TWI632239B

TWI632239B - 腺相關病毒因子viii載體

Info

Publication number: TWI632239B
Application number: TW103131665A
Authority: TW
Inventors: 彼得Ｃ克羅希; 艾米特納斯瓦尼; 金妮麥克頓司; 艾德華杜頓漢
Original assignee: 拜奧馬林製藥公司; 英國倫敦大學
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2018-08-11
Also published as: RU2710307C2; JP6735672B2; FIC20230007I1; RU2019141647A3; DK3044231T3; US20170095538A1; JP2021072871A; EP3770169A1; KR102484396B1; CN112538501A; US20220339262A1; JP2019193675A; SG11201601932UA; AR097657A1; CN105636981B; US9504762B2; EP3044231B1; LTPA2023508I1; WO2015038625A1; MX2016003262A

Abstract

本發明提供改良的腺相關病毒(AAV)因子VIII(FVIII)載體，其包括產生功能因子VIII多肽之AAV FVIII載體及具有高表現活性之AAV FVIII載體。

Description

腺相關病毒因子VIII載體

本申請案主張2013年9月12日申請之美國臨時專利申請案序列號第61/877,042號之優先權，該臨時專利申請案以全文引用之方式併入本文中。

本發明係關於腺相關病毒(AAV)因子VIII(FVIII)載體，其包括具有高表現活性之AAV FVIII載體及表現全長或截斷功能FVIII之AAV FVIII載體。本發明亦係關於製備本文描述的AAV FVIII載體之方法及該AAV FVIII載體之相關聯治療用途。

腺相關病毒(AAV)為感染人類及一些其他靈長類物種的小型、複製缺陷性、非被膜動物病毒。AAV之若干特徵使得此種病毒對藉由基因治療遞送治療蛋白質而言為有吸引力的媒劑，該等特徵包括例如：尚未知AAV會引起人類疾病及誘導適度免疫反應，及AAV載體可感染分化細胞及靜止細胞而不會併入寄主細胞基因組中。使用AAV之基因治療載體已成功地用於一些臨床試驗，例如用於將人類因子IX(FIX)遞送至肝以用於治療B型血友病(Nathwani等人，New Engl.J.Med.365：2357-2365,2011)。

然而，AAV基因治療載體具有一些缺點。詳言之，AAV載體之選殖能力由於病毒之DNA包裝能力而受限。野生型AAV之單鏈DNA基因組為約4.7千鹼基(kb)。實際上，至多約5.0kb之AAV基因組似乎完全(亦即全長)包裝於AAV病毒粒子中。由於要求AAV載體中之核酸基因組必須具有約145個鹼基的兩個AAV反向末端重複序列(ITR)，所以AAV載體之DNA包裝能力使得最多約4.4kb之蛋白質編碼序列可得以囊封。

由於此種大小限制條件，所以大的治療基因，亦即長度大於約4.4kb之彼等治療基因通常不適用於AAV載體。一種此類治療基因為因子VIII(FVIII)基因，其具有編碼2332個胺基酸之多肽的約7.0kb之mRNA，該多肽自N端至C端包含19個胺基酸的信號肽及三個大域(亦即，重鏈或A域、中央域或B域及輕鏈域或C域)。已用於克服FVIII之AAV載體大小限制的一種策略為使用兩個AAV載體，一個編碼重鏈或A域，且另一個編碼輕鏈或C域(參見例如Coutu等人，美國專利第6,221349號、第6,200,560號及第7,351,577號)。規避此大小限制條件之另一策略為產生編碼FVIII之AAV載體，其中蛋白質之中央部分或B域已缺失且由稱為SQ序列之14個胺基酸的連接子置換(Ward等人，Blood,117：798-807,2011，及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013)。

雖然文獻中已報道AAV載體具有>5.0kb之AAV基因組，但是在許多此等狀況下，經編碼基因之5’或3’端似乎遭截斷(參見Hirsch等人，Molec.Ther.18-6-8,2010，及Ghosh等人，Biotech.Genet.Engin.Rev.24：165-178,2007)。然而已證實，重疊同源重組發生在AAV受感染細胞中的具有5’端截斷及3’端截斷的核酸之間，以便產生編碼大蛋白質之「完整」核酸，進而重建功能性全長基因。

需要適用於治療A型血友病的基因治療方法的編碼功能因子VIII蛋白質之新穎AAV載體。因而，本發明係關於AAV載體，其編碼功能活性FVIII以使得AAV病毒粒子囊封編碼治療蛋白質之整個核酸，亦即完全包裝的AAV FVIII載體，進而避免上述過大基因組的問題，或至少產生功能活性因子VIII蛋白質，其可或可不為截斷的。此外，為避免蛋白殼引導的免疫反應，AAV載體應每個蛋白殼粒子具有目標蛋白質之最高可能轉導/表現活性。本發明亦係關於具有高表現活性之完全AAV FVIII載體的產生。最後，本發明係關於用於產生本文描述的AAV因子VIII載體之方法及使用該AAV因子VIII載體之相關聯方法。

本發明提供編碼功能活性FVIII之AAV載體(本文中稱為「AAV FVIII載體」)。編碼功能活性FVIII之基因組較佳地長度至多7.0kb、更佳地長度至多6.5kb、更佳地長度至多6.0kb、更佳地長度至多5.5kb、更佳地長度至多5.0kb，其具有增強啟動子功能。

如本文所使用，「功能活性FVIII」為FVIII蛋白質，其在培養細胞中活體外表現時或在細胞或身體組織中活體內表現時具有野生型FVIII蛋白質之功能性。此功能性包括例如允許在罹患A型血友病之受試者中發生血液凝固且減少血液凝塊所花的時間。野生型FVIII經由凝血級聯參與血液凝固，充當用於活化FIX(FIXa)之輔因子，從而於鈣離子及磷脂存在下形成將因子X(FX)轉化成活化FX(FXa)的複合物。因此，功能活性FVIII可與FIXa形成複合物，該複合物可將FX轉化成FXa。

如本文所使用，「AAV載體」係指為單鏈或雙鏈的核酸，其具有：側接蛋白質編碼序列之AAV 5’反向末端重複序列(ITR)與AAV 3’ITR，該蛋白質編碼序列可操作連接至轉錄調節元件，亦即一或多個啟動子及/或強化子；及多腺苷酸化序列；以及視需要選用的插入蛋白質編碼序列之外顯子之間的一或多個內含子。單鏈AAV載體係指存在於AAV病毒粒子之基因組中的核酸，且可為本文揭露之核酸序列的有義鏈或反義鏈。此等單鏈核酸之大小係以鹼基為單位來提供。雙鏈AAV載體係指存在於質體(例如pUC19)之DNA中或雙鏈病毒(桿狀病毒)之基因組中的用於表現或轉移AAV載體核酸的核酸。此等雙鏈核酸之大小係以鹼基對(bp)為單位來提供。

如本文所使用的術語「反向末端重複序列(ITR)」係指在AAV基因組之5’端及3’端處發現的技術辨識區，該等區順式地充當DNA複製之起點且充當用於病毒基因組之包裝信號。AAV ITR連同AAV rep編碼區提供插入兩個側接ITR之間的核苷酸序列之高效切除及自該核苷酸序列之救援(rescue)，以及該核苷酸序列於寄主細胞基因組中之整合。某些AAV相關ITR之序列由Yan等人，J.Virol.79(1)：364-379(2005)揭露，該文獻以全文引用之方式併入本文。

「轉錄調節元件」係指涉及調節遺傳轉錄之基因的核苷酸序列，其包括啟動子加反應元件、用於結合轉錄因子以便輔助RNA聚合酶結合並促進表現的活化子及強化子序列，以及抑制蛋白結合來阻斷RNA聚合酶連接並防止表現的操縱基因或緘默子(silencer)序列。術語「肝特異性轉錄調節元件」係指調控特異地在肝組織中之基因表現的調節元件。肝特異性調節元件之實例包括但不限於小鼠thyretin啟動子(mTTR)、內源性人類因子VIII啟動子(F8)、人類α-1-抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)及其活性片段、人類白蛋白最小啟動子及小鼠白蛋白啟動子。亦涵蓋來源於肝特異性轉錄因子結合位點之強化子，諸如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及Enh1。

在一實施例中，本發明之AAV載體包含編碼B域已置換為14個胺基酸之SQ序列的功能活性FVIII之核酸，亦即編碼FVIII SQ之核酸。SQ序列揭露於Ward等人，Blood,117：798-807,2011及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013中。FVIII編碼區序列為密碼子最佳化序列(參見Nathwani等人的2013年1月24日公開的美國專利申請公開案第2013/0024960A1號，其以全文引用之方式併入本文，及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013)。此序列在本文中稱為「UCL SQ FVIII」。

