키는데 중요한 역할을 하는 물질로 혈전에 의해서 일어나는 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.

스트렙토키나제는 여러 종류의 병독성 스트렙토코커스군에 의해서 생성되는데 이들의 염기서열은 서로 동일하지 않은 것으로 보고되고 있다(Huang et al., Infect. Immun. 57, 502-506(1989) ; Huang et al., Mol. Microbiol. 3, 197-205(1989) ; Walter et al., Nuc1. Acids Res. 17, 1262(1989)). 스트렙토카나제의 효소학적 활성도는 혈전을 용해할 수 있는 단백질을 발견한 틸레트등(Ti1let et al., J. Exp. Med. 58, 485-502(1933))에 의해서 1933년에 최초로 보고되었으며, 1982년에 전체 아미노산 서열이 밝혀졌다(Jackson, K. W. et al., Biochemistry 21, 6620-6625(1982)). 스트렙토키나제의 유전자는 말크(Malke)등에 의해서 스트렙토코커스의 염색체로부터 클로닝되었으며, 대장균에서 이종 단백질과 융합단백질로 발현되었다(Malke, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3557-3561(1984)).

스트렙토키나제는 이미 여러나라에서 트롬빈 용해물질(thrombolytic agent)로 임상에서 사용되고 있으나, 스트렙토코커스에서 추출된 스트렙토키나제는 인체내에서 독성을 나타내거나 독성이 있는 것으로 알려진 많은 불순물이 섞여 있기 때문에 정제 및 추출 과정에 상당한 어려움이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과, 유전 공학적인 방법에 따라 기존의 스트렙토키나제 유전자와 다른 새로운 스트렙토키나제 유전자를 클로닝하고, 더 나아가 이 새로운 스트렙토키나제 유전자를 대장균 세포에서 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였으며 이를 이용하여 대장균내에서 새로운 유전자를 발현시킴으로써 스트렙토키나제를 대량 제조할 수 있게 되었다.

즉, 본 발명은 스트렙토코커스 H46(ATCC 35556)으로서부터 클로닝된 새로운 스트렙토키나제의 유전자, 이 새로운 유전자를 대장균에서 발현시키기 위한 대장균용 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 이용하여 스트렙토키나제를 대량 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

스트렙토코커스 H46(ATCC 35556)으로부터 새로운 스트렙토키나제를 클로닝하기까지의 과정은 다음과같다.

50ml의 브레인 하트 인퓨젼(brain heart infusion) 배지에서 정지 배양한 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococus equisimilis, Lancefield's Group C, ATCC 35556)를 뮤타놀리신(Mutanolysin, Sigma, Cat. #M9901, Siegal et al., lnfect. Immun. 31, 808(1981))을 첨가하여 37℃에서 30분이상 반응시킨 후 5분동안 16,000×G에서 원심분리하여 새로 침전물을 얻었다. 그런다음, 침전물을 5ml의 TE완충용액(1mM트리스-Cl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 잘 녹인 후 0.5ml의 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 0.25ml의 10% 나트륨도데실설페이트(SDS)를 첨가하여 65℃에서 30분간 반응시키고, 1ml의 5M 칼륨아세테이트를 넣어 주고 1시간 동안 얼음속에서 반응시킨 다음 25분간 20,000×G에서 원심분리하였다. 그 상층액을 분리한 후 전체 헥산을 에탄올로 침전시켰다. 침전물을 건조시킨 후 5ml의 TE완충용액에 재 용해시키고 20μl의 RNase I (10mg/ml, BEL, U.S.A.)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그후 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올(25 : 24 : 1, v/v/v)로 두번 반복 추출한 뒤 상등액을 취하여 2 부피의 에탄올을 첨가하여 전헥산을 침전시켰다.

