JP6029674B2

JP6029674B2 - 第ｖｉｉｉ因子のバイオアベイラビリティを改善するための、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼの組み合わせ使用

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Publication number: JP6029674B2
Application number: JP2014536227A
Authority: JP
Inventors: ザビーネ・ゾルナー; フーベルト・メッツナー
Original assignee: ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2016-11-24
Anticipated expiration: 2032-10-18
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Description

本発明は、出血性障害の治療及び予防的処置における非静脈内投与のための、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを含む医薬製剤に関する。本発明はさらに、出血性障害の処置及び予防のための、第ＶＩＩＩ因子、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼの組み合わせ使用、並びに硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼの共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により第ＶＩＩＩ因子の非静脈内投与後のバイオアベイラビリティを増大させるための方法に関する。

発明の背景
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）
ＦＶＩＩＩは、哺乳動物の肝臓において産生される、分子量約２８０ｋＤａの血漿糖タンパク質である。これは、血液凝固に至る凝固反応カスケードの重要な構成要素である。このカスケード内には、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）が、活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）と連動して、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化形態ＦＸａへと変換する段階がある。ＦＶＩＩＩａはこの段階において補因子として作用し、カルシウムイオン及びリン脂質と共に、ＦＩＸａの活性を最大化するために必要とされる。最も一般的な血友病性障害は、機能的ＦＶＩＩＩの欠損により引き起こされ、血友病Ａと呼ばれる。

血友病Ａの処置における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全２，３５１アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離（特許文献１）並びにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列及びその産生のための組み換え方法の提供であった。

クローン化されたｃＤＮＡから決定されたヒトＦＶＩＩＩの推定一次アミノ酸配列の分析は、それがより大きな前駆体ポリペプチドからプロセシングされたヘテロダイマーであるということを示す。このヘテロダイマーは、約２００ｋＤａのＮ−末端重鎖と金属イオン依存性会合している約８０ｋＤａのＣ−末端軽鎖からなる（Ｋａｕｆｍａｎによる概説、非特許文献１を参照のこと）。このヘテロダイマーの生理的活性化は、トロンビンによるタンパク質鎖のタンパク質分解切断により起こる。トロンビンは重鎖を切断して９０ｋＤａのタンパク質にし、次いで５４ｋＤａ及び４４ｋＤａのフラグメントにする。トロンビンはまた、８０ｋＤａ軽鎖を切断して７２ｋＤａのタンパク質にする。活性ＦＶＩＩＩを構成するのは、カルシウムイオンにより一緒に結合される、後者のタンパク質、及び２つの重鎖フラグメント（上記の５４ｋＤａ及び４４ｋＤａ）である。不活化は、４４ｋＤａＡ２重鎖フラグメントが分子から解離した場合、又は７２ｋＤａ及び５４ｋＤａのドメインがトロンビン、活性化タンパク質Ｃ若しくはＦＸａによりさらに切断された場合に起こる。血漿中では、ＦＶＩＩＩは５０倍モル過剰のフォン・ビルブランド因子タンパク質（「ＶＷＦ」）との会合により安定化され、これが上記のようなＦＶＩＩＩのタンパク質分解的破壊を阻害するようである。

ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３つの構造ドメイン：３３０アミノ酸の三つ組のＡドメイン、９８０アミノ酸の単一のＢドメイン、及び１５０アミノ酸の二つ組のＣドメインに体系付けられる。Ｂドメインは他のタンパク質に対する相同性を有しておらず、そしてこのタンパク質の２５の可能性のあるアスパラギン（Ｎ）−連結グリコシル化部位のうちの１８を提供する。Ｂドメインは凝固において機能を有していないようであり、なお凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）活性を有するＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子を用いて除去され得る。

フォン・ビルブランド因子（ＶＷＦ）
ＶＷＦは哺乳動物の血漿中に存在する多量体接着性糖タンパク質であり、これは多数の生理的機能を有する。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特異的受容体と、コラーゲンのような細胞外マトリックスの成分との間のメディエータとして作用する。さらに、ＶＷＦは担体として役立ち、プロコアグラントＦＶＩＩＩに対してタンパク質を安定化させる。ＶＷＦは内皮細胞及び巨核球において２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。前駆体ポリペプチド、プレ−プロ−ＶＷＦは、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロ−ペプチド及び成熟血漿ＶＷＦにおいて見られる２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。血漿中への分泌の際に、ＶＷＦは異なる分子サイズを有する様々な種の形態で循環する。これらのＶＷＦ分子は、２０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマー及び多量体からなる。ＶＷＦは通常は血漿中で１つのダイマーから５０〜１００のダイマーからなるマルチマーまでとして見出され得る（非特許文献３）。ヒトの循環中のヒトＶＷＦのインビボ半減期は約１２時間である。

ヒトにおける最も頻繁な遺伝性出血性障害はフォン・ビルブランド病（ＶＷＤ）である。出血症状の重症度に依存して、ＶＷＤは、一般にはヒト血漿由来のＶＷＦを含有する濃縮物を用いた補充療法により処置され得るが、組み換えＶＷＦもまた開発中である。ＶＷＦはヒト血漿から、例えば特許文献２に記載されるように製造され得る。特許文献３において、組み換えＶＷＦを単離する方法が記載される。