在第一態樣中，本發明之AAV載體包含圖2A中示意描繪的Proto 1且包含SEQ ID NO：1中闡明的核酸序列。

在第二態樣中，本發明之AAV載體包含圖2B中示意描繪的Proto 1S且包含SEQ ID NO：2中闡明的核酸序列。

在第三態樣中，本發明之AAV載體包含圖2C中示意描繪的Proto 2S且包含SEQ ID NO：3中闡明的核酸序列。

在第四態樣中，本發明之AAV載體包含圖2D中示意描繪的Proto 3S且包含SEQ ID NO：4中闡明的核酸序列。

在另一實施例中，本發明之AAV載體包含編碼FVIII之核酸，該FVIII缺乏：整個B域，包括SQ序列；及a3域，該a3域恰好位於輕鏈或C域之N端。FVIII編碼區序列為密碼子最佳化序列(參見Nathwani等人的2013年1月24日公開的美國專利申請公開案第2013/0024960A1號，其以全文引用之方式併入本文，及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013)。

在第一態樣中，本發明之AAV載體包含圖3A中示意描繪的Proto 4且包含SEQ ID NO：5中闡明的核酸序列。

在第二態樣中，本發明之AAV載體包含圖3B中示意描繪的Proto 5且包含SEQ ID NO：6中闡明的核酸序列。

在第三態樣中，本發明之AAV載體包含圖3C中示意描繪的Proto 6且包含SEQ ID NO：7中闡明的核酸序列。

在第四態樣中，本發明之AAV載體包含圖3D中示意描繪的Proto 7且包含SEQ ID NO：8中闡明的核酸序列。

在另一實施例中，本發明之AAV載體包含包括以下的核酸：AAV2 5’反向末端重複序列(ITR)、肝特異性轉錄調節區、密碼子最佳化功能活性FVIII編碼區、視需要選用的一或多個內含子、多腺苷酸化序列及AAV2 3’ITR。在一較佳實施例中，肝特異性轉錄調節區包含：縮短的ApoE強化子序列；186個鹼基的人類α抗胰蛋白酶(hAAT)近端啟動子，包括5’未轉譯區(UTR)之42個鹼基；及選自由以下組成之群的一或多個強化子：(i)34個鹼基的人類ApoE/C1強化子、(ii)32個鹼基的人類AAT啟動子遠端X區及(iii)人類AAT近端啟動子之遠端元件的80個額外鹼基；並且密碼子最佳化功能活性FVIII編碼區編碼FVIII SQ變異體。在另一較佳實施例中，肝特異性轉錄調節區包含a1微球蛋白強化子序列及186個鹼基的人類α抗胰蛋白酶(AAT)近端啟動子。

在第一態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100ATG，其包含SEQ ID NO：9中闡明的核酸序列。

在第二態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100ATG bGH poly A，其包含SEQ ID NO：10中闡明的核酸序列。

在第三態樣中，本發明之AAV載體包含SEQ ID NO：11中闡明的構築體100ATG短bGH polyA序列。

在第四態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103ATG，其包含SEQ ID NO：12中闡明的核酸序列。

在第五態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103ATG短bGH poly A，其包含SEQ ID NO：13中闡明的核酸序列。

在第六態樣中，本發明之AAV載體包含構築體105ATG bGH poly A，其包含SEQ ID NO：14中闡明的核酸序列。

在第七態樣中，本發明之AAV載體包含構築體DC172ATG FVIII，其包含SEQ ID NO：15中闡明的核酸序列。

在第八態樣中，本發明之AAV載體包含構築體DC172ATG FVIII hAAT，其包含SEQ ID NO：16中闡明的核酸序列。

在第九態樣中，本發明之AAV載體包含構築體DC172 2xHCR ATG FVIII，其包含SEQ ID NO：17中闡明的核酸序列。

在第十態樣中，本發明之AAV載體包含構築體DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT，其包含SEQ ID NO：18中闡明的核酸序列。

在第十一態樣中，本發明之AAV載體包含構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII，其包含SEQ ID NO：19中闡明的核酸序列。

在第十二態樣中，本發明之AAV載體包含構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x微球蛋白強化子，其包含SEQ ID NO：20中闡明的核酸序列。

在第十三態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100ATG短polyA 2x微球蛋白強化子，其包含SEQ ID NO：21中闡明的核酸序列。

在第十四態樣中，本發明之AAV載體包含構築體因子VIII-BMN001，其包含SEQ ID NO：22中闡明的核酸序列。

在第十五態樣中，本發明之AAV載體包含SEQ ID NO：23中闡明的構築體因子VIII-BMN002序列。

在第十六態樣中，本發明之AAV載體包含構築體99，其包含SEQ ID NO：24中闡明的核酸序列。

在第十七態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100，其包含SEQ ID NO：25中闡明的核酸序列。

在第十八態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100反定向，其包含SEQ ID NO：26中闡明的核酸序列。

在第十九態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100AT，其包含SEQ ID NO：27中闡明的核酸序列。

在第二十態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100AT 2x MG，其包含SEQ ID NO：28中闡明的核酸序列。

在第二十一態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100AT 2x MG bGH polyA，其包含SEQ ID NO：29中闡明的核酸序列。

在第二十二態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100AT 2x MG(反向)bGH polyA，其包含SEQ ID NO：30中闡明的核酸序列。

在第二十三態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100 bGH polyA，其包含SEQ ID NO：31中闡明的核酸序列。

在第二十四態樣中，本發明之AAV載體包含構築體100-400，其包含SEQ ID NO：32中闡明的核酸序列。

在第二十五態樣中，本發明之AAV載體包含構築體101，其包含SEQ ID NO：33中闡明的核酸序列。

在第二十六態樣中，本發明之AAV載體包含構築體102序列，其包含SEQ ID NO：34中闡明的核酸序列。

在第二十七態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103，其包含SEQ ID NO：35中闡明的核酸序列。

在第二十九態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103反定向，其包含SEQ ID NO：36中闡明的核酸序列。

在第三十態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103AT，其包含SEQ ID NO：37中闡明的核酸序列。

在第三十一態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103AT 2xMG，其包含SEQ ID NO：38中闡明的核酸序列。

在第三十二態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103AT 2xMG bGH polyA，其包含SEQ ID NO：39中闡明的核酸序列。

在第三十三態樣中，本發明之AAV載體包含構築體103 bGH polyA，其包含SEQ ID NO：40中闡明的核酸序列。

在第三十四態樣中，本發明之AAV載體包含構築體104，其包含包括SEQ ID NO：41中闡明的核酸序列之核酸。

在第三十五態樣中，本發明之AAV載體包含構築體105，其包含 SEQ ID NO：42中闡明的核酸序列。

在第三十六態樣中，本發明之AAV載體包含構築體106，其包含SEQ ID NO：43中闡明的核酸序列。

在第三十七態樣中，本發明之AAV載體包含構築體106AT，其包含SEQ ID NO：44中闡明的核酸序列。

在第三十八態樣中，本發明之AAV載體包含構築體2x SerpinA hAAT，其包含SEQ ID NO：45中闡明的核酸序列。

在其他實施例中，本發明係關於編碼功能因子VIII多肽之載體構築體，其中該等構築體包含呈一或多個不同定向的上述構築體之個別元件之一或多者及其組合。本發明亦係關於呈相反定向的上述構築體。

呈單鏈的本發明之AAV載體之長度小於約7.0kb，或長度小於約6.5kb，或長度小於約6.4kb，或長度小於約6.3kb，或長度小於約6.2kb，或長度小於約6.0kb，或長度小於約5.8kb，或長度小於約5.6kb，或長度小於約5.5kb，或長度小於約5.4kb，或長度小於約5.4kb，或長度小於約5.2kb或長度小於約5.0kb。呈單鏈的本發明之AAV載體之長度在約5.0kb至約6.5kb之範圍變化，長度在約4.8kb至約5.2k之範圍變化，或長度為約4.8kb至5.3kb，或長度為約4.9kb至約5.5kb，或長度為約4.8kb至約6.0kb，或長度為約5.0kb至6.2kb，或長度為約5.1kb至約6.3kb，或長度為約5.2kb至約6.4kb，或長度為約5.5kb至約6.5kb。

在另一實施例中，本發明提供用於產生包含本發明之任何AAV載體的重組腺相關病毒(AAV)粒子之方法。該方法包含以下步驟：培養已用本發明之任何AAV載體轉染的細胞且自轉染細胞之上清液回收重組AAV。

本發明之細胞為對桿狀病毒感染敏感的任何細胞類型，包括諸如以下的昆蟲細胞：High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。所使用的較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞，且包括諸如以下的哺乳動物細胞：HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。

本發明亦提供包含本發明之任何AAV載體之病毒粒子或藉由本發明之前述方法產生的任何病毒粒子。

「AAV病毒粒子(virion)」或「AAV病毒粒子(particle)」或「AAV載體粒子」係指包含至少一種AAV殼蛋白質及囊封多核苷酸AAV載體的病毒粒子。若粒子包含異源多核苷酸(亦即不同於野生型AAV基因組之多核苷酸，諸如遞送至哺乳動物細胞的轉殖基因)，則該粒子通常稱為「AAV載體粒子」或簡單稱為「AAV載體」。因此，AAV載體粒子之產生必然包括AAV載體之產生，因而載體含於AAV載體粒子內。

本發明亦提供包含本發明之任何AAV載體之細胞，及藉由本發明之此等細胞產生的病毒粒子。

在另一實施例中，本發明提供治療罹患A型血友病之患者的方法，其包含向患者投與有效量的本發明之任何AAV載體，或本發明之病毒粒子，或藉由本發明之方法產生的病毒粒子。

在另一實施例中，本發明提供本發明之任何AAV載體用於製備治療A型血友病之藥劑的用途。在一態樣中，藥劑包含以有效治療A型血友病之量表現人類FVIII的一定量的AAV載體。

