ES2813698T3 - Vectores de AAV que comprenden un gen que codifica el factor VIII - Google Patents

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Abstract

Un vector de factor VIII (FVIII) de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, o la SEQ ID NO: 4, en donde dicho vector de FVIII de AAV tiene menos de 5,0 kb de longitud.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores de AAV que comprenden un gen que codifica el factor VIII
La presente solicitud reivindica prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de Serie 61/877.042, presentada el jueves, 12 de septiembre de 2013.
Campo de la invención
La invención se refiere a vectores de factor VIII (FVIII) de virus adenoasociado (AAV), incluyendo vectores de FVIII de AAV con alta actividad de expresión y vectores de FVIII de AAV que expresan FVIII funcional de longitud completa o truncado. La invención también se refiere a métodos para preparar los vectores de FVIII de AAV descritos en el presente documento y usos terapéuticos asociados de los mismos.
Antecedentes
El virus adenoasociado (AAV) es un pequeño animal, de replicación defectuosa, sin envoltura que infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates. Varias características de AAV hacen de este virus un vehículo atractivo para la administración de proteínas terapéuticas mediante terapia génica, incluyendo, por ejemplo, que no se sabe que el AAV cause enfermedades humanas e induzca una respuesta inmune leve, y que los vectores de AAV pueden infectar células tanto en división como inactivas sin integrarse en el genoma de la célula hospedadora. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV se han utilizado con éxito en algunos ensayos clínicos, por ejemplo, para la administración de factor IX humano (FIX) al hígado para el tratamiento de la hemofilia B (Nathwani et al., New Engl. J. Med. 365:2357-2365, 2011).
Los vectores de terapia génica de AAV tienen algunos inconvenientes, sin embargo. En particular, la capacidad de clonación de los vectores de AAV es limitada como consecuencia de la capacidad de empaquetamiento del ADN del virus. El genoma de ADN monocatenario del AAV de tipo silvestre es de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). En la práctica, los genomas de AAV de hasta aproximadamente 5,0 kb parecen estar completamente empaquetados, es decir, de longitud completa, en partículas de virus de AAV. Con el requisito de que el genoma del ácido nucleico en los vectores AAV debe tener dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV de aproximadamente 145 bases, la capacidad de empaquetamiento de ADN de un vector de AAV es tal que se puede encapsidar un máximo de aproximadamente 4,4 kb de secuencia codificante de proteínas.
Debido a esta restricción de tamaño, grandes genes terapéuticos, es decir, los mayores de aproximadamente 4,4 kb de longitud, generalmente no son adecuados para su uso en vectores de AAV. Uno de esos genes terapéuticos es el gen del factor VIII (FVIII), que tiene un ARNm de aproximadamente 7,0 kb que codifica un polipéptido de 2332 aminoácidos que comprende, del extremo N-terminal al extremo C-terminal, un péptido señal de 19 aminoácidos y tres dominios grandes (es decir, la cadena pesada o el dominio A, el dominio central o B, y la cadena ligera o dominio C). Una estrategia que se había empleado para superar la limitación del tamaño del vector de AAV para el FVIII era utilizar dos vectores de AAV, uno que codifica la cadena pesada o el dominio A, y el otro que codifica la cadena ligera o el dominio C (véase, por ejemplo, Coutu et al., las Patente de EE.UU. N.° 6.221349, 6.200.560 y 7.351.577). Otra estrategia para eludir esta restricción de tamaño fue generar vectores de VAA que codifiquen el FVIII en los que la porción central o el dominio B de la proteína se haya eliminado y reemplazado con un enlazador de 14 aminoácidos, conocido como la secuencia SQ (Ward et al., Blood, 117:798-807, 2011 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013).
Si bien se han documentado en la bibliografía vectores de AAV que tienen genomas de AAV de> 5,0 kb, en muchos de estos casos, los extremos 5 'o 3' de los genes codificados parecen estar truncados (véase Hirsch et al., Molec. Ther. 18-6-8, 2010 y Ghosh et al., Biotech. Genet. Engin. Rev. 24:165-178, 2007). Se ha demostrado, sin embargo, que se produce una recombinación homóloga solapante en células infectadas con AAV entre ácidos nucleicos que tienen truncamientos en el extremo 5' y truncamientos en el extremo 3' de modo que se genera un ácido nucleico "completo" que codifica la proteína grande, reconstruyendo así un gen funcional de longitud completa.
Existe la necesidad de nuevos vectores de AAV que codifiquen una proteína de factor VIII funcional útil en enfoques de terapia génica para el tratamiento de la hemofilia A. Como tal, la presente invención se refiere a vectores de AAV que codifican FVIII funcionalmente activo de modo que los viriones de AAV encapsidan todo el ácido nucleico que codifica la proteína terapéutica, es decir, vectores de FVIII de AAV completamente empaquetados, evitando así los problemas mencionados anteriormente de genomas sobredimensionados, o al menos producir una proteína de Factor VIII funcionalmente activa, que puede estar truncada o no. Además, para evitar la respuesta inmune dirigida por la cápside, los vectores de AAV deberían tener la mayor actividad de transducción/expresión posible de la proteína diana por partícula de cápside. La presente invención también se refiere a la producción de vectores de FVIII de AAV completamente con alta actividad de expresión. Por último, la presente invención se refiere a métodos para producir los vectores de factor VIII de AAV descritos en el presente documento y a métodos asociados para el uso de los mismos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona vectores de AAV que codifican FVIII funcionalmente activo (denominados en el presente documento "vectores de FVIII de AAV").
Tal como se usa en el presente documento, un "FVIII funcionalmente activo" es una proteína de FVIII que tiene la funcionalidad de una proteína de FVIII de tipo silvestre in vitro, cuando se expresa en células cultivadas, o in vivo, cuando se expresa en células o tejidos corporales. Esto incluye, por ejemplo, permitir que se produzca la coagulación de la sangre y disminuyendo el tiempo que tarda la sangre en coagularse en un sujeto que padece hemofilia A. El FVIII de tipo silvestre participa en la coagulación sanguínea a través de la cascada de la coagulación, actuando como un cofactor para FIX activado (FIXa) que, en presencia de iones de calcio y fosfolípidos forma un complejo que convierte el Factor X (FX) en FX activado (FXa). En consecuencia, un FVIII funcionalmente activo puede formar un complejo con FIXa, que puede convertir FX a FXa.
Tal como se usa en el presente documento, un "vector de AAV" se refiere a ácidos nucleicos, ya sean monocatenarios o bicatenarios, que tienen una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV 5' y una ITR de AAV 3' que flanquea una secuencia codificadora de proteínas unida operativamente a elementos reguladores de la transcripción, es decir, uno o más promotores y/o potenciadores, y una secuencia de poliadenilación, y, opcionalmente, uno o más intrones insertados entre exones de la secuencia que codifica la proteína. Un vector de AAV monocatenario se refiere a ácidos nucleicos que están presentes en el genoma de una partícula de virus AAV y pueden ser la cadena sentido o la cadena antisentido de las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento. El tamaño de tales ácidos nucleicos monocatenarios se proporciona en bases. Un vector de AAV bicatenario se refiere a los ácidos nucleicos que están presentes en el ADN de los plásmidos, por ejemplo, pUC19, o el genoma de un virus bicatenario, por ejemplo, baculovirus, utilizado para expresar o transferir los ácidos nucleicos del vector de AAV. El tamaño de dichos ácidos nucleicos bicatenarios se proporciona en pares de bases (pb).
La expresión "repetición terminal invertida (ITR)", tal como se usa en el presente documento, se refiere a las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en los extremos 5' y 3' del genoma de AAV que funcionan en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el genoma vírico. Las ITR de AAV, junto con la región codificante de rep AAV, proporcionan una escisión y rescate eficientes e integración de una secuencia de nucleótidos interpuestos entre dos ITR flanqueantes en el genoma de una célula hospedadora. Las secuencias de ciertas ITR asociadas al AAV se desvelan por Yan etal., J. Virol. 79:(1):364-379 (2005), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Un "elemento regulador de la transcripción" se refiere a secuencias de nucleótidos de un gen implicado en la regulación de la transcripción genética, incluido un promotor, más elementos de respuesta, secuencias activadoras y potenciadoras para la unión de factores de transcripción para ayudar a la unión de la ARN polimerasa y promover la expresión, y secuencias operadoras o silenciadoras a las que se unen las proteínas represoras para bloquear la unión de la ARN polimerasa y evitar la expresión. La expresión "elemento regulador de la transcripción específico del hígado" se refiere a un elemento regulador que modula la expresión génica específicamente en el tejido hepático. Los ejemplos de elementos reguladores específicos del hígado incluyen, pero sin limitación, el promotor de tirretina de ratón (mTTR), el promotor endógeno del factor VIII humano (F8), el promotor de alfa-1-antitripsina humana (hAAT) y sus fragmentos activos, el promotor mínimo de albúmina humana y promotor de albúmina de ratón. También se contemplan potenciadores derivados de sitios de unión de factores de transcripción específicos del hígado, tales como EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, con Enh1.
En el presente documento se describe un vector de AAV que comprende un ácido nucleico que codifica el FVIII funcionalmente activo que tiene el dominio B reemplazado por la secuencia SQ de 14 aminoácidos, es decir, la SQ codificante de FVIII. La secuencia SQ se desvela en Ward et al., Blood, 117:798-807, 2011 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013. La secuencia de la región codificante de FVIII es una secuencia optimizada por codón (véase Nathwani et al., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013). Esta secuencia se denomina en el presente documento "UCL SQ FVIII".
En un primer aspecto, el vector de AAV de la invención comprende Proto 1, que se representa esquemáticamente en la Figura 2A y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde el vector tiene menos de 5,0 kb de longitud.
En un segundo aspecto, el vector de AAV de la invención comprende Proto 1S, que se representa esquemáticamente en la Figura 2B y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde el vector tiene menos de 5,0 kb de longitud.
En un tercer aspecto, el vector de AAV de la invención comprende Proto 2S, que se representa esquemáticamente en la Figura 2C y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 3, en donde el vector tiene menos de 5,0 kb de longitud.
En un cuarto aspecto, el vector de AAV de la invención comprende Proto 3S, que se representa esquemáticamente en la Figura 2D y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4, en donde el vector tiene menos de 5,0 kb de longitud.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende un ácido nucleico que codifica el FVIII que carece del dominio B completo, incluyendo la secuencia SQ y el dominio a3, que se encuentra justo en el extremo N-terminal de la cadena ligera o el dominio C. La secuencia de la región codificante de FVIII es una secuencia optimizada por codón (véase Nathwani et al., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013).
