JPH1175849A - パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ - Google Patents

パイロコッカス属に属する超好熱性細菌由来の耐熱性Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ

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JPH1175849A
JPH1175849A JP9239440A JP23944097A JPH1175849A JP H1175849 A JPH1175849 A JP H1175849A JP 9239440 A JP9239440 A JP 9239440A JP 23944097 A JP23944097 A JP 23944097A JP H1175849 A JPH1175849 A JP H1175849A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 至適温度が75℃以上である、耐熱性Flap
エンドヌクレアーゼ。以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパ
ク質をコードするＤＮＡ （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつFlapエンドヌクレアーゼ活性を有するタン
パク質 【効果】 本発明により、反応の至適温度が75℃以上で
ある耐熱性Flapエンドヌクレアーゼを提供できる。さ
ら、本酵素が熱に安定であることから酵素反応をＰＣＲ
反応とカップルさせ、人為的に相同組換えや遺伝子シャ
フリングを高効率で行われる新手法の開発が可能にな
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、低い相同性に基づ
く遺伝子組換えや遺伝子シャフリングに有効な耐熱性の
Flapエンドヌクレアーゼ及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、広範な遺伝子領域にランダム変異
を導入する方法として、目的遺伝子の複製時に特定のヌ
クレオチドを欠乏させることにより遺伝子増幅反応（Ｐ
ＣＲ）を行わせ変異を誘起する方法が有り、局所領域に
ランダム変異を導入する方法として、混合プライマーを
用いるＰＣＲ反応により目的位置に変異を導入する方法
がある。しかし、試験管内で低い相同性に基づく遺伝子
組換えや遺伝子シャフリングを高効率に誘導する方法は
未だ存在しない。生体内での遺伝子組換えや遺伝子シャ
フリングのメカニズムは図１のように考えられている。
図１において、ステップ１は 3 '-5 'エキソヌクレアー
ゼによる5 ' 一本鎖オーバハングの形成を、ステップ２
は低い相同性に基づく一時的塩基対の形成を、ステップ
３はＤＮＡポリメラーゼによるギャプの修復とFlap構造
の形成を、ステップ４はFlapエンドヌクレアーゼによる
Flap一本鎖の除去を、ステップ５はＤＮＡリガーゼによ
るニックの連結をそれぞれ示している。しかし、各ステ
ップを触媒する酵素の性質はあまり明らかではない。Fl
apエンドヌクレアーゼはステップ４を触媒する酵素であ
る。Flapエンドヌクレアーゼ酵素は図２に示すとおりＤ
ＮＡのFlap構造を特異的に認識し、一本鎖部分（この部
分がFlapと呼ばれる）を切断する酵素であり、哺乳動物
細胞や酵母細胞から見出されているが、常温生物由来な
ので耐熱性に乏しく、ＰＣＲ反応を含む人為的遺伝子シ
ャフリング反応には不適当である。
【０００３】従来のFlapエンドヌクレアーゼ酵素は、高
温で不安定であるため、試験管内で低い相同性に基づく
遺伝子組換えや遺伝子シャフリングを高温下で高効率に
誘導する方法の開発には使えない。しかし、耐熱性で高
温で安定な機能を発揮するFlapエンドヌクレアーゼが得
られれば、酵素反応をＰＣＲ反応とカップルさせ、人為
的に相同組換えや遺伝子シャフリングを高効率で行わせ
る新手法の開発が可能となる。従って、高温下で安定な
耐熱性Flapエンドヌクレアーゼの開発がが渇望されてい
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記に鑑み、本発明の
目的は新規な耐熱性Flapエンドヌクレアーゼ及びその遺
伝子を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、以上のよう
な課題を解決すべく、90−100℃で生育する超好熱性細
菌に着目し、その遺伝子配列から本酵素活性を示すと推
測される遺伝子を見出した。さらに、大腸菌を使ってそ
の遺伝子から酵素を生産し、この酵素が高温（75℃以
上）で安定にかつ構造特異的エンドヌクレアーゼ活性を