在另一實施例中，本發明提供包含本發明之任何AAV載體的用於治療A型血友病之組合物。在一態樣中，組合物包含以有效治療A型血友病之量表現人類FVIII的一定量的AAV載體。

在另一實施例中，本發明之AAV載體用於產生AAV病毒粒子，該等AAV病毒粒子適用於治療罹患A型血友病之患者。

圖1提供UCL SQ載體之圖解。自左至右，UCL SQ載體包含AAV2 5’ITR、野生型AAV2病毒序列、34個鹼基的人類ApoE/C1強化子、32個鹼基的人類AAT啟動子遠端X區、186個鹼基的人類AAT啟動子(包括5’UTR序列之42個鹼基)、密碼子最佳化人類FVIII SQ序列(參見Nathwani等人的2013年1月24日公開的美國專利申請公開案第2013/0024960A1號，其以全文引用之方式併入本文，及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013)、49個鹼基的合成多腺苷酸化序列、野生型AAV2病毒序列及AAV2 3’ITR。UCL SQ載體之長度為5081個鹼基。

圖2提供Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S載體之圖解及序列。(A)Proto 1載體之圖解。自UCL SQ載體開始(參見圖1)，使外來野生型AAV2病毒序列缺失，且移除相應於人類AAT 5’UTR與人類FVIII編碼區之間及在人類FVIII終止密碼子與合成多腺苷酸化序列之間的限制位點的序列。(B)Proto 1S載體之圖解。自Proto 1載體開始，使AAV2 5’ITR之3’端處的10個鹼基及3’ITR之5’端處的10個鹼基缺失。(C)Proto 2S載體之圖解。自Proto 1S載體開始，將人類ApoE/C1強化子及人類AAT啟動子遠端X區移動至插入人類FVIII序列之外顯子1與外顯子2之間的100個鹼基的合成內含子中。如由箭頭所指示，人類ApoE/C1強化子及人類AAT啟動子遠端X區之定向與其於Proto 1S中之定向反向。(D)Proto 3S載體之圖解。自Proto 2S開始，人類AAT啟動子遠端X區由呈反向定向的人類ApoE/C1強化子之第二複本置換。

圖3提供Proto 4、Proto 5、Proto 6及Proto 7載體之圖解。(A)Proto 4載體之圖解。自Proto 1載體開始，使SQ序列及a3域缺失。(B)Proto 5載體之圖解。自Proto 4載體開始，將129個鹼基的FVIII內含子插入人類因子VIII序列之外顯子1與外顯子2之間。(C)Proto 6載體之圖解。自Proto 5載體開始，將人類ApoE/C1強化子之第二複本以前向定向插入FVIII內含子中。(D)Proto 7載體之圖解。自Proto 5載體開始，將人類ApoE/C1強化子之第二複本以反向定向插入FVIII內含子中。

圖4A至圖4KK提供具有改良啟動子/強化子序列之AAV FVIII載體之圖解。(A)構築體100ATG之圖解。(B)構築體100ATG bGH polyA之圖解。(C)構築體100ATG短bGH poly A之圖解。(D)構築體103ATG之圖解。(E)構築體103ATG短bGH poly A之圖解。(F)構築體105ATG bGH polyA之圖解。(G)構築體DC172ATG FVIII之圖解。(H)構築體DC172ATG FVIII hAAT之圖解。(I)構築體DC172 2xHCR ATG FVIII之圖解。(J)構築體DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT之圖解。(K)構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII之圖解。(L)構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x微球蛋白強化子之圖解。(M)構築體100ATG短bGH poly A 2x微球蛋白強化子之圖解。(N)構築體因子VIII-BMN001之圖解。(O)構築體FVIII-BMN002之圖解。(P)構築體99之圖解。(Q)構築體100之圖解。(R)構築體100反向定向之圖解。(S)構築體100AT之圖解。(T)構築體100AT 2x MG之圖解。(U)構築體100AT 2x MG bGH polyA之圖解。(V)構築體100AT 2x MG(反向)bGH poly A之圖解。(W)構築體100 bGH poly A。(X)構築體100-400之圖解。(Y)構築體101之圖解。(Z)構築體102之圖解。(AA)構築體103之圖解。(BB)構築體103反向定向之圖解(CC)構築體103AT之圖解。(DD)構築體103AT 2x MG之圖解。(EE)構築體 103AT 2x MG bGH poly A之圖解。(FF)103 sbGH poly A之圖解。(GG)構築體104之圖解。(HH)構築體105之圖解。(II)構築體106之圖解。(JJ)構築體106AT之圖解。(KK)構築體2x SerpinA hAAT之圖解。

圖5提供在Rag2小鼠中評估Proto構築體之結果，且證明Proto 1相似於野生型轉導FVIII。

圖6及7證明Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S表現VP1、VP2及VP3蛋白質(圖5)及VP1、VP2及VP3 DNA(圖6)。

圖8至圖10證明具有增加的FVIII表現之改良啟動子構築體。

過大AAV載體在5’端處隨機截斷且缺乏5’AAV ITR。因為AAV為單鏈DNA病毒且包裝有義鏈或反義鏈，所以過大AAV載體中之有義鏈缺乏5’AAV ITR及可能目標蛋白質編碼基因之5’端之部分，且過大AAV載體中之反義鏈缺乏3’ITR及可能目標蛋白質編碼基因之3’端之部分。功能性轉殖基因係於過大AAV載體受感染細胞中、藉由在目標細胞內退火有義及反義截斷基因組來產生。

本發明提供編碼功能活性FVIII之AAV載體，亦即完全包裝的AAV FVIII載體或具有高表現活性之AAV FVIII載體。本發明之AAV FVIII載體具有改良的表現/粒子，以及改良的AAV病毒產率及簡化純化。將一或多個內含子引入FVIII蛋白質編碼區中增強表現。重新配置強化子之數目及定位亦增強表現。

UCL SQ載體

UCL SQ載體過大，亦即，大於5.0kb的AAV載體，該UCL SQ載體詳細地描述於Nathwani等人的2013年1月24日公開的美國專利申請公開案第2013/0024960A1號，其以全文引用之方式併入本文，及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013中。如圖1所示，UCL SQ載體自左至右包含AAV血清型2(AAV2)5’ITR、野生型AAV2病毒序列、34個鹼基的人類脂蛋白元E(ApoE)/C1強化子、32個鹼基的人類α抗胰蛋白酶(AAT)啟動子遠端X區、186個鹼基的人類AAT啟動子(包括5’未轉譯區(UTR)序列之42個鹼基)、B域置換為14個胺基酸的SQ序列之密碼子最佳化人類FVIII序列、49個鹼基的合成多腺苷酸化序列、野生型AAV2病毒序列及AAV2 3’ITR。UCL SQ載體之長度為5081個鹼基。

如Nathwani等人的2013年1月24日公開的美國專利申請公開案第2013/0024960A1號及McIntosh等人，Blood 121：3335-3344,2013所示，UCL SQ載體活體外及活體內表現功能活性FVIII。

Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S載體

為避免過大AAV載體之問題及/或增加AAV載體之表現，本發明提供編碼FVIII SQ變異體之完全包裝的、較小(亦即小於5.0kb)AAV載體。Proto 1之序列的4970bp核苷酸序列在SEQ ID NO：1中闡明。

為產生AAV載體Proto 1，相較於UCL SQ載體，使對功能活性FVIII之產生似乎不必要的序列缺失。如實例1所示，移除外來DNA之110個鹼基，包括AAV2病毒序列3’至AAV2 5’ITR之53個鹼基、AAV2病毒序列5’至AAV2 3’ITR之46個鹼基，及鄰近於密碼子最佳化FVIII SQ編碼區之11個鹼基。所得Proto 1載體之長度為4970個鹼基。在設計時，未知Proto 1載體是否能夠活體外或活體內表現功能FVIII多肽。

為產生AAV載體Proto 1S，自Proto 1載體移除AAV2 5’ITR之3’端處的10個鹼基及AAV32 3’ITR之5’端處的10個鹼基。所得Proto 1S載體之長度為4950個鹼基。Proto 1S之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：2中闡明。

為產生AAV載體Proto 2S，將合成100個鹼基的內含子插入Proto 1S載體中密碼子最佳化FVIII SQ序列之外顯子1與外顯子2之間。自人類AAT啟動子之上游移除34個鹼基的ApoE/C1強化子及32個鹼基的人類AAT啟動子遠端X區，且將其以反向定向(相較於此等元件位於人類AAT啟動子之上游時的定向而言)插入合成內含子中。所得Proto 2S載體之長度為4983個鹼基。Proto 2S之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：3中闡明。

為產生AAV載體Proto 3S，自Proto 2S載體移除人類AAT啟動子遠端X區，且置換為呈反向定向的34個鹼基ApoE/C1強化子之第二複本。所得Proto 3S載體之長度為4984個鹼基。Proto 3S之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：4中闡明。

