JPH0799989A - ポリペプチドの合成方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 昆虫細胞内である選ばれた遺伝子を発現する
ことのできる組換えバキュロウィルス発現ベクターを製
造する方法を提供する。感染しやすい宿主昆虫細胞を組
換えバキュロウィルス発現ベクターにより適切に感染さ
せることよりなり、その際該発現ベクターが、有効なバ
キュロウィルスプロモーター及び該選ばれたポリペプチ
ドの発現に対してコード化されている少なくとも１つの
選ばれた遺伝子を含む組換えバキュロウィルスゲノムで
あり、該選ばれた遺伝子が該ゲノム中バキュロウィルス
プロモーター或いはそれ自身のプロモーターの転写制御
下におかれていることを特徴とする上記方法。
ことのできる組換えバキュロウィルス発現ベクターを製
造する方法を提供する。感染しやすい宿主昆虫細胞を組
換えバキュロウィルス発現ベクターにより適切に感染さ
せることよりなり、その際該発現ベクターが、有効なバ
キュロウィルスプロモーター及び該選ばれたポリペプチ
ドの発現に対してコード化されている少なくとも１つの
選ばれた遺伝子を含む組換えバキュロウィルスゲノムで
あり、該選ばれた遺伝子が該ゲノム中バキュロウィルス
プロモーター或いはそれ自身のプロモーターの転写制御
下におかれていることを特徴とする上記方法。
Description
【０００１】本発明は組換えウィルス発現ベクターの製
法に関する。より詳しくは、本発明は、バキュロウィル
スプロモーターにカップリングさせた、或る選ばれた遺
伝子をバキュロウィルスゲノム中に導入し、昆虫細胞内
でその選ばれた遺伝子を発現することのできる組換えバ
キュロウィルス発現ベクターを製造する方法に関する。
法に関する。より詳しくは、本発明は、バキュロウィル
スプロモーターにカップリングさせた、或る選ばれた遺
伝子をバキュロウィルスゲノム中に導入し、昆虫細胞内
でその選ばれた遺伝子を発現することのできる組換えバ
キュロウィルス発現ベクターを製造する方法に関する。
【０００２】組換えＤＮＡ技術における最近の進歩は特
別の遺伝子或いはその部分の単離並びにそれらの細菌、
酵素、植物或いは動物細胞並びにこれらの生物体に感染
するウィルスへの転移を容易にした。転移された遺伝子
物質（即ち、変成遺伝子）は複製され、形質転換された
細胞或いはウィルス複製として遺伝される。その結果、
形質転換細胞は転移された遺伝子配列がコード（encod
e）する生成物を産生する能力を獲得する。
別の遺伝子或いはその部分の単離並びにそれらの細菌、
酵素、植物或いは動物細胞並びにこれらの生物体に感染
するウィルスへの転移を容易にした。転移された遺伝子
物質（即ち、変成遺伝子）は複製され、形質転換された
細胞或いはウィルス複製として遺伝される。その結果、
形質転換細胞は転移された遺伝子配列がコード（encod
e）する生成物を産生する能力を獲得する。
【０００３】ウィルス、真核生物及び原核生物の間の遺
伝子或いはその部分の転移及び発現は、全ての生物のＤ
ＮＡがそれが同一の４つのヌクレオチドで構成されてい
るという点において化学的に類似しているので可能であ
る。基本的相違は、生物のゲノムに表われるヌクレオチ
ドの配列にある。コドン（ヌクレオチド トリプレッ
ト）に配列された特定のヌクレオチド配列は、特定のア
ミノ酸配列をコードする。しかしながら、アミノ酸配列
とＤＮＡヌクレオチド配列間のコード（暗号づけ）関係
は全ての生物体に対して本質的に同一である。
伝子或いはその部分の転移及び発現は、全ての生物のＤ
ＮＡがそれが同一の４つのヌクレオチドで構成されてい
るという点において化学的に類似しているので可能であ
る。基本的相違は、生物のゲノムに表われるヌクレオチ
ドの配列にある。コドン（ヌクレオチド トリプレッ
ト）に配列された特定のヌクレオチド配列は、特定のア
ミノ酸配列をコードする。しかしながら、アミノ酸配列
とＤＮＡヌクレオチド配列間のコード（暗号づけ）関係
は全ての生物体に対して本質的に同一である。
【０００４】ゲノムＤＮＡは、蛋白質コード配列（即
ち、「構造遺伝子」）及び構造遺伝子の発現を仲介する
調節領域（転写開始を制御するＤＮＡ配列は通常「プロ
