JP3015878B2 - Ｄｎａポリメラーゼ活性を有する耐熱性酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を有する耐熱性酵素に関し、より詳細には、パイ
ロコッカス属に属する超好熱性細菌由来のＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する耐熱性酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】DNAポリメラーゼはDNAシークエンシング
反応、遺伝子増幅反応(PCR反応)、ＤＮＡの放射活性標
識、変異遺伝子の試験管内合成等に有用な酵素である。
今までに至適温度の異なる種々のＤＮＡポリメラーゼが
細菌や動植物から発見されているが、多くが常温生物由
来のため、耐熱性に乏しく、鋳型DNAの94℃以上での熱
変性反応を含むPCR反応等には不適当であった。また、
耐熱性DNAポリメラーゼとしてTaq DNAポリメラーゼ等の
好熱性細菌由来の酵素が市販されているが、いずれも3'
-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を欠くため、PCR反応等
のポリメラーゼ反応中にエラーを誘発しやすく、PCR反
応等には不向きである。耐熱性かつエラー校正能の高い
DNAポリメラーゼが発見されれば、PCR反応等に有用と考
えられる。従って、極限環境下で正確な複製が行えるDN
Aポリメラーゼが渇望されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、DNAポリメ
ラーゼ活性を有する耐熱性酵素を提供することを目的と
する。また、本発明は、DNAポリメラーゼ活性の他に3'-
5'校正エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性酵素を提
供することも目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく、９０〜１００℃で生育する超高熱性細菌
に着目し、その遺伝子配列から本酵素活性を示すタンパ
ク質をコードすると推測される遺伝子を見い出した。さ
らに、その遺伝子を大腸菌に組み込んで、この形質転換
された大腸菌を使って酵素を生産し、この酵素が高温
（９０℃以上）で安定に存在し、かつDNAポリメラーゼ
活性を示すことを確認して、本発明を完成するに至っ
た。

【０００５】すなわち、本発明は、配列番号２のアミノ
酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されてもよいアミノ酸配列からなり、か
つＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性酵素を提供す
る。本発明の酵素は、好ましくは、９０℃以上の温度で
の加熱処理後に１００％またはそれ以上の残存活性を呈
する。また、本発明の酵素は、好ましくは、さらに3'-
5'校正エキソヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、ま
た、上記の酵素をコードするＤＮＡを提供する。一例と
して、このＤＮＡは配列番号１の塩基配列を有する。

【０００６】さらに、本発明は、上記のＤＮＡを含む組
換えベクター、この組換えベクターにより形質転換され
た宿主細胞、および上記の酵素を製造する方法であっ
て、該酵素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターによ
り形質転換された宿主細胞を培養し、次いで培養物から
該酵素を採取する工程を含む前記方法を提供する。この
方法により、本発明の耐熱性酵素を多量に生産すること
ができる。さらにまた、本発明は、上記の酵素を用いる
ことを特徴とする核酸の増幅方法を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明の耐熱性酵素は、配列番号２のアミノ酸配列
において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されてもよいアミノ酸配列からなり、かつＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を有する耐熱性酵素である。配列番
号２のアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラーゼ
活性を有する耐熱性酵素は、硫黄代謝好熱性古細菌パイ
ロコッカス・ホリコシ（登録番号JCM９９７４）に由来
する。その製造方法の一例を説明する。

【０００８】まず、パイロコッカス・ホリコシを培養し
た後、染色体DNAを調製する。次いで、染色体DNAを制限
酵素により断片化し、ゲノムDNAライブラリーを作製
し、パイロコッカス・ホリコシの染色体をカバーするク
ローンを選択して、クローンの整列化を行う。整列化さ
れたクローンの塩基配列を決定し、DNAポリメラーゼを
コードする遺伝子を同定する。DNAポリメラーゼをコー
ドする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。この遺伝
子をPCR反応で増幅し抽出した後、蛋白質発現プラスミ
ド（例えば、pET11a或いはpET15b）に挿入、そのプラス
ミドを宿主細胞（例えば、大腸菌）に組み込み、本酵素
の生産をおこなうことができる。生産された酵素は加熱
処理およびカラムクロマトグラムで単離精製する。