Proto 4、Proto S、Proto 6及Proto 7載體

為減小AAV載體之大小及/或增加AAV載體之表現，本發明亦提供編碼缺失B域及a3域的FVIII之完全包裝的、較小(亦即小於5.0kb)AAV載體。

為產生AAV載體Proto 4，自Proto 1載體移除14個胺基酸的SQ序列及位於鄰近於C域之a3域。缺失FVIII序列之總量為55個胺基酸或165個鹼基。所得Proto 4載體之長度為4805個鹼基。Proto 4之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：5中闡明。

為產生AAV載體Proto 5，將129個鹼基的截斷FVIII內含子插入Proto 4載體中密碼子最佳化FVIII序列之外顯子1與外顯子2之間。所得Proto 5載體之長度為4934個鹼基。Proto 5之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：6中闡明。

為產生AAV Proto 6載體，將34個鹼基的FVIII內含子置換為在Proto 5載體中呈前向定向的34個鹼基的人類ApoE/C1強化子之第二複本。所得Proto 6載體之長度為4934個鹼基。Proto 6之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：7中闡明。

為產生AAV Proto 7載體，將34個鹼基的FVIII內含子置換為在Proto 5載體中呈反向定向的34個鹼基的人類ApoE/C1強化子之第二複本。所得Proto 7載體之長度為4934個鹼基。Proto 7之序列之核苷酸序列在SEQ ID NO：8中闡明。

具有改良啟動子/強化子序列之額外AAV FVIII載體

產生具有強啟動子之過大AAV載體以增加缺失B域及a3域的FVIII之表現，且此等構築體係用經修飾強化子及/或啟動子序列來產生。在一些實施例中，AAV FVIII載體表現截斷功能FVIII。此等構築體包含一或多個啟動子及強化子序列，諸如ApoE HCR或其片段、微球蛋白強化子或其片段、人類α1抗胰蛋白酶啟動子(hAAT)或其片段、Serpin A強化子或其片段、LP1啟動子強化子或其片段，或巨球蛋白強化子或其片段。此等構築體包含多腺苷酸化序列，諸如bGH poly A序列或合成兔β-血球蛋白poly A序列。在一些實施例中，構築體包含諸如hAAT內含子或人類β-血球蛋白內含子之內含子或內含子片段。

構築體100ATG之長度為5511個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：9中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-502為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基727-910為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基923-5296為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5305-5352為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5367-5511為3’AAV2 ITR。

構築體100ATG bGH poly A之長度為5688個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：10中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-502為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基727-910為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基923-5296為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5305-5529為bGH poly A，且鹼基5544-5688為3’AAV2 ITR。

構築體100ATG短bGH poly A之長度為5613個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：11中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-502 為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基727-910為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基923-5296為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5305-5454為短bGH poly A，且鹼基5469-5613為3’AAV2 ITR。

構築體103ATG之長度為5362個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：12中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE重複序列之四個複本(4x)，鹼基360-577為hAAT啟動子，鹼基578-761為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基774-5147為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5156-5203為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5218-5362為3’AAV2 ITR。

構築體103ATG短bGH poly A之長度為5464個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：13中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE重複序列之四個複本(4x)，鹼基360-577為hAAT啟動子，鹼基578-761為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基774-5147為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5156-5305為bGH短poly A，且鹼基5320-5464為3’AAV2 ITR。

構築體105ATG bGH polyA之長度為6354個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：14中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基173-512為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基519-736為hAAT啟動子，鹼基737-920為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基933-5306為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5315-5539為bGH poly A，鹼基5546-6195為325bp ApoE HCR之兩個複本(2x)且鹼基6210-6354為3’AAV2 ITR。

構築體DC172ATG FVIII之長度為6308個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：15中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-449為145bp巨球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基450-1347為898bp hAAT啟動子，鹼基1348-1531為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基1544- 5917為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5926-6149為bGH poly A，且鹼基6164-6308為3’AAV2 ITR。

構築體DC172ATG FVIII hAAT之長度為5635個鹼基，此構築體在SEQ ID NO：16中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-449為145bp巨球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基457-674為hAAT啟動子，鹼基675-858為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基871-5244為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5253-5476為bGH poly A，且鹼基5490-5635為3’AAV2 ITR。

構築體DC172 2xHCR ATG FVIII之長度為6962個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：17中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-807為321bp ApoE HCR之兩個複本(2x)，鹼基814-1103為145bp巨球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基1104-2001為898bp hAAT啟動子，鹼基2002-2185為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基2198-6571為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基6580-6803為bGH poly A且鹼基6818-6962為3’AAV2 ITR。

構築體DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT之長度為6289個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：18中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-807為321bp ApoE HCR之兩個複本(2x)，鹼基814-1103為145bp巨球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基1111-1328為hAAT啟動子，鹼基1329-1512為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基1525-5898為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5907-6130為bGH poly A且鹼基6245-6289為3’AAV2 ITR。

構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII之長度為5430個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：19中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基168-309為71bp SerpinA強化子之兩個複本(2x)，鹼基326-543為hAAT啟動子，鹼基544-727為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基740-5113 為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5122-5271為短bGH poly A，且鹼基5286-5430為3’AAV2 ITR。

構築體2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x微球蛋白強化子之長度為5779個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：20中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基168-309為71bp SerpinA強化子之兩個複本(2x)，鹼基326-543為hAAT啟動子，鹼基544-727為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基740-5113為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5122-5271為短bGH poly A，鹼基5279-5618為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)且鹼基5635-5779為3’AAV2 ITR。

構築體100ATG短bGH poly A 2x微球蛋白強化子之長度為5962個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：21中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-502為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基727-910為經修飾人類β-血球蛋白第二內含子，鹼基923-5296為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5305-5454為短bGH poly A，鹼基5462-5801為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)且鹼基5818-5962為3’AAV2 ITR。

構築體因子VIII-BMN001之長度為5919個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：22中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-480為ApoE HCR，鹼基487-884為398bp hAAT啟動子，鹼基885-1145為截斷hAAT內含子，鹼基1155-5528為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5537-5760為bGH poly A，且鹼基5775-5919為3’AAV2 ITR。

構築體FVIII-BMN002之長度為5306個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：23中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基175-705為LP1啟動子/強化子，鹼基718-5091為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5100-5147為合成兔β-血球蛋白poly A且鹼基5162-5306為3’AAV2 ITR。

構築體99之長度為5461個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：24中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-627為ApoE HCR/MAR，鹼基634-866為hAAT啟動子，鹼基873-5246為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5255-5302為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5317-5461為3’AAV2 ITR。

構築體100之長度為5327個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：25中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基739-5112為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5121-5168為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5183-5327為3’AAV2 ITR。

構築體100反向定向之長度為5309個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：26中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-484為呈反向定向的ApoE HCR，鹼基491-708為hAAT啟動子，鹼基721-5094為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5103-5150為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5165-5309為3’AAV2 ITR。

構築體100AT之長度為5532個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：27中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-493為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基727-931為hAAT內含子，鹼基944-5317為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5326-5373為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5388-5532為3’AAV2 ITR。

構築體100AT 2x MG之長度為5877個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：28中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基508-847為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基854-1071為hAAT啟動子，鹼基1072-1276為hAAT內含子，鹼基1289-5662為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5671-5718為合成兔β-血球蛋白poly A且鹼基5733-5877為3’AAV2 ITR。

構築體100AT 2x MG bGH poly A之長度為6054個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：29中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基508-847為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基854-1071為hAAT啟動子，鹼基1072-1276為hAAT內含子，鹼基1289-5662為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5671-5895為bGH poly A且鹼基5910-6054為3’AAV2 ITR。

構築體100AT 2x MG(反向)bGH poly A之長度為6054個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：30中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基508-847為呈反向定向的170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基854-1071為hAAT啟動子，鹼基1072-1276為hAAT內含子，鹼基1289-5662為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5671-5895為bGH poly A且鹼基5910-6054為3’AAV2 ITR。

構築體100 bGH poly A之長度為5504個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：31中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基509-726為hAAT啟動子，鹼基739-5112為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基對5121-5345為bGH poly A，且鹼基5360-5504為3’AAV2 ITR。

構築體100-400之長度為5507個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：32中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-493為ApoE HCR，鹼基512-906為398bp hAAT啟動子，鹼基919-5292為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5301-5348為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5363-5507為3’AAV2 ITR。

構築體101之長度為5311個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：33中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基170-477為154bp ApoE HCR之兩個複本(2x)，鹼基493-710為hAAT啟動子，鹼基723-5096為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5105-5152為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5167-5311為3’AAV2 ITR。

構築體102之長度為5156個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：34中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-322為154bp ApoE HCR，鹼基338-555為hAAT啟動子，鹼基568-4941為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基4950-4997為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5012-5156為3’AAV2 ITR。

構築體103之長度為5178個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：35中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基360-577為hAAT啟動子，鹼基590-4963為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基4972-5019為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5034-5178為3’AAV2 ITR。

構築體103反向定向之長度為5160個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：36中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-335為呈反向定向的44bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基342-559為hAAT啟動子，鹼基572-4945為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基4954-5001為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5016-5160為3’AAV2 ITR。

構築體103AT之長度為5383個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：37中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE重複序列之四個複本(4x)，鹼基360-577為hAAT啟動子，鹼基578-782為hAAT內含子，鹼基795-4374為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5177-5224為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5239-5383為3’AAV2 ITR。