기존에 발표된 스트렙토키나제 전체 아미노산 서열(Jackson, K. W. et al., Biochemistry 21. 6620-6625(1982))에 대한 정보를 토대로 스트렙토키나제의 아니노말단의 6개 아미노산과 카르복시 말단의 6개 아미노산에 대응될 수 있는 두개의 시발체, SKND(5'-AAACATATGAT(T/C/A)GCNCCNGA(A/G)TGG-3')와 SKSL(5'-AAAAGTCGACATCATT(C/T)TT(G/A)TC(G/A)TCNGG(G/A)TT(G/A)TC-3')를 고안, 합성한 후 이 시발체를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, Saiki et al., Science 230, l350(1985))을 이용하여 스트렙토코커스와 전헥산으로부터 전체 스트렙토키나제 유전자의 증폭을 수행하였다. 상기 중합효소 연쇄 반응은 퍼킨-앨머 시터스사의 온도 순환기(Thermal Cycler, Perkin-Elmer Cetus, U.S.A.) 를 이용하여 95℃에 서 1분→55℃에서 1분→75℃에서 2분간의 순환을 30회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간을 추가하는 조건에서 실시하였다. 증폭된 약 1.25Kb 염기쌍의 헥산을 전기영동을 통해 확인하였으며, 이를 생거의 디데옥시 염기서열 결정방법(Sangerer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463(1977))으로 염기서열을 결정하고, 이를 제 1 도에 나타내었다. 제 1 도의 염기서열을 갖는 유전자를 이하 SKI 유전자라 한다. 한편 SKI 유전자로부터 유추된 아미노산 서열도 제 1 도에 함께 나타내었다.

제 1 도의 염기서열과 이로부터 유추된 아미노산 서열은 지금까지 밝혀진 3개의 스트렙토키나제 유전자 SKC, SKG 및 SKA(Malke, H. et a1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3557-3561(1984) ; Nucl. Acid Res. 17, 1262(1989); Nucl. Acid Res. 17, 1263(1989))와 염기서열의 경우 92.2% 내지 98.8%, 아미노산 서열의 경우 89.6% 내지 98.6%의 동질성을 나타내었다. 아미노산의 비교결과를 제 2 도에 나타내었다.

본 발명의 SKI 유전자의 염기서열은 상기의 클로닝 방법외에도 화학적 합성법, 예를들면 고체상 포스포아미다이트 케미스트리를 이용하는 DNA합성법등을 이용하여 제조할 수도 있다.

상기에서 얻어진 새로운 SKI 유전자를 발현시키기 위하여 여러가지 발현벡터를 이용할 수 있는데, 예를들면 trp 프로모터를 갖는 발현 벡터 ptrpB22H-HGH(KFCC-10667)를 이용할 수 있으며 벡터로의 클로닝과정은 하기의 방법을 포함하는 여러가지 방법이 있을 수 있다.

본 발명의 SKI 유전자를 발현 벡터로의 클로닝이 용이하도록 하기 위해 5' 말단에 제한효소 Nde I(5'-CATATG-3')과 3'말단에 제한효소 Sal I (5'-GTCGAC-3')을 갖도록 하며, 제한효소 Nde I의 인식부위내에 시작 코돈인 ATG가 존재하고 본 발명에서 하나의 예로서 사용한 발현 벡터 ptrp 322H-HGH(KFCC-10667)의 Nde I의 상류쪽에는 ATG가 존재하지 않기 때문에 mRNA로부터의 해독은 반드시 Nde I의 ATG부터 시작하게 된다.

상기의 헥산을 먼저 제한효소 Nde I으로 200mM 트리스-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 칼륨 아세테이트, 10mM 디티오트레이톨(DTT), pH 7.0의 조건하에서 완전절단한 후 에탄올 침전시켜 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0의 조건하에서 SalI 으로 완전절단한다.

이어서 절단된 헥산 절편을 전기영동하고 젤로부터 헥산추출방법으로 추출한다. 한편으로, ptrp322H-HGH(KFCC-10667)를 제한효소 Pst I과 Sal I으로 완전절단한 후 에탄올 침전시키는 한편, ptrp322H-HGH(KFCC-10667)을 동일 조건하에서 제한 효소 Pst I과 Nde I으로 완전절단한 후 에탄올 침전하여 0.8Kb와 1.5Kb의 단편을 각각 분리 정제한다. 이어서 상기의 3개의 단편을 접합시켜 SKI 발현벡터 ptrpH-SK를 제조하였다. 이 과정을 제 3 도에 도시하였다.

본 출원인은 이 SKI 발현벡터 ptrpH-SK가 포함된 대장균(대장균 W3110, ptrp-SK)을 아메라칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 1991년 12월 18일자로 기탁번호 ATCC 68884로 기탁하였다.