【０００９】精製された当該酵素は、分子量約80,000の
タンパク質で、DNAを鋳型とし、相補鎖を合成するDNA依
存性DNAポリメラーゼであることがわかった。この酵素
は250 mM NaClを含む50ｍトリス塩酸緩衝液（pH8.5）中
で90℃で3時間あるいは98℃で3時間処理しても、活性の
減少は見られなかった。また、活性の至適pHは25℃でpH
8.5であった。さらに、当該酵素は3'-5'校正エキソヌ
クレアーゼ活性も有していた。

【００１０】上記酵素の変異体、すなわち、配列番号２
のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列からな
り、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性酵素
は、周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発、PCR
法などの手法を用いて調製することができる。本発明の
酵素は、DNAシークエンシング反応、遺伝子増幅反応（P
CR反応) 、DNAの放射活性標識、変異遺伝子の試験管内
合成等に利用することができる。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。これらの実施例は説明のためのものであって、本発
明の範囲を限定するものではない。 （実施例１）（菌の培養） JCM９９７４（理化学研究所微生物系統保存施設より入
手）は次の方法で培養した。

【００１２】13.5ｇの食塩、4gのNa₂SO₄、 0.7 g のKCl
、 0.2g のNaHCO₃、0.1gのKBr、30mg のH₃BO₃、10gのM
gCl₂・6H₂O、1.5gのCaCl₂ 、25mgのSrCl₂、1.0mlのレザ
スリン溶液（0.2g/L）、1.0g の酵母エキス、5gのバク
トペプトンを1Lに溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し
加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％
となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気
性とした後、JCM９９７４を植菌した。培地が嫌気性と
なったか否かはNa₂S溶液を加えて、培養液中でNa₂Sによ
るレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確
認した。この培養液を95℃で２〜４日培養し、その後遠
心分離し集菌した。

【００１３】（実施例2）染色体ＤＮＡの調製 JCM９９７４の染色体DNAは以下の方法により調製した。
培養終了後5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集
菌する。菌体を10mM Tris(pH 7.5) 1mM EDTA溶液で２回
洗浄後InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入す
る。このブロックを１％N-lauroylsarcosine、 1mg/ml
プロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNA
はAgaroseブロック中に分離調製された。

【００１４】（実施例3）染色体DNAを含むライブラリー
クローンの作製 実施例2で得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIにより
部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断
片を調製した。このDNA断片と制限酵素HindIIによって
完全分解したBacベクターpBAC108L及びpFOS1とをT4リガ
ーゼを用いて結合させた。前者のベクターを用いた場合
には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気孔窄法
により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合に
は結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold（ストラタジーン
社製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、
この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌
内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質ク
ロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBAC及びFosmid
ライブラリーとした。ライブラリーからJCM９９７４の
染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、ク
ローンの整列化を行った。

【００１５】（実施例4）各BAC或いはFosmidクローンの
塩基配列決定 整列化されたBAC或いはFosmidクローンについて順次以
下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収
した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理する
ことにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1k
b及び2kb長のDNA断片を回収した。この断片をプラスミ
ドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に挿入したショ
ットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン当たり5
00クローン作製した。各ショットガンクローンの塩基配
列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列読み取り
装置373または377を用いて決定していった。各ショット
ガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結
ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC或いはFos
midクローンの全塩基配列を決定していった。

【００１６】（実施例5）DNAポリメラーゼ遺伝子の同定 上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配
列の大型計算機による解析を行い、DNAポリメラーゼを
コードする遺伝子（配列番号１）が同定された。 （実施例6）発現プラスミドの構築 構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdeIとBamHI）サイ
トを構築する目的でDNAプライマーを合成し、ＰＣＲで
その遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。