También se desvela en el presente documento un vector de AAV que comprende Proto 4, que se representa esquemáticamente en la Figura 3A y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 5. También se desvela en el presente documento un vector de AAV que comprende Proto 5, que se representa esquemáticamente en la Figura 3B y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 6. También se desvela en el presente documento un vector de AAV que comprende Proto 6, que se representa esquemáticamente en la Figura 3C y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 7. También se desvela en el presente documento un vector de AAV que comprende Proto 7, que se representa esquemáticamente en la Figura 3D y comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 8. El vector de AAV descrito en el presente documento puede comprender un ácido nucleico que comprende una repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV2, una región reguladora de la transcripción específica del hígado, una región codificante de FVIII funcionalmente activa optimizada por codón, opcionalmente uno o más intrones, una secuencia de poliadenilación y una ITR 3' de AAV2. La región reguladora de la transcripción específica del hígado puede comprender una secuencia potenciadora de ApoE acortada, un promotor proximal alfa anti-tripsina humana (hAAT) de 186 bases, incluyendo 42 bases de la región 5' no traducida (uTr), y uno o más potenciadores seleccionados del grupo que consiste en (i) un potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases, (ii) una región X distal del promotor AAT humano de 32 bases y (iii) 80 bases adicionales del elemento distal del promotor proximal AAT humano; y una región codificante de FVIII funcionalmente activa optimizada por codón codifica la variante SQ de FVIII. La región reguladora de la transcripción específica del hígado descrita en el presente documento puede comprender una secuencia potenciadora de microglobulina a l y el promotor proximal alfa anti-tripsina (AAT) humano de 186 bases. También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100ATG que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 9.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100ATG bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 10.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100ATG corta bGH poliA establecida en la SeQ ID NO: 11.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103ATG que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 12.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103ATG corta bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 13.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 105ATG bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 14.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción DC172ATG FVIII que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 15.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción DC172ATG FVIII hAAT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 16.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción DC1722xHCR ATG FVIII que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 17.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción DC1722xHCR ATG FVIII hAAT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 18.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 19.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x potenciador de p-globulina que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 20.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100ATG corta poliA 2x potenciadora de p-globulina que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 21. También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción Factor VIII-BMN001 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 22.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción de secuencia de Factor VIII-BMN002 expuesta en la SEQ ID NO: 23.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 99 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 24.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 25.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100 de orientación inversa que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la s Eq ID NO: 26.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100AT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 27.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100AT 2x MG que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 28.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100AT 2x MG bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 29.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100AT 2x MG (inversa) bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 30.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100 bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 31.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 100-400 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 32.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 101 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 33.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 102 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 34.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 35.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103 de orientación inversa que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la s Eq ID NO: 36.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103AT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 37.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103AT 2xMG que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 38.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103AT 2xMG bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 39.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 103 bGH poliA que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 40.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 104 que comprende el ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 41.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 105 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 42.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 106 que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 43.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 106AT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 44.
También se describe en el presente documento un vector de AAV que comprende la construcción 2x SerpinA hAAT que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 45.
La presente divulgación también está dirigida a construcciones de vectores que codifican un polipéptido funcional del factor VIII, en donde dichas construcciones comprenden uno o más de los elementos individuales de las construcciones descritas anteriormente y combinaciones de las mismas, en una o más orientaciones diferentes. La presente divulgación también se dirige a las construcciones descritas anteriormente en una orientación opuesta.
En otra realización, la invención proporciona métodos para producción de una partícula de virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende cualquiera de los vectores de AAV de la invención. Los métodos comprenden las etapas de cultivar una célula que ha sido transfectada con cualquiera de los vectores de AAV de la invención y recuperar el AAV recombinante del sobrenadante de la célula transfectada.
Las células de la invención son de cualquier tipo de célula susceptible a la infección por baculovirus, incluyendo células de insectos como High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 y Ao38. Las células de mamífero preferidas utilizadas pueden ser HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 y células MRC-5, incluidas las células de mamíferos como HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 y células MRC-5.
La invención también proporciona una partícula vírica que comprende cualquiera de los vectores AAV de la invención.
Un "virión de AAV" o "partícula vírica de AAV" o "partícula de vector de AAV" se refiere a una partícula vírica compuesta de al menos una proteína de la cápside de AAV y un vector de polinucleotídico encapsidado de AAV. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto del genoma de AAV de tipo silvestre, como un transgén que se administrará a una célula de mamífero), se denomina típicamente como una "partícula de vector de AAV" o simplemente como un "vector de AAV". Por lo tanto, la producción de partículas de vector de AAV incluye necesariamente la producción de vector de AAV, ya que dicho vector está contenido dentro de una partícula de vector de AAV.
La invención también proporciona células que comprenden cualquiera de los vectores AAV de la invención.
En otra realización, la invención proporciona métodos para tratar a un paciente que padece hemofilia A que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de cualquiera de los vectores de a Av de la invención, o una partícula vírica de la invención.
En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera de los vectores de AAV de la invención para el tratamiento de la hemofilia A.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona un esquema del vector UCL SQ. De izquierda a derecha, el vector UCL SQ comprende la 5' ITR de AAV2, la secuencia vírica AAV2 de tipo silvestre, el potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases, la región X distal del promotor AAT humano de 32 bases, el promotor AAT humano de 186 bases, que incluye 42 bases de la secuencia 5 'UTR, la secuencia SQ de FVIII humano optimizada por codón (véase Nathwani et al., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013), la secuencia de poliadenilación sintética de 49 bases, la secuencia vírica de AAV2 de tipo silvestre y la 3'ITR de AAV2. El vector UCL SQ tiene 5081 bases de longitud.
La Figura 2 proporciona esquemas y secuencias de los vectores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S y Proto 3S. (A) Esquema del vector Proto 1. Comenzando por el vector UCL SQ (véase la Figura 1), se eliminaron las secuencias víricas de AAV2 extrañas de tipo silvestre y las secuencias correspondientes a los sitios de restricción entre la AAT 5 'UTR humana y la región codificante del FVIII humano, y entre el codón de terminación del FVIII humano. y la secuencia de poliadenilación sintética. (B) Esquema del vector Proto 1S. Comenzando por el vector Proto 1, se eliminaron 10 bases en el extremo 3' de la 5'ITR de AAV2 y 10 bases en el extremo 5' de la 3' ITR. (C) Esquema del vector Proto 2S. Comenzando por el vector Proto 1S, el potenciador de ApoE/C1 humano y la región X distal del promotor de AAT humano se movieron a un intrón sintético de 100 bases que se insertó entre los exones 1 y 2 de la secuencia del FVIII humano. Tal como indican las flechas, la orientación del potenciador de ApoE/C1 humano y de la región X distal del promotor de AAT humano se invierte en comparación con su orientación en Proto 1S. (D) Esquema del vector Proto 3S. Comenzando por el Proto 2S, la región X distal del promotor de AAT humano se reemplaza por una segunda copia del potenciador ApoE/C1 humano en la orientación inversa.
La Figura 3 proporciona esquemas de los vectores Proto 4, Proto 5, Proto 6 y Proto 7. (A) Esquema del vector Proto 4. Comenzando por el vector Proto 1, se eliminaron la secuencia SQ y el dominio a3. (B) Esquema del vector Proto 5. Comenzando por el vector Proto 4, se insertó un intrón de FVIII de 129 bases entre los exones 1 y 2 de la secuencia del factor VIII humano. (C) Esquema del vector Proto 6. Comenzando por el vector Proto 5, se insertó una segunda copia del potenciador de ApoE/C1 humano en la orientación directa en el intrón de FVIII. (D) Esquema del vector Proto 7. Comenzando por el vector Proto 5, se insertó una segunda copia del potenciador de ApoE/C1 humano en la orientación inversa en el intrón de FVIII.
La Figura 4A - Figura 4KK proporciona esquemas de los vectores de FVIII de AAV con secuencias promotoras/potenciadoras mejoradas. (A) Esquema de la construcción 100ATG. (B) Esquema de la construcción 100ATG bGH poliA. (C) Esquema de la construcción 100ATG corta bGH poli A. (D) Esquema de la construcción 103ATG. (E) Esquema de la construcción 103ATG bGH poli A corta. (F) Esquema de la construcción 105ATG bGH poliA. (G) Esquema de la construcción DC172ATG FVIII. (H) Esquema de la construcción DC172ATG FVIII hAAT. (I) Esquema de la construcción DC172 2xHCR ATG FVIII. (J) Esquema de la construcción DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT. (K) Esquema de la construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII. (L) Esquema de la construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x potenciador de p-globulina. (M) Esquema de la construcción 100ATG corta bGH poli A 2x potenciador de p-globulina. (N) Esquema de la construcción del factor VIII-BMN001. (O) Esquema de la construcción FVIII-BMN002. (P) Esquema de la construcción 99. (Q) Esquema de la construcción 100. (R) Esquema de la construcción 100 de orientación inversa. (S) Esquema de la construcción 100AT. (T) Esquema de la construcción 100AT 2x MG. (U) Esquema de la construcción 100AT 2x MG bGH poliA. (V) Esquema de la construcción 100AT 2x MG bGH poli A (inversa). (W) Construcción 100 bGH poli A. (X) Esquema de la construcción 100-400. (Y) Esquema de la construcción 101. (Z) Esquema de la construcción 102. (AA) Esquema de la construcción 103. (BB) Esquema de la construcción 103 con orientación inversa (CC) Esquema de la construcción 103AT. (DD) Esquema de la construcción 103AT 2x MG. (EE) Esquema de la construcción 103AT 2x MG bGH poli A. (FF) Esquema de la construcción 103 sbGH poli A. (GG) Esquema de la construcción 104. (HH) Esquema de la construcción 105. (II) Esquema de la construcción 106. (JJ) Esquema de la construcción 106AT. (KK) Esquema de la construcción 2x SerpinA hAAT.
La Figura 5 proporciona los resultados de la evaluación de las construcciones de Proto en ratones Rag2, y demuestra que Proto 1 transduce FVIII de forma similar al tipo silvestre.
Las Figuras 6 y 7 demuestran que Proto 1, Proto 1S, Proto 2S y Proto 3S expresan la proteína VP1, VP2 y VP3 (Figura 5) y el ADN de VP1, VP2 y VP3 (Figura 6).
Las Figuras 8-10 demuestran que las construcciones de promotor mejoradas tienen una mayor expresión de FVIII.
Descripción detallada
Los vectores de AAV de gran tamaño están truncados aleatoriamente en los extremos 5' y carecen de una ITR de AAV en 5'. Debido a que el AAV es un virus de ADN de monocatenario y empaqueta cadena sentido o antisentido, la cadena sentido en los vectores AAV de gran tamaño carece de la ITR de AAV en 5' y posiblemente porciones del extremo 5' del gen que codifica la proteína diana, y la cadena antisentido en los vectores de AAV de gran tamaño carece de la ITR en 3' y posiblemente porciones del extremo 3' del gen que codifica la proteína diana. Se produce un transgén funcional en células infectadas con vector de AAV de gran tamaño mediante la hibridación de los genomas truncados sentido y antisentido dentro de la célula diana.
La invención proporciona vectores de AAV que codifican el FVIII funcionalmente activo, es decir, vectores de FVIII de AAV completamente empaquetados o vectores de FVIII de AAV con alta actividad de expresión. Los vectores de FVIII de AAV de la invención tienen una expresión/partícula mejorada, así como el rendimiento mejorado de producción de virus de AAV y purificación simplificada. Introducir uno o más intrones en la región codificante de la proteína del FVIII mejoran la expresión. Reconfigurar el número y la posición de los potenciadores también mejora la expresión.