ＶＷＦはインビボでＦＶＩＩＩを安定化することが公知であり、従ってＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節する重大な役割を果たし、そして結果として一次及び二次止血を制御するための中枢因子である。ＶＷＤ患者におけるＶＷＦ含有医薬製剤の静脈内投与後に、２４時間で１ｍｌあたり１〜３単位の内因性ＦＶＩＩＩ：Ｃの増加が観察され得るということも知られており、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦのインビボ安定化効果を実証した。

患者は一般的に、活性成分の特異的作用様式から恩恵を受けるが、現在、全ての市販の第ＶＩＩＩ因子製剤は静脈内投与により投与され、これは注射部位での感染の危険性を含み、そして一般的に、特に凝固系に異常を有する小児の処置において患者が避けたいと思う手順である。

今日まで、血友病Ａ及びＶＷＤの標準的な処置は、ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦ濃縮物製剤の頻繁な静脈内注入を含む。

これらの補充療法は一般的に有効であるが、しかし例えば予防的処置を受けている重症の血友病Ａ患者において、第ＶＩＩＩ因子は、約１２時間という第ＶＩＩＩ因子の短い血漿半減期のために週におよそ３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。０，０１Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩレベルの上昇に相当する正常ヒト血漿の１％を超えるＦＶＩＩＩレベルを既に達成することにより、重症の血友病Ａは中程度の血友病Ａになる。予防的治療において、投薬計画は、ＦＶＩＩＩ活性のトラフレベルが非血友病ＦＶＩＩＩ活性の２〜３％より低いレベルに低下しないように計画される。

静脈内投与による第ＶＩＩＩ因子の投与は煩雑であり、痛みを伴い、かつ特に患者自身により、又は血友病Ａと診断された小児の親により大部分は在宅治療で行われる場合に特に感染の危険性を伴う。さらに、頻繁な静脈内注射は必然的に瘢痕形成を生じ、将来の注射を妨害する。重症血友病における予防的処置が幼いときに、しばしば２歳未満の小児で開始される場合、このような幼い患者の静脈中にＦＶＩＩＩを週あたり３回注射することはなおより困難である。限定された期間の間、ポートシステムの移植が代替を提供し得る。しかし、これらの場合、繰り返される感染が起こり得、そしてポートは身体運動の間に不都合を引き起こし得る。

従って、第ＶＩＩＩ因子を静脈内注入する必要性を取り除く重大な医学的必要性が存在する。

皮下投与は第ＶＩＩＩ因子について、例えば特許文献４及び特許文献５において提案されてきた。しかし、許容しうるバイオアベイラビリティを達成するために非常に高い用量の第ＶＩＩＩ因子が投与されなければならなかった。

非静脈内投与の際のバイオアベイラビリティを改善するための別のアプローチは、アルブミン融合第ＶＩＩＩ因子を使用することであった（特許文献６）。

特許文献７及び特許文献７は、共投与される薬剤、薬物又はタンパク質の薬物動態プロフィール及び薬力学プロフィールを改善するための、膨大な数の薬剤、薬物及びタンパク質の分散及び送達を促進、増強又は増大させるための拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）又は分散剤としてのヒアルロニダーゼの使用を教示する。

米国特許第４，７５７，００６号ＥＰ０５０３９９１ＥＰ０７８４６３２ＷＯ９５／０１８０４Ａ１ＷＯ９５／０２６７５０ＷＯ２０１１／０２０８６６Ａ２ＷＯ２０１０／０７７２９７Ａ１

Ｋａｕｆｍａｎ、ＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＭｅｄ．Ｒｅｖｓ．６：２３５（１９９２）Ｆｉｓｃｈｅｒｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５１:３４５−３４８、１９９４Ｒｕｇｇｅｒｉｅｔａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２:５７６−５８４、１９９９

非静脈内投与の際の第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティを改善することは非常に望ましい。本出願の発明者らは、驚くべきことに、第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティが、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼと組み合わせて投与された場合に実質的に増加するということを見出した。

発明の要旨
第一の局面において、従って本発明は、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン、及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを含む医薬製剤に関する。

本発明の第一の局面の好ましい実施態様において、医薬製剤は、第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン（例えばヘパリン）、及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを含む。より好ましくは、医薬製剤は、ヒト第ＶＩＩＩ因子、未分画ヘパリン及びヒトヒアルロニダーゼを含む。第ＶＩＩＩ因子はＶＷＦと複合体化されていてもされていなくてもよい。

第二の局面において、本発明は、出血性障害の処置又は予防における使用のための第ＶＩＩＩ因子に関し、ここで該処置又は予防は、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼの投与を含む。第二の局面の変形において、本発明は、出血性障害の処置又は予防における使用のための、第ＶＩＩＩ因子、硫酸化グリコサミノグリカン、及びヒアルロニダーゼに関する。

本発明の第二の局面の好ましい実施態様は、出血性障害の処置又は予防における使用のための第ＶＩＩＩ因子であって、ここで該処置又は予防は、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼの投与を含む。より好ましくは、処置又は予防は、第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン（例えば未分画ヘパリン）及びヒトヒアルロニダーゼの投与を含む。第ＶＩＩＩ因子はＶＷＦと複合体化していても複合体化していなくてもよい。

出血性障害が血友病Ａであることはさらに好ましく、そして治療又は予防が薬剤の非静脈内投与、最も好ましくは皮下、筋内又は皮内注射によるものであることがさらに好ましい。

本発明の第三の局面は、１つ又はそれ以上の第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティを改善するための、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼの組み合わせ使用である。第三の局面の好ましい実施態様は、変更すべきところは変更して第一及び第二の局面の実施態様に対応する。

