CN105636981A - 腺相关病毒因子viii载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改进的腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，包括产生功能性因子VIII多肽的AAV？FVIII载体以及具有高表达活性的AAV？FVIII载体。

Description

腺相关病毒因子VIII载体
本申请要求2013年9月12日提交的美国临时专利申请序列号61/877,042的优先权，该美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，包括具有高表达活性的AAVFVIII载体和表达全长或截短型功能性FVIII的AAVFVIII载体。本发明还涉及制备本文所述的AAVFVIII载体的方法和其相关的治疗用途。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是一种感染人类和一些其它灵长类物种的小的有复制缺陷的无包膜的动物病毒。AAV的若干特征使得这种病毒成为用于通过基因治疗递送治疗性蛋白质的有吸引力的运载体，包括例如已知AAV不会引起人类疾病并且AAV诱导轻微的免疫反应，以及AAV载体可以感染分裂的细胞和休眠细胞这两者而不整合到宿主细胞基因组中。使用AAV的基因治疗载体已经被成功地用于一些临床试验中，例如用于向肝脏递送人类因子IX(FIX)以治疗B型血友病(Nathwani等,NewEngl.J.Med.365:2357-2365,2011)。
然而，AAV基因治疗载体确实有一些缺点。具体来说，AAV载体的克隆能力由于所述病毒的DNA包装能力而是有限的。野生型AAV的单链DNA基因组是约4.7个千碱基(kb)。实际上，最多约5.0kb的AAV基因组似乎被完全包装(即全长)到AAV病毒颗粒中。对于AAV载体中的核酸基因组必须具有两个具有约145个碱基的AAV反向末端重复序列(ITR)的要求来说，AAV载体的DNA包装能力使得蛋白质编码序列的最多约4.4kb可以被衣壳化。
由于这一尺寸限制，大的治疗性基因，即长度大于约4.4kb的那些一般不适用于AAV载体中。一种这样的治疗性基因是因子VIII(FVIII)基因，它具有编码具有2332个氨基酸的多肽的约7.0kb的mRNA，所述多肽从N末端到C末端包含具有19个氨基酸的信号肽以及三个大的结构域(即重链或A结构域、中央或B结构域、以及轻链或C结构域)。已经被用于针对FVIII克服AAV载体尺寸限制的一种策略在于使用两种AAV载体，一种编码重链或A结构域，并且另一种编码轻链或C结构域(参见例如Coutu等的美国专利号6,221349、6,200,560以及7,351,577)。规避这一尺寸限制的另一种策略在于产生编码如下的FVIII的AAV载体，其中所述蛋白质的中央部分或B结构域已经缺失并且被具有14个氨基酸的接头置换，所述接头被称为SQ序列(Ward等,Blood,117:798-807,2011；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013)。
虽然在文献中已经报道AAV载体具有>5.0kb的AAV基因组，但是在这些情况中的许多情况下，所编码的基因的5'末端或3'末端似乎被截短(参见Hirsch等,Molec.Ther.18-6-8,2010；以及Ghosh等,Biotech.Genet.Engin.Rev.24:165-178,2007)。然而，已经证实的是，在受AAV感染的细胞中在具有5'末端截短的核酸与具有3'末端截短的核酸之间存在重叠的同源重组，以使得产生编码大蛋白质的“完整”核酸，从而重新构建功能性的全长基因。
对可用于基因治疗方法中以治疗A型血友病的编码功能性因子VIII蛋白质的新型AAV载体存在需要。因而，本发明涉及AAV载体，所述AAV载体编码功能活性FVIII以使得AAV病毒体将编码治疗性蛋白质的整个核酸衣壳化，即完全包装的AAVFVIII载体，从而避免尺寸过大的基因组的上述问题，或至少产生可能被截短或可能没有被截短的功能活性因子VIII蛋白质。此外，为了避免衣壳引导的免疫反应，AAV载体应当具有每个衣壳颗粒的靶蛋白的最高可能的转导/表达活性。本发明还涉及具有高表达活性的完全AAVFVIII载体的制备。最终，本发明涉及用于产生本文所述的AAV因子VIII载体的方法以及使用其的相关方法。
发明内容
本发明提供了编码功能活性FVIII的AAV载体(在本文被称为“AAVFVIII载体”)。编码功能活性FVIII的基因组优选地具有最多7.0kb的长度，更优选地具有最多6.5kb的长度，还更优选地具有最多6.0kb的长度，还更优选地具有最多5.5kb的长度，还更优选地具有最多5.0kb的长度，具有增强的启动子功能。
如本文所用的“功能活性FVIII”是当在培养细胞中表达时具有野生型FVIII蛋白质的体外功能或当在细胞或身体组织中表达时具有野生型FVIII蛋白质的体内功能的FVIII蛋白质。这包括例如在患有A型血友病的受试者中允许发生凝血以及缩短血液凝固所耗费的时间。野生型FVIII经由凝血级联，充当激活的FIX(FIXa)的辅因子来参与凝血，所述激活的FIX在钙离子和磷脂存在下形成复合体，所述复合体将因子X(FX)转化成激活的FX(FXa)。因此，功能活性FVIII可以与FIXa形成复合体，所述复合体可以将FX转化成FXa。
如本文所用的“AAV载体”指的是单链或双链的核酸，所述核酸具有：侧接蛋白质编码序列的AAV5'反向末端重复(ITR)序列和AAV3'ITR，所述蛋白质编码序列与转录调节元件，即一个或多个启动子和/或增强子、以及多聚腺苷酸化序列可操作地连接；以及任选的插入到所述蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。单链AAV载体指的是存在于AAV病毒颗粒的基因组中的核酸，并且所述核酸可以是本文所公开的核酸序列的正义链或反义链。这样的单链核酸的尺寸是以碱基提供的。双链AAV载体指的是存在于用于表达或转移AAV载体核酸的质粒(例如pUC19)的DNA或双链病毒(例如杆状病毒)的基因组中的核酸。这样的双链核酸的尺寸是以碱基对(bp)提供的。
如本文所用的术语“反向末端重复序列(ITR)”指的是存在于AAV基因组的5'末端和3'末端处的本领域公认的区域，所述区域以顺式充当DNA复制起点和病毒基因组的包装信号。AAVITR连同AAVrep编码区一起提供在两个侧接的ITR之间插入到宿主细胞基因组中的核苷酸序列的高效切除和拯救以及整合。某些AAV相关ITR的序列由Yan等,J.Virol.79(1):364-379(2005)公开，该文献以引用的方式整体并入本文。
“转录调节元件”指的是涉及调节基因转录的基因的核苷酸序列，包括启动子、加上响应元件、用于结合转录因子以有助于RNA聚合酶结合并且促进表达的激活子和增强子序列、以及与阻遏蛋白结合以阻断RNA聚合酶连接并且阻止表达的操纵子或沉默子序列。术语“肝脏特异性转录调节元件”指的是特异性地调节肝脏组织中的基因表达的调节元件。肝脏特异性调节元件的实例包括但不限于小鼠甲状腺素运载蛋白启动子(mTTR)、内源性人类因子VIII启动子(F8)、人类α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)和其活性片段、人白蛋白最小启动子、以及小鼠白蛋白启动子。还涵盖了源自于肝脏特异性转录因子结合位点的增强子，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及Enh1。
在一个实施方案中，本发明的AAV载体包含一种核酸，所述核酸编码具有被具有14个氨基酸的SQ序列置换的B结构域的功能活性FVIII，即编码FVIIISQ。所述SQ序列公开在Ward等,Blood,117:798-807,2011；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013中。所述FVIII编码区序列是密码子优化的序列(参见Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1，该美国专利申请公开以引用的方式整体并入本文；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013)。这个序列在本文被称作“UCLSQFVIII”。
在第一个方面，本发明的AAV载体包含Proto1，所述Proto1示意性地描绘于图2A中并且包含SEQIDNO:1中所示的核酸序列。
在第二个方面，本发明的AAV载体包含Proto1S，所述Proto1S示意性地描绘于图2B中并且包含SEQIDNO:2中所示的核酸序列。
在第三个方面，本发明的AAV载体包含Proto2S，所述Proto2S示意性地描绘于图2C中并且包含SEQIDNO:3中所示的核酸序列。
在第四个方面，本发明的AAV载体包含Proto3S，所述Proto3S示意性地描绘于图2D中并且包含SEQIDNO:4中所示的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体包含一种核酸，所述核酸编码缺少包括SQ序列在内的整个B结构域和a3结构域的FVIII，所述a3结构域正位于轻链或C结构域的N末端。所述FVIII编码区序列是密码子优化的序列(参见Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1，该美国专利申请公开以引用的方式整体并入本文；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013)。
在第一个方面，本发明的AAV载体包含Proto4，所述Proto4示意性地描绘于图3A中并且包含SEQIDNO:5中所示的核酸序列。
在第二个方面，本发明的AAV载体包含Proto5，所述Proto5示意性地描绘于图3B中并且包含SEQIDNO:6中所示的核酸序列。
在第三个方面，本发明的AAV载体包含Proto6，所述Proto6示意性地描绘于图3C中并且包含SEQIDNO:7中所示的核酸序列。
在第四个方面，本发明的AAV载体包含Proto7，所述Proto7示意性地描绘于图3D中并且包含SEQIDNO:8中所示的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体包含一种核酸，所述核酸包含AAV25'反向末端重复序列(ITR)、肝脏特异性转录调节区、密码子优化的功能活性FVIII编码区、任选的一个或多个内含子、多聚腺苷酸化序列、以及AAV23'ITR。在一个优选的实施方案中，所述肝脏特异性转录调节区包含缩短的ApoE增强子序列；具有186个碱基的人类α抗胰蛋白酶(hAAT)近端启动子，包括5'非翻译区(UTR)的42个碱基；以及选自由以下各项组成的组的一个或多个增强子：(i)具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子、(ii)具有32个碱基的人类AAT启动子远端X区、以及(iii)人类AAT近端启动子的远端元件的80个额外的碱基；并且密码子优化的功能活性FVIII编码区编码FVIIISQ变体。在另一个优选的实施方案中，所述肝脏特异性转录调节区包含a1微球蛋白增强子序列和具有186个碱基的人类α抗胰蛋白酶(AAT)近端启动子。
在第一个方面，本发明的AAV载体包含构建体100ATG，所述构建体100ATG包含SEQIDNO:9中所示的核酸序列。
在第二个方面，本发明的AAV载体包含构建体100ATGbGH多聚腺苷酸(polyA)，所述构建体100ATGbGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:10中所示的核酸序列。
在第三个方面，本发明的AAV载体包含SEQIDNO:11中所示的构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸序列。
在第四个方面，本发明的AAV载体包含构建体103ATG，所述构建体103ATG包含SEQIDNO:12中所示的核酸序列。
在第五个方面，本发明的AAV载体包含构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸，所述构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:13中所示的核酸序列。
在第六个方面，本发明的AAV载体包含构建体105ATGbGH多聚腺苷酸，所述构建体105ATGbGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:14中所示的核酸序列。
在第七个方面，本发明的AAV载体包含构建体DC172ATGFVIII，所述构建体DC172ATGFVIII包含SEQIDNO:15中所示的核酸序列。
在第八个方面，本发明的AAV载体包含构建体DC172ATGFVIIIhAAT，所述构建体DC172ATGFVIIIhAAT包含SEQIDNO:16中所示的核酸序列。
在第九个方面，本发明的AAV载体包含构建体DC1722×HCRATGFVIII，所述构建体DC1722×HCRATGFVIII包含SEQIDNO:17中所示的核酸序列。