【００１７】Upper primer 、 5'-TTTTGTCGACTTACATATGATCCTGGATGCTGATTATATTACCGAAG
ATGGCAAACCGAT-3'（配列番号３） Lower primer 、 5'-TTTTGGTACCTTTGGATCCTTAGGCATATTAAGACTTCTTGACCTT-
3' （配列番号４）

【００１８】ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとBamHI）
で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子を
精製した。pET11a或いはpET15b（Novagen社製)を制限酵
素NdeIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子
とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連
結したＤＮＡの一部をE. coli-XL1-BlueMRF1のコンピテ
ントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られ
たコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製し
た。

【００１９】（実施例7）組換え遺伝子の発現 大腸菌（E. coli HMS174(DE3) 、 Novagen社製）のコン
ピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ｍL
移す。その中に発現プラスミド溶液0.005ｍＬを加え氷
中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行
い、ＳＯＣmedium0.9mLを加え、37度で1時間振とう培養
する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに
適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体を得た。な
お、この形質転換体をE. coli HMS174(DE3) pET15b/DNA
pol と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に
平成１０年７月１４日に寄託した（受託番号：FERM P-1
6898) 。

【００２０】当形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ
培地（２リットル）で600ｎｍの吸収が1に達するまで培
養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyra
noside）を加えさらに14時間培養した。培養後遠心分離
（6,000ｒｐｍ，20min）で集菌した。

【００２１】（実施例8）耐熱性酵素の精製 集菌した菌体を-20℃で凍結融解し、２倍量の10 mMトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）と1 mgのDNaseを加え懸濁液を
得た。得られた懸濁液を37℃で30分保温した後、10分間
超音波照射した。さらに８５℃で30分加熱後、遠心分離
(11,000 rpm、20分)し上澄液を得た。これをNi-カラム
（Novagen 、 His・Bind metal chelation resin & Hi
s・Bind buffer kitを使用）にかけ親和性クロマトグラ
ムを行った。ここで得られた60 mMイミダゾール流出画
分をセントリプレップ30(アミコン社)で100 mMリン酸緩
衝液(pH6.0)に置換した。さらに、これをHiTrap SP（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配によ
る溶出を行った。次に、各画分のSDS-電気泳動を行い、
含まれるタンパク質の分子量を測定した。遺伝子配列よ
り当該DNAポリメラーゼの分子量は80,000 Daと予測され
たので、この分子量のタンパク質を含む画分を集め、セ
ントリプレップ30を用い50 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
7.0）へ置換した。これをさらに次の親和性クロマトグ
ラム、HiTrapヘパリン（ファルマシア社製）カラムに吸
着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い精製酵素を得
た。

【００２２】（実施例9）酵素反応条件 （１）PCR反応 当該DNAポリメラーゼの活性検出を目的に、前記の２種
のDNAオリゴマー（Upper primerとLower primer）と当
該酵素をコードする発現ベクターpET15b/DNA polを鋳型
DNAとしてPCR反応を行った。反応温度条件は１サイクル
が３ステップ（94℃：１分、61℃：２分、70℃：３分）
からなり、３５サイクルを繰り返した。反応液組成(100
ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8）、10 mM KCl
、 4 mM MgSO₄ 、 0.1% Triton X-100、 0.375 mM dNT
P mix、 100 pmol Upper primer、 100 pmol Lower pri
mer、 0.1μg DNAポリメラーゼであった。