示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明は、至適温度が75℃以上であ
る耐熱性Flapエンドヌクレアーゼである。さらに、本発
明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする
ＤＮＡである。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつFlapエンドヌクレアーゼ活性を有するタン
パク質。
【０００７】上記ＤＮＡの具体例としては配列番号１で
表されるＤＮＡが挙げられる。なお、上記アミノ酸の付
加、欠失又は置換は周知技術である部位特定変異誘発
（例えば、Nucleic Acid Reserch, Vol.10, No.20, p64
87〜6500, 1982を参照)により実施することができ、ア
ミノ酸の付加、欠失又は置換に関し、１又は複数のアミ
ノ酸とは前記部位特定変異誘発法により付加、欠失又は
置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【０００８】さらに、本発明は上記ＤＮＡを含む組み換
えベクターである。さらに、本発明は上記ＤＮＡを含む
組み換えベクターで形質転換した形質転換体である。さ
らに、本発明は上記形質転換体を培地中で培養して耐熱
性Flapエンドヌクレアーゼを製造することを特徴とする
耐熱性Flapエンドヌクレアーゼの製造方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明で使用した超好熱性細菌は、硫黄代謝好熱性
古細菌パイロコッカス・ホリコシＪＣＭ９９７４であ
る。
【００１０】本発明の耐熱性Flapエンドヌクレアーゼは
次の方法によって得た。パイロコッカス・ホリコシＪＣ
Ｍ９９７４の染色体ＤＮＡを鋳型として、実施例６で示
すアッパープライマーとローワープライマーとを用い、
ＰＣＲ反応を行い、Flapエンドヌクレアーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離した。
【００１１】この遺伝子を、タンパク質発現プラスミド
pET 15b に挿入、その組み換えプラスミドを大腸菌に組
み込み、その形質転換した大腸菌を培地中で培養して本
酵素の生産を行った。生産された耐熱性Flapエンドヌク
レアーゼ酵素は加熱処理およびカラムクロマトグラムで
単離精製した。精製された耐熱性Flapエンドヌクレアー
ゼ酵素は、分子量約40,000のタンパク質で、図２に示し
たFlap型ＤＮＡ基質を認識し、一本鎖オリゴヌクレオチ
ド部分（Flap部分）を加水分解する酵素であることを確
認した。
【００１２】この酵素は１Ｍ ＮａＣｌを含有する50mM
リン酸緩衝液（pH7.５) 中で95℃で数時間処理しても、
活性の低下が見られなかった。さらに、活性の至適pHは
6.０−8.０で、至適温度はpH８で約75℃以上であった。
【００１３】
【発明の効果】本発明により、反応の至適温度が75℃以
上である耐熱性Flapエンドヌクレアーゼを提供できる。
さら、本酵素が熱に安定であることから酵素反応をＰＣ
Ｒ反応とカップルさせ、人為的に相同組換えや遺伝子シ
ャフリングを高効率で行う新手法の開発が可能になる。
【００１４】
【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定
されるものではない。 〔実施例１〕 菌の培養 パイロコッカス・ホリコシＪＣＭ９９７４は次の方法で
培養した。13.5g の食塩、４g のＮａ2ＳＯ4 、0.７g
のＫＣｌ、0.２g のＮａＨＣＯ3、0.１g のＫＢｒ、30m
gのＨ3ＢＯ3 、10ｇのＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2Ｏ、1.５g の
ＣａＣｌ2 、25mgのＳｒＣｌ2 、1.０mlのレザスリン溶
液（0.２g/L)、1.０g の酵母エキス、５ｇのバクトペプ
トンを１Ｌに溶かし、この溶液のpHを6.８に調整し加圧
殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.２％とな
るように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性と
した後、パイロコッカス・ホリコシＪＣＭ９９７４を植
菌した。培地が嫌気性となったか否かはＮａ2Ｓ溶液を
加えて、培養液中でＮａ2Ｓによるレザスリン溶液のピ
ンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を
95℃で２〜４日培養し、得られる培養物を5000rpm 、10
分間の遠心分離して集菌し、菌体１ｇを得た。