이러한 발현벡터 ptrpH-SK는 적당한 대장균에 형질전환시킨 후 Mp 액체배지 또는 이와 유사한 배지에서 배양하여 SKI 유전자의 발현을 유도하여 스트렙토키나제를 대량으로 발현시킬 수 있다. 스트렙토키나제의 발현을 유도하는 방법은 trp 작동 유전자의 특성을 이용하여 인돌아크릴산(IAA)을 이용하여 인위적으로 유도하는 방법과 IAA의 첨가없이 자동 유도하는 방법을 사용할 수 있다. 특히 자동유도 방법은 IAA의 첨가가 생략되기 때문에 생산원가의 절감에 큰 기여를 할 수 있다. 이와 같이 유전공학적으로 대장균을 이용하여 대량 발현시킴으로써 스트렙토키나제를 저렴하게 대량으로 쉽게 확보할 수 있게 되었다.

본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다. 다음의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고 발명의 범위를 제한하지 않는다.

아래 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

제한 효소로 DNA의 절단

사용된 제한효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabe,Inc. MA, USA)로부터 구매하였으며, 멸균된 1.5ml 용량의 에펜돌프튜브에서 보통 반응 부피가 50μl에서 100μl가 되도록하였으며 반응 온도는 37℃에서 1시간 내지 2시간 반응시켰고, 반응이 완료된 후에는 65℃에서 15분간 열처리하거나, 또는 내열성인 제한효소는 페놀 추출과 에탄올 침전법을 사용하였다. 10배 완충용액 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1 : 100mM 비스 트리스 프로판-HCl, 100mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨(DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 500mM NaC1,10mM(DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3 : 100mM 트리스-HCl, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl, 10mM(DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4 : 200mM 트리스-아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 칼륨 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2]

페놀 추출과 에탄올 침전

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한효소를 불활성화시키거나, 헥산을 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA용액으로 포화시켰다. 페놀 추출은 시료와 페놀을 1 : 1(부피/부피)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합시킨 후 원심분리(15000×G, 5분)시켜 상충액을 새 튜브로 옮긴 후, 동일 과정을 3회 반복하였다. 그런 다음, 상충액을 동일 부피의 클로로포름-이소부탄올(24 : 1(v/v))용액으로 추출하여 0.1부피의 3M 소디움아세테이트와 2.5부피 에탄올을 가하고 -70℃에서 30분간 혹은 -20℃에서 약 12시간 정치한 후 원심분리(15000rpm, 20분, 4℃)하여 헥산을 침전시켰다.

[참조예 3]

접합 반응

집합효소는 T4 DNA 리가제(T4 DNA 리가제, New England Biolabs, Inc.)와 10배 접합 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH 7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M DTT, 10mM ATP, 0.5mg/ml 소혈청알부민(BSA))을 사용하고 보통 20μl 부피에서 10단위체의 접합효소를 사용하였으며, 평활말단(blunt ends)을 갖는 DNA 집합은 100단위체의 접합 효소를 사용하였다. 반응조건은 보통 16℃에서 적어도 5시간 이상 또는 4℃에서 14시간 이상 반응시켰으며 반응이 완료된 후에 65℃에서 15분간 가열하여 접합효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

대장균 형질전환

대장균 숙주세포로는 HB101(ATCC 33694), 또는 W3110(ATCC 27325)을 사용하였다. 숙주세포를 100ml 액체 LB배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 효모추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 37℃에서 650nm에서의 광학밀도 값이 0.25에서 0.5에 달할때까지 배양한 후 원심 분리기로 세포들을 분리한 뒤 50ml 0.1M 염화 마그네슘(M9C1₂)을 가하여 세척한 후 다시 원심 분리하여 여기에 다시 50ml 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음 위에서 30분간 정치시켰다. 이들 세포를 다시 원심분리시켜 동일용액 5ml에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및, 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 형질변환은 위에서 얻은 0.2ml 세포에 접합반응액 10μl을 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨 후 42℃에서 1분동안 열처리 한 다음 2.0ml 액체 LB 배지를 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 50μg/ml 앰피실린을 함유하고 있는 고체 LB배지가 있는 페트리 디쉬에 도포한 후 37℃에서 밤새 배양하였다.

[실시예 1]

시발체의 제조

스티렙토키나제 유전자를 증폭하기 위한 시발체는 기존에 발표된 아미노산 서열(Jackson et al., Biochemistry 21, 6620-6625(1982))을 참조하여 다음과 같은 두 시발체를 고안하였다.