本発明の第四の局面は、それを必要とする被験体に、治療有効量の、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを投与することにより出血性障害を処置する方法である。第ＶＩＩＩ因子、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼは、同時に、例えば単一の組成物に混合されて投与され得る。あるいは、１つの成分が別個に投与され得、一方で他の２つの成分は一緒に投与される。別の実施態様において、全ての３つの成分が別々に、例えば時差様式で投与される。

さらに別の局面において、本発明は、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン、及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを含む医薬キットに関する。

本発明の全ての局面において、第ＶＩＩＩ因子は好ましくはヒト第ＶＩＩＩ因子である。好ましい硫酸化グリコサミノグリカンはヘパリンであり、最も好ましくは未分画ヘパリンである。

図１は実施例１の結果を示す。ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼが共投与された場合に増加する。第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティに対する組み合わせ投与の効果は相乗的である。

詳細な説明
本発明は出血性障害の処置及び予防に関する。

本明細書で使用される用語「出血性障害」は家族性及び後天性の血友病Ａを含む。

本発明の第一の局面によれば、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子、少なくとも１つの硫酸化グリコサミノグリカン、及び少なくとも１つのヒアルロニダーゼを含む医薬製剤が提供される。

第ＶＩＩＩ因子は野生型第ＶＩＩＩ因子であっても変異を含んでいてもよい。グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存して変化し得る。特定のアミノ酸配列に言及する場合、そのような配列の翻訳後修飾は本出願に包含される。

用語「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は本明細書において置き換え可能に使用される。「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型第ＶＩＩＩ因子（ＦａｃｔｏＶＩＩＩ）も、野生型第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有する野生型第ＶＩＩＩ因子の誘導体も含む。誘導体は、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入及び／又は付加を有し得る。用語第ＶＩＩＩ因子は、重鎖及び軽鎖を含む、第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解的にプロセシングされた形態、例えば活性化前の形態を含む。

用語「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型第ＶＩＩＩ因子の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の生物学的活性を有するいずれの第ＶＩＩＩ因子変異形（ｖａｒｉａｎｔｓ）又は変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）も含む。第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を決定するために適切な試験は、一段階若しくは二段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａｅｔａｌ．１９８２．ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｓｓａｙｏｆＦＶＩＩＩ：ＣａｎｄＦＩＸａｉｎＢｌｏｏｍｅｄ．ＴｈｅＨｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．ＮＹＣｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ１９９２）又は発色基質ＦＶＩＩＩ：活性アッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ、１９８４．ＳｃａｎｄＪＨａｅｍａｔｏｌ３３:１３９−１４５、ｓｕｐｐｌ．）である。これらの参考文献の内容は参照により本明細書中に加入される。

非限定的な例として、第ＶＩＩＩ因子分子としては、ＡＰＣ切断を防止するか又は低減させる第ＶＩＩＩ因子変異体（Ａｍａｎｏ１９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７−５６３）、アルブミン融合ＦＶＩＩＩ分子（ＷＯ２０１１／０２０８６６Ａ２）、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合分子（ＷＯ０４／１０１７４０Ａ）、Ａ２ドメインをさらに安定化する第ＶＩＩＩ因子変異体（ＷＯ９７／４０１４５）、増加した発現を生じるＦＶＩＩＩ変異体（Ｓｗａｒｏｏｐｅｔａｌ．１９９７．ＪＢＣ２７２：２４１２１−２４１２４）、減少した免疫原性を有する第ＶＩＩＩ因子変異体（Ｌｏｌｌａｒ１９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５−５０８）、異なって発現された重鎖及び軽鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈｅｔａｌ．１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５−１００）、ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）及び／又はＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）のようなＦＶＩＩＩの異化をもたらす受容体への結合を低減するＦＶＩＩＩ変異体（Ａｎａｎｙｅｖａｅｔａｌ．２００１．ＴＣＭ、１１：２５１−２５７）、ジスルフィド結合安定化ＦＶＩＩＩ変異形（Ｇａｌｅｅｔａｌ．、２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５−１３２２）、改善された分泌特性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｍｉａｏｅｔａｌ．、２００４．Ｂｌｏｏｄ１０３：３４１２−３４１９）、増加した補因子特異的活性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４４：１０２９８−３０４）、改善された生合成及び分泌、減少したＥＲシャペロン相互作用、改善されたＥＲ−ゴルジ輸送、増加した活性又は不活化に対する抵抗性、及び改善された半減期を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｐｉｐｅによる要約、２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７−２３７）、並びにＢ−ドメインの全て又は一部の欠失を有するＦＶＩＩＩ変異体（例えばＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１、ＷＯ０２／１０２８５０Ａ２、ＷＯ００／２４７５９Ａ１及び米国特許第４，８６８，１１２号を参照のこと）が挙げられる。「単鎖」ＦＶＩＩＩ分子であるＦＶＩＩＩ分子は特に好ましい。単鎖ＦＶＩＩＩはＢ−ドメインの全て又は一部の欠失及び酸性ａ３領域の全て又は一部の欠失を有し、その結果Ａｒｇ１６４８での切断部位（これは通常分泌の間に切断される）が欠失される。単鎖ＦＶＩＩＩ分子は、例えばＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１；ＵＳ２００２／１３２３０６Ａ１；Ｋｒｉｓｈｎａｎｅｔａｌ．（１９９１）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｖｏｌ．１９５、ｎｏ．３、ｐａｇｅｓ６３７−６４４；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａｅｔａｌ．（１９９８）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６１、ｎｏ．３、ｐａｇｅｓ１６５−１７３；Ｄｏｎａｔｈｅｔａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、ｖｏｌ．３１２、ｐａｇｅｓ４９−５５に開示される。