【００１５】〔実施例２〕 染色体ＤＮＡの調整 パイロコッカス・ホリコシＪＣＭ９９７４の染色体ＤＮ
Ａは以下の方法により調製した。実施例１で得た菌体の
0.1 ｇを10mM Tris (pH7.5) 1mM ＥＤＴＡ溶液で２回洗
浄後InCert Agarose (ＦＭＣ社製）ブロック中に封入す
る。このブロックを１％ N-ラウロイルザルコシン(iaur
oylsarcosine)、１mg/ml プロテアーゼＫ溶液中で処理
することにより、染色体ＤＮＡはAgarose ブロック中に
分離調製される。
【００１６】〔実施例３〕 染色体ＤＮＡを含むライブ
ラリークローンの作製 実施例２で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素HindIII に
より部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長
の断片を調製した。このＤＮＡ断片と制限酵素HindIIに
よって完全分解したBac ベクターpBAC108L（Ung-Jon Ki
m et.al. Nucleic Acid Reseach, 20(5) 1083-1085(199
2)) 及びpFOS1 （Ung-Jon Kim et.al. Nucleic Acid Re
seach, 20(5) 1083-1085(1992)) とをＴ４リガーゼを用
いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合
終了後のＤＮＡをただちに大腸菌内へ電気孔窄法により
導入した。後者のベクターpFOS1 を用いた場合には結合
終了後のＤＮＡをGIGA Pack Gold (ストラタジーン社
製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、こ
の粒子を大腸菌に感染させることによりＤＮＡを大腸菌
内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質ク
ロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をＢＡＣ及びFosm
idライブラリーとした。ライブラリーからパイロコッカ
ス・ホリコシＪＪＣＭ９９７４の染色体をカバーするの
に適したクローンを選択して、クローンの整列化を行っ
た。
【００１７】〔実施例４〕 各ＢＡＣ或いはFosmidクロ
ーンの塩基配列決定 整列化されたＢＡＣ或いはFosmidクローンについて順次
以下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回
収した各ＢＡＣ或いはFosmidクローンのＤＮＡを超音波
処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動
により１kb及び２kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断
片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に
挿入したショットガンクローンを各ＢＡＣ或いはFosmid
クローン当たり 500クローン作製した。各ショットガン
クローンの塩基配列をパーキンエルマー、ＡＢＩ社製自
動塩基配列読み取り装置 373または 377を用いて決定し
ていった。各ショットガンクローンから得られた塩基配
列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編
集し、各ＢＡＣ或いはFosmidクローンの全塩基配列を決
定していった。
【００１８】〔実施例５〕 Flapエンドヌクレアーゼ遺
伝子の同定 上記で決定された各ＢＡＣ或いはFosmidクローンの塩基
配列の大型計算機による解析を行い、Flapエンドヌクレ
アーゼをコードする遺伝子が同定された。この遺伝子の
配列を配列番号１に示す。そして、この塩基配列から演
繹されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１９】〔実施例６〕 発現プラスミドの構築 構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdelとXhol) サイト
を構築する目的でＤＮＡプライマーを合成し、ＰＣＲで
その遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。 アッパー プライマー 5'GGGAATTCCTGCAGATCGCATATGGGTGTTCCTATCGGTGAC3' ローワー プライマー 5'ACTAATCCCGGGTACCTCGAGGCTATAGACTTTAGGGTTTCT3' ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdelとXhol) で完全分解（37
℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。
【００２０】pET-15b 、(Novagen社製) を制限酵素Ndel
とXholで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リ
ガーゼで16℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮ
Ａの一部をE.coil-XL 1-BlueMRF1のコンピテントセルに
導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニ
ーから発現プラスミドをアルカリ法（Sambrook,J.et.a
l. Molecular Cloning : A laboratory Manual, 2 nd e
dn., Cold Spring Harbor Laboratory(1989))で精製し
た。
【００２１】〔実施例７〕 組換え遺伝子の発現 大腸菌（E.coli BL21(DE3)、Novagen 社製) のコンピテ
ントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1mL移
す。その中に発現プラスミド溶液0.005mL を加え氷中に
30分間放置した後42℃でヒートショックを30秒間行い、
ＳＯＣmedium 0.９mLを加え、37℃で１時間振とう培養
する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに
適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体を得た。この
形質転換体は平成９年８月１８日に工業技術院生命工学
工業研究所に FERM P-16389 として寄託されている。
【００２２】この形質転換体をアンピシリンを含む２Ｙ
Ｔ培地（２Ｌ）で600nm の吸収が１に達するまで培養し
た後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosi
de)を加えさらに６時間培養した。培養後遠心分離（6,0
00rpm、20min)で集菌し、菌体30ｇを得た。
【００２３】（実施例８）耐熱性酵素の精製 集菌した菌体30ｇを−20℃で凍結融解し、菌体量の２倍
のアルミナと１mgのDNase を加え、菌体を粉砕した後、
５倍量の10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)を加え懸濁液を
得た。得られた懸濁液を85℃で30min 加熱後遠心分離
（11,000rpm 、20min)し、上澄をNi−カラム（Novagen,
His-Bind metal chelation resin & His-Bind buffer
kit を使用）による親和性クロマトグラムを行った。こ
こで得られた60mMイミダゾール流出画分をHiTrap SP(フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させ、ＮａＣｌ濃度勾配
による溶出を行い活性画分を得た。さらに得られた活性
画分溶液をHitrap Heparinカラム（ファルマシア社製）
に通し、ＮａＣｌ濃度勾配による溶出を行い精製酵素１
mgを得た。
【００２４】〔実施例９〕 酵素反応条件 （１） 合成オリゴヌクレオチド 全てのオリゴヌクレオチドはグライナージャパン株式会
社により合成された。各オリゴヌクレオチドの名称と配
列は以下の様である。 Fbr strand: 5'-GGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTG-3' Fadj strand: 5'-CTGCCATCAGTTGCAC-3' Flap strand: 5'-CCTGAGACGGAGTTTCAATCCTGACGAACTGTA
G-3'
【００２５】（２） Flap基質（図２）の調整 ［γ-32Ｐ］ＡＴＰとＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて酵素で切断されることになる Flap strandの5'端
を32Ｐラベル化した。ラベル化された Flapstrandを F
br strand 、 Fadj strandと共に150mM ＮａＣｌを含む
20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4)の中で煮沸し、溶液の温
度を徐々に４℃まで下げることによりアニーリングさせ
た。
【００２６】（３） Flapエンドヌクレアーゼ活性 15mlの50mMトリス塩酸緩衝液（pH８、1.5mM MgCl2 、0.