Vector UCL SQ
El vector UCL SQ, que se describe en detalle en Nathwani etal., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, es un vector de AAV de gran tamaño, es decir, mayor que 5,0 kb. Tal como se muestra en la Figura 1, el vector UCL SQ comprende, de izquierda a derecha, el serotipo 2 de AAV (AAV2) 5' ITR, la secuencia vírica AAV2 de tipo silvestre, el potenciador de la apolipoproteína E humana (ApoE)/C1 de 34 bases, la región X distal del promotor alfa anti-tripsina (AAT) humana de 32 bases, el promotor a At humano de 186 bases, que incluye 42 bases de la secuencia de la región no traducida (UTR) 5', la secuencia de FVIII humano optimizada por codón en la que el dominio B se reemplaza con la secuencia SQ de 14 aminoácidos, la secuencia de poliadenilación sintética de 49 bases, la secuencia vírica de AAV2 de tipo silvestre y la 3'ITR de AAV2. El vector UCL SQ tiene 5081 bases de longitud.
Tal como se muestra en Nathwani et al., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013 y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, el vector UCL SQ expresa FVIII funcionalmente activo in vitro e in vivo.
Vectores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S y Proto 3S
Para evitar el problema de los vectores AAV sobredimensionados y/o aumentar la expresión de los vectores de AAV, la invención proporciona vectores de AAV completamente empaquetados, más pequeños, es decir, menos de 5,0 kb, que codifican la variante FVIII SQ. La secuencia de nucleótidos de 4970 pb de la secuencia de Proto 1 se expone en la SEQ ID NO: 1.
Para generar el vector AAV Proto 1, las secuencias que parecen ser innecesarias para la producción de FVIII funcionalmente activo se eliminaron en comparación con el vector UCL SQ. Tal como se muestra en el Ejemplo 1, se eliminaron 110 bases de ADN extraño, incluyendo 53 bases de la secuencia vírica de AAV2 3' a la 5'ITR de AAV2, 46 bases de la secuencia vírica de AAV2 5' a la 3'ITR de AAV2, y 11 bases adyacentes a la región codificante de FVIII SQ optimizada por codón. El vector Proto 1 resultante tiene 4970 bases de longitud. Cuando se diseña, se desconocía si el vector Proto 1 sería capaz de expresar polipéptido funcional de FVIII, ya sea in vitro o in vivo.
Para generar el vector Proto 1S de AAV, se eliminaron 10 bases en el extremo 3' de la 5'ITR de AAV2 y 10 bases en el extremo 5' de la 3'ITR de AAV32 del vector Proto 1. El vector Proto 1S resultante tiene 4950 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 1S se establece en la SEQ ID NO: 2.
Para generar el vector Proto 2S de AAV, se insertó un intrón sintético de 100 bases entre los exones 1 y 2 de la secuencia SQ de FVIII optimizada por codón en el vector Proto 1S. El potenciador ApoE/C1 de 34 bases y la región X distal del promotor de AAT humano de 32 bases se retiraron del promotor de AAT humano y se insertaron en el intrón sintético en la orientación inversa (en comparación con la orientación cuando estos elementos se encuentran en aguas arriba del promotor de AAT humano). El vector Proto 2S resultante tiene 4983 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 2S se establece en la SEQ ID NO: 3.
Para generar el vector Proto 3S de AAV, la región X distal del promotor de AAT humano se eliminó del vector Proto 2S y se reemplazó con una segunda copia del potenciador ApoE/C1 de 34 bases en la orientación inversa. El vector Proto 3S resultante tiene 4984 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 3S se establece en la SEQ ID NO: 4.
Vectores Proto 4, Proto S, Proto 6 y Proto 7
Para reducir el tamaño de los vectores de AAV y/o aumentar la expresión de los vectores de AAV, la invención también proporciona vectores de AAV completamente empaquetados, más pequeños, es decir, menos de 5,0 kb, que codifican el dominio B y el dominio a3 de FVIII delecionado.
Para generar el vector AAV Proto 4, la secuencia SQ de 14 aminoácidos y el dominio a3 ubicado adyacente al dominio C se eliminaron del vector Proto 1. La cantidad total de secuencia de FVIII delecionada es de 55 aminoácidos o 165 bases. El vector Proto 4 resultante tiene 4805 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 4 se establece en la SEQ ID NO: 5.
Para generar el vector AAV Proto 5, se insertó un intrón de FVIII truncado de 129 bases entre los exones 1 y 2 de la secuencia de FVIII optimizada por codón en el vector Proto 4. El vector Proto 5 resultante tiene 4934 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 5 se establece en la SEQ ID NO: 6.
Para generar el vector Proto 6 de AAV, se reemplazaron 34 bases del intrón de FVIII con una segunda copia del potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases en la orientación directa en el vector Proto 5. El vector Proto 6 resultante tiene 4934 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 6 se establece en la SEQ ID NO: 7.
Para generar el vector Proto 7 de AAV, se reemplazaron 34 bases del intrón de FVIII con una segunda copia del potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases en la orientación inversa en el vector Proto 5. El vector Proto 7 resultante tiene 4934 bases de longitud. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de Proto 7 se establece en la SEQ ID NO: 8.
Vectores adicionales de FVIII de AAV con secuencias promotoras/potenciadoras mejoradas
Se generaron vectores de AAV de gran tamaño con promotores fuertes para aumentar la expresión del dominio B y del FVIII suprimido del dominio a3, y estas construcciones se generaron con secuencias potenciadoras y/o promotoras modificadas. En algunas realizaciones, los vectores de FVIII de AAV expresan un FVIII funcional truncado. Estas construcciones comprenden una o más secuencias promotoras y potenciadoras tales como ApoE HCR o fragmentos de la misma, el potenciador de la ^-globulina o fragmentos del mismo, el promotor de antitripsina humana alfa 1 (hAAT) o fragmentos del mismo, el potenciador Serpin A o fragmentos del mismo, el potenciador del promotor LP1 o fragmentos del mismo o potenciador de macroglobulina o fragmento del mismo. Estas construcciones comprenden una secuencia de poliadenilación tal como la secuencia bGH poliA o la secuencia poli A de p-globina de conejo sintética. En alguna realización, las construcciones comprenden un intrón o fragmentos de un intrón tal como un intrón hAAT o un intrón de p-globina humana.
La construcción 100ATG tiene 5511 bases de longitud. Esta construcción se expone en la SEQ ID NO: 9 en la que las bases 1-145 son la 5'AAV2 ITR, las bases 160-502 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 727-910 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 923-5296 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5305-5352 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5367-5511 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100ATG bGH poli A tiene 5688 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 10 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-502 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 727-910 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 923-5296 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5305-5529 son un bGH poli A y las bases 5544-5688 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción 100ATG corta bGH poli A tiene 5613 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 11 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-502 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 727-910 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 923-5296 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5305-5454 son una bGH poli A corta y las bases 5469-5613 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103ATG tiene 5362 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 12 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una repetición de ApoE de 44 pb, las bases 360-577 son un promotor de hAAT, las bases 578-761 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 774-5147 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5156-5203 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5218-5362 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103ATG corta bGH poli A tiene 5464 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 13 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una repetición de ApoE de 44 pb, las bases 360-577 son un promotor de hAAT, las bases 578-761 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 774-5147 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5156-5305 son una bGH corta poliA y las bases 5320-5464 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 105ATG bGH poliA tiene una longitud de 6354 bases. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 14 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 173-512 son dos copias (2x) de un potenciador de microglobulina de 170 pb, las bases 519-736 son un promotor de hAAT, las bases 737-920 son un 2° intrón de una pglobina humana modificado, las bases 933-5306 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5315-5539 son un bGH poli A, las bases 5546-6195 son dos copias (2x) de un ApoE HCR de 325 pb y las bases 6210-6354 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción DC172ATG FVIII tiene 6308 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 15 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-449 son dos copias (2x) de un potenciador de macroglobulina de 145 pb, las bases 450-1347 son un promotor hAAT de 898 pb, las bases 1348-1531 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 1544-5917 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5926-6149 son un bGH poli A y las bases 6164-6308 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción DC172ATG FVIII hAAT tiene 5635 bases de longitud, Esta construcción se establece como la SEQ ID NO: 16 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-449 son dos copias (2x) de un potenciador de macroglobulina de 145 pb, las bases 457-674 son un promotor de hAAT, las bases 675-858 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 871-5244 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5253-5476 son un bGH poli A y las bases 5490-5635 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción DC1722xHCR ATG FVIII tiene 6962 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 17 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-807 son dos copias (2x) de una ApoE HCR de 321 pb, las bases 814-1103 son dos copias (2x) de un potenciador de macroglobulina de 145 pb, las bases 1104-2001 son un promotor hAAT de 898 pb, las bases 2002-2185 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 2198-6571 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 6580-6803 son un bGH poli A y las bases 6818­ 6962 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT tiene 6289 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 18 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-807 son dos copias (2x) de una ApoE HCR de 321 pb, las bases 814-1103 son dos copias (2x) de un potenciador de macroglobulina de 145 pb, las bases 1111-1328 son un promotor de hAAT, las bases 1329-1512 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 1525-5898 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5907-6130 son un bGH poli A y las bases 6245­ 6289 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII tiene 5430 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 19 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 168-309 son dos copias (2x) de un potenciador SerpinA de 71 pb, las bases 326-543 son un promotor de hAAT, las bases 544-727 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 740-5113 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5122-5271 son una bGH poli A corta, y las bases 5286-5430 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x potenciador de p-globulina tiene una longitud de 5779 bases. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 20 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 168-309 son dos copias (2x) de un potenciador SerpinA de 71 pb, las bases 326-543 son un promotor de hAAT, las bases 544-727 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 740-5113 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5122-5271 son una bGH poli A corta, las bases 5279-5618 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb y las bases 5635-5779 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100ATG corta bGH poli A 2x potenciador de p-globulina tiene 5962 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 21 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-502 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 727-910 son un 2° intrón de una p-globina humana modificado, las bases 923-5296 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5305-5454 son una bGH poli A corta, las bases 5462-5801 son dos copias (2x) de un potenciador de microglobulina de 170 pb y las bases 5818-5962 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción Factor VIII-BMN001 tiene 5919 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 22 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-480 son una ApoE HCR, las bases 487-884 son un promotor hAAT de 398 pb, las bases 885-1145 son un intrón hAAT truncado, las bases 1155-5528 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5537-5760 son un bGH poli A y las bases 5775-5919 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción FVIII-BMN002 tiene 5306 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 23 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 175-705 son un promotor/potenciador de LP1, las bases 718­ 5091 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5100-5147 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5162-5306 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 99 tiene 5461 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 24 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-627 son una ApoE HCR/MAR, las bases 634-866 son un promotor de hAAT, las bases 873-5246 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5255-5302 son una poliA sintética de pglobina de conejo y las bases 5317-5461 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100 tiene 5327 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 25 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 739-5112 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5121-5168 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5183-5327 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100 con orientación inversa tiene 5309 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 26 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-484 son una ApoE HCR en orientación inversa, las bases 491-708 son un promotor de hAAT, las bases 721-5094 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5103-5150 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5165-5309 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100AT tiene 5532 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 27 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 727-931 son un intrón hAAT, las bases 944-5317 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5326-5373 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5388-5532 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100AT 2x MG tiene 5877 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 28 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 508-847 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 854-1071 son un promotor de hAAT, las bases 1072-1276 son un intrón hAAT, las bases 1289-5662 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5671-5718 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5733-5877 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100AT 2x MG bGH poli A tiene 6054 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 29 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 508-847 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 854-1071 son un promotor de hAAT, las bases 1072-1276 son un intrón hAAT, las bases 1289-5662 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5671-5895 son un bGH poli A y las bases 5910-6054 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción 100AT 2x MG (reverso) bGH poli A tiene 6054 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 30 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 508-847 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb en orientación inversa, las bases 854-1071 son un promotor de hAAT, las bases 1072-1276 son un intrón hAAT, las bases 1289-5662 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5671-5895 son un bGH poli A y las bases 5910-6054 son la 3'AAV2 ITR.