성숙형 스트렙토키나제의 아미노말단 부위 6개의 아미노산 서열은 이소루이신(Ile)-알라닌(Ala)-글리신(Gly)-프롤린(Pro)-글루탐산(Gln)-트립토판(Trp)을 갖고 있으며 이들의 아미노산에 대응되는 코돈들은 다음과 같다.

Ile : ATT, ATC, ATA

Ala : GCG, GCA, GCT, GCC

Gly : GGG, GGA, GGT, GGC

Pro : CCG, CCA, CCT, CCC

Glu : GAA, GAG

Trp : TGG

따라서 이들 아미노산 서열에 대응되는 DNA 염기서열은 다음과 같이 표기할 수 있다.

Ile……Ala-Gly-Pro-Glu……Trp : 아미노산 서열

5'-AT(T/C/A)GCN GGN CCN GA(A/G) TGG-3' : 윗 가닥 DNA서열

3'-TA(A/G/T) CGN CCN GAN CT(T/C) ACC5' : 아랫 가닥 DNA 서열

상기에서, X/Y는 X 또는 Y이고, X/Y/Z은 X,Y 또는 Z이다.

따라서 아미노 말단 시발체(SKND)는 상기의 DNA 염기서열의 윗 가닥과 클로닝을 용이하게 하기 위한 Nde I 인식부위를 갖고 있으며 그 염기서열은 다음과 같다. 시발체 SKND의 염기 서열은 5'-AAACATATGAT(T/C/A)GCNCCNGA(A/G)TGG-3'으로 여기서 N은 염기 G,A,T,C가 같은 농도로 혼합된 것을 의미하며, X/Y는 염기 X와 염기 Y가 같은 농도로 혼합되어 있는 것을 의미하며, X/Y/Z는 염기 X, 염기 Y 및 염기 Z가 같은 농도로 혼합되 있는 것을 의미한다.

한편, 카르복실말단의 6개의 아미노산 서열은 아스파르산(Asp) -아스파라진(Asn)-프롤린(Pro)-아스파르산(Asp)-아스파르산(Asp)-라이신(Lys)을 갖고 있으며 이들의 아미노산에 대응되는 코돈들은 다음과같다.

Asp : GAT, GAC

Asn : AAT, AAC

Pro : CCG, CCA, CCT, CCC

Lys : AAG, AAA

따라서 이들 아미노산 서열에 대응되는 DNA 염기서열은 다음과 같다.

Asp----Asn----Pro-Asp----Asp----Lys : 아미노산 서열

5'-GA(T/C) AA(T/C) CCN GA(T/C) GA(T/C) AA(A/G)-3' : 윗 가닥 DNA 서열

3'-CT(A/G) TT(A/G) GGN CT(A/G) CT(A/G) TT(T/C)-5' : 아랫 가닥 DNA 서열

상기에서, X/Y는 X 또는 Y를 의미한다.

따라서 C 말단 시발체(SKSL)는 상기의 DNA 염기서열의 아랫 가닥, 종료코돈 5'-TAG-3', 5'-TAA-3' 및 클로닝을 용이하게 하기 위한 Sal I인식부위를 갖고 있으며 그 염기서열은 다음과 같다. 시발체 SKSL의 염기서열은 3'-CT(A/G)TT(A/G)GGNCT(A/G)CT(A/G)TT(T/C)TTACTACAGCT-GAAAA-5'이다. 여기서 N은 염기 G,A,T,C가 같은 농도로 혼합된 것을 의미하며, X/Y는 염기 X와 염기 Y가 같은 농도로 혼합되어 있는 것을 의미한다.

위와 같이 고안된 시발체들은 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., 모뎀 380B, U. S.A.) 로 합성한 후, 변성 폴리아크릴아마이드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아마이드 : 비스(29 : 1, w/w), 50mM 트리스, 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리한 후 C18 컬럼인 SEP-PAK(WatersInc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세트니트릴 : 물(50 : 50) 혼합액으로 용출하여 순수 정제하였고, 260nm에서의 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[실시예 2]