モーター」と称される）とに組織されている。一般的
に、酵素ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターにより、そ
れが構造遺伝子に沿って移動するに際して、それがコー
ドされた情報をメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に
転写するように活性化される。ｍＲＮＡは認識配列、リ
ボソーム結合に対する信号及び翻訳開始及び終止に対す
る信号を含む。遺伝子のプロモーター領域（通常、遺伝
子の５′側面隣接領域（flanking region ）と説明され
ている）における重要な転写信号の役割の遺伝学的分析
の最近の進歩は，ＤＮＡ配列を選択的に除去或いは変更
してそれらの発現における機能及び役割を研究すること
及びこれらの配列の幾つかを除去して、それらの例えば
組換えＤＮＡ宿主‐ベクター系などの異種生物学系にお
ける機能を研究することを容易に行うことができるよう
にした。
ち、「構造遺伝子」）及び構造遺伝子の発現を仲介する
調節領域（転写開始を制御するＤＮＡ配列は通常「プロ
モーター」と称される）とに組織されている。一般的
に、酵素ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターにより、そ
れが構造遺伝子に沿って移動するに際して、それがコー
ドされた情報をメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に
転写するように活性化される。ｍＲＮＡは認識配列、リ
ボソーム結合に対する信号及び翻訳開始及び終止に対す
る信号を含む。遺伝子のプロモーター領域（通常、遺伝
子の５′側面隣接領域（flanking region ）と説明され
ている）における重要な転写信号の役割の遺伝学的分析
の最近の進歩は，ＤＮＡ配列を選択的に除去或いは変更
してそれらの発現における機能及び役割を研究すること
及びこれらの配列の幾つかを除去して、それらの例えば
組換えＤＮＡ宿主‐ベクター系などの異種生物学系にお
ける機能を研究することを容易に行うことができるよう
にした。
【０００５】真核生物のプロモーターは、通常その配置
及び原核生物プロモーター配列への構造的類似性（Brea
thnach & Chambon, 50 Ann. Rev. Biochem. 349-383 (1
981)）が転写の促進への関与を示唆する２つのヌクレオ
チドの保存配列により特徴付けられている。第１のもの
は、ＲＮＡ開始部位（ｍＲＮＡに対する転写開始部位で
あるキャップ部位）から２０〜３０塩基対上流に位置す
る核酸アデニン及びチミンに富んだ配列（Goldberg-Hog
ness、「ＴＡＴＡ」或いは「ＡＴＡ」ボックス）であ
り、調和配列（consensus sequence）（５′‐ＴＡＴＡ
Ａ‐ＡＴＡ‐３′）により特徴付けられている。第２の
領域は、ＣＣＡＡＴボックス（Efstratadis 等、21 Cel
l 653-668 (1980)）であり、それは幾つかの遺伝子のキ
ャップ部位から７０〜９０塩基対上流に位置し、標準的
配列５′‐ＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＡＴＣＴ‐３′（Benois
t 等、8 Nucleic Acids Res. 127-142 (1980) ）を有す
る。これらの配列は、制限エンドヌクレアーゼ酵素及び
組換えＤＮＡ分子を産生するクローニングの使用によっ
て、及びクローン化されたヌクレオチド配列のin vitro
或いは部位‐特異的突然変異誘発による制御された除去
或いは変更によって、除去或いは変成することができ
る。制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子の部位‐特異
的切断に触媒作用を及ぼすことのできる加水分解酵素で
ある。制限酵素活性の部位は、ある特別のヌクレオチド
配列の存在により決定され、所定の制限エンドヌクレア
ーゼに対する認識部位と称される。多くの制限酵素が単
離され、それらの認識部位に従って分類されている。幾
つかの制限エンドヌクレアーゼは同一点における両方の