La construcción 100 bGH poli A tiene 5504 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 31 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 509-726 son un promotor de hAAT, las bases 739-5112 son un SQ FVIII optimizado por codón, los pares de bases 5121-5345 son una bGH poli A y las bases 5360-5504 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 100-400 tiene 5507 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 32 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-493 son una ApoE HCR, las bases 512-906 son un promotor hAAT de 398 pb, las bases 919-5292 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5301-5348 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5363-5507 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 101 tiene 5311 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 33 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 170-477 son dos copias (2x) de un ApoE HCR de 154 pb, las bases 493­ 710 son un promotor de hAAT, las bases 723-5096 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5105-5152 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5167-5311 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 102 tiene 5156 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 34 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-322 son un HCR ApoE de 154 pb, las bases 338-555 son un promotor de hAAT, bases 568-4941 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 4950-4997 son una poliA sintética de pglobina de conejo y las bases 5012-5156 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103 tiene 5178 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 35 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb, las bases 360-577 son un promotor de hAAT, las bases 590-4963 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 4972-5019 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5034-5178 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103 con orientación inversa tiene 5160 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 36 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-335 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb en orientación inversa, las bases 342-559 son un promotor de hAAT, las bases 572-4945 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 4954-5001 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5016-5160 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103AT tiene 5383 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 37 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb, las bases 360-577 son un promotor de hAAT, las bases 578-782 son un intrón hAAT, las bases 795-4374 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5177-5224 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5239-5383 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103AT 2x MG tiene 5728 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 38 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb, las bases 359-698 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 705-922 son un promotor de hAAT, las bases 923-1127 son un intrón hAAT, las bases 1140-5513 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5522-5569 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5584-5728 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 103AT 2x MG bGH poli A tiene 5905 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 39 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb, las bases 359-698 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 705-922 son un promotor de hAAT, las bases 923-1127 son un intrón hAAT, las bases 1140-5513 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5522-5746 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5761-5905 son la 5' AAV2 iTr .
La construcción 103 bGH poli A tiene 5355 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 40 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-344 son cuatro copias (4x) de una ApoE HCR de 44 pb, las bases 360-577 son un promotor de hAAT, las bases 590-4963 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 4972­ 5196 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5211-5355 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 104 tiene 5618 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 41 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 169-784 son cuatro copias (4x) de un ApoE HCR de 154 pb, las bases 800-1017 son un promotor de hAAT, las bases 1030-5403 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5412­ 5459 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5474-5618 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 105 tiene 5993 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 42 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 173-512 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 519-736 son un promotor de hAAT, las bases 749-5122 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5131-5178 son una poli A sintética de p-globina de conejo, las bases 5185-5834 son dos copias (2x) de un ApoE HCR y las bases 5849-5993 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 106 tiene 5337 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 43 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 173-512 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 519-736 son un promotor de hAAT, las bases 749-5122 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5131-5178 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5193-5337 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 106AT tiene 5542 bases de longitud. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 44 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 173-512 son dos copias (2x) de un potenciador de p-globulina de 170 pb, las bases 519-736 son un promotor de hAAT, las bases 737-941 son un intrón hAAT, las bases 954-5327 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 5336-5383 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 5398­ 5542 son la 3' AAV2 ITR.
La construcción 2x SerpinA hAAT es de 5126 bases. Esta construcción se establece en la SEQ ID NO: 45 en la que las bases 1-145 son la 5' AAV2 ITR, las bases 160-301 son una ApoE HCR, las bases 308-525 son un promotor de hAAT, las bases 538-4911 son un SQ FVIII optimizado por codón, las bases 4920-4967 son una poliA sintética de p-globina de conejo y las bases 4982-5126 son la 3' AAv2 ITR.
Vectores AAV
Tal como se usa en el presente documento, el término "AAV" es una abreviatura estándar de virus adenoasociado. El virus adenoasociado es un parvovirus de ADN monocatenario que crece solo en células en las que un virus auxiliar coinfectante proporciona ciertas funciones. Actualmente existen trece serotipos de AAV que se han caracterizado, tal como se muestra a continuación en la Tabla 1. Se puede encontrar información general y reseñas de AAV en, por ejemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, págs. 169-228, y Berns, 1990, Virology, págs. 1743-1764, Raven Press, (Nueva York). Sin embargo, se espera plenamente que estos mismos principios sean aplicables a serotipos de AAV adicionales, ya que es bien sabido que los diversos serotipos están estrechamente relacionados, tanto estructural como funcionalmente, incluso a nivel genético. (Véase, por ejemplo, Blacklowe, 1988, págs. 165-174 de Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; y Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por ejemplo, todos los serotipos de AAV exhiben aparentemente propiedades de replicación muy similares mediadas por genes rep homólogos; y todos llevan tres proteínas de la cápside relacionadas, como las expresadas en AAV 6. El grado de parentesco lo sugiere además el análisis de heterodúplex, que revela una hibridación cruzada extensa entre serotipos a lo largo de la longitud del genoma; y la presencia de segmentos de autohibridación análogos en los extremos terminales que corresponden a "secuencias de repetición terminal invertidas" (ITR). Los patrones de infectividad similares también sugieren que las funciones de replicación en cada serotipo están bajo un control regulador similar.
Un "vector de AAV" tal como se usa en el presente documento se refiere a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminales (ITR) de AAV. Dichos vectores de AAV se pueden replicar y empaquetar en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedadora que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa productos génicos rep y cap.
Un "virión de AAV" o "partícula vírica de AAV" o "partícula de vector de AAV" se refiere a una partícula vírica compuesta de al menos una proteína de la cápside de AAV y un vector de polinucleotídico encapsidado de AAV. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto del genoma de AAV de tipo silvestre, como un transgén que se administrará a una célula de mamífero), se denomina típicamente como una "partícula de vector de AAV" o simplemente como un "vector de AAV". Por lo tanto, la producción de partículas de vector de AAV incluye necesariamente la producción de vector de AAV, ya que dicho vector está contenido dentro de una partícula de vector de AAV.
Los genes "rep" y "cap" de AAV son genes que codifican proteínas de replicación y encapsidación, respectivamente. Se han encontrado genes rep y cap de AAV en todos los serotipos de AAV examinados hasta la fecha, y se describen en el presente documento y en las referencias citadas. En el a Av de tipo silvestre, los genes rep y cap se encuentran generalmente adyacentes entre sí en el genoma vírico (es decir, están "acoplados" juntos como unidades transcripcionales contiguas o superpuestas), y generalmente se conservan entre los serotipos de AAV. Los genes rep y cap del AAV también se denominan individual y colectivamente "genes de empaquetamiento de AAV". El gen cap de AAV de acuerdo con la presente invención codifica una proteína Cap que es capaz de empaquetar vectores de AAV en presencia de una función auxiliar de rep y adeno y es capaz de unirse a receptores de células diana. En algunas realizaciones, el gen cap de AAV codifica una proteína de la cápside que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de un serotipo de AAV particular, por ejemplo los serotipos que se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Seroti os de AAV
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Las secuencias de AAV empleadas para la producción de AAV se pueden obtener del genoma de cualquier serotipo de AAV. Generalmente, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de los aminoácidos y a nivel del ácido nucleico, proporcionan un conjunto similar de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente física y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan por mecanismos prácticamente idénticos. Para la secuencia genómica de los serotipos de AAv y una discusión de las similitudes genómicas, véase, por ejemplo, Número de referencia de GenBank U89790; Número de referencia de GenBank J01901; Número de referencia de GenBank AF043303; Número de referencia de GenBank AF085716; Chlorini et al., J. Vir. 71: 6823-33(1997); Srivastava et al., J. Vir. 45:555-64 (1983); Chlorini et al., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Vir.
72:309-319 (1998); y Wu et al., J. Vir. 74: 8635-47 (2000).
La organización genómica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AAV es una molécula lineal de ADN monocatenario que tiene menos de aproximadamente 5.000 nucleótidos (nt) de longitud. Unas repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleótidos codificantes únicas de las proteínas de replicación no estructurales (Rep) y las proteínas estructurales (VP). Las proteínas VP forman la cápside. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y se organizan de forma que pueda formarse un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla con forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como origen para la replicación de ADN viral, actuando como cebadores para el complejo de la ADN polimerasa celular. Los genes Rep codifican las proteínas Rep, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. Rep78 y Rep68 se transcriben a partir del promotor p5, y Rep 52 y Rep40 se transcriben a partir del promotor p19. Los genes cap codifican las proteínas VP, VP1, VP2 y VP3. Los genes cap se transcriben a partir del promotor p40.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside de AAV está operativamente unida a secuencias de control de expresión para la expresión en un tipo celular específico, tal como células Sf9 o HEK. Se pueden usar técnicas conocidas por un experto en la técnica para expresar genes extraños en células hospedadoras de insectos o células hospedadoras de mamíferos para poner en práctica la invención. Se describe la metodología para la ingeniería molecular y la expresión de polipéptidos en células de insectos, por ejemplo, en Summers y Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. N.° 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. y R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman y Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York; W.H. Freeman y Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volumen 39; la patente de EE.UU. N.° 4.745.051; US2003148506; y WO 03/074714. Un promotor particularmente adecuado para la transcripción de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside de AAV es, por ejemplo, el promotor poliedro. Sin embargo, se conocen en la técnica otros promotores que son activos en células de insectos, por ejemplo, los promotores p10, p35 o IE-1 y también se contemplan promotores adicionales descritos en las referencias anteriores.
El uso de células de insecto para la expresión de proteínas heterólogas está bien documentado, al igual que los métodos para introducir ácidos nucleicos, tales como vectores, por ejemplo, vectores compatibles con células de insecto, en dichas células y los métodos para mantener dichas células en cultivo. Véase, por ejemplo, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., J. Vir. 63:3822-8 (1989); Kajigaya et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 88: 4646-50 (1991); Ruffing et al., J. Vir. 66:6922-30 (1992); Kirnbauer et al., Vir.