構築體103AT 2x MG之長度為5728個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：38中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基359-698為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基705-922為hAAT啟動子，鹼基923-1127為hAAT內含子，鹼基1140-5513為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5522-5569為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5584-5728為3’AAV2 ITR。

構築體103AT 2x MG bGH poly A之長度為5905個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：39中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基359-698為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基705-922為hAAT啟動子，鹼基923-1127為hAAT內含子，鹼基1140-5513為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5522-5746為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5761-5905為5’AAV2 ITR。

構築體103 bGH poly A之長度為5355個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：40中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-344為44bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基360-577為hAAT啟動子，鹼基590-4963為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基4972-5196為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5211-5355為3’AAV2 ITR。

構築體104之長度為5618個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：41中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基169-784為154bp ApoE HCR之四個複本(4x)，鹼基800-1017為hAAT啟動子，鹼基1030-5403為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5412-5459為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5474-5618為3’AAV2 ITR。

構築體105之長度為5993個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：42中闡明，其中鹼基1-145為5'AAV2 ITR，鹼基173-512為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基519-736為hAAT啟動子，鹼基749-5122為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5131-5178為合成兔β-血球蛋白poly A，鹼基5185-5834為ApoE HCR之兩個複本(2x)，且鹼基5849-5993為3’AAV2 ITR。

構築體106之長度為5337個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：43中闡明，其中鹼基1-145為5'AAV2 ITR，鹼基173-512為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基519-736為hAAT啟動子，鹼基749-5122為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5131-5178為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5193-5337為3’AAV2 ITR。

構築體106AT之長度為5542個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：44中闡明，其中鹼基1-145為5'AAV2 ITR，鹼基173-512為170bp微球蛋白強化子之兩個複本(2x)，鹼基519-736為hAAT啟動子，鹼基737-941為hAAT內含子，鹼基954-5327為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基5336-5383為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基5398-5542為3’AAV2 ITR。

構築體2x SerpinA hAAT為5126個鹼基。此構築體在SEQ ID NO：45中闡明，其中鹼基1-145為5’AAV2 ITR，鹼基160-301為ApoE HCR，鹼基308-525為hAAT啟動子，鹼基538-4911為密碼子最佳化SQ FVIII，鹼基4920-4967為合成兔β-血球蛋白poly A，且鹼基4982-5126為3’AAV2 ITR。

AAV載體

如本文所使用，術語「AAV」為腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒為單鏈DNA小病毒，其僅生長在其中某些功能由共同感染輔助病毒來提供的細胞中。當前存在已獲表徵的十三種AAV血清型，如以下表1中所示。AAV之一般資訊及評論可見於例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses，第1卷，第169-228頁，及Berns,1990,Virology，第1743-1764頁，Raven Press,(New York)中。然而，可完全預期此等相同原理將適用於額外AAV血清型，因為所熟知的是，各種血清型在結構上及功能上、甚至在遺傳層面關聯十分緊密。(參見例如，Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease之第165-174頁，J.R.Pattison，編著；及Rose,Comprehensive Virology 3：1-61(1974))。例如，所有AAV血清型表觀地顯示由同源rep基因介導的極為相似的複製性質；且全部帶有三種相關殼蛋白質，諸如AAV 6中表現的彼等蛋白質。相關程度進一步藉由異源雙鏈體分析來表明，該非互補雙螺旋分析揭示血清型之間沿基因組之長度的廣泛交叉雜交；及末端處相應於「反向末端重複序列」(ITR)的同功自退火段之存在。相似的感染性型式亦表明：每一血清型中之複製功能受相似的調節控制。

如本文所使用的「AAV載體」係指包含一或多個所關注的由AAV末端重複序列(ITR)側接的多核苷酸(或轉殖基因)之載體。當已由編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的寄主細胞中存在感染性病毒粒子時，此等AAV載體可複製及包裝於該等病毒粒子中。

AAV「rep」及「cap」基因為分別編碼複製蛋白質及囊封蛋白質之基因。已在迄今為止所檢驗的所有AAV血清型中發現AAV rep及cap基因，且該等基因描述於本文中及所引用的參考文獻中。在野生型AAV中，rep及cap基因通常在病毒基因組中發現為彼此相鄰(亦即，其「偶聯」在一起成為鄰接或重疊的轉錄單元)，且該等基因通常在各AAV血清型中得以保存。AAV rep及cap基因亦個別地及共同地稱為「AAV包裝基因」。根據本發明之AAV cap基因編碼Cap蛋白質，該Cap蛋白質能夠於rep及adeno輔助功能存在下包裝AAV載體，且能夠結合目標細胞受體。在一些實施例中，AAV cap基因編碼具有來源於特定AAV血清型(例如表1所示的血清型)之胺基酸序列的殼蛋白質。

用於產生AAV之AAV序列可來源於任何AAV血清型之基因組。通常，AAV血清型具有在胺基酸及核酸層面具有顯著同源性的基因組序列，提供一組相似的遺傳功能，產生在實體上及功能上等效的病毒粒子，且藉由實際上相同的機制來複製及裝配。就AAV血清型之基因組序列及基因組相似性之論述而言，參見例如，GenBank登錄號U89790；GenBank登錄號J01901；GenBank登錄號AF043303；GenBank登錄號AF085716；Chlorini等人，J.Vir.71：6823-33(1997)；Srivastava等人，J.Vir.45：555-64(1983)；Chlorini等人，J.Vir.73：1309-1319(1999)；Rutledge等人，J.Vir.72：309-319(1998)；及Wu等人，J.Vir.74：8635-47(2000)。

所有已知的AAV血清型之基因組組織極為相似。AAV之基因組為長度小於約5,000個核苷酸(nt)的線性、單鏈DNA分子。反向末端重複序列(ITR)側接用於非結構複製(Rep)蛋白質及結構(VP)蛋白質之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白質形成蛋白殼。末端145 nt為自互補的，且經組織以便可形成能量穩定的分子內雙鏈體，該分子內雙鏈體形成T形髮夾。此等髮夾結構用作用於病毒DNA複製之起點，充當用於細胞DNA聚合酶複合物之引子。Rep基因編碼Rep蛋白質、Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。Rep78及Rep68自p5啟動子轉錄，且Rep 52及Rep40自p19啟動子轉錄。cap基因編碼VP蛋白質、VP1、VP2及VP3。 cap基因自p40啟動子轉錄。

在一些實施例中，編碼AAV殼蛋白質之核酸序列可操作連接至用於在諸如Sf9或HEK細胞之特異細胞類型中表現的表現控制序列。熟習此項技術者已知的用於在昆蟲寄主細胞或哺乳動物寄主細胞中表現外來基因之技術可用於實踐本發明。用於昆蟲細胞之分子工程改造及在昆蟲細胞中表現多肽的方法論描述於例如Summers及Smith.1986.A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures,Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，德克薩斯州科利奇站；Luckow.1991.In Prokop等人，Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications,97-152；King,L.A.及R.D.Possee,1992,The baculovirus expression system,Chapman and Hall，英國；O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow,1992,Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，紐約；W.H.Freeman及Richardson,C.D.,1995,Baculovirus Expression Protocols,Methods in Molecular Biology，第39卷；美國專利第4,745,051號；US2003148506；及WO 03/074714。用於轉錄編碼AAV殼蛋白質之核苷酸序列的尤其適合的啟動子例如為多角體啟動子。然而，亦涵蓋此項技術中已知的在昆蟲細胞中為活性的其他啟動子，例如p10、p35或IE-1啟動子及以上參考文獻中所述的其他啟動子。

昆蟲細胞用於表現異源蛋白質之用途已有明確記載，如將諸如載體(例如昆蟲細胞相容載體)之核酸引入此等細胞中之方法，及在培養物中維持此等細胞之方法。參見例如，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Richard編著，Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL，牛津大學出版社(1994)；Samulski等人，J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88：4646-50(1991)；Ruffing等人，J.Vir.66：6922-30(1992)；Kirnbauer等人，Vir.219：37-44(1996)；Zhao等人，Vir.272：382-93(2000)；及Samulski等人，美國專利第6,204,059號。在一些實施例中，在昆蟲細胞中編碼AAV之核酸構築體為昆蟲細胞相容載體。如本文所使用的「昆蟲細胞相容載體」或「載體」係指能夠生產性地轉型或轉染昆蟲或昆蟲細胞之核酸分子。示範性生物學載體包括質體、線性核酸分子及重組病毒。可使用任何載體，只要其為昆蟲細胞相容的即可。載體可整合於昆蟲細胞基因組中，但載體於昆蟲細胞中之存在無需為持久的，且亦包括瞬時游離基因組載體。載體可藉由任何已知手段來引入，例如藉由細胞之化學處理、電穿孔或感染來引入。在一些實施例中，載體為桿狀病毒、病毒載體或質體。在更佳實施例中，載體為桿狀病毒，亦即構築體為桿狀病毒載體。桿狀病毒載體及其使用方法描述於以上就昆蟲細胞之分子工程改造所引用的參考文獻中。