これら第ＶＩＩＩ因子変異体及び変異形は全て、それら全体として参照により本明細書に加入される。

ヒトＶＩＩＩの成熟野生型形態のアミノ酸配列は配列番号２において示される。特定の配列のアミノ酸位置への言及は、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質におけるそのアミノ酸の位置を意味し、かつ言及される配列における他の位置での変異、例えば欠失、挿入及び／又は置換の存在を除外しない。例えば、配列番号２に言及する「Ｇｌｕ２００４」における変異は、改変されたホモログにおいて、配列番号２の位置１〜２３３２における１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠失しているということを除外しない。配列番号１をコードするＤＮＡ配列は配列番号１において示される。

本明細書で使用される用語「グリコサミノグリカン」は、特にアミノヘキソース単位を含むオリゴ糖又は多糖を指す。硫酸化グリコサミノグリカンとしては、限定されないが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸が挙げられる。好ましくは、硫酸化グリコサミノグリカンはヘパリンであり、最も好ましくは、硫酸化グリコサミノグリカンは未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン及びコンドロイチン硫酸からなる群より選択される。

用語「ヘパリン」は、未分画ヘパリン及び低分子量を有するヘパリンを含む。一実施態様において、本発明に従って使用されるヘパリンは、約８ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、最も好ましくは約１２ｋＤａ〜約１６ｋＤａ、例えば約１５ｋＤａの平均分子量を有し得る「未分画ヘパリン」である。別の実施態様において、本発明に従って使用されるヘパリンは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。ＬＭＷＨは、８０００Ｄａ未満の平均分子量を有するヘパリン又はヘパリン塩であり、それらについて全ての鎖の少なくとも６０％が８０００Ｄａ未満の分子量を有する。好ましくは、本発明に従って使用されるＬＭＷＨの分子量は、約２ｋＤａ〜約８ｋＤａ、より好ましくは約３ｋＤａ〜約６ｋＤａ、最も好ましくは約４ｋＤａ〜約５ｋＤａ、例えば約４．５ｋＤａである。ＬＭＷＨはポリマーヘパリンの分画又は解重合の様々な方法により得ることができる。ＬＭＷＨの例としては、限定されないが、アルデパリン（Ｎｏｒｍｉｆｌｏ）、セルトパリン（ｃｅｒｔｏｐａｒｉｎ）（Ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ）、エノキサパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ及びＣｌｅｘａｎｅ）、パルナパリン（Ｆｌｕｘｕｍ）、チンザパリン（Ｉｎｎｏｈｅｐ及びＬｏｇｉｐａｒｉｎ）、ダルテパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ）、レビパリン（Ｃｌｉｖａｒｉｎ）及びナドロパリン（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）が挙げられる。

用語「ヘパリン」はまた、天然に存在するヘパリンから切断及び単離により又は合成経路のいずれかにより誘導された、ヘパリン分子の低分子量フラグメントも含む。例えば、合成的に製造され、そしてその構造がヘパリンから誘導されたものである市販の硫酸化五糖類が存在する。それはフォンダパリヌクスナトリウムとして入手可能である。

コンドロイチン硫酸としては、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン−４−サルフェート）、コンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン−６−サルフェート）、コンドロイチン硫酸Ｄ（コンドロイチン−２，６−サルフェート）、及びコンドロイチン硫酸Ｅ（コンドロイチン−４，６−サルフェート）が挙げられる。

デルマタン硫酸（以前はコンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれる）は市販されている別の硫酸化グリコサミノグリカンである。

ケラタン硫酸は別の硫酸化グリコサミノグリカンである。ケラタン硫酸の構造は、例えばＦｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ（２０００）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙｖｏｌ．１０ｎｏ．１０ｐｐ．９５１−９５８に記載される。

ヘパラン硫酸は、ヘパリンとは異なるＮ−硫酸化多糖である（例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、Ｊ．Ｔ．、Ｌｙｏｎ、Ｍ．（２０００）．「ＭｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＨｅｐａｒａｎＳｕｌｆａｔｅａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓａｎｄｍｏｒｐｈｏｇｅｎｓ」．ＩｎＩｏｚｚｏ、Ｍ、Ｖ．．Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ:ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮｅｗＹｏｒｋ．ｐｐ．２７-５９；及びＧａｌｌａｇｈｅｒ、Ｊ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ、Ａ．（１９８５）．「ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＨｅｐａｒａｎＳｕｌｐｈａｔｅａｎｄＨｅｐａｒｉｎ:ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｕｌｐｈａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｓＨｅｐａｒａｎＳｕｌｐｈａｔｅａｎｄＨｅｐａｒｉｎａｒｅｓｅｐａｒａｔｅｆａｍｉｌｉｅｓｏｆＮ−ｓｕｌｐｈａｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３０（３）:６６５-７４を参照のこと）。

用語「ヒアルロニダーゼ」は、ヒアルロノグルクロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）活性、ヒアルロノグルコサミニダーゼ活性又はヒアルロン酸リアーゼ活性を有するいずれかのポリペプチドを指す。好ましくは、ヒアルロニダーゼは少なくとも部分的にヒアルロナン（ヒアルロン酸）を分解することができる。