在第十个方面，本发明的AAV载体包含构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT，所述构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT包含SEQIDNO:18中所示的核酸序列。
在第十一个方面，本发明的AAV载体包含构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII，所述构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII包含SEQIDNO:19中所示的核酸序列。
在第十二个方面，本发明的AAV载体包含构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子，所述构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子包含SEQIDNO:20中所示的核酸序列。
在第十三个方面，本发明的AAV载体包含构建体100ATG短多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子，所述构建体100ATG短多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子包含SEQIDNO:21中所示的核酸序列。
在第十四个方面，本发明的AAV载体包含构建体因子VIII-BMN001，所述构建体因子VIII-BMN001包含SEQIDNO:22中所示的核酸序列。
在第十五个方面，本发明的AAV载体包含SEQIDNO:23中所示的构建体因子VIII-BMN002序列。
在第十六个方面，本发明的AAV载体包含构建体99，所述构建体99包含SEQIDNO:24中所示的核酸序列。
在第十七个方面，本发明的AAV载体包含构建体100，所述构建体100包含SEQIDNO:25中所示的核酸序列。
在第十八个方面，本发明的AAV载体包含构建体100反向定向，所述构建体100反向定向包含SEQIDNO:26中所示的核酸序列。
在第十九个方面，本发明的AAV载体包含构建体100AT，所述构建体100AT包含SEQIDNO:27中所示的核酸序列。
在第二十个方面，本发明的AAV载体包含构建体100AT2×MG，所述构建体100AT2×MG包含SEQIDNO:28中所示的核酸序列。
在第二十一个方面，本发明的AAV载体包含构建体100AT2×MGbGH多聚腺苷酸，所述构建体100AT2×MGbGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:29中所示的核酸序列。
在第二十二个方面，本发明的AAV载体包含构建体100AT2×MG(反向)bGH多聚腺苷酸，所述构建体100AT2×MG(反向)bGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:30中所示的核酸序列。
在第二十三个方面，本发明的AAV载体包含构建体100bGH多聚腺苷酸，所述构建体100bGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:31中所示的核酸序列。
在第二十四个方面，本发明的AAV载体包含构建体100-400，所述构建体100-400包含SEQIDNO:32中所示的核酸序列。
在第二十五个方面，本发明的AAV载体包含构建体101，所述构建体101包含SEQIDNO:33中所示的核酸序列。
在第二十六个方面，本发明的AAV载体包含构建体102序列，所述构建体102序列包含SEQIDNO:34中所示的核酸序列。
在第二十七个方面，本发明的AAV载体包含构建体103，所述构建体103包含SEQIDNO:35中所示的核酸序列。
在第二十九个方面，本发明的AAV载体包含构建体103反向定向，所述构建体103反向定向包含SEQIDNO:36中所示的核酸序列。
在第三十个方面，本发明的AAV载体包含构建体103AT，所述构建体103AT包含SEQIDNO:37中所示的核酸序列。
在第三十一个方面，本发明的AAV载体包含构建体103AT2×MG，所述构建体103AT2×MG包含SEQIDNO:38中所示的核酸序列。
在第三十二个方面，本发明的AAV载体包含构建体103AT2×MGbGH多聚腺苷酸，所述构建体103AT2×MGbGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:39中所示的核酸序列。
在第三十三个方面，本发明的AAV载体包含构建体103bGH多聚腺苷酸，所述构建体103bGH多聚腺苷酸包含SEQIDNO:40中所示的核酸序列。
在第三十四个方面，本发明的AAV载体包含构建体104，所述构建体104包含SEQIDNO:41中所示的核酸序列。
在第三十五个方面，本发明的AAV载体包含构建体105，所述构建体105包含SEQIDNO:42中所示的核酸序列。
在第三十六个方面，本发明的AAV载体包含构建体106，所述构建体106包含SEQIDNO:43中所示的核酸序列。
在第三十七个方面，本发明的AAV载体包含构建体106AT，所述构建体106AT包含SEQIDNO:44中所示的核酸序列。
在第三十八个方面，本发明的AAV载体包含构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAAT，所述构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAAT包含SEQIDNO:45中所示的核酸序列。
在另外的其它实施方案中，本发明涉及编码功能性因子VIII多肽的载体构建体，其中所述构建体以一个或多个不同的定向包含上述构建体和其组合的单个元件中的一个或多个。本发明还涉及呈相反定向的上述构建体。
呈单链形式的本发明的AAV载体具有小于约7.0kb的长度，或具有小于6.5kb的长度，或具有小于6.4kb的长度，或具有小于6.3kb的长度，或具有小于6.2kb的长度，或具有小于6.0kb的长度，或具有小于5.8kb的长度，或具有小于5.6kb的长度，或具有小于5.5kb的长度，或具有小于5.4kb的长度，或具有小于5.4kb的长度，或具有小于5.2kb的长度或具有小于5.0kb的长度。呈单链形式的本发明的AAV载体的长度在约5.0kb至约6.5kb的范围内，或长度在约4.8kb至约5.2k的范围内，或长度在4.8kb至5.3kb的范围内，或长度在约4.9kb至约5.5kb的范围内，或长度在约4.8kb至约6.0kb的范围内，或长度在约5.0kb至6.2kb的范围内或长度在约5.1kb至约6.3kb的范围内，或长度在约5.2kb至约6.4kb的范围内，或长度在约5.5kb至约6.5kb的范围内。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生重组腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，所述重组腺相关病毒(AAV)颗粒包含本发明的AAV载体中的任一种。所述方法包括以下步骤：培养已经转染了本发明的AAV载体中的任一种的细胞以及从转染的细胞的上清液中回收重组AAV。
本发明的细胞是易受杆状病毒感染的任何细胞类型，包括昆虫细胞，如HighFive、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5以及Ao38。所使用的优选的哺乳动物细胞可以是HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19以及MRC-5细胞，并且包括哺乳动物细胞，如HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19以及MRC-5细胞。
本发明还提供了包含本发明的AAV载体中的任一种的病毒颗粒或通过本发明的上述方法所产生的任何病毒颗粒。
“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指的是由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如欲被递送到哺乳动物细胞中的转基因)，那么它通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，以使得载体被包含在AAV载体颗粒内。
本发明还提供了包含本发明的AAV载体中的任一种的细胞以及由本发明的这些细胞产生的病毒颗粒。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有A型血友病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本发明的AAV载体中的任一种或本发明的病毒颗粒或由本发明的方法产生的病毒颗粒。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的AAV载体中的任一种用于制备用于治疗A型血友病的药物的用途。在一个方面，所述药物包含表达有效治疗A型血友病的量的人类FVIII的量的AAV载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的AAV载体中的任一种以用于治疗A型血友病。在一个方面，所述组合物包含表达有效治疗A型血友病的量的人类FVIII的量的AAV载体。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体用于产生可用于治疗患有A型血友病的患者的AAV病毒颗粒。
附图说明
图1提供了UCLSQ载体的示意图。从左至右，所述UCLSQ载体包含AAV25'ITR；野生型AAV2病毒序列；具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子；具有32个碱基的人类AAT启动子远端X区；具有186个碱基的人类AAT启动子，包括5'UTR序列的42个碱基；密码子优化的人类FVIIISQ序列(参见Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1，该美国专利申请公开以引用的方式整体并入本文；以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013)；具有49个碱基的合成多聚腺苷酸化序列；野生型AAV2病毒序列；以及AAV23'ITR。所述UCLSQ载体具有5081个碱基的长度。
图2提供了Proto1载体、Proto1S载体、Proto2S载体以及Proto3S载体的示意图和序列。(A)Proto1载体的示意图。从UCLSQ载体(参见图1)开始，使外部野生型AAV2病毒序列缺失，并且去除人类AAT5'UTR与人类FVIII编码区之间和人类FVIII终止密码子与合成多聚腺苷酸化序列之间对应于限制性酶切位点的序列。(B)Proto1S载体的示意图。从Proto1载体开始，使AAV25'ITR的3'末端处的10个碱基和3'ITR的5'末端处的10个碱基缺失。(C)Proto2S载体的示意图。从Proto1S载体开始，将人类ApoE/C1增强子和人类AAT启动子远端X区移动到被插入到人类FVIII序列的外显子1与2之间的具有100个碱基的合成内含子中。如由箭头所示，人类ApoE/C1增强子和人类AAT启动子远端X区的定向与它们在Proto1S中的定向相比是反向的。(D)Proto3S载体的示意图。从Proto2S开始，将人类AAT启动子远端X区用人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以反向定向置换。
图3提供了Proto4载体、Proto5载体、Proto6载体以及Proto7载体的示意图。(A)Proto4载体的示意图。从Proto1载体开始，使SQ序列和a3结构域缺失。(B)Proto5载体的示意图。从Proto4载体开始，将具有129个碱基的FVIII内含子插入于人类因子VIII序列的外显子1与2之间。(C)Proto6载体的示意图。从Proto5载体开始，将人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以正向定向插入于FVIII内含子中。(D)Proto7载体的示意图。从Proto5载体开始，将人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以反向定向插入于FVIII内含子中。