桿狀病毒為節肢動物之被膜DNA病毒，其中兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白質之熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙鏈基因組(80-200kbp)，其可經工程改造來允許將大的基因組內容物遞送至特異細胞。用作載體之病毒通常為加州苜蓿夜蛾(Autographa californica)多蛋白殼核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶(Bm NPV)(Kato等人，2010)。

桿狀病毒通常用於昆蟲細胞之感染以便表現重組蛋白質。詳言之，異源基因於昆蟲中之表現可如例如以下所述來完成：美國專利第4,745,051號；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；及Martin等人(1988)。許多桿狀病毒菌株及變異體及可用於蛋白質產生的相應允許使用的昆蟲寄主細胞描述於Luckow等人(1988)，Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)及McKenna(1989)中。

用於產生重組AAV之方法

本揭露內容提供用於在昆蟲或哺乳動物細胞中產生重組AAV之材料及方法。在一些實施例中，病毒構築體進一步包含啟動子及啟動子下游的限制位點，以允許編碼一或多種所關注蛋白質的多核苷酸之插入，其中啟動子及限制位點位於5' AAV ITR下游及3' AAV ITR上游。在一些實施例中，病毒構築體進一步包含在限制位點下游及3' AAV ITR上游的轉錄後調節元件。在一些實施例中，病毒構築體進一步包含插入限制位點處且與啟動子可操作連接的多核苷酸，其中該多核苷酸包含所關注蛋白質之編碼區。如熟練技藝人士所瞭解，本申請案中揭露的AAV載體中任一者可作為病毒構築體用於產生重組AAV的方法中。

在一些實施例中，輔助功能係藉由一或多個輔助質體或包含腺病毒或桿狀病毒輔助基因之輔助病毒來提供。腺病毒或桿狀病毒輔助基因之非限制性實例包括但不限於E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可向AAV包裝提供輔助功能。

AAV之輔助病毒為此項技術中已知的且包括例如來自腺病毒科 (Adenoviridae)及皰疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV之輔助病毒之實例包括但不限於SAdV-13輔助病毒及類SAdV-13輔助病毒，其描述於美國公開案第20110201088號(其揭露內容以引用之方式併入本文)；輔助載體pHELP(Applied Viromics)。熟練技藝人士將瞭解的是，可提供足夠輔助功能的AAV之任何輔助病毒或輔助質體可用於本文中。

在一些實施例中，AAV cap基因存在於質體中。質體可進一步包含AAV rep基因。來自任何AAV血清型(包括但不限於AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13及其任何變異體)之cap基因及/或rep基因可用於本文中以產生重組AAV。在一些實施例中，AAV cap基因編碼來自以下者的蛋白殼：血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其變異體。

在一些實施例中，昆蟲或哺乳動物細胞可用輔助質體或輔助病毒、病毒構築體及編碼AAV cap基因之質體來轉染；且重組AAV病毒可在共同轉染後的各種時間點進行收集。例如，重組AAV病毒可在共同轉染後的約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約72小時、約96小時、約120小時或此等兩個時間點中任何時間點之間的時間進行收集。

重組AAV亦可使用此項技術中已知的適用於產生感染性重組AAV的任何習知方法來產生。在一些情形下，重組AAV可藉由使用穩定表現用於AAV粒子產生之必要組件中的一些組件的昆蟲或哺乳動物細胞來產生。例如，包含AAV rep及cap基因及諸如新黴素抗性基因的可選擇標記物之質體(或多個質體)可整合於細胞之基因組中。昆蟲或哺乳動物細胞可隨後用輔助病毒(例如提供輔助功能的腺病毒或桿狀病毒) 及包含5' AAV ITR及3' AAV ITR(及需要時，編碼異源蛋白質之核苷酸序列)之病毒載體來共同感染。此方法之優點在於細胞為可選擇的且適於重組AAV之大規模生產。作為另一非限制性實例，可將腺病毒或桿狀病毒而非質體用於將rep及cap基因引入包裝細胞中。作為另一非限制性實例，可將含有5' AAV LTR及3' AAV LTR以及rep-cap基因之病毒載體穩定整合於生產細胞之DNA中，且輔助功能可藉由野生型腺病毒來提供以產生重組AAV。

用於AAV產生的細胞類型

包含本發明之AAV載體之病毒粒子可使用任何無脊椎動物細胞類型來產生，該細胞類型允許產生AAV或生物產品且可維持在培養物中。例如，所使用的昆蟲細胞系可來自於秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)，諸如SF9、SF21、SF900+；果蠅細胞系；蚊細胞系，例如白線斑蚊(Aedes albopictus)所得的細胞系；家蠶(domestic silkworm)細胞系，例如家蠶(Bombyxmori)細胞系；粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞系，諸如High Five細胞；或鱗翅類細胞系，諸如Ascalapha odorata細胞系。較佳昆蟲細胞為來自對桿狀病毒感染敏感的昆蟲物種之細胞，包括High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。

桿狀病毒為節肢動物之被膜DNA病毒，其中兩個成員為用於在細胞培養物中產生重組蛋白質之熟知表現載體。桿狀病毒具有環狀雙鏈基因組(80-200kbp)，其可經工程改造來允許將大的基因組內容物遞送至特異細胞。用作載體之病毒通常為加州苜蓿夜蛾多蛋白殼核多角體病毒(AcMNPV)或家蠶(Bm-NPV)(Kato等人，2010)。

桿狀病毒通常用於昆蟲細胞之感染以便表現重組蛋白質。詳言之，異源基因於昆蟲中之表現可如例如以下所述來完成：美國專利第 4,745,051號；Friesen等人(1986)；EP 127,839；EP 155,476；Vlak等人(1988)；Miller等人(1988)；Carbonell等人(1988)；Maeda等人(1985)；Lebacq-Verheyden等人(1988)；Smith等人(1985)；Miyajima等人(1987)；及Martin等人(1988)。許多桿狀病毒菌株及變異體及可用於蛋白質產生的相應允許使用的昆蟲寄主細胞描述於Luckow等人(1988),Miller等人(1986)；Maeda等人(1985)及McKenna(1989)中。

在本發明之另一態樣中，本發明之方法亦使用哺乳動物細胞類型來進行，該細胞類型允許複製AAV或產生生物產品且可維持在培養物中。所使用的較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。

AAV FVIII載體之測試

測試本發明之完全包裝的AAV FVIII載體之分析法包括例如(1)包含AAV載體核酸之雙鏈DNA質體於HepG2細胞(一種來源於人類肝之細胞系)中之瞬時轉染，以便檢查肝特異性mRNA表現及剪接，以及活體外FVIII蛋白質產生及分泌；(2)在293細胞及桿狀病毒感染昆蟲細胞中產生包含AAV FVIII載體之AAV病毒粒子；(3)藉由鹼性凝膠分析及複製分析來評估AAV載體核酸；及(4)在Rag2小鼠中評估FVIII表現、FVIII活性及FVIII特異活性。此等分析法較詳細描述於實例中。

本發明之完全包裝的AAV FVIII載體顯示與UCL SQ載體至少相同的表現及/或活性，且較佳相較於UCL SQ載體而言顯示1.5倍、2倍、3倍、4倍，或5倍或5倍以上的表現及/或活性。

本發明之完全包裝的AAV FVIII載體具有高的載體產率同時很少有或沒有碎片基因組污染物，且較佳相較於UCL SQ載體而言具有大1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍的載體產率。

本發明之其他態樣及優點將在考量以下說明性實例後得以理解。

實例 實例1 Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S載體之產生

為獲得小於UCL SQ載體之載體，將本案發明人咸信對FVIII表現及/或活性或對AAV病毒粒子產生不必要的DNA序列自UCL SQ載體序列移除。移除外來DNA序列，包括AAV2病毒序列3’至AAV2 5’ITR之53個鹼基、AAV2病毒序列5’至AAV2 3’ITR之46個鹼基，及鄰近於密碼子最佳化FVIII SQ編碼區之11個鹼基。長度為4970個鹼基的所得Proto 1載體以圖解形式展示於圖2A中，且序列在SEQ ID NO：1中闡明。Proto 1產生感染性病毒且編碼功能因子VIII多肽。

鄰近於AAV2 ITR中之髮夾環的序列亦可在重組AAV載體中為非必需的(參見Srivastava等人，美國專利第6,521,225號；Wang等人，J.Virol.70：1668-1677,1996；及Wang等人，J.Virol.71：3077-3082, 1997)。為進一步減小Proto 1載體之大小，自AAV2 5'ITR中髮夾環之3'直接移除AAV2序列之10個鹼基，且自AAV2 3'ITR中髮夾環之5'直接移除AAV2序列之10個鹼基。長度為4950個鹼基的所得Proto 1S載體以圖解形式展示於圖2B中，且序列在SEQ ID NO：2中闡明。

為盡力增加FVIII SQ變異體於Proto 1S載體中之表現，將100個鹼基的合成內含子插入密碼子最佳化FVIII SQ序列之外顯子1與外顯子2之間。已知的是，內含子之插入可在其他少內含子基因(諸如，例如干擾素基因)中產生mRNA表現程度之增加。