219:37-44 (1996); Zhao et al., Vir. 272:382-93 (2000); y Samulski et al., la patente de EE.UU. N.° 6.204.059. En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico que codifica el AAV en células de insecto es un vector compatible con células de insecto. U "vector compatible con células de insecto" o "vector" tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transformar o transfectar de forma productiva un insecto o una célula de insecto. Los vectores biológicos ejemplares incluyen plásmidos, moléculas de ácido nucleico lineales y virus recombinantes. Puede emplearse cualquier vector, siempre que sea compatible con las células de insecto. El vector puede integrarse en el genoma de las células de insecto, pero no es necesario que sea permanente la presencia del vector en la célula de insecto y también se incluyen vectores episomales. Los vectores pueden introducirse por cualquier medio conocido, por ejemplo, por tratamiento químico de las células, electroporación o infección. En algunas realizaciones, el vector es un baculovirus, un vector vírico o un plásmido. En una realización más preferida, el vector es un baculovirus, es decir, la construcción es un vector baculovírico. Los vectores baculovíricos y los métodos para su uso se describen en las referencias citadas anteriormente sobre ingeniería molecular de células de insectos.
Los baculovirus son virus de ADN envueltos de artrópodos, dos de los cuales son vectores de expresión bien conocidos para producir proteínas recombinantes en cultivos celulares. Los baculovirus tienen genomas circulares bicatenarias (80-200 kpb) que se pueden modificar para permitir la administración de un gran contenido genómico a células específicas. Los virus utilizados como vector son generalmente nucleopoliedrovirus multicápside de Autographa californica (AcMNPV) o Bombyx mori (Bm) NPV) (Kato et al., 2010).
Los baculovirus se utilizan comúnmente para la infección de células de insectos para la expresión de proteínas recombinantes. En particular, la expresión de genes heterólogos en insectos se puede lograr como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 4.745.051; Friesen et al (1986); los documentos EP 127.839; los documentos EP 155.476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); y Martin et al (1988). Numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas que pueden usarse para la producción de proteínas se describen en Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) y McKenna (1989).
Métodos para producir AAV recombinantes
La presente divulgación proporciona materiales y métodos para producir AAV recombinantes en células de insectos o mamíferos. Las construcciones víricas pueden comprender además un promotor y un sitio de restricción aguas abajo del promotor para permitir la inserción de un polinucleótido que codifica una o más proteínas de interés, donde se encuentran el promotor y el sitio de restricción aguas abajo de la 5' AAV ITR y aguas arriba de la 3' AAV ITR. La construcción vírica puede comprender además un elemento regulador postranscripcional aguas abajo del sitio de restricción y aguas arriba de la 3' AAV ITR. La construcción vírica puede comprender además un polinucleótido insertado en el sitio de restricción y unido operativamente con el promotor, donde el polinucleótido comprende la región codificante de una proteína de interés. Tal como apreciarán los técnicos expertos, cualquiera de los vectores de AAV desvelados en la presente solicitud se puede usar en el método como la construcción vírica para producir el AAV recombinante.
Las funciones auxiliares pueden ser proporcionadas por uno o más plásmidos auxiliares o virus auxiliares que comprenden genes auxiliares adenovíricos o baculovíricos. Los ejemplos no limitantes de los genes auxiliares adenovíricos o baculovíricos incluyen, pero sin limitación, E1A, E1B, E2A, E4 y VA, que pueden proporcionar funciones de ayuda al empaquetado de AAV.
Los virus auxiliares de AAV son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, virus de la familia Adenoviridae y la familia Herpesviridae. Ejemplos de virus auxiliares de AAV incluyen, pero sin limitación, el virus auxiliar SAdV-13 y virus auxiliares similares a SAdV-13 descritos en la publicación de EE. UU. N.° 20110201088, vectores auxiliares pHELP (Applied Viromics). Un experto en la materia apreciará que en la presente invención se puede utilizar cualquier virus auxiliar o plásmido auxiliar de AAV que pueda proporcionar una función auxiliar adecuada a AAV.
Los genes cap de AAV pueden estar presentes en un plásmido. El plásmido puede comprender además un gen rep de AAV. Los genes cap y/o el gen rep de cualquier serotipo de AAV (incluidos, pero sin limitación, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AaV8, AAV9, AaV10, AAV11, AAV12, AAV13 y cualquier variante del mismo) se pueden utilizar en la presente memoria para producir el AAV recombinante. Los genes cap de AAV pueden codificar una cápside del serotipo 1, serotipo 2, serotipo 4, serotipo 5, serotipo 6, serotipo 7, serotipo 8, serotipo 9, serotipo 10, serotipo 11, serotipo 12, serotipo 13 o una variante del mismo.
La célula de insecto o mamífero se puede transfectar con el plásmido auxiliar o el virus auxiliar, la construcción vírica y el plásmido que codifica los genes cap de AAV; y el virus AAV recombinante se puede recolectar en varios puntos de tiempo después de la cotransfección. Por ejemplo, el virus AAV recombinante se puede recolectar aproximadamente a las 12 horas, aproximadamente a las 24 horas, aproximadamente a las 36 horas, aproximadamente a las 48 horas, aproximadamente a las 72 horas, aproximadamente a las 96 horas, aproximadamente a las 120 horas, o un tiempo entre cualquiera de estos dos puntos de tiempo después de la cotransfección.
El AAV recombinante también se puede producir usando cualquier método convencional conocido en la técnica adecuado para producir AAV recombinante infeccioso. En algunos casos, se puede producir un AAV recombinante utilizando una célula de insecto o mamífero que exprese de forma estable algunos de los componentes necesarios para la producción de partículas de AAV. Por ejemplo, un plásmido (o plásmidos múltiples) que comprende los genes rep y cap de AAV, y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a la neomicina, se pueden integrar en el genoma de la célula. La célula de insecto o mamífero puede entonces coinfectarse con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus o baculovirus que proporcionan las funciones auxiliares) y el vector vírico que comprende las 5' y 3' AAV ITR (y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína heteróloga, si se desea). Las ventajas de este método son que las células se pueden seleccionar y son adecuadas para la producción a gran escala del AAV recombinante. Como otro ejemplo no limitante, se pueden usar adenovirus o baculovirus en lugar de plásmidos para introducir genes rep y cap en células de empaquetamiento. Como otro ejemplo no limitante más, tanto el vector vírico que contiene las 5' y 3' AAV LTR y los genes rep-cap pueden integrarse de forma estable en el ADN de las células productoras, y las funciones auxiliares se pueden proporcionar mediante un adenovirus de tipo silvestre para producir el AAV recombinante.
Tipos de células utilizadas en la producción de AAV
Las partículas víricas que comprenden los vectores de AAV de la invención se pueden volver a documentar utilizando cualquier tipo de célula de invertebrado que permita la producción de AAV o productos biológicos y que se pueda mantener en cultivo. Por ejemplo, la línea celular de insecto utilizada puede ser de Spodoptera frugiperda, tal como SF9, SF21, SF900+, líneas celulares de Drosophila, líneas celulares de mosquitos, por ejemplo, líneas celulares derivadas de Aedes albopictus, líneas celulares de gusanos de seda domésticos, por ejemplo, líneas celulares de Bombyx mori, líneas celulares de Trichoplusia ni tales como las células High Five o las líneas celulares de Lepidoptera tales como las líneas celulares de Ascalapha odorata. Las líneas celulares de insecto preferidas son células de las especies de insecto que son susceptibles a la infección por baculovirus, incluyendo High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 y Ao38.
Los baculovirus son virus de ADN envueltos de artrópodos, dos de los cuales son vectores de expresión bien conocidos para producir proteínas recombinantes en cultivos celulares. Los baculovirus tienen genomas circulares bicatenarias (80-200 kpb) que se pueden modificar para permitir la administración de un gran contenido genómico a células específicas. Los virus usados como vector son generalmente el nucleopoliedrovirus multicápside de Autographa californica (AcMNPV) o de Bombyx mori (Bm-NPV) (Kato et al., 2010).
Los baculovirus se utilizan comúnmente para la infección de células de insectos para la expresión de proteínas recombinantes. En particular, la expresión de genes heterólogos en insectos se puede lograr como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N.° 4.745.051; Friesen et al (1986); los documentos EP 127.839; los documentos EP 155.476; Vlak et al (1988); Miller et al (1988); Carbonell et al (1988); Maeda et al (1985); Lebacq-Verheyden et al (1988); Smith et al (1985); Miyajima et al (1987); y Martin et al (1988). Numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras de insectos permisivas que pueden usarse para la producción de proteínas se describen en Luckow et al (1988), Miller et al (1986); Maeda et al (1985) y McKenna (1989).
En otro aspecto de la invención, los métodos de la invención también se llevan a cabo con cualquier tipo de célula de mamífero que permita la replicación de AAV o la producción de productos biológicos, y que pueda mantenerse en cultivo. Las células de mamífero preferidas utilizadas pueden ser HEK293, HeLa, CHO, n S0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 y células MRC-5.
Prueba de vectores de FVIII de AAV
Los ensayos para probar los vectores de FVIII de AAV completamente empaquetados de la invención incluyen, por ejemplo, (1) transfección transitoria de plásmidos de ADN bicatenario que comprenden los ácidos nucleicos del vector AAV en células HepG2, una línea celular obtenida del hígado humano para verificar la expresión y el corte y empalme del ARNm específico del hígado, y la producción y secreción de proteína de FVIII in vitro; (2) producción de viriones de AAV que comprenden los vectores de FVIII de AAV en células 293 y células de insecto infectadas con baculovirus; (3) evaluación de los ácidos nucleicos del vector AAV mediante análisis de gel alcalino y ensayos de replicación; y (4) evaluación de la expresión de FVIII, actividad de FVIII y actividad específica de FVIII en ratones Rag2. Estos ensayos se describen con mayor detalle en los Ejemplos.
Los vectores de FVIII de AAV completamente empaquetados de la invención muestran al menos la misma expresión y/o actividad que el vector UCL SQ, y preferentemente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces o más expresión y/o actividad en comparación con el vector UCL SQ.
Los vectores de FVIII de AAV completamente empaquetados de la invención tienen un alto rendimiento de vector con pocos o ningún contaminante del genoma fragmentario, y preferiblemente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces mayor rendimiento del vector en comparación con el vector UCL SQ.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán considerando los siguientes ejemplos ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Generación de los vectores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S y Proto 3S
El vector UCL SQ, que se describe en detalle en Nathwani etal., Pub. de Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 2013/0024960A1, publicada el 24 de enero de 2013, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad, y McIntosh et al., Blood 121:3335-3344, 2013, es un vector de AAV de gran tamaño, es decir, mayor que 5,0 kb. Tal como se muestra en la Figura 1, el vector UCL SQ comprende, de izquierda a derecha, el serotipo 2 de AAV (AAV2) 5' ITR, la secuencia vírica AAV2 de tipo silvestre, el potenciador de la apolipoproteína E humana (ApoE)/C1 de 34 bases, la región X distal del promotor alfa anti-tripsina (AAT) humana de 32 bases, el promotor AAT humano de 186 bases, que incluye 42 bases de la secuencia de la región no traducida (UTR) 5', la secuencia de FVIII humano optimizada por codón en la que el dominio B se reemplaza con la secuencia SQ de 14 aminoácidos, la secuencia de poliadenilación sintética de 49 bases, la secuencia vírica de AAV2 de tipo silvestre y la 3'ITR de AAV2. El vector UCL SQ tiene 5081 bases de longitud.