图4A-图4KK提供了具有改进的启动子/增强子序列的AAVFVIII载体的示意图。(A)构建体100ATG的示意图。(B)构建体100ATGbGH多聚腺苷酸的示意图。(C)构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸的示意图。(D)构建体103ATG的示意图。(E)构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸的示意图。(F)构建体105ATGbGH多聚腺苷酸的示意图。(G)构建体DC172ATGFVIII的示意图。(H)构建体DC172ATGFVIIIhAAT的示意图。(I)构建体DC1722×HCRATGFVIII的示意图。(J)构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT的示意图。(K)构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII的示意图。(L)构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子的示意图。(M)构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子的示意图。(N)构建体因子VIII-BMN001的示意图。(O)构建体FVIII-BMN002的示意图。(P)构建体99的示意图。(Q)构建体100的示意图。(R)构建体100反向定向的示意图。(S)构建体100AT的示意图。(T)构建体100AT2×MG的示意图。(U)构建体100AT2×MGbGH多聚腺苷酸的示意图。(V)构建体100AT2×MG(反向)bGH多聚腺苷酸的示意图。(W)构建体100bGH多聚腺苷酸。(X)构建体100-400的示意图。(Y)构建体101的示意图。(Z)构建体102的示意图。(AA)构建体103的示意图。(BB)构建体103反向定向的示意图。(CC)构建体103AT的示意图。(DD)构建体103AT2×MG的示意图。(EE)构建体103AT2×MGbGH多聚腺苷酸的示意图。(FF)103sbGH多聚腺苷酸的示意图。(GG)构建体104的示意图。(HH)构建体105的示意图。(II)构建体106的示意图。(JJ)构建体106AT的示意图。(KK)构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAAT的示意图。
图5提供了在Rag2小鼠中评价Proto构建体的结果，并且证实Proto1以类似于野生型的方式转导FVIII。
图6和7证实Proto1、Proto1S、Proto2S以及Proto3S表达VP1、VP2和VP3蛋白质(图5)以及VP1、VP2和VP3DNA(图6)。
图8-10证实改进的启动子构建体提高了FVIII的表达。
具体实施方式
尺寸过大的AAV载体会在5'末端处被随机地截短并且缺少5'AAVITR。由于AAV是单链DNA病毒并且包装正义链或反义链，因此尺寸过大的AAV载体中的正义链缺少5'AAVITR并且可能缺少靶蛋白编码基因的5'末端的部分，并且尺寸过大的AAV载体中的反义链缺少3'ITR并且可能缺少靶蛋白编码基因的3'末端的部分。功能性转基因在受尺寸过大的AAV载体感染的细胞中是通过正义截短型基因组和反义截短型基因组在靶细胞内的退火而产生的。
本发明提供了编码功能活性FVIII的AAV载体，即完全包装的AAVFVIII载体或具有高表达活性的AAVFVIII载体。本发明的AAVFVIII载体具有提高的表达/颗粒以及提高的AAV病毒产量和简化的纯化。将一个或多个内含子引入到FVIII蛋白质编码区中提高了表达。重新配置增强子的数目和定位也提高了表达。
UCLSQ载体
UCLSQ载体是一种尺寸过大，即大于5.0kb的AAV载体，该UCLSQ载体详细描述于Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013中，该美国专利申请公开以引用的方式整体并入本文。如图1中所示，UCLSQ载体从左至右包含AAV血清2型(AAV2)5'ITR；野生型AAV2病毒序列；具有34个碱基的人类载脂蛋白E(ApoE)/C1增强子；具有32个碱基的人类α抗胰蛋白酶(AAT)启动子远端X区；具有186个碱基的人类AAT启动子，包括5'非翻译区(UTR)序列的42个碱基；密码子优化的人类FVIII序列，其中B结构域被具有14个氨基酸的SQ序列置换；具有49个碱基的合成多聚腺苷酸化序列；野生型AAV2病毒序列；以及AAV23'ITR。所述UCLSQ载体具有5081个碱基的长度。
如Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013中所证实，所述UCLSQ载体在体外和体内表达功能活性FVIII。
Proto1载体、Proto1S载体、Proto2S载体以及Proto3S载体
为了避免尺寸过大的AAV载体的问题和/或为了提高AAV载体的表达，本发明提供了编码FVIIISQ变体的完全包装的更小，即小于5.0kb的AAV载体。Proto1的序列的4970bp核苷酸序列示于SEQIDNO:1中。
为了产生AAV载体Proto1，与UCLSQ载体相比，使对于功能活性FVIII的产生来说似乎不必要的序列缺失。如实施例1中所示，去除外部DNA的110个碱基，包括AAV25'ITR的3'末端处的AAV2病毒序列的53个碱基、AAV23'ITR的5'末端处的AAV2病毒序列的46个碱基、以及与密码子优化的FVIIISQ编码区相邻的11个碱基。所得的Proto1载体具有4970个碱基的长度。在设计时，Proto1载体是否将能够在体外或体内表达功能性FVIII多肽是未知的。
为了产生AAV载体Proto1S，从Proto1载体去除AAV25'ITR的3'末端处的10个碱基、以及AAV323'ITR的5'末端处的10个碱基。所得的Proto1S载体具有4950个碱基的长度。Proto1S的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:2中。
为了产生AAV载体Proto2S，将合成的具有100个碱基的内含子插入于Proto1S载体中密码子优化的FVIIISQ序列的外显子1与2之间。将具有34个碱基的ApoE/C1增强子和具有32个碱基的人类AAT启动子远端X区从人类AAT启动子的上游去除并且以反向定向插入所述合成内含子中(与在这些元件位于人类AAT启动子的上游时的定向相比)。所得的Proto2S载体具有4983个碱基的长度。Proto2S的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:3中。
为了产生AAV载体Proto3S，将人类AAT启动子远端X区从Proto2S载体中去除，并且用具有34个碱基的ApoE/C1增强子的第二个拷贝以反向定向置换。所得的Proto3S载体具有4984个碱基的长度。Proto3S的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:4中。
Proto4载体、ProtoS载体、Proto6载体以及Proto7载体
为了减小AAV载体的尺寸和/或提高AAV载体的表达，本发明还提供了编码B结构域和a3结构域缺失的FVIII的完全包装的更小，即小于5.0kb的AAV载体。
为了产生AAV载体Proto4，将具有14个氨基酸的SQ序列和位于与C结构域相邻处的a3结构域从Proto1载体中去除。缺失的FVIII序列的总量是55个氨基酸或165个碱基。所得的Proto4载体具有4805个碱基的长度。Proto4的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:5中。
为了产生AAV载体Proto5，将具有129个碱基的截短型FVIII内含子插入于Proto4载体中密码子优化的FVIII序列的外显子1与2之间。所得的Proto5载体具有4934个碱基的长度。Proto5的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:6中。
为了产生AAVProto6载体，在Proto5载体中将FVIII内含子的34个碱基用具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以正向定向置换。所得的Proto6载体具有4934个碱基的长度。Proto6的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:7中。
为了产生AAVProto7载体，在Proto5载体中将FVIII内含子的34个碱基用具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以反向定向置换。所得的Proto7载体具有4934个碱基的长度。Proto7的序列的核苷酸序列示于SEQIDNO:8中。
具有改进的启动子/增强子序列的另外的AAVFVIII载体
产生具有强启动子的尺寸过大的AAV载体以提高B结构域和a3结构域缺失的FVIII的表达，并且这些构建体是用修饰的增强子和/或启动子序列产生的。在一些实施方案中，AAVFVIII载体表达截短型功能性FVIII。这些构建体包含一个或多个启动子和增强子序列，如ApoEHCR或其片段、μ-球蛋白增强子或其片段、人类α1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)或其片段、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A增强子或其片段、LP1启动子增强子或其片段、或巨球蛋白增强子或其片段。这些构建体包含多聚腺苷酸化序列，如bGH多聚腺苷酸序列或合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸序列。在某个实施方案中，所述构建体包含内含子或内含子的片段，如hAAT内含子或人类β-球蛋白内含子。
构建体100ATG具有5511个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:9中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-502是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基727-910是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基923-5296是密码子优化的SQFVIII，碱基5305-5352是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5367-5511是3'AAV2ITR。
构建体100ATGbGH多聚腺苷酸具有5688个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:10中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-502是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基727-910是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基923-5296是密码子优化的SQFVIII，碱基5305-5529是bGH多聚腺苷酸并且碱基5544-5688是3'AAV2ITR。
构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸具有5613个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:11中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-502是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基727-910是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基923-5296是密码子优化的SQFVIII，碱基5305-5454是短bGH多聚腺苷酸并且碱基5469-5613是3'AAV2ITR。
构建体103ATG具有5362个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:12中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoE重复序列的四个拷贝(4×)，碱基360-577是hAAT启动子，碱基578-761是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基774-5147是密码子优化的SQFVIII，碱基5156-5203是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5218-5362是3'AAV2ITR。
构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸具有5464个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:13中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoE重复序列的四个拷贝(4×)，碱基360-577是hAAT启动子，碱基578-761是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基774-5147是密码子优化的SQFVIII，碱基5156-5305是bGH短多聚腺苷酸并且碱基5320-5464是3'AAV2ITR。