３つのクラスのヒアルロニダーゼがある：
（１）四糖類及び六糖類が主要最終産物であるエンド−ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼである、哺乳類ヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）。これらは加水分解活性及びトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、そしてヒアルロナン及びコンドロイチン硫酸（ＣＳ）、具体的にはＣ４−Ｓ及びＣ６−Ｓを分解し得る。
（２）細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ４．２．２．１）は、主に二糖類最終産物を生じるベータ−脱離反応により機能するエンド−ベータ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼである。
（３）ヒル、他の寄生生物、及び甲殻類由来のヒアルロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）は、ベータ１−３連結の加水分解により四糖類及び六糖類最終生成物を生じるエンド−ベータ−グルクロニダーゼである。

哺乳類ヒアルロニダーゼは本発明に従って好ましく、そしてこれらはさらに２つのグループに分けられ得る：中性活性酵素及び酸活性酵素。中性活性ヒアルロニダーゼが好ましい。本発明のヒアルロニダーゼはいずれの種由来のものでもよい。しかし、より好ましくは、ヒアルロニダーゼはヒトヒアルロニダーゼである。なおより好ましくは、ヒト遺伝子ＨＹＡＬ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｑ１２７９４）、ＨＹＡＬ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｑ１２８９１）、ＨＹＡＬ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｑ２Ｍ３Ｔ９）及びＰＨ２０／ＳＰＡＭ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｐ３８５６７）によりそれぞれコードされるヒアルロニダーゼが、本発明においてヒアルロニダーゼとして使用される。最も好ましくは、ヒアルロニダーゼはヒトＰＨ２０（Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受入番号Ｐ３８５６７）である。さらなる可溶性ＰＨ２０ポリペプチド及びＷＯ２０１０／０７７２９４Ａ１に記載される伸長された可溶性ＰＨ２０ポリペプチド（特に、ＷＯ２０１０／０７７２９４Ａ１の図１に示されるヒトＰＨ２０のアミノ酸配列を参照のこと）が特に好ましい。これらのポリペプチドは参照により本明細書中に加入される。

それらが少なくともいくつかのヒアルロニダーゼ活性をなお有する限り、上記のヒアルロニダーゼのいずれかの変異形及び変異体がさらに含まれる。

本明細書で使用されるヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロン酸の切断を酵素により触媒する能力を指す。米国薬局方（ＵＳＰ）ＸＸＩＩヒアルロニダーゼについてのアッセイは、酵素をＨＡと３０分間３７℃にて反応させた後に残っている高分子量ヒアルロン酸、又はヒアルロナン、（ＨＡ）基質の量を測定することにより間接的にヒアルロニダーゼ活性を決定する（ＵＳＰＸＸＩＩ−ＮＦＸＶＩＩ（１９９０）６４４−６４５ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｃ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。参照標準溶液は、いずれかのヒアルロニダーゼの相対的活性（単位）を確定するためにアッセイにおいて使用され得る。ヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を決定するためのインビトロアッセイは当該分野で公知である。例となるアッセイとしては、未切断のヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する場合に形成される不溶性沈殿物を検出することにより、ヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を間接的に測定する微小濁度（ｍｉｃｒｏｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）アッセイが挙げられる（例えば、Ｈｙｎｅｓ、Ｗ．Ｌ．、Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ（１９９４）．Ａｓｓａｙｓｆｏｒｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ２３５:６０６−６１６を参照のこと）。例えば試験されるヒアルロニダーゼの活性（単位）を決定するために標準曲線を作製するために参照標準が使用され得る。別の例において、ヒアルロニダーゼ活性は、残留ビオチン化ヒアルロン酸がヒアルロニダーゼとのインキュベーションの後に測定されるマイクロタイターアッセイを使用して測定される（例えば、ＦｒｏｓｔａｎｄＳｔｅｒｎ（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：２６３−２６９、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．２００５／０２６０１８６を参照のこと）。ヒアルロニダーゼ活性を測定するための他のアッセイも当該分野において公知であり、かつ使用され得る（例えば、Ｄｅｉｐｅｃｈｅｔａｌ．、（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：３５−４１；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．、（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２２：２５７−２６３を参照のこと）。

一実施態様において、第ＶＩＩＩ因子、硫酸化グリコサミノグリカン、及びヒアルロニダーゼは同じ組成物中に含有される。３つの成分を含むこの組成物は、単一の注射などにより患者に投与され得る。

別の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子、硫酸化グリコサミノグリカン、及びヒアルロニダーゼは同じ組成物中に存在しない。例えば、３つの成分の各々は、前記医薬製剤中の別個の投薬形態で提供され得る。あるいは、３つの成分のうちの２つが同じ組成物中に存在し得、一方で第３の成分は別個の投薬形態で提供される。さらに別の変形において、３つの成分の各々は、前記医薬製剤中の別個の投薬形態で提供される。要約すれば、本発明は以下の実施態様を包含する。