Para obtener un vector que sea más pequeño que el vector UCL SQ, se eliminaron de la secuencia del vector UCL SQQ las secuencias de ADN que los inventores del presente documento consideran innecesarias para la expresión y/o actividad de FVIII, o para la producción de viriones de AAV. Se eliminó la secuencia de ADN extraño, incluyendo 53 bases de la secuencia vírica de AAV2 3' a la 5'ITR de AAV2, 46 bases de la secuencia vírica de AAV25' a la 3'ITR de AAV2, y 11 bases adyacentes a la región codificante de FVIII SQ optimizada por codón. El vector resultante Proto 1, que tiene 4970 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 2A, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 1. Proto 1 produjo virus infecciosos y codifica un polipéptido de factor VIII funcional.
Las secuencias adyacentes al bucle de horquilla en la ITR de AAV2 también pueden ser prescindibles en vectores de AAV recombinantes (véase Srivastava et al., la Patente de EE.UU. N.° 6.521.225; Wang et al., J. Virol. 70:1668-1677, 1996; y Wang et al., J. Virol. 71:3077-3082, 1997). Para reducir aún más el tamaño del vector Proto 1, se eliminaron 10 bases de la secuencia de AAV2 directamente en 3' del bucle de horquilla en la 5'ITR de AAV2 y se eliminaron 10 bases de la secuencia de AAV2 directamente en 5' del bucle de horquilla en la 3'ITR de AAV2. El vector resultante Proto 1S, que tiene 4950 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 2B, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 2.
En un esfuerzo por aumentar la expresión de la variante FVIII SQ en el vector Proto 1S, se insertó un intrón sintético de 100 bases entre los exones 1 y 2 en la secuencia de FVIII optimizada por codón. Se sabe que la inserción de un intrón puede resultar en un mayor nivel de expresión de ARNm en genes que de otro modo no tienen intrones, tales como, por ejemplo, los genes del interferón.
Los potenciadores se definen como funcionales independiente de la distancia y la orientación. El potenciador de 34 bases ApoE/C1 funciona de manera independiente de la distancia y la orientación con respecto a la expresión de FVIII, tal como se ejemplifica por su presunta actividad potenciadora en Gray et al., la Patente de EE.u U. N.° 8.030.065 (expresión de FIX) y en Nathwani et al., la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2013/0024960 (expresión de FVIII), las cuales ambas se incorporan en el presente documento a modo de referencia en su integridad. La región X distal del promotor AAT humano de 32 bases, descrito en Di Simone et al., EMBO J. 6:2759-2766, 1987, se encuentra dentro de un dominio regulador que potencia la expresión de un promotor heterólogo.
En otro intento de aumentar aún más la expresión de la variante FVIII SQ en el vector Proto 1S, la secuencia del intrón sintético incorporó el potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases y la región X distal del promotor AAT humano de 32 bases, que se trasladó desde su ubicación aguas arriba del promotor AAT humano. Estos dos elementos reguladores se insertaron en la orientación inversa con respecto a su orientación en Proto 1S. El vector resultante Proto 2S, que tiene 4983 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 2C, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 3.
Como no se había demostrado previamente que la región X distal del promotor AAT humano funcionara aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción en un intrón, este elemento regulador en el vector Proto 2S se reemplazó con una segunda copia del potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases en la misma orientación que la primera copia del potenciador en el intrón. El vector resultante Proto 3S, que tiene 4985 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 2D, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 4.
Los ácidos nucleicos de los vectores Proto 1, Proto 1S, Proto 2S y Proto 3S se clonaron en el plásmido de expresión bacteriana pUC19, generando así formas bicatenarias de los vectores de FVIII de AAV.
Ejemplo 2
Generación de vectores Proto 4, Proto 5, Proto 6 y Proto 7
Para reducir aún más el tamaño del vector Proto 1 y/o aumentar la expresión de FVIII en comparación con el vector Proto 1, se delecionó el dominio a3, que se encuentra adyacente a la cadena ligera o al dominio C. El dominio a3 está implicado en la unión al factor von Willenbrand, pero puede ser prescindible para FVIII funcionalmente activo in vivo. Comenzando por el vector Proto 1, se eliminaron la secuencia SQ de 14 aminoácidos y el dominio a3 de 41 aminoácidos (correspondientes a los aminoácidos 1649-1689 del FVIII de tipo silvestre). El vector resultante Proto 4, que tiene 4805 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 3A, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 5.
En un intento por aumentar la expresión del dominio B y el dominio a3 eliminado de FVIII, se insertó un intrón de FVIII truncado de 129 bases entre los exones 1 y 2 en la secuencia de FVIII optimizada por codón en el vector Proto 4. El vector resultante Proto 5, que tiene 4934 bases de longitud, se muestra en forma esquemática en la Figura 3B, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 6.
En un intento de aumentar aún más la expresión del dominio B y del dominio a3 eliminado de FVIII, se insertó una segunda copia del potenciador ApoE/C1 humano de 34 bases en la orientación directa o inversa en el vector Proto 5. El vector resultante Proto 6, que tiene 4934 bases de longitud y tiene el potenciador intrónico ApoE/C1 en la orientación directa, se muestra en forma esquemática en la Figura 3C, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 7.
El vector resultante Proto 7, que tiene 4934 bases de longitud y tiene el potenciador intrónico ApoE/C1 en la orientación inversa, se muestra en forma esquemática en la Figura 3D, y la secuencia se establece en la SEQ ID NO: 8.
Los ácidos nucleicos de los vectores Proto 4, Proto 5, Proto 6 y Proto 7 se clonaron en el plásmido de expresión bacteriana pUC19, generando así formas bicatenarias de los vectores de FVIII de AAV.
Ejemplo 3
Ensayos para probar la expresión y la actividad de los vectores de FVIII de AAV
Los ensayos para probar los vectores de FVIII de AAV de la invención incluyen, por ejemplo, (1) transfección transitoria de plásmidos de ADN bicatenario que comprenden los ácidos nucleicos del vector AAV en células HepG2, una línea celular obtenida del hígado humano para verificar la expresión y el corte y empalme del ARNm específico del hígado, y la producción y secreción de proteína de FVIII in vitro; (2) producción de viriones de AAV que comprenden los vectores de FVIII de AAV en células 293 y células de insecto infectadas con baculovirus; (3) evaluación de los ácidos nucleicos del vector AAV mediante análisis de gel alcalino y ensayos de replicación; y (4) evaluación de la expresión de FVIII, actividad de FVIII y actividad específica de FVIII en ratones Rag2.
Ensayos de transfección transitoria.
Se realiza un ensayo preliminar in vitro para comparar la expresión y actividad de FVIII de los vectores de FVIII de AAV de la presente invención con la del vector UCL SQ. Las formas bicatenarias de los vectores de FVIII de AAV de la presente invención se transfectan de forma transitoria en la línea celular de hígado humano, HepG2. Después de la transfección, por ejemplo, 24 a 48 horas después, se mide el antígeno de FVIII y la actividad en los sobrenadantes de cultivo.
Utilizando este ensayo, la actividad de FVIII en células HepG2 transfectadas transitoriamente con los vectores Proto 1, Proto 1S y Proto 2S fue similar a la actividad de FVIII obtenida usando el vector UCL SQ, lo que demuestra que los vectores Proto 1, Proto 1S y Proto 2S eran capaces de expresar la proteína funcional del factor VIII.
Producción de viriones de AAV en células 293 y células de insectos infectadas con baculovirus.
Para demostrar que los vectores de FVIII de AAV de la presente invención de hecho empaquetan los ácidos nucleicos que codifican FVIII, las formas bicatenarias de los vectores de FVIII de AAV generados tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2 se introducen en células capaces de producir viriones de AAV. En un primer sistema de producción de virus AAV, los plásmidos que comprenden los ácidos nucleicos del vector FVIII de AAV en forma bicatenaria se cotransfectan en células 293 junto con un plásmido que expresa las proteínas Cap y Rep de AAV y un plásmido que expresa las funciones auxiliares de Adenovirus necesarias para la producción del virión de AAV. En un segundo sistema de producción de virus AAV, se generan construcciones de baculovirus que expresan los ácidos nucleicos del vector de FVIII de AAV y las proteínas Cap y Rep de AAV, y luego se coinfectan en células Sf9 de insecto. Los viriones de AAV resultantes producidos en las células 293 transfectadas transitoriamente o en las células Sf9 infectadas con baculovirus se purifican y analizan mediante métodos estándar conocidos en la técnica.
Evaluación por gel alcalino y ensayo de replicación
Se usa un ensayo de electroforesis en gel alcalino para determinar el tamaño del ácido nucleico empaquetado. Se usa un ensayo de centro de replicación para determinar qué vectores de FVIII de AAV se empaquetan en forma intacta mediante ambos métodos de empaquetamiento.
Se utiliza un ensayo de extensión de cebadores para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos de los vectores de FVIII de AAV que tienen extremos completos, es decir, terminan en el extremo 5' del bucle de horquilla en la 5'ITR de AAV2 (cadena sentido) o la 3'ITR (cadena antisentido).
Como alternativa, se utiliza un ensayo de PCR para determinar si los ácidos nucleicos de los vectores de FVIII de AAV tienen extremos completos, es decir, terminan en el extremo 5' del bucle de horquilla en la 5'ITR de AAV2 (cadena sentido) o la 3'ITR (cadena antisentido).
Evaluación en ratones Rag2
Los viriones de AAV producidos en células 293 transfectadas transitoriamente o en vectores empaquetados con células Sf9 infectadas con baculovirus se analizan para determinar la expresión y actividad de FVIII en ratones Rag2 a 2e11, 2e12 y 2e13 genomas víricos (vg)/kg, administrados por vía intravenosa. En este ensayo se utilizan ratones Rag2 porque la expresión y/o la actividad del FVIII no se complica por la presencia de una respuesta inmune del hospedador al virus AAV o la proteína del FVIII humano.
El antígeno de FVIII se determina usando un ensayo basado en ELISA. La actividad de FVIII se determina usando un ensayo de activación de FXa y/o un ensayo de coagulación. Utilizando los ensayos de actividad y antígeno del FVIII, se determina la actividad específica de FVIII.