5mM b-メルカプトエタノール、100mg/ml 牛血清アルブ
ミン）に400fmol の32Ｐラベル化Flap基質と酵素を加
え、50℃で30分間反応させた。次に15mlの95％ホルムア
ミド、 10mM ＥＤＴＡ、１mg/ml キシレンシアノールを
加え酵素反応を停止させた。さらにこの反応液を95℃、
５分間加温し、７Ｍ尿素と１×ＴＢＥ(89mM トリス、89
mM 硼酸、２mM ＥＤＴＡ、pH８）を含む15％ポリクア
リルアミドゲル（16×45cm）に添加し、2000Ｖで２時間
泳動した。反応産物はモレキュラーイメージャーGS-525
(Bio-rad社）で画像化、定量化された。活性の一ユニッ
トは通常のFlapエンドヌクレアーゼ活性測定条件下、１
fmolのFlap基質を分解する酵素量と規定される。酵素の
諸性質
【００２７】（１） 基質特異性 本酵素は単純な二本鎖ＤＮＡや一本鎖ＤＮＡには作用せ
ず、図２の様なＤＮＡ構造体の一本鎖ＤＮＡ部分（Fla
p) を根本から切り出すエンドヌクレアーゼ活性を有す
る。図２に示す基質の一例においては矢印が切断点を示
し、20mer の一本鎖ＤＮＡを遊離する。また、当酵素の
活性はＤＮＡの塩基配列には依存しない。
【００２８】（２） 至適pH 酵素活性の至適pHの測定は、 50mM 酢酸ナトリウム緩衝
液、 50mM リン酸緩衝液及び 50mM ほう酸緩衝液中（pH
４〜９）に、32Ｐラベル化Flap基質（図２）を400fmol
含む溶液を調整し、50℃で酵素の加水分解活性の初速度
を測定することにより求めた。pH6.０−8.０近傍で最大
初速度が得られたため、最適pHは6.０−8.０と結論し
た。
【００２９】（３） 至適温度 基質として32Ｐラベル化Flap基質（図２）を400fmol 使
用し、 50mM リン酸緩衝液（pH8.０）中に一定量の酵素
を加えて30分反応させ、相対活性を調べた。最大活性
（至適温度）は75℃以上であった。
【００３０】（４） 耐熱性 当該酵素を0.1mg/mlの濃度で含む水溶液（50mMリン酸緩
衝液、pH8.０、１M NaCl) を95℃で５時間加熱後、残存
活性を調べた。その結果95℃における活性の半減期は５
時間であった。また、走査型指差熱測定計（ＤＳＣ) を
用い熱変性を調べた。0.5mg/mlの当該酵素溶液（50mMリ
ン酸緩衝液pH8.０、１M NaCl) を用い、０〜125℃で測
定したところ、熱変性温度（Tm) が103℃であることが
明らかとなった。
【００３１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：1032 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1029 配列 ATG GGT GTT CCT ATC GGT GAC CTC GTT CCG AGG AAG GAG ATA GAT CTT 48 Met Gly Val Pro Ile Gly Asp Leu Val Pro Arg Lys Glu Ile Asp Leu 1 5 10 15 GAA AAT CTG TAT GGA AAG AAG ATA GCG ATA GAT GCC CTA AAC GCC ATC 96 Glu Asn Leu Tyr Gly Lys Lys Ile Ala Ile Asp Ala Leu Asn Ala Ile 20 25 30 TAT CAG TTT TTA TCA ACG ATA AGA CAG AGG GAT GGA ACA CCA CTT ATG 144 Tyr Gln Phe Leu Ser Thr Ile Arg Gln Arg Asp Gly Thr Pro Leu Met 35 40 45 GAC TCT AAG GGT AGG ATA ACC TCT CAT TTA AGT GGG CTC TTT TAT AGA 192 Asp Ser Lys Gly Arg Ile Thr Ser His Leu Ser Gly Leu Phe Tyr Arg 50 55 60 ACG ATA AAT CTA ATG GAA GCC GGT ATT AAG CCG GCC TAC GTC TTT GAT 240 Thr Ile Asn Leu Met Glu Ala Gly Ile Lys Pro Ala Tyr Val Phe Asp 65 70 75 80 GGA AAG CCT CCG GAA TTC AAA AGG AAG GAG CTC GAA AAA AGG AGG GAA 288 Gly Lys Pro Pro Glu Phe Lys Arg Lys Glu Leu Glu Lys Arg Arg Glu 85 90 95 GCT AGA GAA GAG GCA GAA CTA AAA TGG AAA GAA GCT CTA GCC AAG GGA 336 Ala Arg Glu Glu Ala Glu Leu Lys Trp Lys Glu Ala Leu Ala Lys Gly 100 105 110 AAC CTG GAG GAA GCT AGG AAA TAC GCT CAA AGG GCA ACT AAG GTT AAT 384 Asn Leu Glu Glu Ala Arg Lys Tyr Ala Gln Arg Ala Thr Lys Val Asn 115 120 125 GAA ATG CTA ATC GAA GAT GCA AAG AAG CTT TTG CAA CTA ATG GGA ATA 432 Glu Met Leu Ile Glu Asp Ala Lys Lys Leu Leu Gln Leu Met Gly