表１の実施態様（１）〜（４）におけるように３つの成分が同じ組成物中に存在しない場合、別個の組成物が別々に投与されてもよいし、３つの成分全てが同時に投与されるように投与の少し前にそれらが混合されてもよい。別々の投与がある場合、投与は連続して、例えば時差様式で行われてもよい。投与が別々に行われる場合、投与の順序は、第ＶＩＩＩ因子が最初に投与され、続いて硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼが投与されるような順序であり得る。あるいは、硫酸化グリコサミノグリカンが最初の成分として投与され、続いて第ＶＩＩＩ因子及びヒアルロニダーゼが投与され得る。さらに別の実施態様において、ヒアルロニダーゼが最初に投与され、続いて第ＶＩＩＩ因子及び硫酸化グリコサミノグリカンが投与される。３つの成分の投与の間の時間は、例えば約１秒から約２４時間、又は約１０秒から約１時間、又は約２０秒から約１０分で変化し得る。典型的には、３つの成分は２４又はそれ以下、好ましくは１時間又はそれ以下、最も好ましくは１０分又はそれ以下以内に投与される。一般に、３つの成分が同時に単一の投与、例えば注射により投与されることが好ましい。様々な投与経路は以下で考察される。それらは変更すべきところは変更して上記のものにも当てはまる。

医薬製剤の成分は、医薬製剤を提供するために、従来の生理学的に適合性の水性緩衝液中に溶解され得、この緩衝液には場合により医薬賦形剤が加えられ得る。

このような医薬担体及び賦形剤、さらには適切な製剤処方の製造は当該分野で周知である（例えば、「ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒｅｔａｌ．、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）又は「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、３^ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ、Ｋｉｂｂｅｅｔａｌ．、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（２０００）を参照のこと）。特定の実施態様において、医薬組成物は少なくとも１つの添加物、例えばフィラー、増量剤、緩衝剤、安定剤、又は賦形剤を含み得る。標準的な医薬製剤化処方技術は当業者に周知である（例えば、２００５Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ ＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｒ）、ＴｈｏｍｓｏｎＨｅａｌｔｈｃａｒｅ: Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ: ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、２０ｔｈｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏｅｔａｌ．、Ｅｄｓ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ: Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００を参照のこと）。適切な医薬添加剤としては、例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ショ糖、トレハロース、若しくはその他のような糖類、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、若しくはその他のようなアミノ酸、塩化ナトリウム若しくはその他の塩のような等張状態を達成するための添加剤、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウム若しくはその他のような安定剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどのような生理的ｐＨ緩衝化剤が挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物はｐＨ緩衝化試薬及び湿潤剤又は乳化剤を含有し得る。さらなる実施態様において、組成物は保存料又は安定剤を含有し得る。特に、第ＶＩＩＩ因子を含む医薬製剤は、凍結乾燥形態又は安定な可溶形態で製剤化され得る。第ＶＩＩＩ因子は当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。また、硫酸化グリコサミノグリカン及び第ＶＩＩＩ因子が同じ組成物中に含有される場合、このような組成物はまた、凍結乾燥形態又は適切な可溶形態で提供され得る。凍結乾燥製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤、例えば注射用滅菌水、又は生理食塩水又は安定な緩衝液を加えることにより、使用前に再構成される。

本発明の医薬製剤中に含まれる組成物は、いずれかの薬学的に適切な手段により個体に送達され得る。様々な送達系が公知であり、そしていずれかの都合の良い経路により組成物を投与するために使用され得る。好ましくは、本発明の医薬製剤中に含まれる組成物は、非静脈内投与により個体に送達される。より好ましくは、本発明の組成物は、従来の方法に従って、皮下、筋内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内又は経皮投与、最も好ましくは皮下、筋内又は経皮投与用に製剤化される。製剤は注入又はボーラス注射により継続的に投与され得る。いくつかの製剤は持続放出系を包含する。

本発明の医薬製剤の組成物は、治療有効用量で患者に投与され、この治療有効用量は、容認されない有害な副作用を生じる用量に達することなく処置される状態又は適応症の重症度又は伝播を予防するか又は減少させる、所望の効果を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、例えば適応症、処方、投与様式のような多くの因子に依存し、そしてそれぞれの適応症について前臨床及び臨床試験において決定されなければならない。

本発明の一実施態様において、処置される被験体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、皮下注射の５時間後から皮下注射の８時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における第ＶＩＩＩ因子の通常血漿レベルの、２％より高く、好ましくは５％より高く、より好ましくは８％より高く、最も好ましくは１０％より高い。血漿レベルは本明細書以後の実施例１において示されるように決定されるべきである。

本発明の一実施態様において、処置される被験体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、皮下注射の４時間後から皮下注射の１６時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における第ＶＩＩＩ因子の通常血漿レベルの、２％より高く、好ましくは５％より高く、より好ましくは８％より高く、最も好ましくは１０％より高い。

本発明の別の実施態様において、処置される被験体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、皮下注射の３時間後から皮下注射の２４時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における第ＶＩＩＩ因子の通常血漿レベルの、２％より高く、好ましくは４％より高く、より好ましくは６％より高く、最も好ましくは８％より高い。

本発明の別の実施態様において、処置される被験体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、皮下注射の２時間後から皮下注射の３２時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における第ＶＩＩＩ因子の通常血漿レベルの、２％より高く、好ましくは３％より高く、より好ましくは４％より高く、最も好ましくは５％より高い。

本発明のさらに別の実施態様において、処置される被験体における第ＶＩＩＩ因子の血漿レベルは、注射の１時間後から注射の４８時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における第ＶＩＩＩ因子の通常血漿レベルの、２％より高く、好ましくは３％より高く、より好ましくは４％より高く、最も好ましくは５％より高い。

１回の投与についての第ＶＩＩＩ因子の用量は、典型的には１，０００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は８００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は６００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は４００ＩＵ／体重ｋｇ未満、例えば、約１０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約２０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約３０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約４０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約７５ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約１００ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約２００ＩＵ／体重ｋｇの用量である。ＦＶＩＩＩはそれ自体で、又はＶＷＦとの複合体として投与され得る。