构建体105ATGbGH多聚腺苷酸具有6354个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:14中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基173-512是170bp微球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基519-736是hAAT启动子，碱基737-920是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基933-5306是密码子优化的SQFVIII，碱基5315-5539是bGH多聚腺苷酸，碱基5546-6195是325bpApoEHCR的两个拷贝(2×)并且碱基6210-6354是3'AAV2ITR。
构建体DC172ATGFVIII具有6308个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:15中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-449是145bp巨球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基450-1347是898bphAAT启动子，碱基1348-1531是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基1544-5917是密码子优化的SQFVIII，碱基5926-6149是bGH多聚腺苷酸并且碱基6164-6308是3'AAV2ITR。
构建体DC172ATGFVIIIhAAT具有5635个碱基的长度。这一构建体被示为SEQIDNO:16，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-449是145bp巨球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基457-674是hAAT启动子，碱基675-858是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基871-5244是密码子优化的SQFVIII，碱基5253-5476是bGH多聚腺苷酸并且碱基5490-5635是3'AAV2ITR。
构建体DC1722×HCRATGFVIII具有6962个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:17中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-807是321bpApoEHCR的两个拷贝(2×)，碱基814-1103是145bp巨球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基1104-2001是898bphAAT启动子，碱基2002-2185是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基2198-6571是密码子优化的SQFVIII，碱基6580-6803是bGH多聚腺苷酸并且碱基6818-6962是3'AAV2ITR。
构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT具有6289个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:18中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-807是321bpApoEHCR的两个拷贝(2×)，碱基814-1103是145bp巨球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基1111-1328是hAAT启动子，碱基1329-1512是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基1525-5898是密码子优化的SQFVIII，碱基5907-6130是bGH多聚腺苷酸并且碱基6245-6289是3'AAV2ITR。
构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII具有5430个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:19中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基168-309是71bp丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A增强子的两个拷贝(2×)，碱基326-543是hAAT启动子，碱基544-727是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基740-5113是密码子优化的SQFVIII，碱基5122-5271是短bGH多聚腺苷酸，并且碱基5286-5430是3'AAV2ITR。
构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子具有5779个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:20中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基168-309是71bp丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A增强子的两个拷贝(2×)，碱基326-543是hAAT启动子，碱基544-727是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基740-5113是密码子优化的SQFVIII，碱基5122-5271是短bGH多聚腺苷酸，碱基5279-5618是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)并且碱基5635-5779是3'AAV2ITR。
构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子具有5962个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:21中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-502是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基727-910是修饰的人类β-球蛋白第二内含子，碱基923-5296是密码子优化的SQFVIII，碱基5305-5454是短bGH多聚腺苷酸，碱基5462-5801是170bp微球蛋白增强子的两个拷贝(2×)并且碱基5818-5962是3'AAV2ITR。
构建体因子VIII-BMN001具有5919个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:22中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-480是ApoEHCR，碱基487-884是398bphAAT启动子，碱基885-1145是截短型hAAT内含子，碱基1155-5528是密码子优化的SQFVIII，碱基5537-5760是bGH多聚腺苷酸并且碱基5775-5919是3'AAV2ITR。
构建体FVIII-BMN002具有5306个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:23中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基175-705是LP1启动子/增强子，碱基718-5091是密码子优化的SQFVIII，碱基5100-5147是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5162-5306是3'AAV2ITR。
构建体99具有5461个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:24中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-627是ApoEHCR/MAR，碱基634-866是hAAT启动子，碱基873-5246是密码子优化的SQFVIII，碱基5255-5302是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5317-5461是3'AAV2ITR。
构建体100具有5327个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:25中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基739-5112是密码子优化的SQFVIII，碱基5121-5168是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5183-5327是3'AAV2ITR。
构建体100反向定向具有5309个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:26中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-484是呈反向定向的ApoEHCR，碱基491-708是hAAT启动子，碱基721-5094是密码子优化的SQFVIII，碱基5103-5150是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5165-5309是3'AAV2ITR。
构建体100AT具有5532个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:27中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基727-931是hAAT内含子，碱基944-5317是密码子优化的SQFVIII，碱基5326-5373是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5388-5532是3'AAV2ITR。
构建体100AT2×MG具有5877个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:28中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基508-847是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基854-1071是hAAT启动子，碱基1072-1276是hAAT内含子，碱基1289-5662是密码子优化的SQFVIII，碱基5671-5718是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5733-5877是3'AAV2ITR。
构建体100AT2×MGbGH多聚腺苷酸具有6054个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:29中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基508-847是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基854-1071是hAAT启动子，碱基1072-1276是hAAT内含子，碱基1289-5662是密码子优化的SQFVIII，碱基5671-5895是bGH多聚腺苷酸并且碱基5910-6054是3'AAV2ITR。
构建体100AT2×MG(反向)bGH多聚腺苷酸具有6054个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:30中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基508-847是呈反向定向的170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基854-1071是hAAT启动子，碱基1072-1276是hAAT内含子，碱基1289-5662是密码子优化的SQFVIII，碱基5671-5895是bGH多聚腺苷酸并且碱基5910-6054是3'AAV2ITR。
构建体100bGH多聚腺苷酸具有5504个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:31中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基509-726是hAAT启动子，碱基739-5112是密码子优化的SQFVIII，碱基对5121-5345是bGH多聚腺苷酸并且碱基5360-5504是3'AAV2ITR。