Ile 130 135 140 CCA ATA ATT CAG GCT CCA AGT GAA GGA GAA GCC CAA GCG GCA TAC ATG 480 Pro Ile Ile Gln Ala Pro Ser Glu Gly Glu Ala Gln Ala Ala Tyr Met 145 150 155 160 GCA AGT AAA GGG GAT GTC TAC GCG TCA GCG AGT CAA GAT TAT GAT TCA 528 Ala Ser Lys Gly Asp Val Tyr Ala Ser Ala Ser Gln Asp Tyr Asp Ser 165 170 175 CTA CTC TTT GGT GCT CCA AGG TTG ATT AGG AAT CTG ACA ATT ACG GGA 576 Leu Leu Phe Gly Ala Pro Arg Leu Ile Arg Asn Leu Thr Ile Thr Gly 180 185 190 AAA AGA AAG ATG CCT GGG AAA GAT GTT TAC GTT GAA ATA AAG CCA GAG 624 Lys Arg Lys Met Pro Gly Lys Asp Val Tyr Val Glu Ile Lys Pro Glu 195 200 205 TTA GTA GTT CTA GAT GAG GTA CTA AAA GAG CTT AAG ATA ACA AGA GAA 672 Leu Val Val Leu Asp Glu Val Leu Lys Glu Leu Lys Ile Thr Arg Glu 210 215 220 AAG CTT ATA GAA CTT GCA ATT CTG GTT GGG ACT GAC TAT AAT CCT GGG 720 Lys Leu Ile Glu Leu Ala Ile Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gly 225 230 235 240 GGC GTA AAG GGG ATA GGA CCT AAG AAG GCC CTT GAG ATT GTA AGA TAT 768 Gly Val Lys Gly Ile Gly Pro Lys Lys Ala Leu Glu Ile Val Arg Tyr 245 250 255 TCA AGG GAT CCC CTA GCA AAG TTC CAA AGA CAG AGC GAT GTG GAT CTT 816 Ser Arg Asp Pro Leu Ala Lys Phe Gln Arg Gln Ser Asp Val Asp Leu 260 265 270 TAC GCT ATT AAG GAA TTC TTC CTT AAC CCT CCT GTC ACT AAT GAA TAC 864 Tyr Ala Ile Lys Glu Phe Phe Leu Asn Pro Pro Val Thr Asn Glu Tyr 275 280 285 TCG CTT AGT TGG AAG GAG CCT GAT GAG GAA GGA ATA TTA AAA TTC CTC 912 Ser Leu Ser Trp Lys Glu Pro Asp Glu Glu Gly Ile Leu Lys Phe Leu 290 295 300 TGT GAT GAG CAT AAT TTT AGC GAA GAA AGG GTA AAA AAT GGG ATA GAA 960 Cys Asp Glu His Asn Phe Ser Glu Glu Arg Val Lys Asn Gly Ile Glu 305 310 315 320 AGA CTA AAA AAG GCG ATA AAA GCT GGA AGA CAA TCA ACG CTT GAG AGT 1008 Arg Leu Lys Lys Ala Ile Lys Ala Gly Arg Gln Ser Thr Leu Glu Ser 325 330 335 TGG TTC GTT AAA AAG AAA CCC TAA 1032 Trp Phe Val Lys Lys Lys Pro 340
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：343 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Gly Val Pro Ile Gly Asp Leu Val Pro Arg Lys Glu Ile Asp Leu 1 5 10 15 Glu Asn Leu Tyr Gly Lys Lys Ile Ala Ile Asp Ala Leu Asn Ala Ile 20 25 30 Tyr Gln Phe Leu Ser Thr Ile Arg Gln Arg Asp Gly Thr Pro Leu Met 35 40 45 Asp Ser Lys Gly Arg Ile Thr Ser His Leu Ser Gly Leu Phe Tyr Arg 50 55 60 Thr Ile Asn Leu Met Glu Ala Gly Ile Lys Pro Ala Tyr Val Phe Asp 65 70 75 80 Gly Lys Pro Pro Glu Phe Lys Arg Lys Glu Leu Glu Lys Arg Arg Glu 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Ala Glu Leu Lys Trp Lys Glu Ala Leu Ala