Se espera que a los expertos en la técnica se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la invención después de considerar las realizaciones actualmente preferidas de la misma. En consecuencia, las únicas limitaciones que deberían imponerse al alcance de la invención son las que aparecen en las reivindicaciones adjuntas. Ejemplo 4
Generación de construcciones con secuencias promotoras/potenciadoras mejoradas
Para generar vectores de AAV adicionales con promotores fuertes que aumentan la expresión del FVIII funcional, se generaron construcciones con secuencias potenciadoras y/o promotoras modificadas. En algunas realizaciones, las construcciones comprendían versiones acortadas de la ApoE o los potenciadores de la p-globulina. Estas construcciones se generaron usando técnicas estándar de clonación de ADN y las secuencias de las mismas se muestran en las SEQ ID NO: 9-45.
Ejemplo 5
Generación de partículas víricas de AAV
Generación de bácmido recombinante
Las células competentes DH10 Bac se descongelaron en hielo. Se añadió plásmido lanzadera recombinante (por ejemplo, pFB-GFP) y se mezcló suavemente con las células competentes y se incubó en hielo durante 30 minutos. A continuación, las células competentes se sometieron a calor a una temperatura de aproximadamente 42 °C durante 30 segundos y luego se enfriaron en hielo durante 2 minutos. Las células competentes recibieron un choque térmico durante 30 segundos a 42 °C y se enfriaron en hielo durante 2 min. Se añadió SOC a las células y se dejó incubar a 37 °C con agitación durante 4 horas para permitir que tuviera lugar la recombinación. Durante el periodo de incubación, se extendió X-gal en dos placas LB (que además contenían varios antibióticos (por ejemplo, kanamicina, gentamicina y tetraciclina) para transformación, seguido por IPTG.
Se obtuvo una cantidad de la mezcla de incubación, se diluyó y luego se extendió sobre las dos placas LB y se incubó a 37 °C durante aproximadamente 30-48 horas. Se seleccionaron varias colonias blancas de cada placa y se cultivaron durante la noche en medio LB que contenía la misma combinación de antibióticos proporcionada en las placas LB. A continuación, se preparó una solución madre de ADN de bácmido y glicerol y se almacenó a -80 °C.
Purificación de ADN de bácmido recombinante
Se extrae una cantidad de solución madre de glicerol y bácmido y se inocula en medio LB que contiene la misma combinación de antibiótico proporcionada en las placas LB descritas en el Ejemplo 1. Los cultivos se dejan crecer durante la noche a 37 °C con agitación. A continuación, una cantidad del cultivo se centrifuga en una microcentrífuga a máxima velocidad durante aproximadamente 30 segundos.
Los sedimentos se resuspendieron en un tampón de resuspensión usando una pipeta seguida de un tampón de lisis, y el tubo se invirtió varias veces para mezclar el tampón y luego se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. Un tampón de resuspensión ejemplar comprende Tris-CL 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM y 100 |jg/ml de ribonucleasa A. Un tampón de lisis ejemplar comprende NaOH 200 mM y SDS al 1%. Una cantidad de tampón de precipitado (por ejemplo, un tampón que comprende acetato de potasio 3,0 M, pH 5,5) se añadió lentamente y el tubo se invirtió varias veces para mezclar el tampón y luego se incubó en hielo durante aproximadamente 10 minutos. El tubo se centrifugó durante aproximadamente 10 minutos a máxima velocidad y el sobrenadante se vertió en un tubo que contenía isopropanol. El tubo se invirtió varias veces para mezclar la solución.
A continuación, la solución se centrifugó a velocidad máxima durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se eliminó inmediatamente después de centrifugar con pipeta.
Se añadió una cantidad de etanol al 70% para enjuagar el sedimento y se centrifugó de nuevo a máxima velocidad durante 1 minuto. Luego se eliminó el etanol y la solución se centrifugó nuevamente para eliminar las trazas del etanol. Se añadió una cantidad de tampón TE/EB a cada tubo y el sedimento se disolvió cuidadosamente con una pipeta. La solución se almacenó a -20 °C si no se usaba inmediatamente.
Producción de solución madre P0 de baculovirus recombinante
Las células Sf9 se sembraron a aproximadamente 1 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos (o 6 x 106 células en una placa de 10 cm o 1,7 x 107 células en una placa de 15 cm) y se dejó que las células se unieran durante al menos 1 hora antes de la transfección.
Las soluciones de transfección A y B se preparan de la siguiente manera: Solución A: se diluyó una cantidad de bácmido en una cantidad de medio libre de suero sin antibióticos en un tubo de 15 ml. Solución B: se diluyó una cantidad de CellFectin en una cantidad de medio libre de suero sin antibióticos en un tubo de 15 ml. La solución B se añadió a la solución A y se mezcló suavemente con una pipeta aproximadamente 3 veces con una pipeta y se incubó a temperatura ambiente durante 30 ~ 45 minutos. A continuación, se aspiró medio de la placa y se añadió una cantidad de medio libre de suero sin antibióticos para lavar las células. Se añadió una cantidad de SF900II sin antibióticos a cada tubo que contenía mezclas de lípido-ADN.
Se aspiró el medio de las células, la solución de transfección se añadió a las células y las células se incubaron durante aproximadamente 5 horas a 28 °C. Se retiró la solución de transfección y se añadió una cantidad de medio libre de suero antibióticos, y se incubó durante aproximadamente 4 días a 28 °C. Se recogió el medio que contiene el baculovirus recombinante y se centrifugó durante aproximadamente 5 minutos a 1000 rpm para eliminar los restos celulares. El baculovirus se almacenó a 4 °C en la oscuridad.
Amplificación de baculovirus (PI)
Las células Sf9 se cultivaron hasta aproximadamente 4 x 106 células/ml y se diluyeron a aproximadamente 2 x 106 células/ml con medio fresco en matraces de agitación. Se infectó una cantidad de células Sf9 con una cantidad del baculovirus de la solución madre P0. La multiplicidad de infecciones (MDI) es de aproximadamente 0,1.
Las células Sf9 se incubaron durante aproximadamente 3 días y se recolectó el baculovirus. Las células se centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células y el sobrenadante se recogió y se almacenó a 4 °C en la oscuridad. El título del baculovirus se determinó de acuerdo con el protocolo Rapid Titer Kit de Clontech.
Producción de AAV usando baculovirus recombinantes P1
Las células Sf9 se cultivaron hasta aproximadamente 1 x 107 células/ml y se diluyeron hasta aproximadamente 5 x 106 células/ml. Se infectó una cantidad de células Sf9 diluidas con vector Bac (5Moi) y auxiliar de Bac (15Moi) durante 3 días. La viabilidad celular se evaluó al tercer día (se observan aproximadamente el 50 % ~ 70 % de células muertas).
Los sedimentos celulares se recolectaron mediante centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos. Se retiró el medio y las células se lisaron (o los sedimentos celulares se almacenaron a -20 °C si no se usaron inmediatamente).
Protocolo de lisis y bandas
Se añade una cantidad de tampón de lisis Sf9 más Benzonasa a cada sedimento de células y se agita vorticialmente a fondo para resuspender las células. Las células Sf9 resuspendidas se incubaron en hielo durante aproximadamente 10 min. para enfriar el lisado. El lisado se sometió a ultrasonidos durante aproximadamente 20 segundos para lisar las células a fondo y luego se incubó a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos.
Se añadió una cantidad de NaCl 5 M y la mezcla se agitó vorticialmente y luego se incubó durante otros 30 minutos a 37 °C. Se añadió una cantidad de NaCl para llevar la concentración de sal a aproximadamente 500 mM, se agitó vorticialmente y se centrifugó a 8.000 rpm durante 20 minutos a 15 °C para producir un lisado aclarado.
El lisado aclarado pasa a las etapas de ultracentrifugación. Se preparó un gradiente de CsCl añadiendo primero el lisado aclarado, luego una cantidad de 1,32 g/cc y una cantidad de soluciones de CsCl de 1,55 g/cc a través de una jeringa con aguja larga. Se marcó la interfase entre las soluciones de CsCl. Se añadió PBS a la parte superior de los tubos de centrífuga y los tubos se equilibraron y sellaron cuidadosamente.
Los tubos se centrifugaron a 55.000 rpm durante aproximadamente 20 horas a 15 °C. Se pinchó un agujero en la parte superior de cada tubo y se marcó la banda de AAV ubicada ligeramente por encima de la marca de la interfase de las dos soluciones de CsCl.
Se lleva a cabo una segunda centrifugación de CsCl transfiriendo la solución de AAV a un tubo de centrífuga para un rotor de 70,1 Ti y se añadió una cantidad de solución de CsCl hasta casi la parte superior del tubo. Los tubos se equilibraron y sellaron. Los tubos se centrifugan a 65.000 rpm durante aproximadamente 20 horas y se recogió la banda de AAV (banda inferior, la banda superior son cápsides vacías).
Ejemplo 5
Evaluación de las construcciones en ratones Rag2
Los genomas de AAV que comprenden una secuencia génica que codifica el FVIII de SQ optimizado por codones se generaron utilizando baculovirus y células 293 utilizando las construcciones UCL SQ, Proto 1, Proto S1, Proto S2 y Proto S3. Los límites de empaquetamiento son 4800 pb para baculovirus y 4950 para células 293.
Tal como se muestra en la Figura 5, Proto 1 con genomas truncados o no truncados transduce FVIII similar a la construcción UCL SQ. El AAV5.2 producido a partir de baculovirus y lisados de células 293T medido en un gel Bis-Tris al 4-12%. Cada muestra expresó proteína VP1, VP2 y VP3, tal como se muestra en la Figura 6. El ADN genómico de las muestras de AAV se analizó en geles de agarosa alcalina al 0,8%, como se muestra en la Figura 7.
La transducción de Proto 1 fue similar a la construcción UCL SQ cuando estos AAV fueron producidos por el sistema de baculovirus. La inclusión del intrón que contiene Proto2S y 3S no transdujo mejor que Proto 1. El vector UCL SQ que contiene las secuencias flanqueantes de AAV elaboradas en células 293 fue más potente que el UCL SQ que carece de la secuencia de AAV preparada en baculovirus. Como resultado, se agregaron potenciadores adicionales a Proto 1, por ejemplo, las construcciones 101, 102, 102 y 104, en un intento por aumentar la potencia.
Ejemplo 6
Expresión y actividad de los vectores de AAV FVIII con secuencias promotoras/potenciadoras mejoradas
La expresión y actividad de los vectores de AAV que comprenden las construcciones 99 a la construcción 106 se ensayaron usando el protocolo de inyección hidrodinámica. La administración hidrodinámica es un método rápido para seleccionar promotores hepáticos in vivo. Se generó ADN plasmídico de AAV usando el método descrito en el Ejemplo 5 y luego se diluyó en Solución de Administración Hidrodinámica T ransIT-QR. El ADN plasmídico se inyectó en la vena de la cola de ratones C57B1/6 de 5-6 semanas de vida (18-25 g) a un volumen determinado por (peso del ratón (g)/10) = 0,1 ml de solución de administración). El tiempo de inyección fue de menos de 5 segundos. Se recogió plasma de cada ratón 48 horas después de la inyección y se midió la cantidad de antígeno de FVIII expresado usando un ensayo ELISA.