投与される硫酸化グリコサミノグリカンの量は、典型的には約０．０１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約０．０５〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇ、約０．２５〜約２ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．５〜約１ｍｇ／体重ｋｇの範囲に及ぶ。硫酸化グリコサミノグリカンの量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／適用される製品ｍＬ、約０．０１〜約１０ｍｇ／適用される製品ｍＬ、約０．０５〜約１ｍｇ／適用される製品ｍＬの範囲に及び得る。

典型的には、ヒアルロニダーゼの治療有効用量は、安定化された溶液又は懸濁液又は凍結乾燥形態（ｆｒｏｍ）で、約１〜約１０，０００Ｕ／体重ｋｇ、約３〜約５，０００Ｕ／体重ｋｇ、約５〜約１，０００Ｕ／体重ｋｇ、約８〜約５００Ｕ／体重ｋｇ、又は約１０〜約２５０Ｕ／体重ｋｇである。製剤は、限定されないが、アンプル、シリンジ、及び個々に包装された錠剤又はカプセル剤のような単位投薬形態で提供され得る。例えば、ヒアルロニダーゼは、約１０Ｕ、２５Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、２５０Ｕ、５００Ｕ、１０００Ｕ、５，０００Ｕ又はそれ以上で皮下投与され得る。ヒアルロニダーゼは、場合により他の薬理学的に有効な薬剤又は治療剤と共に、０．１〜５０ｍｌ、０．５〜２０ｍｌ、又は１〜１０ｍｌ、典型的には１〜１０ｍｌの総体積で、（第ＶＩＩＩ因子及び硫酸化グリコサミノグリカンとは）別々に投与されても、第ＶＩＩＩ因子及び硫酸化グリコサミノグリカンと同時に投与されてもよい。典型的には、本明細書において考慮されるヒアルロニダーゼの注射又は注入の体積は、０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、５０ｍｌ若しくはそれ以上、又はおよそ０．０１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、５０ｍｌ若しくはそれ以上である。いくつかの例において、投薬量は、ヒアルロニダーゼ対第ＶＩＩＩ因子の量の比として提供され得る。ヒアルロニダーゼの単位数対第ＶＩＩＩ因子の単位数（Ｕ）の比は、約５０：１〜約１：５０、又は約１０：１〜約１：１０、又は約５：１〜約１：５の範囲に及び得る。ヒアルロニダーゼは、１００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ若しくは１０００Ｕ／ｍＬ、若しくはおよそ１００Ｕ／ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ若しくは１０００Ｕ／ｍＬのストック溶液として提供され得、又は直接的使用若しくは使用前に有効濃度に希釈するためのより濃縮された形態、例えば２０００Ｕ／ｍｌ、３０００Ｕ／ｍｌ、４０００Ｕ／ｍｌ、５０００Ｕ／ｍｌ、８０００Ｕ／ｍｌ、１０，０００Ｕ／ｍＬ若しくは２０，０００Ｕ／ｍＬ、若しくはおよそ２０００Ｕ／ｍｌ、３０００Ｕ／ｍｌ、４０００Ｕ／ｍｌ、５０００Ｕ／ｍｌ、８０００Ｕ／ｍｌ、１０，０００Ｕ／ｍＬ若しくは２０，０００Ｕ／ｍＬで提供され得る。ヒアルロニダーゼは液体又は凍結乾燥製剤として提供され得る。

本明細書で使用される用語「バイオアベイラビリティ」は、第ＶＩＩＩ因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子又はＦＶＩＩＩ関連製剤）の投与された用量の、皮下、静脈内又は皮内投与後の最終時点までの所定の時点で血漿中で検出され得る比率を指す。典型的には、バイオアベイラビリティは、１０ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの間の用量（例えば４００ＩＵ／体重ｋｇ）の製剤を投与し；投与後の所定の時点で血漿サンプルを入手し；そして１つ又はそれ以上の発色若しくは凝固アッセイ（又はいずれかのバイオアッセイ）、イムノアッセイ、又はそれらと等価なものを使用してサンプル中の第ＶＩＩＩ因子、例えば第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子関連ポリペプチドの含有量を決定することにより、試験動物において測定される。バイオアベイラビリティは、ｙ軸上に血漿中の第ＶＩＩＩ因子の濃度又は活性、そしてｘ軸上に投与後の時間の、投与後の所定の最終時点までの曲線下面積（ＡＵＣ）として表される。好ましくは、この所定の時点は投与の４８時間後である。最も好ましくは、バイオアベイラビリティは本明細書以下の実施例において示されるように決定される。試験製剤の相対的バイオアベイラビリティは、試験製剤のＡＵＣと、その試験製剤と同じ用量及び方法（例えば、静脈内、皮下又は皮内）で投与された参照製剤のＡＵＣとの間の比を指す。

本発明によれば、第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティ（硫酸化グリコサミノグリカン及びヒアルロニダーゼと共投与された場合）は、単独で投与された場合の第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティよりも高い。好ましくは、バイオアベイラビリティは、少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも２００％、より好ましくは少なくとも３００％、最も好ましくは少なくとも４００％増加する。バイオアベイラビリティの増加は、好ましくは第ＶＩＩＩ因子が皮下注射により１，０００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は８００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は６００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は４００ＩＵ／体重ｋｇ未満の用量で、例えば約１０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約２０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約３０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約４０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約７５ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約１００ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約２００ＩＵ／体重ｋｇの用量で投与された場合に得られる。第ＶＩＩＩ因子はそれ自体で、又はＶＷＦとの複合体で投与され得る。