构建体100-400具有5507个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:32中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-493是ApoEHCR，碱基512-906是398bphAAT启动子，碱基919-5292是密码子优化的SQFVIII，碱基5301-5348是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5363-5507是3'AAV2ITR。
构建体101具有5311个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:33中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基170-477是154bpApoEHCR的两个拷贝(2×)，碱基493-710是hAAT启动子，碱基723-5096是密码子优化的SQFVIII，碱基5105-5152是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5167-5311是3'AAV2ITR。
构建体102具有5156个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:34中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-322是154bpApoEHCR，碱基338-555是hAAT启动子，碱基568-4941是密码子优化的SQFVIII，碱基4950-4997是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5012-5156是3'AAV2ITR。
构建体103具有5178个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:35中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基360-577是hAAT启动子，碱基590-4963是密码子优化的SQFVIII，碱基4972-5019是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5034-5178是3'AAV2ITR。
构建体103反向定向具有5160个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:36中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-335是呈反向定向的44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基342-559是hAAT启动子，碱基572-4945是密码子优化的SQFVIII，碱基4954-5001是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5016-5160是3'AAV2ITR。
构建体103AT具有5383个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:37中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基360-577是hAAT启动子，碱基578-782是hAAT内含子，碱基795-4374是密码子优化的SQFVIII，碱基5177-5224是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5239-5383是3'AAV2ITR。
构建体103AT2×MG具有5728个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:38中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基359-698是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基705-922是hAAT启动子，碱基923-1127是hAAT内含子，碱基1140-5513是密码子优化的SQFVIII，碱基5522-5569是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5584-5728是3'AAV2ITR。
构建体103AT2×MGbGH多聚腺苷酸具有5905个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:39中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基359-698是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基705-922是hAAT启动子，碱基923-1127是hAAT内含子，碱基1140-5513是密码子优化的SQFVIII，碱基5522-5746是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5761-5905是5'AAV2ITR。
构建体103bGH多聚腺苷酸具有5355个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:40中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-344是44bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基360-577是hAAT启动子，碱基590-4963是密码子优化的SQFVIII，碱基4972-5196是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5211-5355是3'AAV2ITR。
构建体104具有5618个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:41中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基169-784是154bpApoEHCR的四个拷贝(4×)，碱基800-1017是hAAT启动子，碱基1030-5403是密码子优化的SQFVIII，碱基5412-5459是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5474-5618是3'AAV2ITR。
构建体105具有5993个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:42中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基173-512是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基519-736是hAAT启动子，碱基749-5122是密码子优化的SQFVIII，碱基5131-5178是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸，碱基5185-5834是ApoEHCR的两个拷贝(2×)并且碱基5849-5993是3'AAV2ITR。
构建体106具有5337个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:43中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基173-512是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基519-736是hAAT启动子，碱基749-5122是密码子优化的SQFVIII，碱基5131-5178是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5193-5337是3'AAV2ITR。
构建体106AT具有5542个碱基的长度。这一构建体示于SEQIDNO:44中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基173-512是170bpμ-球蛋白增强子的两个拷贝(2×)，碱基519-736是hAAT启动子，碱基737-941是hAAT内含子，碱基954-5327是密码子优化的SQFVIII，碱基5336-5383是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基5398-5542是3'AAV2ITR。
构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAAT是5126个碱基。这一构建体示于SEQIDNO:45中，其中碱基1-145是5'AAV2ITR，碱基160-301是ApoEHCR，碱基308-525是hAAT启动子，碱基538-4911是密码子优化的SQFVIII，碱基4920-4967是合成兔β-球蛋白多聚腺苷酸并且碱基4982-5126是3'AAV2ITR。
AAV载体
如本文所用的术语“AAV”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是只在细胞中生长的一种单链DNA细小病毒，其中某些功能由共感染辅助病毒提供。当前存在已经被表征的十三种AAV血清型，如下表1中所示。有关AAV的一般信息和综述可以见于例如Carter,1989,《细小病毒手册》(HandbookofParvoviruses),第1卷,第169-228页以及Berns,1990,《病毒学》(Virology),第1743-1764页,RavenPress,(NewYork)中。然而，完全预期的是，这些相同的原理将适用于另外的AAV血清型，这是因为公知的是，各种血清型在结构和功能这两方面，甚至是在基因水平上是非常密切相关的。(参见例如Blacklowe,1988,《细小病毒和人类疾病》(ParvovirusesandHumanDisease)的第165-174页,J.R.Pattison编著；以及Rose,《综合病毒学》(ComprehensiveVirology)3:1-61(1974))。举例来说，所有AAV血清型显然表现出由同源rep基因所介导的非常相似的复制特性；并且全部均带有三种相关的衣壳蛋白，如AAV6中表达的那些。相关度进一步通过异源双链体分析来表明，所述异源双链体分析揭示了血清型之间沿基因组长度的广泛的交叉杂交；以及对应于“反向末端重复序列”(ITR)的末端处类似的自退火段的存在。相似的感染模式还表明每一种血清型中的复制功能处在相似的调节控制之下。
如本文所用的“AAV载体”指的是包含由AAV末端重复序列(ITR)侧接的一个或多个所关注的多核苷酸(或转基因)的载体。当存在于已经被转染了编码和表达rep和cap基因产物的载体的宿主细胞中时，这样的AAV载体可以被复制和包装到感染性病毒颗粒中。
“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指的是由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如欲被递送到哺乳动物细胞中的转基因)，那么它通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，以使得载体被包含在AAV载体颗粒内。
AAV“rep”基因和“cap”基因分别是编码复制蛋白和衣壳化蛋白的基因。已经在迄今为止所研究的所有AAV血清型中发现了AAVrep基因和cap基因，并且所述基因描述于本文和所引用的参考文献中。在野生型AAV中，rep基因和cap基因一般被发现在病毒基因组中是彼此相邻的(即它们在一起“偶联”成邻接或重叠的转录单位)，并且它们在AAV血清型间一般是保守的。AAVrep基因和cap基因还被单独称为和统称为“AAV包装基因”。根据本发明的AAVcap基因编码Cap蛋白，所述Cap蛋白能够在rep和腺病毒辅助功能的存在下包装AAV载体并且能够结合靶细胞受体。在一些实施方案中，AAVcap基因编码具有源自于特定的AAV血清型，例如表1中所示的血清型的氨基酸序列的衣壳蛋白。
表1：AAV血清型
AAV血清型 基因库登录号
AAV-1 NC_002077.1
AAV-2 NC_001401.2
AAV-3 NC_001729.1
AAV-3B AF028705.1
AAV-4 NC_001829.1
AAV-5 NC_006152.1
AAV-6 AF028704.1
AAV-7 NC_006260.1
AAV-8 NC_006261.1
AAV-9 AX753250.1