전체 헥산 추출

50ml의 브레인 하트 인퓨젼 배지에서 정지 배양한 스트렙토고커스 에퀴시밀리스(Lancefield's Group C, ATCC 35556)를 원심분리 한 후, 침전된 세포에 뮤타놀리 신(Mutanolysin, Sigma, Cat. #M9901, Siegal et al., Infect. Immun, 31, 808(1981))을 첨가한 후 37℃에서 30분 이상 반응시켰다. 이후 5분 동안 16,000×G에서 원심분리하여 얻은 세로 침전물을 5ml의 TE 완충용액(lmM 트리스-C1, pH 7.5, 1mM EDTA)에 잘 녹인 후 0.5ml의 0.5M EDTA와 0.25ml의 10% SDS를 첨가하였다. 65℃에서 30분간 반응시킨 후 1ml의 5M 칼륨 아세테이트를 넣어주고 1시간 동안 얼음속에서 반응시켰다. 25분간 20,000×G에서 원심분리하여 상등액을 분리한 후 전체 헥산을 에탄올로 침전시켰다.

침전물을 건조시킨 후 5ml의 TE 완충 용액에 재용해시키고 20μl의 RNase I (10mg/ml, BRL, U.S.A.)을 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그후 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올(25 : 24 : 1, v/v/v)로 두번 반복 추출한 뒤 상등액을 2 부피의 에탄올을 첨가하여 전헥산을 침전시켰다. 침전후 얻은 전체 헥산을 0.5ml의 TE 완충 용액에 녹어 다음 실험에 이용하였다.

[실시예 3]

중합효소 연쇄 반응(PCR)

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10μl의 10X Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1% (w/v)셀라틴), 10μl의 dNTP's혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 1.25mM), 시발체 SKND와 SKSL 2μg씩, 0.5μl의 앰플리택 DNA중합효소(Perkin-Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100μl로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기위해 50μl의 미네랄 오일을 첨가하였다. 온도 순환기(Perkin-Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며 순환 프로그램은 95℃에서 1분→55℃에서 1분→72℃에서 2분간의 순환을 25회 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 반응시켰다. 중합효소를 제거하기 위하여 반응 혼합물에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 원심분리하였다. 상충액을 새 튜브에 옮기고 1/10부피의 3M 나트륨아세테이트, 2배 부피의 100% 에탄올을 넣고 혼합한후 원심분리하여 약 1.25Kb의 이중 나선 헥산을 얻었다. 이 상기의 헥산을 20μl의 TE완충액(10mM 트리스-Cl, pH 7.5,1mM EDTA)에 녹인 후 다음 실험에 이용하였다.

전체 염기서열은 염기서열 결정용 백터인 M13mp18(New England Biolabs, 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5595, USA. Cat. #408)에 클로닝하여 전체 염기서열을 결정하였다.

[실시예 4]

발현벡터의 제조

[단계 l]

상기 실시예 3에서 얻어진 스트렙토키나제 유전자용액 2μg을 총부피 50μl에서 NEB 완충용액 4(참조예 1)의 조건하에서 37℃에서 제한효소 Nde I (10 단위체)으로 1-2시간 절단한 후 페놀-클로로포름 추출법(참조예 2)에 의해 추출한 후 에탄올 침전시켰다. 침전된 헥산을 5μl의 NEB 완충용액 3(참조예 1)으로 용존시킨 뒤 다시 제한효소 Sal I (10 단위체)으로 37℃에서 1-2시간 반응시켰다.

플라스미드 ptrp 322H-HGH(KFCC 10667) 2μg을 제한효소 Pst I와 제한효소 Sal I으로, 또한 동일 플라스미드 2μg을 제한효소 Pst I과 제한효소 Nde I로 상기와 동일한 방법으로 각각 완전절단하여 0.7% 아가로오스 젤로 분리 약 1.25Kb, 1.5Kb, 0.8Kb 단편을 각각 분리 정제하였다. 이하 이들 단편을 각각 단편 SKI-N/L, 단편 PL, 단편 PN이라 한다.

[단계 2]

상기 단계 1에서 얻은 단편들은 다음과 같이 접합반응을 실시하였다. 약 100ng의 단편 SKI-N/L, 100ng의 단편 PL, 약 100ng의 단편 PN, 2μl의 10배 접합용액, 10단위제 T4 DNA 접합 요소와 총부피가 20μl가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 2시간 이상 반응시켰다(참조예 3). 반응이 끝난뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환(참조예 4)시켜 단편 SKI 유전자를 함유하고 있는 4개의 ptrpH-SK(#1,#2, #3, #4)를 선별하였다.