ＤＮＡ鎖上のホスホ‐ジエステル結合を加水分解し、ブ
ラント末端を生成するのに対し、その他のものは互に数
個のヌクレオチドで隔てられた結合を加水分解し、各Ｄ
ＮＡ分子の末端に遊離の一本鎖領域を生成する。これら
の一本鎖末端は自己相補的であり、同一の相補的一本鎖
配列を有する加水分解されたＤＮＡ或いはもう１つの或
いは異種のＤＮＡ配列と再結合するために使用され得
る。
及び原核生物プロモーター配列への構造的類似性（Brea
thnach & Chambon, 50 Ann. Rev. Biochem. 349-383 (1
981)）が転写の促進への関与を示唆する２つのヌクレオ
チドの保存配列により特徴付けられている。第１のもの
は、ＲＮＡ開始部位（ｍＲＮＡに対する転写開始部位で
あるキャップ部位）から２０〜３０塩基対上流に位置す
る核酸アデニン及びチミンに富んだ配列（Goldberg-Hog
ness、「ＴＡＴＡ」或いは「ＡＴＡ」ボックス）であ
り、調和配列（consensus sequence）（５′‐ＴＡＴＡ
Ａ‐ＡＴＡ‐３′）により特徴付けられている。第２の
領域は、ＣＣＡＡＴボックス（Efstratadis 等、21 Cel
l 653-668 (1980)）であり、それは幾つかの遺伝子のキ
ャップ部位から７０〜９０塩基対上流に位置し、標準的
配列５′‐ＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＡＴＣＴ‐３′（Benois
t 等、8 Nucleic Acids Res. 127-142 (1980) ）を有す
る。これらの配列は、制限エンドヌクレアーゼ酵素及び
組換えＤＮＡ分子を産生するクローニングの使用によっ
て、及びクローン化されたヌクレオチド配列のin vitro
或いは部位‐特異的突然変異誘発による制御された除去
或いは変更によって、除去或いは変成することができ
る。制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子の部位‐特異
的切断に触媒作用を及ぼすことのできる加水分解酵素で
ある。制限酵素活性の部位は、ある特別のヌクレオチド
配列の存在により決定され、所定の制限エンドヌクレア
ーゼに対する認識部位と称される。多くの制限酵素が単
離され、それらの認識部位に従って分類されている。幾
つかの制限エンドヌクレアーゼは同一点における両方の
ＤＮＡ鎖上のホスホ‐ジエステル結合を加水分解し、ブ
ラント末端を生成するのに対し、その他のものは互に数
個のヌクレオチドで隔てられた結合を加水分解し、各Ｄ
ＮＡ分子の末端に遊離の一本鎖領域を生成する。これら
の一本鎖末端は自己相補的であり、同一の相補的一本鎖
配列を有する加水分解されたＤＮＡ或いはもう１つの或
いは異種のＤＮＡ配列と再結合するために使用され得
る。
【０００６】制限部位は比較的稀である。しかしなが
ら、制限エンドヌクレアーゼの一般的使用は、所望の制
限部位配列を含有する化学的に合成された二本鎖オリゴ
ヌクレオチド類の利用可能性により極めて改良されてき
た。実質的に任意の天然の、クローン化された遺伝子的
に変更された或いは化学的に合成されたＤＮＡのセグメ
ントを、適当な認識部位を含むオリゴヌクレオチドをそ
のＤＮＡ分子の末端に付着させることにより、任意のそ
の他のセグメントにカップリングさせることができる。
この生成物を適当な制限エンドヌクレアーゼの加水分解
作用に付することにより、ＤＮＡ分子をカップリングす
るための必要な相補的末端を生成することができる。
ら、制限エンドヌクレアーゼの一般的使用は、所望の制
限部位配列を含有する化学的に合成された二本鎖オリゴ
ヌクレオチド類の利用可能性により極めて改良されてき
た。実質的に任意の天然の、クローン化された遺伝子的
に変更された或いは化学的に合成されたＤＮＡのセグメ
ントを、適当な認識部位を含むオリゴヌクレオチドをそ
のＤＮＡ分子の末端に付着させることにより、任意のそ
の他のセグメントにカップリングさせることができる。
この生成物を適当な制限エンドヌクレアーゼの加水分解
作用に付することにより、ＤＮＡ分子をカップリングす
るための必要な相補的末端を生成することができる。
【０００７】特異的制限酵素に対する認識部位は、通