AAV-10 AY631965.1
AAV-11 AY631966.1
AAV-12 DQ813647.1
AAV-13 EU285562.1
被用于产生AAV的AAV序列可以源自于任何AAV血清型的基因组。一般来说，AAV血清型具有在氨基酸水平和核酸水平上显著同源的基因组序列，提供一组相似的遗传功能，产生在物理上和功能上基本上等同的病毒体，并且通过几乎相同的机制复制和组装。对于AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的论述，参见例如基因库登录号U89790；基因库登录号J01901；基因库登录号AF043303；基因库登录号AF085716；Chlorini等,J.Vir.71:6823-33(1997)；Srivastava等,J.Vir.45:555-64(1983)；Chlorini等,J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge等,J.Vir.72:309-319(1998)；以及Wu等,J.Vir.74:8635-47(2000)。
所有已知的AAV血清型的基因组组织是非常相似的。AAV的基因组是具有小于约5,000个核苷酸(nt)的长度的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)侧接非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特的编码核苷酸序列。VP蛋白形成衣壳。末端的145nt是自身互补的并且经过组织以使得可以形成在能量上稳定的分子内双链体，所述双链体形成T形发夹结构。这些发夹结构充当病毒DNA复制起点，从而用作细胞DNA聚合酶复合体的引物。Rep基因编码Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52、以及Rep40。Rep78和Rep68是从p5启动子转录的，并且Rep52和Rep40是从p19启动子转录的。cap基因编码VP蛋白，即VP1、VP2以及VP3。cap基因是从p40启动子转录的。
在一些实施方案中，编码AAV衣壳蛋白的核酸序列与表达控制序列可操作地连接以在特定的细胞类型，如Sf9或HEK细胞中表达。可以使用本领域技术人员已知用于在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达外来基因的技术来实施本发明。用于在昆虫细胞中分子工程化和表达多肽的方法描述于例如以下文献中：Summers和Smith.1986.《用于杆状病毒载体和昆虫培养程序的方法手册》(AManualofMethodsforBaculovirusVectorsandInsectCultureProcedures),德克萨斯州农业实验站(TexasAgriculturalExperimentalStation),公告号(Bull.No.)7555,CollegeStation,Tex.；Luckow.1991.Prokop等,在具有杆状病毒载体的昆虫细胞中异源基因的克隆和表达(CloningandExpressionofHeterologousGenesinInsectCellswithBaculovirusVectors),《重组DNA技术和应用》(RecombinantDNATechnologyandApplications),97-152；King,L.A.和R.D.Possee,1992,《杆状病毒表达系统》(Thebaculovirusexpressionsystem),ChapmanandHall,UnitedKingdom；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,1992,《杆状病毒表达载体：实验室手册》(BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual),NewYork；W.H.Freeman和Richardson,C.D.,1995,《杆状病毒表达方案》(BaculovirusExpressionProtocols),《分子生物学方法》(MethodsinMolecularBiology),第39卷；美国专利号4,745,051；US2003148506；以及WO03/074714。对于编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的转录特别合适的启动子是例如多角体启动子。然而，在昆虫细胞中具有活性的其它启动子是本领域已知的，例如p10、p35或IE-1启动子，并且还考虑了上述参考文献中所述的另外的启动子。
使用昆虫细胞来表达异源蛋白质是有据可查的，将核酸，如载体，例如昆虫细胞相容性载体引入到这样的细胞中的方法以及在培养中维持这样的细胞的方法也是如此。参见例如《分子生物学方法》(METHODSINMOLECULARBIOLOGY),Richard编著,HumanaPress,NJ(1995)；O'Reilly等,《杆状病毒表达载体：实验室手册》(BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS,ALABORATORYMANUAL),OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA88:4646-50(1991)；Ruffing等,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kirnbauer等,Vir.219:37-44(1996)；Zhao等,Vir.272:382-93(2000)；以及Samulski等的美国专利号6,204,059。在一些实施方案中，在昆虫细胞中编码AAV的核酸构建体是昆虫细胞相容性载体。如本文所用的“昆虫细胞相容性载体”或“载体”指的是能够成效性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子、以及重组病毒。可以利用任何载体，只要它是昆虫细胞相容的即可。所述载体可以整合到昆虫细胞基因组中，但是载体在昆虫细胞中的存在不需要是永久性的并且还包括瞬时游离型载体。可以通过任何已知的手段，例如通过化学处理细胞、电穿孔、或感染来引入所述载体。在一些实施方案中，所述载体是杆状病毒、病毒载体、或质粒。在一个更优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒，即所述构建体是杆状病毒载体。杆状病毒载体和它们的使用方法描述于上文引用的关于昆虫细胞的分子工程化的参考文献中。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，其中两个成员是用于在细胞培养物中产生重组蛋白的公知的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80kbp-200kbp)，所述基因组可以被工程化以允许向特定的细胞递送大的基因组含量。被用作载体的病毒一般是苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)或家蚕(Bombyxmori，Bm)NPV(Kato等,2010)。
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。具体来说，可以实现异源基因在昆虫中的表达，如例如以下文献中所述：美国专利号
4,745,051；Friesen等(1986)；EP127,839；EP155,476；Vlak等(1988)；Miller等(1988)；Carbonell等(1988)；Maeda等(1985)；Lebacq-Verheyden等(1988)；Smith等(1985)；Miyajima等(1987)；以及Martin等(1988)。可以用于产生蛋白质的许多杆状病毒株和变体以及相应的容许的昆虫宿主细胞描述于Luckow等(1988)；Miller等(1986)；Maeda等(1985)；以及McKenna(1989)中。
用于产生重组AAV的方法
本公开提供了用于在昆虫细胞或哺乳动物细胞中产生重组AAV的材料和方法。在一些实施方案中，病毒构建体还包含启动子和启动子下游的限制性酶切位点以允许插入编码所关注的一种或多种蛋白质的多核苷酸，其中启动子和限制性酶切位点位于5'AAVITR的下游和3'AAVITR的上游。在一些实施方案中，病毒构建体还包含处于限制性酶切位点下游和3'AAVITR上游的转录后调节元件。在一些实施方案中，病毒构建体还包含插入于限制性酶切位点处并且与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含所关注的蛋白质的编码区。如本领域技术人员所将了解的那样，本申请中所公开的AAV载体中的任一种可以作为病毒构建体用于所述方法中以产生重组AAV。
在一些实施方案中，辅助功能是由包含腺病毒或杆状病毒辅助基因的一种或多种辅助质粒或辅助病毒提供的。腺病毒或杆状病毒辅助基因的非限制性实例包括但不限于E1A、E1B、E2A、E4以及VA，它们可以为AAV包装提供辅助功能。
AAV的辅助病毒是本领域已知的并且包括例如来自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV的辅助病毒的实例包括但不限于美国公开号20110201088(其公开内容以引用的方式并入本文)中所述的SAdV-13辅助病毒和SAdV-13样辅助病毒、辅助载体pHELP(AppliedViromics公司)。本领域技术人员将了解的是，可以为AAV提供足够的辅助功能的AAV的任何辅助病毒或辅助质粒均可以用于本文。
在一些实施方案中，AAVcap基因存在于质粒中。所述质粒还可以包含AAVrep基因。来自任何AAV血清型(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13和其任何变体)的cap基因和/或rep基因可以用于本文中以产生重组AAV。在一些实施方案中，AAVcap基因编码来自血清1型、血清2型、血清4型、血清5型、血清6型、血清7型、血清8型、血清9型、血清10型、血清11型、血清12型、血清13型或其变体的衣壳。
在一些实施方案中，可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助质粒或辅助病毒、编码AAVcap基因的病毒构建体和质粒转染；并且可以在共转染之后的各个时间点收集重组AAV病毒。举例来说，可以在共转染之后的约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、或这些时间点中的任何两个之间的时间收集重组AAV病毒。
还可以使用本领域已知的适用于产生感染性重组AAV的任何常规方法来产生重组AAV。在一些情况下，可以通过使用稳定表达对于AAV颗粒产生来说必要的组分中的一些的昆虫细胞或哺乳动物细胞来产生重组AAV。举例来说，包含AAVrep基因和cap基因以及选择标记，如新霉素抗性基因的质粒(或多种质粒)可以被整合到细胞的基因组中。然后可以将昆虫细胞或哺乳动物细胞用辅助病毒(例如提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒)以及包含5'AAVITR和3'AAVITR(以及如果需要的话，编码异源蛋白质的核苷酸序列)的病毒载体共感染。这种方法的优势在于所述细胞是可选择的并且适用于大规模产生重组AAV。作为另一个非限制性实例，可以使用腺病毒或杆状病毒，而不是使用质粒来将rep基因和cap基因引入到包装细胞中。作为又另一个非限制性实例，含有5'AAVLTR和3'AAVLTR的病毒载体以及含有rep-cap基因的病毒载体这两者可以被稳定整合到生产细胞的DNA中，并且辅助功能可以由野生型腺病毒提供以产生重组AAV。
用于产生AAV的细胞类型
包含本发明的AAV载体的病毒颗粒可以使用允许产生AAV或生物产物并且可以在培养中维持的任何无脊椎动物细胞类型来产生。举例来说，所使用的昆虫细胞系可以来自于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)，如SF9、SF21、SF900+；果蝇细胞系；蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedesalbopictus)衍生的细胞系；家蚕(domesticsilkworm)细胞系，例如家蚕(Bombyxmori)细胞系；粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞系，如HighFive细胞；或鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，如黑巫蛾(Ascalaphaodorata)细胞系。优选的昆虫细胞是来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括HighFive、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5以及Ao38。