本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併用して投与され得る。これらの薬剤は同じ医薬の一部として組み込まれてもよい。

実施例１：皮下適用されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティ及び様々な添加剤の血友病Ａモデルにおける評価
材料及び動物モデル
実験において使用された第ＶＩＩＩ因子はＢ−ドメイン切断型単鎖組み換え第ＶＩＩＩ因子（本明細書以後では「ｒＦＶＩＩＩ」と呼ぶ）であった。これは野生型第ＶＩＩＩ因子配列のＢドメインの大部分及び酸性ａ３領域の一部に欠失を有する。この第ＶＩＩＩ因子は、Ａｓｎ７６４をＴｈｒ１６５３と融合することにより生成された「単鎖」第ＶＩＩＩ因子である。これは細胞培養細胞において発現されて細胞培養培地から精製された。

使用されたさらなる薬剤を表２にまとめる。

第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスを血友病Ａの動物モデルとして使用した。これらのマウスはエキソン１６及び１７を欠いており、従ってＦＶＩＩＩを発現しない（ＢｉＬ．ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９５、Ｖｏｌ１０（１）、１１９−１２１；ＢｉＬ．ｅｔａｌ、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、Ｖｏｌ８８（９）、３４４６−３４５０）。これにより、ノックアウトマウスの血漿におけるＦＶＩＩＩの活性の定量により処置後のＦＶＩＩＩレベルの分析が可能となる。

方法
血管外注射がＦＶＩＩＩ（ヒト）を用いる改善された治療のための選択肢であり得るかどうかを評価するために、血管外治療の典型的な代表である皮下注射を選択した。行われた非臨床薬物動態研究の設計を以下の表３において詳述する。第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルを、血友病Ａモデルへ様々な添加剤と共に（表３に詳細な処置グループ）ＦＶＩＩＩの単回静脈内注射又は皮下注射の後に決定した。

対応するグループを、様々な異なる添加剤の存在下で同じ用量のＦＶＩＩＩ（発色基質（ＣＳ）活性アッセイ）を用いて処置した。単回適用のために、各処置グループについて様々な異なる成分を、体重約２５ｇのＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスへの皮下適用の前に、体積２００μＬ（全てのグループについて同一の体積）で混ぜあわせた。処置グループを表３にまとめる。

短期麻酔下で、血液サンプルを抜き取り、クエン酸ナトリウムを使用し１０％クエン酸血液にして抗凝固剤処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性の決定のために-７０℃で保存した。サンプリングの時点を表４において詳述する。血漿中のＦＶＩＩＩ活性の定量を標準的な、ａＰＴＴベースのアプローチ（ＢｅｈｒｉｎｇＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＴｉｍｅｒ）により行った。動物を標準的飼育条件で維持した。

結果
結果を表４及び図１にまとめる。ヘパリン又はヒアルロニダーゼの存在下でのＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスへの４００ＩＵ／ｋｇＦＶＩＩＩの皮下注射は、ＦＶＩＩＩ単独の投与と比較して、血漿レベルでのＦＶＩＩＩ活性の有意な増加を生じた。ヘパリン及びヒアルロニダーゼをＦＶＩＩＩと共投与した場合、さらにバイオアベイラビリティの相乗的増加もあった。

実施例２：皮下適用された第ＶＩＩＩ因子及びヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の血友病Ａモデルにおけるバイオアベイラビリティの評価
ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の可溶性形態はＨａｌｏｚｙｍｅから購入され得る。あるいは、これはＷＯ２０１０／０７７２９７Ａ１に記載されるように製造され得る。

使用されるべき他の薬剤は実施例１において使用されるものと同じである。

実験は実施例１において上で記載されたように行うことができる。処置グループの可能な概略は以下のとおりである：

結果は上記の実施例１と同じ様式で表示され得る。

Claims

第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン、及びヒアルロニダーゼを含む医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン、及びヒアルロニダーゼが同じ組成物中に含有される、請求項１に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン、及びヒアルロニダーゼが前記医薬製剤中の別個の投薬形態で提供される、請求項１に記載の医薬製剤。
ヒアルロニダーゼがヒトヒアルロニダーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記ヘパリンが未分画ヘパリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
出血性障害の処置又は予防における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子がヒト第ＶＩＩＩ因子である、請求項６に記載の医薬製剤。
ヒアルロニダーゼがヒトヒアルロニダーゼである、請求項６又は７に記載の医薬製剤。
出血性障害が血友病Ａである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン及びヒアルロニダーゼが同時に投与される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン及びヒアルロニダーゼが別々に投与される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
処置又は予防が、前記第ＶＩＩＩ因子、ヘパリン及びヒアルロニダーゼの非静脈内投与を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
前記非静脈内投与が皮下注射、筋内注射又は経皮注射である、請求項１２に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティを改善するための、ヘパリン及びヒアルロニダーゼを含む医薬製剤。
出血性障害の治療及び予防的処置のための、請求項１４に記載の医薬製剤。
出血性障害が、家族性及び後天性血友病Ａ、家族性又は後天性フォン・ビルブランド病から選択される、請求項１４又は１５に記載の医薬製剤。
第ＶＩＩＩ因子、ヒアルロニダーゼ及びヘパリンを含む、出血性障害の治療又は予防のための医薬キット。