【００２３】（２）DNA合成反応 DNA合成反応はKornbergらの方法（Aposhian, H. V., a
nd Kornberg, A., (1962) J. Biol. Chem., 237, 519-5
25.; Kornberg, R. S., Zimmerman, B. S., and Kornbe
rg, A., (1961) J. Biol. Chem., 236, 1487-1493.）に
従った。反応液組成(200 ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.8）、10 mM KCl 、 10 mM (NH₄)₂SO₄、 2 mM M
gSO₄ 、 0.1% Triton X-100、 0.25 mM dNTP mix 、
0.37 Mbqの(α-³²P) dATP、 20 mgの加熱急冷処理サケ
精巣DNA 、 0.1μg の DNAポリメラーゼであった。反応
は75℃で30分間行い、反応後これに0.5 mgの氷冷サケ精
巣DNAを加え、500 mlの氷冷1 N過塩素酸と500 mlの氷冷
水を添加し、酸不溶性画分を遠心分離（9000xg 5分間）
で得た。この沈殿を300 mlの0.2 NのNaOHに溶解し、再
度300 mlの氷冷1 N過塩素酸と300 mlの氷冷水を加え、
遠心分離で酸不溶性画分を得た。この沈殿を1 mlの1 N
酢酸で洗浄し、遠心分離後沈殿を0.4 mlの2 Nアンモニ
ア水に溶解し、この放射活性をCherenkov効果で液体シ
ンチレーションカウンターを用いて測定した。

【００２４】（３）至適pH 至適pHは、トリス塩酸緩衝液系の温度上昇に伴うpHの減
少を考慮し、上記測定条件における反応温度を25℃に固
定し、酵素反応液のpHをトリス塩酸緩衝液を用い7.0か
ら9.42まで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取り
込みにより決定した。 （４）至適Mg²⁺濃度 至適Mg²⁺濃度は、上記DNA合成反応でMgSO₄濃度を2 mMか
ら10 mMまで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取
り込みにより決定した。

【００２５】（５）DNA合成時の正確性 DNA合成時の正確性はKunkelの方法(Kunkel, A. T., (19
85) J. Biol. Chem.,260, 5787-5796.)で測定した。ま
ずβ-ガラクトシダーゼのαペプチドをコードする遺伝
子部分にギャップを含むファージDNA, Gapped M13mp2を
造成した。これを基質としてDNA合成を行った。合成反
応は20 mM Hepes (pH 7.8)、 2mM Dithiothreitol 、 1
0 mM MgCl₂、 500 mM dNTP、 0.3 mg のgapped circula
r DNA 、0.1μg の当該DNAポリメラーゼを用いて、75℃
で30分間行った。次にDNA合成反応物を用い、E. coli C
SH50(D(pro-lac), ara-, thi-/F'(traD36, proAB, lacI
_QZΔ-M15)) を形質転換し、形質転換体を指示菌と共に5
-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド (X
-Gal)を含む2YT(Amp)培地にまき、生じた白色プラーク
の青色プラークに対する割合を調べた。

【００２６】（６）熱安定性 加熱処理用の酵素液(100 ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.8 、 25 ℃）、25 mM NaCl 、 10 mM KCl、 10 m
M (NH₄)₂SO₄、 2 mM MgSO₄ 、 0.1% Triton X-100 と0.
1 mg/ml濃度の当該酵素を含む。これをGeneAmp PCR Sys
tem 2400 (Perkin Elmer)で90℃と98℃で3時間加熱処理
し、残存活性を上記DNA合成反応を用い、酸不溶性画分
への放射活性の取り込みで測定した。

【００２７】（実施例10）酵素の諸性質 （１）タンパク質化学的性質 当該酵素は774アミノ酸残基より構成され、その分子量
は80,000 Daである。 （２） PCR反応とDNA合成反応 PCR反応の結果、目的DNAフラグメントと同じ長さ（2372
bp）の増幅反応産物をアガロースゲル電気泳動で確認
した。また、当該酵素を含まない反応系では PCR反応産
物は検出されなかった。さらに、加熱急冷処理サケ精巣
DNAを基質とした75℃でのDNA合成反応に於て、酵素(0.1
μg)と4 mM MgSO₄を添加した反応系では非添加系に較べ
577倍以上の放射活性の上昇を検出した。以上の事実よ
り、当該DNAポリメラーゼは十分活性であることが明ら
かになった。また、75℃の30分間の合成反応に於て10 n
molのdNTPを取り込む酵素量を1単位( Unit)と規定する
と、この活性1単位は0.082 μgの酵素量に相当した。さ
らに、この時の合成速度は5.6塩基／秒であった。