杆状病毒是节肢动物的包膜DNA病毒，其中两个成员是用于在细胞培养物中产生重组蛋白的公知的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80kbp-200kbp)，所述基因组可以被工程化以允许向特定的细胞递送大的基因组含量。被用作载体的病毒一般是苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)或家蚕(Bm-NPV)(Kato等,2010)。
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。具体来说，可以实现异源基因在昆虫中的表达，如例如以下文献中所述：美国专利号4,745,051；Friesen等(1986)；EP127,839；EP155,476；Vlak等(1988)；Miller等(1988)；Carbonell等(1988)；Maeda等(1985)；Lebacq-Verheyden等(1988)；Smith等(1985)；Miyajima等(1987)；以及Martin等(1988)。可以用于产生蛋白质的许多杆状病毒株和变体以及相应的容许的昆虫宿主细胞描述于Luckow等(1988)；Miller等(1986)；Maeda等(1985)；以及McKenna(1989)中。
在本发明的另一个方面，还使用允许AAV复制或生物产物产生并且可以在培养中维持的任何哺乳动物细胞类型来进行本发明的方法。所使用的优选的哺乳动物细胞可以是HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT1080、A549、Cos-7、ARPE-19以及MRC-5细胞。
AAVFVIII载体的测试
测试本发明的完全包装的AAVFVIII载体的测定包括例如(1)在HepG2细胞中瞬时转染包含AAV载体核酸的双链DNA质粒以检验肝脏特异性mRNA的表达和剪接以及FVIII蛋白质的体外产生和分泌，所述HepG2细胞是一种源自于人类肝脏的细胞系；(2)在293细胞和受杆状病毒感染的昆虫细胞中产生包含AAVFVIII载体的AAV病毒体；(3)通过碱性凝胶分析和复制测定来评价AAV载体核酸；以及(4)在Rag2小鼠中评价FVIII表达、FVIII活性、以及FVIII比活性。这些测定更详细描述于实施例中。
本发明的完全包装的AAVFVIII载体展示出与UCLSQ载体至少相同的表达和/或活性，并且优选地与UCLSQ载体相比，展示出1.5倍、2倍、3倍、4倍、或5倍或更大的表达和/或活性。
本发明的完全包装的AAVFVIII载体具有高载体产量而很少有或没有片段基因组污染物，并且优选地与UCLSQ载体相比，具有1.5倍、2倍、3倍、4倍、或5倍的载体产量。
在考虑下列说明性实施例时，将了解本发明的其它方面和优势。
实施例
实施例1
Proto1载体、Proto1S载体、Proto2S载体以及Proto3S载体的产生
UCLSQ载体是一种尺寸过大，即大于5.0kb的AAV载体，该UCLSQ载体详细描述于Nathwani等的在2013年1月24日公开的美国专利申请公开号2013/0024960A1以及McIntosh等,Blood121:3335-3344,2013中，该美国专利申请公开以引用的方式整体并入本文。如图1中所示，UCLSQ载体从左至右包含AAV血清2型(AAV2)5'ITR；野生型AAV2病毒序列；具有34个碱基的人类载脂蛋白E(ApoE)/C1增强子；具有32个碱基的人类α抗胰蛋白酶(AAT)启动子远端X区；具有186个碱基的人类AAT启动子，包括5'非翻译区(UTR)序列的42个碱基；密码子优化的人类FVIII序列，其中B结构域被具有14个氨基酸的SQ序列置换；具有49个碱基的合成多聚腺苷酸化序列；野生型AAV2病毒序列；以及AAV23'ITR。所述UCLSQ载体具有5081个碱基的长度。
为了获得小于UCLSQ载体的载体，从UCLSQ载体序列中去除由本文的发明人认为对于FVIII表达和/或活性或对于AAV病毒体产生来说不必要的DNA序列。去除外部DNA序列，包括AAV25'ITR的3'末端处的AAV2病毒序列的53个碱基、AAV23'ITR的5'末端处的AAV2病毒序列的46个碱基、以及与密码子优化的FVIIISQ编码区相邻的11个碱基。具有4970个碱基的长度的所得的Proto1载体以示意形式示于图2A中，并且序列示于SEQIDNO:1中。Proto1产生感染性病毒并且编码功能性因子VIII多肽。
与AAV2ITR中的发夹环相邻的序列在重组AAV载体中也可能是可有可无的(参见Srivastava等的美国专利号6,521,225；Wang等,J.Virol.70:1668-1677,1996；以及Wang等,J.Virol.71:3077-3082,1997)。为了进一步减小Proto1载体的尺寸，直接在AAV25'ITR中的发夹环的3'末端处去除AAV2序列的10个碱基，并且直接在AAV23'ITR中的发夹环的5'末端处去除AAV2序列的10个碱基。具有4950个碱基的长度的所得的Proto1S载体以示意形式示于图2B中，并且序列示于SEQIDNO:2中。
为了努力提高Proto1S载体中FVIIISQ变体的表达，将具有100个碱基的合成内含子插入于密码子优化的FVIII序列中的外显子1与2之间。已知的是，插入内含子可以使得本来含有更少的内含子的基因，例如像干扰素基因中mRNA的表达水平提高。
增强子被定义为以非距离和定向依赖性的方式起作用。对于FVIII表达来说，具有34个碱基的ApoE/C1增强子以非距离和定向依赖性方式起作用，如由它在Gray等的美国专利号8,030,065(FIX表达)和Nathwani等的美国专利申请公开号2013/0024960(FVIII表达)中假定的增强子活性所举例说明，这两篇文献以引用的方式整体并入本文。DiSimone等,EMBOJ.6:2759-2766,1987中所述的具有32个碱基的人类AAT启动子远端X区位于提高异源启动子的表达的调节结构域内。
再次试图进一步提高Proto1S载体中FVIIISQ变体的表达，所述合成内含子序列纳入具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子和具有32个碱基的人类AAT启动子远端X区，后者是从它在人类AAT启动子上游的位置移动而来的。这两个调节元件以相对于它们在Proto1S中的定向反向的定向插入。具有4983个碱基的长度的所得的Proto2S载体以示意形式示于图2C中，并且序列示于SEQIDNO:3中。
由于人类AAT启动子远端X区先前并没有被证实在内含子中的转录起始位点的下游起作用，因此将Proto2S载体中的这个调节元件用具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以与内含子中所述增强子的第一个拷贝相同的定向置换。具有4985个碱基的长度的所得的Proto3S载体以示意形式示于图2D中，并且序列示于SEQIDNO:4中。
将Proto1、Proto1S、Proto2S以及Proto3S载体核酸克隆到pUC19细菌表达质粒中，从而产生AAVFVIII载体的双链形式。
实施例2
Proto4载体、Proto5载体、Proto6载体以及Proto7载体的产生
为了进一步减小Proto1载体的尺寸和/或与Proto1载体相比提高FVIII的表达，使位于与轻链或C结构域相邻处的a3结构域缺失。a3结构域涉及与血管性血友病因子(vonWillenbrandFactor)的结合，但是在体内对于功能活性FVIII来说可能是可有可无的。
从Proto1载体开始，使具有14个氨基酸的SQ序列和具有41个氨基酸的a3结构域(对应于野生型FVIII的氨基酸1649-1689)缺失。具有4805个碱基的长度的所得的Proto4载体以示意形式示于图3A中，并且序列示于SEQIDNO:5中。
为了试图提高B结构域和a3结构域缺失的FVIII的表达，将具有129个碱基的截短型FVIII内含子插入于Proto4载体中密码子优化的FVIII序列中的外显子1与2之间。具有4934个碱基的长度的所得的Proto5载体以示意形式示于图3B中，并且序列示于SEQIDNO:6中。
为了试图进一步提高B结构域和a3结构域缺失的FVIII的表达，在Proto5载体中将具有34个碱基的人类ApoE/C1增强子的第二个拷贝以正向定向或反向定向插入。具有4934个碱基的长度并且具有呈正向定向的内含子ApoE/C1增强子的所得的Proto6载体以示意形式示于图3C中，并且序列示于SEQIDNO:7中。
具有4934个碱基的长度并且具有呈反向定向的内含子ApoE/C1增强子的所得的Proto7载体以示意形式示于图3D中，并且序列示于SEQIDNO:8中。
将Proto4、Proto5、Proto6以及Proto7载体核酸克隆到pUC19细菌表达质粒中，从而产生AAVFVIII载体的双链形式。
实施例3
测试AAVFVIII载体的表达和活性的测定
测试本发明的AAVFVIII载体的测定包括例如(1)在HepG2细胞中瞬时转染包含AAV载体核酸的双链DNA质粒以检验肝脏特异性mRNA的表达和剪接以及FVIII蛋白质的体外产生和分泌，所述HepG2细胞是一种源自于人类肝脏的细胞系；(2)在293细胞和受杆状病毒感染的昆虫细胞中产生包含AAVFVIII载体的AAV病毒体；(3)通过碱性凝胶分析和复制测定来评价AAV载体核酸；以及(4)在Rag2小鼠中评价FVIII表达、FVIII活性、以及FVIII比活性。
瞬时转染测定。
进行初步体外测定以将来自本发明的AAVFVIII载体的FVIII表达和活性与来自UCLSQ载体的FVIII表达和活性进行比较。将本发明的AAVFVIII载体的双链形式瞬时转染到人类肝脏细胞系HepG2中。在转染之后，例如24小时或48小时后，测量培养上清液中的FVIII抗原和活性。
使用这种测定，瞬时转染了Proto1载体、Proto1S载体以及Proto2S载体的HepG2细胞中的FVIII活性类似于使用UCLSQ载体所获得的FVIII活性，这证实Proto1载体、Proto1S载体以及Proto2S载体能够表达功能性因子VIII蛋白质。
在293细胞和受杆状病毒感染的昆虫细胞中AAV病毒体的产生。
为了证实本发明的AAVFVIII载体的确包装了编码FVIII的核酸，将如实施例1和2中所述而产生的AAVFVIII载体的双链形式引入到能够产生AAV病毒体的细胞中。在第一AAV病毒产生系统中，将包含呈双链形式的AAVFVIII载体核酸的质粒连同表达AAVCap和Rep蛋白的质粒和表达为AAV病毒体产生所需的腺病毒辅助功能的质粒一起共转染到293细胞中。在第二AAV病毒产生系统中，产生表达AAVFVIII载体核酸以及AAVCap和Rep蛋白的杆状病毒构建体，然后将它们共感染到昆虫Sf9细胞中。通过本领域已知的标准方法对在瞬时转染的293细胞或受杆状病毒感染的Sf9细胞中产生的所得的AAV病毒体进行纯化和分析。
通过碱性凝胶和复制测定进行评价
使用碱性凝胶电泳测定来确定包装的核酸的尺寸。使用复制中心测定来确定哪些AAVFVIII载体通过这两种包装方法以完整形式被包装。
使用引物延伸测定来定量具有完整末端，即终止于AAV25'ITR(正义链)或3'ITR(反义链)中的发夹环的5'末端的AAVFVIII载体核酸的量。
或者，使用PCR测定来确定AAVFVIII载体核酸是否具有完整末端，即终止于AAV25'ITR(正义链)或3'ITR(反义链)中的发夹环的5'末端。
在Rag2小鼠中进行评价
在Rag2小鼠中以静脉内给予的2e11个、2e12个、以及2e13个病毒基因组(vg)/公斤针对FVIII表达和活性测试在瞬时转染的293细胞或受杆状病毒感染的Sf9细胞中由包装的载体产生的AAV病毒体。在这一测定中使用Rag2小鼠，这是因为FVIII表达和/或活性不会因宿主对AAV病毒或人类FVIII蛋白质的免疫反应的存在而变得复杂。
使用基于ELISA的测定确定FVIII抗原。使用FXa激活测定和/或凝血测定来确定FVIII活性。使用FVIII抗原和活性测定确定FVIII比活性。
在实施本发明中许多改动方案和变化方案预期在考虑本发明的优选的实施方案时被本领域技术人员想到。因此，应当对本发明的范围所施加的限制条件仅是所附权利要求书中出现的那些限制条件。
实施例4
具有改进的启动子/增强子序列的构建体的产生
为了产生提高功能性FVIII表达的具有强启动子的另外的AAV载体，用修饰的增强子和/或启动子序列产生构建体。在一些实施方案中，所述构建体包含ApoE增强子或μ-球蛋白增强子的缩短型式。使用标准DNA克隆技术产生这些构建体并且其序列示于SEQISNO:9-45中。
实施例5
AAV病毒颗粒的产生
重组杆粒的产生
将DH10Bac感受态细胞在冰上解冻。添加重组穿梭质粒(例如pFB-GFP)并且与感受态细胞轻轻混合并且在冰上孵育30分钟。然后在约42℃的温度下对感受态细胞进行加热，持续30秒，然后在冰上冷却2分钟。在42℃使感受态细胞进行热休克，持续30秒，并且在冰上冷却2分钟。将SOC添加到细胞中并且在37℃在搅拌下孵育4小时以允许进行重组。在孵育期间，将X-gal涂铺到两个LB板(另外含有各种抗生素(例如卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素(gentamycin)以及四环素(tetracycline))上以用于转化，之后涂铺IPTG。