Se inyectaron dosis crecientes de plásmido Proto 1 (2,5, 5, 12,5 y 50 pg) en la vena de la cola de los ratones. La cantidad de FVIII en el plasma del ratón inyectado se midió usando una prueba ELISA y se usó FVIII recombinante (equivalentes de Xyntha SQ) como estándar para la comparación.
Para investigar la expresión de los elementos promotores/potenciadores mejorados de la construcción p100-400, la construcción 100 (p100), la construcción FVIII-BMN001 (pFVIII-BMN001), Proto 1, la construcción 100AT (p100-AT), la construcción 100 bGH poli A (p100-bGHPA), la construcción 101 (p101) y la construcción 104 (p104). Tal como se muestra en la Figura 8, todas las construcciones produjeron FVIII funcional a diferentes niveles de eficacia.
Las Figuras 9 y 10 proporcionan datos para la inyección de 1 pg de plásmido de varias construcciones. Tal como se muestra en la Figura 8, la inyección de la construcción FVIII-BMN001, la construcción FVIII-BMN002, la construcción 102 (p102), la construcción 103 (p103) y la construcción 104 (p104) dio como resultado la expresión de al menos 20 ng de FVIII en 5 de cada 10 ratones. Tal como se muestra en la Figura 9, la inyección de la construcción FVIII-BMN001, la construcción 103 (p103), la construcción 103-AT (p103-AT; el promotor hAAT de 398 pb), la construcción 100 (p100),

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de factor VIII (FVIII) de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3, o la SEQ ID NO: 4, en donde dicho vector de FVIII de AAV tiene menos de 5,0 kb de longitud.
2. Un método para producir una partícula de virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende
A) cultivar una célula que ha sido transfectada con un vector de FVIII de AAV de la reivindicación 1; y
B) recuperar la partícula de AAV recombinante del sobrenadante de la célula transfectada.
3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha célula es una célula de insecto.
4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha célula de insecto es una célula SF9.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la transfección de dicha célula que ha sido transfectada con un vector de FVIII de AAV se realiza mediante la infección de dicha célula por un baculovirus que comprende dicho vector de FVIII de AAV.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde la transfección de dicha célula que ha sido transfectada con un vector de FVIII de AAV es una cotransfección con un segundo vector que comprende los genes rep y cap de AAV.
7. Una partícula vírica de AAV que comprende el vector de FVIII de AAV de la reivindicación 1.
8. La partícula vírica de AAV de la reivindicación 7, en donde la partícula vírica de AAV comprende una proteína de la cápside de AAV-5.
9. Una célula aislada que comprende el vector de FVIII de AAV de la reivindicación 1.
10. Una composición que comprende el vector de FVIII de AAV de la reivindicación 1 o la partícula vírica de AAV de la reivindicación 7 u 8 para su uso en el tratamiento de la hemofilia A.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201210357D0 (en) 2012-06-12 2012-07-25 Ucl Business Plc Factor VIII sequences
ES2813698T3 (es) 2013-09-12 2021-03-24 Biomarin Pharm Inc Vectores de AAV que comprenden un gen que codifica el factor VIII
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
CN112553229A (zh) 2014-11-05 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
JP6879486B2 (ja) * 2015-03-17 2021-06-02 フリーイェ・ユニヴェルシテイト・ブリュッセルＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ Ｆｖｉｉｉおよびｆｉｘ用の最適化された肝臓特異的発現系
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
EP3626274B1 (en) * 2015-04-16 2025-01-22 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
BR112018006074A2 (pt) * 2015-09-24 2018-10-09 Biomarin Pharm Inc vetores de fator viii de vírus adeno-associado, partículas virais associadas e formulações terapêuticas compreendendo as mesmas
KR102766526B1 (ko) * 2015-10-28 2025-02-13 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 간-특이적 작제물인, 인자 viii 발현 카세트 및 이의 사용 방법
PE20231949A1 (es) * 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
SG11201804070XA (en) 2015-11-13 2018-06-28 Baxalta Inc Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
EP3374388A1 (en) * 2015-11-13 2018-09-19 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
WO2017180857A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating hemophilia a
WO2017205573A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Lonza Houston Inc. Methods for isolating adeno-associated virus using a polydiallyldialkylammonium salt
IL263801B2 (en) 2016-07-26 2024-01-01 Biomarin Pharm Inc Novel adeno-associated virus capsid proteins
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
BR112020001979A2 (pt) * 2017-08-01 2020-08-18 Spark Therapeutics, Inc. métodos de terapia genética do fator viii (fviii)
JP2021522811A (ja) 2018-05-09 2021-09-02 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド フェニルケトン尿症の治療方法
AR117427A1 (es) 2018-05-14 2021-08-04 Biomarin Pharm Inc Expresión estable de vectores de aav en sujetos jóvenes
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
AU2019268330A1 (en) 2018-05-15 2020-11-26 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of Parkinson's disease
AU2019306194A1 (en) 2018-07-16 2021-02-04 Baxalta GmbH Gene therapy of hemophilia A using viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression
WO2020020475A1 (en) * 2018-07-27 2020-01-30 Zentrum Für Forschungsförderung In Der Pädiatrie Gmbh Improved concepts for the treatment of genetic disorders with high-capacity plal-generated gold nanoparticles
JP7684212B2 (ja) 2018-08-03 2025-05-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子の発現による改善された臨床パラメーター
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
GB201813528D0 (en) 2018-08-20 2018-10-03 Ucl Business Plc Factor IX encoding nucleotides
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
EP4461814A3 (en) * 2018-10-12 2025-02-26 Genzyme Corporation Generation of improved human pah for treatment of severe pku by liver-directed gene replacement therapy
TWI851647B (zh) 2019-01-16 2024-08-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
WO2020168362A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia a with improved factor viii expression
JP7795357B2 (ja) 2019-03-13 2026-01-07 ジェネレーション バイオ カンパニー Ｆｖｉｉｉ治療薬を発現するための非ウイルス性ｄｎａベクターおよびその使用
TW202126284A (zh) 2019-09-30 2021-07-16 美商百歐維拉提夫治療公司 慢病毒載體配製物
JP6831943B1 (ja) 2019-10-24 2021-02-17 三ツ星ベルト株式会社 摩擦伝動ベルトおよびその製造方法
US20220396610A1 (en) * 2019-11-01 2022-12-15 Freeline Therapeutics Limited Factor viii polypeptide
CA3161154A1 (en) * 2019-11-14 2021-05-20 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with liver-specific gene therapy vectors
EP4069269A4 (en) * 2019-12-06 2023-12-27 The Children's Hospital Of Philadelphia COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FACTOR VIII FUNCTION
US20230023826A1 (en) 2019-12-12 2023-01-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
WO2021236908A2 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of regulatory proteins for the production of adeno-associated virus
WO2021262963A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein
US20230407328A1 (en) 2020-11-02 2023-12-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Process for enriching adeno-associated virus
AU2021391433A1 (en) * 2020-12-01 2023-06-22 Akouos, Inc. Anti-vegf antibody constructs and related methods for treating vestibular schwannoma associated symptoms
CN116710149A (zh) * 2020-12-18 2023-09-05 桑格摩生物治疗股份有限公司 含有腺相关病毒载体的改善的药物组合物
JP2024527252A (ja) 2021-06-14 2024-07-24 武田薬品工業株式会社 発現の増加した組み換えｆｖｉｉｉバリアントをコードするウイルスベクターを用いた、血友病ａの遺伝子療法
EP4359547A1 (en) * 2021-06-22 2024-05-01 Pfizer Inc. Production of adeno-associated virus vector in insect cells
EP4377466A4 (en) * 2021-07-28 2025-11-05 Biomarin Pharm Inc LARGE-SCALE ADENE-ASSOCIATED VIRUS PRODUCTION SYSTEMS
KR20240049332A (ko) * 2021-08-23 2024-04-16 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 인자 viii 유전자
WO2023036054A2 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Inspirar Limited Composition and method for treating hemophilia
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023173078A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Homology Medicines, Inc. Bidirectional dual promoter expression vectors and uses thereof
US20250276093A1 (en) * 2022-04-20 2025-09-04 AskBio Inc. Therapeutic adeno-associated virus using codon optimized nucleic acid encoding factor viii
TW202417631A (zh) 2022-09-22 2024-05-01 美商拜奧馬林製藥公司 用ａａｖ基因治療載體治療心肌病
TW202421788A (zh) 2022-09-22 2024-06-01 美商拜奧馬林製藥公司 用ａａｖ基因療法載體治療致心律不整性心肌病
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用
WO2024074143A1 (en) * 2022-10-08 2024-04-11 Lingyi Biotech Co., Ltd. Construct for enhancing gene expression
CN116555266B (zh) * 2023-06-09 2024-11-12 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 肝脏特异性表达的重组启动子和载体及其在肝脏相关疾病治疗中的应用
WO2025008774A1 (en) 2023-07-05 2025-01-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
CN118064436B (zh) * 2024-04-18 2024-07-26 上海凌医生物科技有限公司 一种增强基因表达的嵌合启动子
WO2025239324A1 (ja) * 2024-05-13 2025-11-20 中外製薬株式会社 遺伝子改変非ヒト動物

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
KR100356615B1 (ko) * 1993-07-13 2003-04-03 아방티 파르마 소시에테 아노님 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6521225B1 (en) 1996-09-06 2003-02-18 Chiron Corporation AAV vectors
WO2000011149A1 (en) * 1998-08-24 2000-03-02 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
WO2003074714A1 (en) 2002-03-05 2003-09-12 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Baculovirus expression system
ES2436741T3 (es) 2004-09-22 2014-01-07 St. Jude Children's Research Hospital Expresión mejorada de Factor IX en vectores de terapia génica
CN1286981C (zh) * 2004-11-30 2006-11-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
EP1739179A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
US7943374B2 (en) * 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
US7943379B2 (en) 2008-04-30 2011-05-17 Nationwide Children's Hospital, Inc. Production of rAAV in vero cells using particular adenovirus helpers
GB0911870D0 (en) * 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
KR20140083035A (ko) * 2011-10-18 2014-07-03 체에스엘 베링 게엠베하 인자 ｖｉｉｉ의 생체이용률을 증가시키기 위한 황산화 글리코사미노글리칸과 하이알루로니다제의 병용 사용
CN103215308B (zh) * 2013-02-01 2015-12-23 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 表达重组人fviii的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用
ES2813698T3 (es) 2013-09-12 2021-03-24 Biomarin Pharm Inc Vectores de AAV que comprenden un gen que codifica el factor VIII

Also Published As

Publication number Publication date
FR23C1007I1 (fr) 2023-03-24
EP3770169A1 (en) 2021-01-27
CA3178379A1 (en) 2015-03-19
AU2014318890B2 (en) 2019-03-07
US20200101140A1 (en) 2020-04-02
JP6735672B2 (ja) 2020-08-05
KR20160049015A (ko) 2016-05-04
US20220339262A1 (en) 2022-10-27
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