【００２８】（３）至適pH 25℃で至適pHは8.5であった。 （４）至適Mg²⁺濃度 本酵素の至適Mg²⁺濃度は4 mMであった。

【００２９】（５）DNA合成時の正確性 Kunkel法を用いたDNA合成反応を行い、生じたファージD
NAを用いて形質転換反応を行い、全部で6630個のファー
ジプラークを検出し、その中に23個の白色ないしは薄い
水色のファージプラークが含まれていた。その結果、当
該酵素の変異誘起率は35x10^-4であった。コントロール
として行った好熱性細菌Thermus aquaticus由来のTaq D
NAポリメラーゼの変異誘起率が130x10^-4であったので、
当該酵素はTaq DNAポリメラーゼに較べ格段に良いDNA合
成時の正確性を示したと言える。

【００３０】（６）熱安定性 図１に示すように、当該酵素は98℃、３時間の加熱処理
でも安定であり、むしろ酵素触媒能の活性化が見られ
た。さらに、90℃、３時間の加熱処理は98℃のそれより
効果的で、非加熱酵素に較べ、２．５倍の酵素活性上昇
をもたらした。

【００３１】

【発明の効果】本発明により、新規なDNAポリメラーゼ
が提供された。このDNAポリメラーゼは、高温環境下で
正確な複製が行えるので、遺伝子増幅反応(PCR反応)等
に有用である。また、このDNAポリメラーゼはDNAシーク
エンシング反応にも利用できるので、当該酵素を用いた
遺伝子配列解析に関する新手法の開発が可能になる。