常、ランダムに分布している。従って、制限酵素による
切断は、隣接コドン間で、１つのコドン内で或いは遺伝
子内の幾つかのランダム部位において生じ得る。この組
立てには多くの変化が可能であるが、ＤＮＡ配列をプロ
モーター領域に関して適当な位置及び配向で挿入してこ
れらの配列を発現させるために技術が利用可能であるこ
とに注意することが重要である。
常、ランダムに分布している。従って、制限酵素による
切断は、隣接コドン間で、１つのコドン内で或いは遺伝
子内の幾つかのランダム部位において生じ得る。この組
立てには多くの変化が可能であるが、ＤＮＡ配列をプロ
モーター領域に関して適当な位置及び配向で挿入してこ
れらの配列を発現させるために技術が利用可能であるこ
とに注意することが重要である。
【０００８】潜在的に任意のＤＮＡ配列はこの様に外来
ＤＮＡ配列をクローニングヴィークル（vehicle ）或い
はベクター分子内に挿入することによりクローン化し
て、時にはキメラ或いはハイブリッド遺伝子と称される
人工的な組換え分子或いは複合体を構成することができ
る。殆んどの目的のためには、利用されるクローニング
ヴィークルは、組換え分子が細菌、酵母、植物或いは動
物細胞内に形質転換により入れられた際に複製すること
ができるような無欠陥のレプリコンを含む二本鎖染色体
外性ＤＮＡ配列である。普通使用されるクローニングヴ
ィークルは、ウィルス、及び細菌、酵母、植物及び動物
細胞に付随するプラスミドから得られる。
ＤＮＡ配列をクローニングヴィークル（vehicle ）或い
はベクター分子内に挿入することによりクローン化し
て、時にはキメラ或いはハイブリッド遺伝子と称される
人工的な組換え分子或いは複合体を構成することができ
る。殆んどの目的のためには、利用されるクローニング
ヴィークルは、組換え分子が細菌、酵母、植物或いは動
物細胞内に形質転換により入れられた際に複製すること
ができるような無欠陥のレプリコンを含む二本鎖染色体
外性ＤＮＡ配列である。普通使用されるクローニングヴ
ィークルは、ウィルス、及び細菌、酵母、植物及び動物
細胞に付随するプラスミドから得られる。
【０００９】生化学及び組換えＤＮＡ技術における最近
の進歩は「異種起源」ＤＮＡを含有するクローニングヴ
ィークル或いはベクターの構成に導いた。「異種起源」
という用語は、通常細胞によっては産生されないポリペ
プチドをコードするＤＮＡを称する。この異種起源ＤＮ
Ａは細胞のゲノム中に組込まれるか或いは自己複製プラ
スミド或いはウィルスクローニングヴィークルに乗せて
形質転換細胞内に維持されうる。これらの形質転換細胞
群はその他のベクターへの更に操作、変成及び転移のた
めの異種ＤＮＡの新たな源を提供する。外来遺伝子を有
するある種のウィルスベクターは、形質転換細胞内で複
製し、これを溶解する。複製に際し、外来遺伝子は、そ
の特別の細胞タイプ内において発現することもあり、発
現されないこともある。複製ウィルスを単離し、更に、
追加の細胞を感染するのに使用することが出来、このよ
うにして更に使用するための組換え体の新たな源を提供
する。
の進歩は「異種起源」ＤＮＡを含有するクローニングヴ
ィークル或いはベクターの構成に導いた。「異種起源」
という用語は、通常細胞によっては産生されないポリペ
プチドをコードするＤＮＡを称する。この異種起源ＤＮ
Ａは細胞のゲノム中に組込まれるか或いは自己複製プラ
スミド或いはウィルスクローニングヴィークルに乗せて
形質転換細胞内に維持されうる。これらの形質転換細胞
群はその他のベクターへの更に操作、変成及び転移のた
めの異種ＤＮＡの新たな源を提供する。外来遺伝子を有
するある種のウィルスベクターは、形質転換細胞内で複
製し、これを溶解する。複製に際し、外来遺伝子は、そ
の特別の細胞タイプ内において発現することもあり、発
現されないこともある。複製ウィルスを単離し、更に、
追加の細胞を感染するのに使用することが出来、このよ
うにして更に使用するための組換え体の新たな源を提供
する。
【００１０】一度遺伝子或いはその所望部分がクローン
化され、及び或いは所望されたように生化学的に変成さ
れるか或いはその他の生化学的に変成されるか、または