Lys Gly 100 105 110 Asn Leu Glu Glu Ala Arg Lys Tyr Ala Gln Arg Ala Thr Lys Val Asn 115 120 125 Glu Met Leu Ile Glu Asp Ala Lys Lys Leu Leu Gln Leu Met Gly Ile 130 135 140 Pro Ile Ile Gln Ala Pro Ser Glu Gly Glu Ala Gln Ala Ala Tyr Met 145 150 155 160 Ala Ser Lys Gly Asp Val Tyr Ala Ser Ala Ser Gln Asp Tyr Asp Ser 165 170 175 Leu Leu Phe Gly Ala Pro Arg Leu Ile Arg Asn Leu Thr Ile Thr Gly 180 185 190 Lys Arg Lys Met Pro Gly Lys Asp Val Tyr Val Glu Ile Lys Pro Glu 195 200 205 Leu Val Val Leu Asp Glu Val Leu Lys Glu Leu Lys Ile Thr Arg Glu 210 215 220 Lys Leu Ile Glu Leu Ala Ile Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Gly 225 230 235 240 Gly Val Lys Gly Ile Gly Pro Lys Lys Ala Leu Glu Ile Val Arg Tyr 245 250 255 Ser Arg Asp Pro Leu Ala Lys Phe Gln Arg Gln Ser Asp Val Asp Leu 260 265 270 Tyr Ala Ile Lys Glu Phe Phe Leu Asn Pro Pro Val Thr Asn Glu Tyr 275 280 285 Ser Leu Ser Trp Lys Glu Pro Asp Glu Glu Gly Ile Leu Lys Phe Leu 290 295 300 Cys Asp Glu His Asn Phe Ser Glu Glu Arg Val Lys Asn Gly Ile Glu 305 310 315 320 Arg Leu Lys Lys Ala Ile Lys Ala Gly Arg Gln Ser Thr Leu Glu Ser 325 330 335 Trp Phe Val Lys Lys Lys Pro 340
【図面の簡単な説明】
【図１】生体内で耐熱性Flapエンドヌクレアーゼの酵素
活性の関与する相同組換えと遺伝子シャフリングメカニ
ズムを示す図。Flapエンドヌクレアーゼはステップ４を
触媒する。
【図２】Flapエンドヌクレアーゼの基質となりうるＤＮ
Ａ構造の一例を示す図。一本鎖部分がFlapと呼ばれる。
矢印は本酵素による切断部位を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１０年７月２９日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６３８９号
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術
研究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４０号
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 松井 えり子 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 川崎 聡子 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院 生命工学工業技術研究所内

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 至適温度が75℃以上である、耐熱性Flap
    エンドヌクレアーゼ。
  2. 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
    コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
    パク質。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
    ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
    らなり、かつFlapエンドヌクレアーゼ活性を有するタン
    パク質。
  3. 【請求項３】 配列番号１で表されるＤＮＡであること
    を特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項２又は３記載のＤＮＡを含む組み
    換えベクター。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の組み換えベクターで形質
    転換した形質転換体。
  6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
    養して耐熱性Flapエンドヌクレアーゼを製造することを
    特徴とする耐熱性Flapエンドヌクレアーゼの製造方法。
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