【００３２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> Heat-resistant Enzyme having DNA Polymerase Activity <130> 11900221 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2328 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <220> <221> CDS <222> (1)..(2325) <400> 1 atg atc ctg gat gct gat tat ata acc gaa gat ggc aaa ccg ata att 48 Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Ile Ile 1 5 10 15 agg ata ttt aaa aaa gaa aat ggt gag ttt aaa gtc gaa tac gac agg 96 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Val Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 aat ttt agg cca tat att tac gcc ctc ctt aga gat gac tct gcg ata 144 Asn Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 gac gaa ata aag aag atc acg gcc caa aga cat gga aaa gtt gtg aga 192 Asp Glu Ile Lys Lys Ile Thr Ala Gln Arg His Gly Lys Val Val Arg 50 55 60 att gta gaa acc gag aag att caa aga aaa ttt ttg gga agg cca ata 240 Ile Val Glu Thr Glu Lys Ile Gln Arg Lys Phe Leu Gly Arg Pro 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Met Ile Lys 180 185 190 agg cta att agg gta att aag gag aaa gat ccg gat gta ata atc act 624 Arg Leu Ile Arg Val Ile Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr 195 200 205 tac aac ggt gat aac ttt gac ttt cca tac ctc cta aag agg gct gaa 672 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Arg Ala Glu 210 215 220 aag ctc ggt ata aag ctc ctc ctt gga agg gat aat agc gag cca aaa 720 Lys Leu Gly Ile Lys Leu Leu Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 atg cag aaa atg ggt gac tct cta gcg gta gag ata aaa ggg aga ata 768 Met Gln Lys Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu Ile Lys Gly Arg Ile 245 250 255 cac ttt gat ctc ttc cct gtg ata cgg aga aca ata aac ttg cca act 816 His Phe Asp Leu Phe Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 tac aca ctt gaa gcg gtt tac gag gcc ata ttt ggt aag ccg aag gag 864 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 aag gta tat gca gat gag att gca aag gcc tgg gaa act ggg gaa gga 912 Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300 ctc gag aga gtt gca aag tac tca atg gag gac gcc aag gta act tac 960 Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 gag ctc ggg aga gag ttc ttt ccg atg gaa gcc cag ctc gca agg ctc 1008 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ala Arg Leu 325 330 335 gtc gga caa cca gtt tgg gat gtt tct aga tcc agt aca gga aac tta 1056 Val Gly Gln Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 gtt gag tgg ttc ctc ctc aga aaa gcg tat gaa agg aac gag cta gcc 1104 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 cct aac aag cca gat gaa aag gag tat gag aga agg cta agg gaa agt 1152 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Tyr Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ser 370 375 380 tac gag gga gga tat gta aag gag cca gaa aag gga tta tgg gag gga 1200 Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Gly 385 390 395 400 ata gta agc tta gac ttc cgc agt cta tat ccc tca ata ata ata acc 1248 Ile Val Ser Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr 405 410 415 cac aac gtt tct ccc gat acc ctc aac cga gaa gga tgc gag gaa tat 1296 His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Glu Glu Tyr 420 425 430 gac gtg gct ccc aag gta gga cac cgc ttc tgt aaa gac ttt cca ggg 1344 Asp Val Ala Pro Lys Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly 435 440 445 ttc att cca agt cta ctt ggt cag cta ctc gaa gaa agg caa aag atc 1392 Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Gln Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile 450 455 460 aag aag aga atg aag gag agc aaa gat ccc gtt gag aaa aag ctc ctc 1440 Lys Lys Arg Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val Glu Lys Lys Leu Leu 465 470 475 480 gac tac agg caa cgg gct atc aag atc tta gca aac agt tat tac ggg 1488 Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly 485 490 495 tat tat ggt tat gcg aaa gct aga tgg tac tgc aaa gag tgc gca gaa 1536 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 500 505 510 agc gtt acg gca tgg ggg agg caa tac ata gat tta gtt agg aga gaa 1584 Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Asp Leu Val Arg Arg Glu 515 520 525 ctt gaa gct aga gga ttt aaa gtc ctg tat ata gac acg gat gga ctc 1632 Leu Glu Ala Arg Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu 530 535 540 tac gcg act att cct ggg gtt aag gac tgg gaa gag gtt aaa agg agg 1680 Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Val Lys Asp Trp Glu Glu Val Lys Arg Arg 545 550 555 560 gcc tta gag ttc gta gac tat ata aac tcc aag ctc cca gga gtt ctc 1728 Ala Leu Glu Phe Val Asp Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Val Leu 565 570 575 gaa ctc gaa tat gag ggc ttt tac gca agg ggg ttc ttc gtc aca aag 1776 Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys 580 585 590 aag aag tat gcc ctg ata gat gag gaa gga aag ata gtg aca aga ggt 1824 Lys Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly 595 600 605 cta gag ata gtt agg agg gac tgg agt gag ata gca aag gag acc caa 1872 Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln 610 615 620 gca aga gtt tta gag gcc ata ctc aag cac ggt aat gtt gaa gag gcc 1920 Ala Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn Val Glu Glu Ala 625 630 635 640 gtc aag ata gtt aag gat gta acc gaa aag ctg aca aat tat gaa gtt 1968 Val Lys Ile Val Lys Asp Val Thr Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Val 645 650 655 ccc cca gaa aag ctg gtc ata tac gag cag ata acg agg cca ata aat 2016 Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Ile Asn 660 665 670 gaa tac aag gca ata ggg ccc cac gta gcc gtg gca aag agg ctt atg 2064 Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Met 675 680 685 gcc agg gga atc aag gtg aaa cct ggg atg gtg ata ggg tac ata gtc 2112 Ala Arg