获得一定量的孵育混合物，将它稀释，然后涂铺到两个LB板上并且在37℃孵育约30小时-48小时。从每一个板选择若干个白色菌落并且在含有LB板中提供的相同抗生素组合的LB培养基中培养过夜。随后，制备杆粒DNA和甘油原液并且储存在-80℃。
重组杆粒DNA的纯化
将一定量的杆粒甘油原液取出，并且接种到含有实施例1中所述的LB板中所提供的相同抗生素组合的LB培养基中。使培养物在37℃在振荡下生长过夜。随后，使一定量的培养物在微型离心机中以全速旋转约30秒。
使用移液管将沉淀物重悬于重悬缓冲液中，继而重悬于裂解缓冲液中，并且将管翻转若干次以混合缓冲液，然后在室温下孵育约5分钟。示例性重悬缓冲液包含50mMTris-CL(pH8.0)、10mMEDTA以及100μg/mLRNA酶A。示例性裂解缓冲液包含200mM的NaOH和1％SDS。缓慢添加一定量的沉淀缓冲液(例如包含3.0M乙酸钾(pH5.5)的缓冲液)并且将管翻转若干次以混合缓冲液，然后在冰上孵育约10分钟。将管以全速离心约10分钟并且将上清液倒入容纳异丙醇的管中。将管翻转若干次以混合溶液。
随后，在室温下将溶液以全速离心约15分钟并且在离心之后立即用移液管去除上清液。
添加一定量的70％乙醇以冲洗沉淀物并且再次以全速旋转1分钟。然后去除乙醇并且将溶液再次旋转以去除痕量的乙醇。将一定量的TE/EB缓冲液添加到每一个管中并且小心地通过移液管溶解沉淀物。如果不立即使用的话，将溶液储存在-20℃。
重组杆状病毒的P0原液的产生
将Sf9细胞以约1×106个细胞/孔接种到6孔板中(或以6×106个细胞接种于10cm板中或以1.7×107个细胞接种于15cm培养皿中)并且在转染之前使细胞贴壁至少1小时。
如下制备转染溶液A和B：溶液A：在15mL管中将一定量的杆粒稀释到一定量不含抗生素的无血清培养基中。溶液B：在15mL管中将一定量的CellFectin稀释到一定量不含抗生素的无血清培养基中。将溶液B添加到溶液A中并且通过移液管吹吸约3次轻轻混合，并且在室温下孵育30分钟-45分钟。随后，从板中吸出培养基并且添加一定量的不含抗生素的无血清培养基以洗涤细胞。将一定量的不含抗生素的SF900II添加到容纳脂质-DNA混合物的每一个管中。
从细胞吸出培养基，将转染溶液添加到细胞中并且将细胞在28℃孵育约5小时。去除转染溶液并且添加一定量的无血清培养基+抗生素，并且在28℃孵育约4天。将含有重组杆状病毒的培养基收集并且以1000rpm旋转约5分钟以去除细胞碎片。将杆状病毒在暗处储存在4℃。
杆状病毒(P1)的扩增
将Sf9细胞培养到约4×106个细胞/毫升并且在摇瓶中使用新鲜培养基稀释到约2×106个细胞/毫升。将一定量的Sf9细胞用一定量的P0储备杆状病毒感染。感染复数(MOI)是约0.1。
将Sf9细胞孵育约3天并且收集杆状病毒。将细胞以2,000rpm旋转5分钟以使细胞沉淀并且收集上清液并且在暗处储存在4℃。根据Clontech公司的快速滴度试剂盒(RapidTiterKit)方案测定杆状病毒的滴度。
使用P1重组杆状病毒产生AAV
将Sf9细胞培养到约1×107个细胞/毫升并且稀释到约5×106个细胞/毫升。将一定量的稀释了的Sf9细胞用Bac-载体(5Moi)和Bac-辅助病毒(15Moi)感染3天。在第三天评估细胞活力(观测到约50％-70％的死细胞)。
通过以3000rpm离心10分钟来收集细胞沉淀物。去除培养基并且将细胞裂解(或如果不立即使用的话，将细胞沉淀物储存在-20℃)。
裂解和显带方案
将一定量的Sf9裂解缓冲液加上Benzonase(核酸酶)添加到每一个细胞沉淀物中并且充分涡旋混合以使细胞重悬。将重悬的Sf9细胞在冰上孵育约10分钟以将裂解物冷却。将裂解物超声处理约20秒以将细胞充分裂解，然后在37℃孵育约30分钟。
添加一定量的5MNaCl并且将混合物涡旋混合，然后在37℃再孵育30分钟。添加一定量的NaCl以使盐浓度达到约500mM，涡旋混合并且在15℃以8,000rpm离心20分钟以产生澄清的裂解物。
对澄清的裂解物进行超速离心步骤。通过经由具有长针的注射器首先添加澄清的裂解物，然后添加1.32g/cc的量和1.55g/cc的量的CsCl溶液来制备CsCl梯度。标出CsCl溶液之间的界面。将PBS添加到离心管的顶部上并且小心地将管平衡和密封。
在15℃将管以55,000rpm离心约20小时。在每一个管的顶部上刺穿孔并且标出位于略高于两种CsCl溶液的界面标记处的AAV条带。
通过以下步骤进行第二次CsCl离心：将AAV溶液转移到用于70.1Ti转子的离心管中，并且将一定量的CsCl溶液添加到靠近管顶部处。将管平衡和密封。将管以65,000rpm离心约20小时并且收集AAV条带(更低的条带，更高的条带是空衣壳)。
实施例5
在Rag2小鼠中评价构建体
使用杆状病毒和293细胞，使用UCLSQ构建体、Proto1构建体、ProtoS1构建体、ProtoS2构建体以及ProtoS3构建体产生包含密码子优化的SQFVIII编码基因序列的AAV基因组。包装限度对于杆状病毒来说是4800bp并且对于293细胞来说是4950bp。
如图5中所示，具有截短型或非截短型基因组的Proto1以类似于UCLSQ构建体的方式转导FVIII。在4％-12％Bis-Tris凝胶上测量由杆状病毒和293T细胞裂解物产生的AAV5.2。每一种样品均表达VP1、VP2以及VP3蛋白质，如图6中所示。使来自AAV样品的基因组DNA在0.8％碱性琼脂糖凝胶上进行电泳，如图7中所示。
当通过杆状病毒系统制备这些AAV时，Proto1的转导类似于UCLSQ构建体。含有内含子的纳入的Proto2S和Proto3S的转导没有优于Proto1。在293细胞中制备的含有AAV侧接序列的UCLSQ载体比在杆状病毒中制备的缺少AAV序列的UCLSQ更强效。因此，将另外的增强子添加到Proto1中，例如构建体101、102、102以及104以试图提高效能。
实施例6
具有改进的启动子/增强子序列的AAVFVIII载体的表达和活性
使用液压注射方案测试包含构建体99至构建体106的AAV载体的表达和活性。液压递送是一种在体内筛选肝脏启动子的快速的方法。使用实施例5中所述的方法产生AAV质粒DNA，然后在TransIT-QR液压递送溶液中稀释。将质粒DNA以通过(小鼠体重(g)/10)＝0.1ml递送溶液)所确定的体积注射到5周-6周大的C57Bl/6小鼠(18g-25g)的尾静脉中。注射时间短于5秒。在注射之后48小时采集来自每一只小鼠的血浆并且使用ELISA测定测量所表达的FVIII抗原的量。
将递增剂量的Proto1质粒(2.5μg、5μg、12.5μg以及50μg)注射到小鼠的尾静脉中。使用ELISA测试测量被注射的小鼠的血浆中FVIII的量并且使用重组FVIII(XynthaSQ等同物)作为标准以进行比较。
为了研究表达，构建体p100-400、构建体100(p100)、构建体FVIII-BMN001(pFVIII-BMN001)、Proto1、构建体100AT(p100-AT)、构建体100bGH多聚腺苷酸(p100-bGHPA)、构建体101(p101)以及构建体104(p104)的改进的启动子/增强子元件。如图8中所示，所有的构建体以不同的效率水平产生功能性FVIII。
图9和10提供了注射1μg的各种构建体的质粒的数据。如图8中所示，注射构建体FVIII-BMN001、构建体FVIII-BMN002、构建体102(p102)、构建体103(p103)以及构建体104(p104)使得在10只小鼠中有5只中表达至少20ng的FVIII。如图9中所示，注射构建体FVIII-BMN001、构建体103(p103)、构建体103-AT(p103-AT；398bphAAT启动子)、构建体100(p100)、构建体100AT(p100-AT；398bphAAT启动子)使得在10只小鼠中有5只中表达至少100ng/ml的FVIII。

Claims (8)

1.一种腺相关病毒(AAV)因子VIII(FVIII)载体，所述载体包含核酸，所述核酸包含AAV25'反向末端重复序列(ITR)、肝脏特异性转录调节区、密码子优化的功能活性FVIII编码区、任选的一个或多个内含子、多聚腺苷酸化序列、以及AAV23'ITR。
2.如权利要求1所述的AAVFVIII载体，其中所述核酸包含选自由以下各项组成的组的核苷酸序列：
i.SEQIDNO:1中所示的Proto1序列；
ii.SEQIDNO:2中所示的Proto1S序列；
iii.SEQIDNO:3中所示的Proto2S序列；
iv.SEQIDNO:4中所示的Proto3S序列；
v.SEQIDNO:5中所示的Proto4序列；
vi.SEQIDNO:6中所示的Proto5序列；
vii.SEQIDNO:7中所示的Proto6序列；
viii.SEQIDNO:8中所示的Proto7序列；
ix.SEQIDNO:9中所示的构建体100ATG序列；
x.SEQIDNO:10中所示的构建体100ATGbGH多聚腺苷酸序列；
xi.SEQIDNO:11中所示的构建体100ATG短bGH多聚腺苷酸序列；
xii.SEQIDNO:12中所示的构建体103ATG序列；
xiii.SEQIDNO:13中所示的构建体103ATG短bGH多聚腺苷酸序列；
xiv.SEQIDNO:14中所示的构建体105ATGbGH多聚腺苷酸序列；
xv.SEQIDNO:15中所示的构建体DC172ATGFVIII序列；
xvi.SEQIDNO:16中所示的构建体DC172ATGFVIIIhAAT序列；
xvii.SEQIDNO:17中所示的构建体DC1722×HCRATGFVIII序列；
xviii.SEQIDNO:18中所示的构建体DC1722×HCRATGFVIIIhAAT序列；
xix.SEQIDNO:19中所示的构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII序列；
xx.SEQIDNO:20中所示的构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAATATGFVIII2×μ-球蛋白增强子序列；
xxi.SEQIDNO:21中所示的构建体100ATG短多聚腺苷酸2×μ-球蛋白增强子序列；
xxii.SEQIDNO:22中所示的构建体因子VIII-BMN001序列；
xxiii.SEQIDNO:23中所示的构建体因子VIII-BMN002序列；
xxiv.SEQIDNO:24中所示的构建体99序列；
xxv.SEQIDNO:25中所示的构建体100序列；
xxvi.SEQIDNO:26中所示的构建体100反向定向序列；
xxvii.SEQIDNO:27中所示的构建体100AT序列；
xxviii.SEQIDNO:28中所示的构建体100AT2×MG序列；
xxix.SEQIDNO:29中所示的构建体100AT2×MG多聚腺苷酸序列；
xxx.SEQIDNO:30中所示的构建体100AT2×MG(反向)bGH多聚腺苷酸序列；
xxxi.SEQIDNO:31中所示的构建体100bGH多聚腺苷酸序列；
xxxii.SEQIDNO:32中所示的构建体100-400序列；
xxxiii.SEQIDNO:33中所示的构建体101序列；
xxxiv.SEQIDNO:34中所示的构建体102序列；
xxxv.SEQIDNO:35中所示的构建体103序列；
xxxvi.SEQIDNO:36中所示的构建体103反向定向序列；
xxxvii.SEQIDNO:37中所示的构建体103AT序列；
xxxviii.SEQIDNO:38中所示的构建体103AT2×MG序列；
xxxix.SEQIDNO:39中所示的构建体103AT2×MG多聚腺苷酸序列；
xl.SEQIDNO:40中所示的构建体103bGH多聚腺苷酸序列；
xli.SEQIDNO:41中所示的构建体104序列；
xlii.SEQIDNO:42中所示的构建体105序列；
xliii.SEQIDNO:43中所示的构建体106序列；
xliv.SEQIDNO:44中所示的构建体106AT序列；以及
xlv.SEQIDNO:45中所示的构建体2×丝氨酸蛋白酶抑制蛋白AhAAT序列。
3.一种产生重组腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，所述方法包括
A)培养已经被转染了如权利要求1或2所述的AAV载体的细胞；以及
B)从所述转染的细胞的上清液中回收重组AAV颗粒。
4.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含如权利要求1或2所述的病毒载体。
5.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1或2所述的病毒载体。
6.一种治疗患有A型血友病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如权利要求1或2所述的AAVFVIII载体。
7.如权利要求1或2所述的AAVFVIII载体用于制备用于治疗A型血友病的药物的用途。
8.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1或2所述的AAVFVIII载体以治疗A型血友病。
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