ゲノム遺伝子がそれらの発現を容易にされるようにして
挿入されると、それらは次いで発現ベクターに転移され
る。遺伝コードの性質のために、クローン化された或い
はハイブリッド遺伝子或いはその部分は、それがコード
するアミノ酸配列の生産を指示する。プロモーター領域
と適当な関係に位置するクローン化遺伝子を用いた発現
ベクターを構成するための一般的技術は、次の文献に記
載されている：B.Polisky 等、73 Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 3900 (1976)； K.Itakura等、198 Science
1056-1063 (1977)； L.Villa-Komaroff 等、75 Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 3727-3731 (1978) など。
化され、及び或いは所望されたように生化学的に変成さ
れるか或いはその他の生化学的に変成されるか、または
ゲノム遺伝子がそれらの発現を容易にされるようにして
挿入されると、それらは次いで発現ベクターに転移され
る。遺伝コードの性質のために、クローン化された或い
はハイブリッド遺伝子或いはその部分は、それがコード
するアミノ酸配列の生産を指示する。プロモーター領域
と適当な関係に位置するクローン化遺伝子を用いた発現
ベクターを構成するための一般的技術は、次の文献に記
載されている：B.Polisky 等、73 Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 3900 (1976)； K.Itakura等、198 Science
1056-1063 (1977)； L.Villa-Komaroff 等、75 Proc. N
atl. Acad. Sci. U.S.A. 3727-3731 (1978) など。
【００１１】「発現」という用語は次のようにして特徴
付けることができる。比較的単純な原核生物においてさ
えも、細胞は多くの蛋白質を合成する能力を有する。任
意の与えられた時間において、細胞が合成することが可
能である多くの蛋白質は実際には合成されてはいない。
ある遺伝子によりコードされる特別のポリペプチドが細
胞により合成されている時、その遺伝子が発現されてい
ると云われる。発現されるためには、その特別のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は遺伝子の制御領域に関
して適当な位置になければならない。制御領域の機能
は、その制御下にある遺伝子の発現を任意の与えられた
時点における細胞の変化する必要性に対応するようにす
るものである。
付けることができる。比較的単純な原核生物においてさ
えも、細胞は多くの蛋白質を合成する能力を有する。任
意の与えられた時間において、細胞が合成することが可
能である多くの蛋白質は実際には合成されてはいない。
ある遺伝子によりコードされる特別のポリペプチドが細
胞により合成されている時、その遺伝子が発現されてい
ると云われる。発現されるためには、その特別のポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は遺伝子の制御領域に関
して適当な位置になければならない。制御領域の機能
は、その制御下にある遺伝子の発現を任意の与えられた
時点における細胞の変化する必要性に対応するようにす
るものである。
【００１２】本明細書においては、以下の定義が使用さ
れる。クローニングヴィークルとは、細胞内或いは形質
転換による生物体内において複製することのできる無欠
陥のレプリコンを含む染色体外性の長さの二本鎖ＤＮＡ
である。一般的に、クローニングヴィークルは、ウィル
ス或いはプラスミドより得られ、最も普通には環状ＤＮ
Ａの形態を取る。遺伝子という用語は、単一蛋白質鎖の
伝達及び合成を荷うＤＮＡ配列を指す。感染という用語
は、条件がそれらの複製及び生育に好ましい場合の細胞
の病原性ウィルス因子による侵略を指す。トランスフェ
クション（transfection）という用語は、リン酸塩或い
はその他の適当な試薬、例えばデキストランサルフェー
ト、を含有するＤＮＡの溶液に塩化カルシウムの添加時