Gly Ile Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val 690 695 700 ctc agg ggt gat ggc ccg ata agt aag agg gct atc tca ata gaa gaa 2160 Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile Ser Ile Glu Glu 705 710 715 720 ttc gat ccc agg aag cat aaa tac gac gcc gaa tac tac ata gag aac 2208 Phe Asp Pro Arg Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn 725 730 735 caa gtc tta cct gcc gtt gaa aga ata ctc aaa gct ttt ggg tac aaa 2256 Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Lys 740 745 750 agg gaa gac ctt agg tgg cag aaa aca aaa caa gtg gga tta gga gca 2304 Arg Glu Asp Leu Arg Trp Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala 755 760 765 tgg atc aag gtc aag aag tct taa 2328 Trp Ile Lys Val Lys Lys Ser 770 <210> 2 <211> 775 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 2 Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Ile Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Val Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Asn Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Asp Glu Ile Lys Lys Ile Thr Ala Gln Arg His Gly Lys Val Val Arg 50 55 60 Ile Val Glu Thr Glu Lys Ile Gln Arg Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Thr Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Leu Ala Val Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Val Ile Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Leu Ile Arg Val Ile Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Ile Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Arg Ala Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Lys Leu Leu Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Met Gln Lys Met Gly Asp Ser Leu Ala Val Glu Ile Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Phe Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ala Arg Leu 325 330 335 Val Gly Gln Pro Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Tyr Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ser 370 375 380 Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Gly 385 390 395 400 Ile Val Ser Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr 405 410 415 His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Glu Glu Tyr 420 425 430 Asp Val Ala Pro Lys Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly 435 440 445 Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Gln Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile 450 455 460 Lys Lys Arg Met Lys Glu Ser Lys Asp Pro Val Glu Lys Lys Leu Leu 465 470 475 480 Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly 485 490 495 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu 500 505 510 Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Gln Tyr Ile Asp Leu Val Arg Arg Glu 515 520 525 Leu Glu Ala Arg Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu 530 535 540 Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Val Lys Asp Trp Glu Glu Val Lys Arg Arg 545 550 555 560 Ala Leu Glu Phe Val Asp Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Val Leu 565 570 575 Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Ala Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys 580 585 590 Lys Lys Tyr Ala Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Val Thr Arg Gly 595 600 605 Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln 610 615 620 Ala Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asn Val Glu Glu Ala 625 630 635 640 Val Lys Ile Val Lys Asp Val Thr Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Val 645 650 655 Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Ile Asn 660 665 670 Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Met 675 680 685 Ala Arg Gly Ile Lys Val Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val 690 695 700 Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Lys Arg Ala Ile Ser Ile Glu Glu 705 710 715 720 Phe Asp Pro Arg Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn 725 730 735 Gln Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Lys 740 745 750 Arg Glu Asp Leu Arg Trp Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala 755 760 765 Trp Ile Lys Val Lys Lys Ser 770 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:An upper primer designed to cre ate the NdeI site. <400> 3 ttttgtcgac ttacatatga tcctggatgc tgattatatt accgaagatg gcaaaccgat 60 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:A lower primer designed to crea te the BamHI site. <400> 4 ttttggtacc tttggatcct taggcatatt aagacttctt gacctt 46

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の耐熱性酵素の90℃と98℃加熱
処理後の残存活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 小杉 佳次 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 河原林 裕 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 菊池 久 東京都渋谷区西原２−49−10 製品評価 技術センター内 (56)参考文献 米国特許5827716（ＵＳ，Ａ) 米国特許5545552（ＵＳ，Ａ) 米国特許5489523（ＵＳ，Ａ) 国際公開98／1567（ＷＯ，Ａ１) ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５（２) （1998），ｐ．55−76 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列において１若
   しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
   てもよいアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡポリメラー
   ゼ活性を有する耐熱性酵素。
2. 【請求項２】 ９０℃以上の温度での加熱処理後に１０
   ０％またはそれ以上の残存活性を呈する請求項１記載の
   酵素。
3. 【請求項３】 さらに3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活
   性を有する請求項１または２に記載の酵素。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を
   コードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号１の塩基配列を有する請求項４
   記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項４記載のＤＮＡを含む組換えベク
   ター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターにより形
   質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を
   製造する方法であって、該酵素をコードするＤＮＡを含
   む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養
   し、次いで培養物から該酵素を採取する工程を含む前記
   方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を
   用いることを特徴とする核酸の増幅方法。