強化子係定義為以獨立於距離及定向之方式工作。34個鹼基的ApoE/C1強化子相對於FVIII表現而言以獨立於距離及定向之方式工作，如在Gray等人，美國專利第8,030,065號(FIX表現)及Nathwani等人，美國專利申請公開案第2013/0024960號(FVIII表現)中由該強化子之假定強化子活性所例證，兩個專利皆以全文引用之方式併入本文。描述於Di Simone等人，EMBO J.6：2759-2766,1987中的32個鹼基的人類AAT啟動子遠端X區係位於增強異源啟動子之表現的調節域內。

在進一步增加FVIII SQ變異體於Proto 1S載體中之表現的另一種嘗試中，合成內含子序列併入有34個鹼基的人類ApoE/C1強化子及32個鹼基的人類AAT啟動子遠端X區，該人類AAT啟動子遠端X區自其於人類AAT啟動子上游之位置移動。此等兩個調節元件以相對於其於Proto 1S中之定向的反向定向插入。長度為4983個鹼基的所得Proto 2S載體以圖解形式展示於圖2C中，且序列在SEQ ID NO：3中闡明。

由於先前尚未顯示人類AAT啟動子遠端X區在內含子中之轉錄起始位點下游起作用，所以將Proto 2S載體中之此調節元件置換為與內含子中之強化子之第一複本呈相同定向的34個鹼基的人類ApoE/C1強化子之第二複本。長度為4985個鹼基的所得Proto 3S載體以圖解形式展示於圖2D中，且序列在SEQ ID NO：4中闡明。

將Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S載體核酸選殖至pUC19細菌表現質體中，藉以產生雙鏈形式的AAV FVIII載體。

實例2 Proto 4、Proto 5、Proto 6及Proto 7載體之產生

為相較於Proto 1載體進一步減小Proto 1載體之大小及/或增加FVIII之表現，使位於鄰近於輕鏈或C域之a3域缺失。a3域涉及與溫韋伯氏(von Willenbrand)因子之結合，但對活體內功能活性FVIII而言可為非必需的。

自Proto 1載體開始，使14個胺基酸的SQ序列及41個胺基酸的a3域(對應於野生型FVIII之胺基酸1649-1689)缺失。長度為4805個鹼基的所得Proto 4載體以圖解形式展示於圖3A中，且序列在SEQ ID NO：5中闡明。

為嘗試增加缺失B域及a3域的FVIII之表現，將129個鹼基的截斷FVIII內含子插入Proto 4載體中密碼子最佳化FVIII序列之外顯子1與外顯子2之間。長度為4934個鹼基的所得Proto 5載體以圖解形式展示於圖3B中，且序列在SEQ ID NO：6中闡明。

為嘗試進一步增加缺失B域及a3域的FVIII之表現，將34個鹼基的人類ApoE/C1強化子之第二複本以前向或反向定向插入Proto 5載體中。長度為4934個鹼基且具有呈前向定向的內含子ApoE/C1強化子的所得Proto 6載體以圖解形式展示於圖3C中，且序列在SEQ ID NO：7中闡明。

長度為4934個鹼基且具有呈反向定向的內含子ApoE/C1強化子的所得Proto 7載體以圖解形式展示於圖3D中，且序列在SEQ ID NO：8中闡明。

將Proto 4、Proto 5、Proto 6及Proto 7載體核酸選殖至pUC19細菌表現質體中，藉以產生雙鏈形式AAV FVIII載體。

實例3 測試AAV FVIII載體之表現及活性的分析法

測試本發明之AAV FVIII載體之分析法包括例如(1)包含AAV載體核酸之雙鏈DNA質體於HepG2細胞(一種來源於人類肝之細胞系)中之瞬時轉染，以便檢查肝特異性mRNA表現及剪接，以及活體外FVIII蛋白質產生及分泌；(2)在293細胞及桿狀病毒感染昆蟲細胞中產生包含AAV FVIII載體之AAV病毒粒子；(3)藉由鹼性凝膠分析及複製分析來評估AAV載體核酸；及(4)在Rag2小鼠中評估FVIII表現、FVIII活性及FVIII特異活性。

瞬時轉染分析。

執行初步活體外分析來比較本發明之AAV FVIII載體的FVIII表現及活性與UCL SQ載體的FVIII表現及活性。本發明之雙鏈形式AAV FVIII載體瞬時轉染至人類肝細胞系HepG2中。在轉染之後，例如24或48小時後，量測培養物上清液中之FVIII抗原及活性。

使用此分析，在用Proto 1、Proto 1S及Proto 2S載體瞬時轉染的HepG2細胞中之FVIII活性與使用UCL SQ載體獲得的FVIII活性相似，證明Proto 1、Proto 1S及Proto 2S載體能夠表現功能因子VIII蛋白質。

在293細胞及桿狀病毒感染昆蟲細胞中產生AAV病毒粒子。

為證明本發明之AAV FVIII載體確實包裝編碼FVIII之核酸，將如實例1及2所述產生的雙鏈形式AAV FVIII載體引入能夠產生AAV病毒粒子之細胞中。在第一AAV病毒產生系統中，包含呈雙鏈形式的AAV FVIII載體核酸之質體與表現AAV Cap及Rep蛋白質之質體及表現AAV病毒粒子產生所需的腺病毒輔助功能之質體一起共同轉染至293細胞中。在第二AAV病毒產生系統中，產生表現AAV FVIII載體核酸及AAV Cap及Rep蛋白質之桿狀病毒構築體，且隨後共同感染至昆蟲Sf9細胞中。藉由此項技術中已知的標準方法來純化及分析在瞬時轉染的 293細胞或桿狀病毒感染Sf9細胞中所產生的所得AAV病毒粒子。

藉由鹼性凝膠及複製分析的評估

鹼性凝膠電泳分析用於測定包裝核酸之大小。複製中心分析用於測定何種AAV FVIII載體藉由兩種包裝方法以完整形式得以包裝。

引子延伸分析用於定量AAV FVIII載體核酸之量，該AAV FVIII載體核酸具有完整末端，亦即，在AAV2 5’ITR(有義鏈)或3’ITR(反義鏈)中髮夾環之5’端處終止。

替代地，PCR分析用於判定AAV FVIII載體核酸是否具有完整末端，亦即，在AAV2 5’ITR(有義鏈)或3’ITR(反義鏈)中髮夾環之5’端處終止。

在Rag2小鼠中的評估

在以每公斤2e11、2e12及2e13個病毒基因組(vg)來靜脈內施予的情況下，測試瞬時轉染的293細胞或桿狀病毒感染Sf9細胞包裝載體中所產生的AAV病毒粒子在Rag2小鼠中之FVIII表現及活性。此分析中使用Rag2小鼠，因為FVIII表現及/或活性不因對AAV病毒或人類FVIII蛋白質之寄主免疫反應的存在而變得複雜。

FVIII抗原使用基於ELISA之分析來測定。FVIII活性使用FXa活化分析及/或凝固分析來測定。使用FVIII抗原及活性分析測定FVIII特異活性。

在實踐本發明中，熟習此項技術者在考量其當前較佳實施例後預期會思及許多修改及變化。因此，僅有應對本發明範疇施加之限制為出現於隨附申請專利範圍中之限制。

實例4 具有改良啟動子/強化子序列的構築體之產生

為產生具有增加功能FVIII之表現的強啟動子之額外AAV載體，用經修飾強化子及/或啟動子序列來產生構築體。在一些實施例中，構築體包含縮短型式之ApoE或微球蛋白強化子。此等構築體係使用標準DNA選殖技術來產生，且其序列在SEQ IS NO：9-45中展示。

實例5 AAV病毒粒子之產生 重組Bacmid之產生

將DH10 Bac勝任細胞(competent cell)於冰上解凍。添加重組穿梭(shuttle)質體(例如pFB-GFP)，且與勝任細胞輕輕混合並於冰上孵化30分鐘。隨後使勝任細胞在大致42℃之溫度下經受加熱歷時30秒，且隨後於冰上冷卻2分鐘。在42℃加熱下搖動勝任細胞30秒，且於冰上冷卻2min。將SOC添加至細胞，且允許在37℃下、在攪動下孵化4小時以使重組發生。在孵化期期間，將X-gal展佈於兩個LB板(另外含有用於轉型的各種抗生素(例如康黴素、健他黴素及四環素)上，後面有IPTG。

獲得一定量的孵化混合物，將其稀釋且隨後展佈於兩個LB板上，並在37℃下孵化大致30-48小時。自每一板選擇若干白色純系，且在含有與提供於LB板中相同的抗生素組合之LB培養基中培養隔夜。接著，製備Bacmid DNA及甘油儲料，且在-80℃下儲存。

重組Bacmid DNA之純化

移除一定量的Bacmid甘油儲料，且接種於含有與提供於實例1中所述的LB板中相同的抗生素組合之LB培養基中。使培養物在37℃下、在搖動下生長隔夜。接著，在微離心機中以全速將一定量的培養物旋轉大致30秒。

使用吸量管將團塊再懸浮於再懸浮緩衝液中，接著再懸浮於溶解緩衝液中，且將管倒轉若干次來混合緩衝液，且隨後在室溫下孵化大致5分鐘。示範性再懸浮緩衝液包含50mM Tris-CL(pH 8.0)、10mM EDTA及100ug/mL RNase A。示範性溶解緩衝液包含200mM NaOH及1% SDS。緩慢添加一定量的沈澱物緩衝液(例如包含3.0M乙酸鉀(pH 5.5)之緩衝液)，且倒轉若干次來混合緩衝液，且隨後於冰上孵化大致10分鐘。將管以全速離心大致10分鐘，且將上清液倒入含有異丙醇之管中。將管倒轉若干次來混合溶液。