[실시예 5]

발현 벡터의 대장균에 형질 전환 및 SDS-폴리 아크릴 아마이드겔 전기 영동에 의한 발현 확인.

상기 실시예 4에서 얻은 ptrpH-SK을 함유하고 있는 4개의 플라스미드를 발현용 대장균인 대장균 W3110(ATCC 27325)에 형질전환(참조예 4)시킨 후 이들을(클론 #1, #2, #3,#4) 50μg/ml의 엠피실린이 함유된 액체 LB배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 다음, 이중 5ml을 1ℓ의 M9 배양액(40mM K₂HPO₄22mM KH₂PO₄., 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 글르코스, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10μg/ml Vit B_l, 40μg/ml 앰피실린)으로 옮겨서 37℃에서 약 3-4시간 동안 진탕 배양하여 대장균의 성장 속도가 650nm에서 흡광도가 0.5 정도가 될때 여러가지 농도(0.1mM부터 시작하여 0.1mM씩 증가시켜 1.0mM까지)의 IAA을 첨가하여 스트렙토키나제 유전자가 발현되도록 하였다. 또는 IAA 첨가없이 밤새 배양하여 스트렙토키나제가 자동적으로 발현되도록 하였다.

IAA를 첨가하여 강제로 발현을 유도한 경우는 IAA를 첨가한지 약 5시간후, 자동유도를 하였을때는 12시간에서 24시간이 경과한 후에, 세포배양액을 원심분리기(Beckman J6-B, Rotor JS4.2)를 이용하여 25분간 원심분리하여 대장균 세포 침전물을 수집하여 세포균질액을 램리의 방법(Laemmli et al., Nature 227., 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 12% 폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동하여 유전자 산물을 발현시켰으며 발현 결과 분자량이 약 47000달톤 위치에서 전체 대장균 단백질의 약 10% 이상에 해당되는 양의 스트렙토키나제 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, 이를 제 4 도에 나타내었다.

제 4 도의 제 1열은 스트렙토키나제 유전자를 함유하고 있지 않는 대장균 W3110의 단백질 밴드 패턴이고 ; 제 2 열 및 제 3 열은 ptrpH-SK의 클론 #1을 함유하고 있는 대장균으로, IAA유도 후 각각 2시간과 4시간 후의 단백질 밴드 패턴이고 ; 제 4 열 및 제 5 열은 ptrpH-SK의 클론 #2를 함유하고 있는 대장균으로, IAA유도후 각각 2시간과 4시간후의 단백질 밴즈 패턴이고 ; 제 6 열 및 제 7 열은 ptrpH-SK의 클톤 #3을 함유하고 있는 대장균으로, IAA 유도 후 각각 2시간과 4시간후의 단백질 밴드 패턴이고 ; 제 8 열 및 제 9 열은 ptrpH-SK의 클론 #4를 함유하고 있는 대장균으로, IAA유도후 각각 2시간과 4시간 후의 단백질밴드 패턴이고 ; 제 10 열은 표준 단백질 분자량으로 위로부터, 97400, 68000, 43000, 18400, 14300달톤이다.

상기 클론들 중 #1의 ptrpH-SK를 1991년 12원 18일자로 ATCC에 기탁번호 ATCC 68884로 기탁하였다.

이상과 같이 본 발명자들이 제조한 스트렙토키나제 유전자를 함유한 발현벡터를 사용한 전체 대장균 단백질중 약 10% 이상의 높은 농도로 스트렙토키나제 효소 단백질이 발현됨을 확인하였다.

본 발명의 실시태양에 있어 당해분야에서 숙련된 자들에게 자명한 여러 변형과 변화를 가하여도 본 발명의 본질과 영역을 벗어나지 않을 것이다.

Claims

하기 아미노산 서열을 갖는 신규한 스트렙토키나제를 코딩하는 염기서열을 포함하는 스트렙토키나제유전자.
제 1 항에 있어서, 다음의 염기 서열을 갖는 신규한 스트렙토키나제 유전자.
제 1 항 또는 제 2 항의 유전자를 함유하는 스트렙토키나제 발현벡터.
제 3 항에 있어서, 발현벡터 ptrpH-SK.
제 3 항 또는 제 4 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 5 항에 있어서, ptrpH-SK에 의해 형질전환된 대장균 W3110(ATCC 68884).
제 5 항 또는 제 6 항의 대장균을 배양하여서 스트렙토키나제를 생산하는방법.