接著，在室溫下將溶液以全速離心大致15分鐘，且在離心之後用吸量管立即移除上清液。

添加一定量的70%乙醇來清洗團塊且再次全速旋轉1分鐘。隨後移除乙醇且將溶液再次旋轉來移除痕量的乙醇。藉由吸量管將一定量的TE/EB緩衝液添加至每一管且小心地溶解團塊。若不立即使用，則在-20℃下儲存溶液。

重組桿狀病毒之P0儲料之產生

在6孔板中以大致1 x 10⁶個細胞/孔(或在10cm板中以6 x 10⁶個或在15cm皿中1.7 x 10⁷個細胞)來接種Sf9細胞，且使細胞在轉染之前附著至少1小時。

轉染溶液A和B如下製備：溶液A：在15mL管中，將一定量的Bacmid稀釋於一定量的不具有抗生素的無血清培養基中。溶液B：在15mL管中，將一定量的CellFectin稀釋於一定量的不具有抗生素的無血清培養基中。藉由吸量管將溶液B添加至溶液A且輕輕混合，藉由吸量管進行大致3次，且在室溫下孵化30~45分鐘。接著，抽吸來自板的培養基且添加一定量的不具有抗生素的無血清培養基來洗滌細胞。將一定量的不具有抗生素的SF900II添加至含有脂質-DNA混合物之每一管。

抽吸來自細胞的培養基，將轉染溶液添加至細胞且在28℃下將細胞孵化大致5小時。移除轉染溶液且添加一定量的無血清培養基+抗生素，且在28℃下孵化大致4天。收集含有重組桿狀病毒之培養基且以1000rpm旋轉大致5分鐘來移除細胞碎片。在4℃下於暗處儲存桿狀病毒。

桿狀病毒(P1)之擴增

使Sf9細胞生長至大致4 x 10⁶個細胞/毫升，且在搖瓶中用新鮮培養基稀釋至大致2 x 10⁶個細胞/毫升。用一定量的P0儲備桿狀病毒感染一定量的Sf9細胞。感染重數(MOI)為大致0.1。

將Sf9細胞孵化大致3天，且收穫桿狀病毒。以2,000rpm旋轉細胞5分鐘來使細胞形成團塊，且收集上清液在4℃下於暗處儲存。根據Clontech之Rapid Titer Kit規程測定桿狀病毒之力價。

使用P1重組桿狀病毒產生AAV

使Sf9細胞生長至約1 x 10⁷個細胞/毫升，且稀釋至約5 x 10⁶個細胞毫升。用桿狀病毒載體(5Moi)及桿狀病毒輔助物(15Moi)感染一定量的稀釋Sf9細胞歷時3天。在第三天評鑑細胞存活率(觀察到大致50%~70%的死細胞)。

藉由以3000rpm離心10分鐘來收穫細胞團塊。移除培養基且溶解細胞(或若不立即使用，則在-20℃下儲存細胞團塊)。

溶解及成帶(banding)規程

將一定量的Sf9溶解緩衝液加Benzonase添加至每一細胞團塊，且徹底渦旋來再懸浮細胞。將再懸浮Sf9細胞於冰上孵化大致10min.以冷卻溶解產物。將溶解產物音波處理大致20秒，以徹底地溶解細胞，且隨後在37℃下孵化大致30分鐘。

添加一定量的5M NaCl且將混合物渦旋，且隨後在37℃下再孵化30分鐘。添加一定量的NaCl來使鹽濃度達到約500mM，在15℃下以8,000rpm渦旋且離心20分鐘來產生澄清溶解產物。

澄清溶解產物繼續超離心步驟。藉由首先添加澄清溶解產物，隨後經由帶長針之注射器添加量為1.32g/cc及量為1.55g/cc的CsCl溶液來製備CsCl-梯度劑。標記CsCl溶液之間的界面。將PBS添加至離心管頂部且將管小心地平衡並密封。

在15℃下，以55,000rpm將管離心大致20小時。在每一管之頂部穿刺出孔，且標記位於稍高於兩個CsCl溶液之界面標記的AAV帶。

藉由將AAV溶液轉移至離心管的70.1 Ti轉子來進行第二CsCl離心，且將一定量的CsCl添加至管頂部附近。將管平衡且密封。以65,000rpm將管離心大致20小時，且收集AAV帶(下方帶，較高處的帶為空蛋白殼)。

實例5 在Rag2小鼠中評估構築體

包含密碼子最佳化SQ FVIII編碼基因序列之AAV基因組使用桿狀病毒及293細胞、使用UCL SQ、Proto 1、Proto S1、Proto S2及Proto S3構築體來產生。桿狀病毒之包裝極限為4800bp，且293細胞之包裝極限及4950。

如圖5所示，具有截斷或非截斷基因組轉導FVIII之Proto 1相似於UCL SQ構築體。由桿狀病毒及293T細胞溶解產物產生的AAV5.2在4-12% Bis-Tris凝膠上量測。如圖6所示，每一樣本表現VP1、VP2及VP3蛋白質。來自AAV樣本之基因組DNA在0.8%鹼性瓊脂糖凝膠上運作，如圖7所示。

當此等AAV藉由桿狀病毒系統製備時，Proto 1之轉導相似於UCL SQ構築體。對含有內含子之Proto2S及3S的包括並不比Proto 1轉導更佳。在293細胞中製備的含有AAV側接序列之UCL SQ載體比在桿狀病毒中製備的缺乏AAV序列之UCL SQ更有效。因此，為嘗試增加效力，將額外強化子添加至Proto 1，例如構築體101、102、102及104。

實例6 具有改良啟動子/強化子序列之AAV FVIII載體之表現及活性

使用流體動力學注入規程測試包含構築體99至構築體106之AAV 載體之表現及活性。流體動力學遞送為一種活體內篩選肝啟動子之快速方法。使用實例5中所述之方法來產生AAV質體DNA，且隨後在TransIT-QR流體動力學遞送溶液中稀釋。以藉由(小鼠重量(g)/10)=0.1ml遞送溶液)所測定之體積，將質體DNA注入至5-6週齡C57Bl/6小鼠(18-25g)之尾部靜脈中。注入時間小於5秒。在注入之後48小時收集每一小鼠之血漿，且使用ELISA分析量測FVIII抗原表現之量。

將增加劑量之Proto 1質體(2.5、5、12.5及50μg)注入至小鼠之尾部靜脈中。使用ELISA測試來量測受注入小鼠之血漿中FVIII之量，且將重組FVIII(Xyntha SQ等效物)用作比較標準。

為研究表現，構築體p100-400、構築體100(p100)、構築體FVIII-BMN001(pFVIII-BMN001)、Proto1、構築體100AT(p100-AT)、構築體100 bGH poly A(p100-bGHPA)、構築體101(p101)及構築體104(p104)之改良啟動子/強化子元件。如圖8所示，所有構築體產生效率級別不同的功能FVIII。

圖9及圖10提供用於各種構築體之1μg質體之注入的資料。如圖8所示，構築體FVIII-BMN001、構築體FVIII-BMN002、構築體102(p102)、構築體103(p103)及構築體104(p104)之注入在10只小鼠的5只中產生至少20ng FVIII的表現量。如圖9所示，構築體FVIII-BMN001、構築體103(p103)、構築體103-AT(p103-AT；398bp hAAT啟動子)、構築體100(p100)、構築體100AT(p100-AT；398bp hAAT啟動子)之注入在10只小鼠的5只中產生至少100ng/ml FVIII的表現量。

<110> 美商拜奧馬林製藥公司彼得 C 克羅希

<120> 腺相關病毒因子VIII載體

<130> 30610/48689

<150> US-61/877,042

<151> 2013-09-12

<160> 45

<170> PatentIn 3.5版

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Claims

一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含AAV2 5’反向末端重複序列(ITR)、肝特異性轉錄調節區、功能活性因子VIII(FVIII)編碼區、多腺苷酸化序列、AAV2 3’ITR及視需要選用的一或多個內含子，其中該功能活性FVIII編碼區包含SEQ ID NO：9之核苷酸923-5296。
一種產生重組腺相關病毒(AAV)粒子之方法，其包含：A)培養已用如請求項1之AAV載體轉染的細胞；以及B)自該轉染細胞之上清液回收重組AAV粒子。
一種病毒粒子，其包含如請求項1之AAV載體。
一種如請求項1之AAV載體之用途，其係用以製備用於治療A型血友病之藥劑，其中該藥劑係調配為用於靜脈內投與。
一種組合物，其包含如請求項1之AAV載體，其係用於治療A型血友病。
一種經分離核酸，其編碼功能活性FVIII蛋白，該經分離核酸包含SEQ ID NO：9之核苷酸923-5296。
一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含SEQ ID NO：1之核苷酸序列。
一種病毒粒子，其包含如請求項7之AAV載體。
一種如請求項7之AAV載體之用途，其係用以製備用於治療A型血友病之藥劑，其中該藥劑係調配為用於靜脈內施用。