に、ＤＮＡの沈澱及び細胞内への摂取により、精製核酸
で細胞を感染させる手法を指す。
れる。クローニングヴィークルとは、細胞内或いは形質
転換による生物体内において複製することのできる無欠
陥のレプリコンを含む染色体外性の長さの二本鎖ＤＮＡ
である。一般的に、クローニングヴィークルは、ウィル
ス或いはプラスミドより得られ、最も普通には環状ＤＮ
Ａの形態を取る。遺伝子という用語は、単一蛋白質鎖の
伝達及び合成を荷うＤＮＡ配列を指す。感染という用語
は、条件がそれらの複製及び生育に好ましい場合の細胞
の病原性ウィルス因子による侵略を指す。トランスフェ
クション（transfection）という用語は、リン酸塩或い
はその他の適当な試薬、例えばデキストランサルフェー
ト、を含有するＤＮＡの溶液に塩化カルシウムの添加時
に、ＤＮＡの沈澱及び細胞内への摂取により、精製核酸
で細胞を感染させる手法を指す。
【００１３】遺伝子的に変成された生物体による蛋白質
の工業的或いは実験室的合成に使用するために上記一般
的方式及び技術を利用する多くの宿主‐ベクター系が開
発されてきた。これらの宿主‐ベクター系の多くは米国
特許第４，３３８，３９７号明細書に記載されているよ
うな原核生物宿主‐ベクター系である。更に、A.Miyano
hara等、80 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1 (1983)
に記載されるようなＢ型肝炎表面抗原合成に用いられる
系、及びPitzeman等219 Science 620 (1983)に記載され
るような酵母内におけるヒトインターフェロンの合成系
など、ベクターとして酵母を使用する系も利用されてい
る。
の工業的或いは実験室的合成に使用するために上記一般
的方式及び技術を利用する多くの宿主‐ベクター系が開
発されてきた。これらの宿主‐ベクター系の多くは米国
特許第４，３３８，３９７号明細書に記載されているよ
うな原核生物宿主‐ベクター系である。更に、A.Miyano
hara等、80 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1 (1983)
に記載されるようなＢ型肝炎表面抗原合成に用いられる
系、及びPitzeman等219 Science 620 (1983)に記載され
るような酵母内におけるヒトインターフェロンの合成系
など、ベクターとして酵母を使用する系も利用されてい
る。
【００１４】目的蛋白質の合成に原核生物宿主‐ベクタ
ー系を利用する価値は、そのような系に内在するある種
の制限により減少している。例えば、その様な系のｍＲ
ＮＡ転写或いは蛋白質生成物は原核生物中においては不
安定な場合がある。更に、蛋白質が原核生物細胞内にお
いて合成される前に、微生物に導入されたＤＮＡ配列
は、介在ＤＮＡ配列、ナンセンス配列、及び活性真核生
物蛋白質を含まないポリペプチド配列をコードする初期
及び末端配列がないにちがいない。更に、ある種の真核
生物蛋白質は生物学的に活性となるために合成後に変成
（即ち、グルコシル化）を必要とし、原核生物細胞は一
般的にこの様な変成を行う能力がない。酵母或いは原核
生物宿主‐ベクター系に更に伴う制限は、合成された遺
伝子生成物の細胞内からの回収の困難性である。米国特
許第４，３３６，３３６号明細書は特に遺伝子生成物の
回収の問題に向けられものであり、遺伝的に変成された
細菌による蛋白質の合成及び分泌の方法を提供するもの
である。
ー系を利用する価値は、そのような系に内在するある種
の制限により減少している。例えば、その様な系のｍＲ
ＮＡ転写或いは蛋白質生成物は原核生物中においては不
安定な場合がある。更に、蛋白質が原核生物細胞内にお
いて合成される前に、微生物に導入されたＤＮＡ配列
は、介在ＤＮＡ配列、ナンセンス配列、及び活性真核生
物蛋白質を含まないポリペプチド配列をコードする初期
及び末端配列がないにちがいない。更に、ある種の真核
生物蛋白質は生物学的に活性となるために合成後に変成
（即ち、グルコシル化）を必要とし、原核生物細胞は一
般的にこの様な変成を行う能力がない。酵母或いは原核
生物宿主‐ベクター系に更に伴う制限は、合成された遺
伝子生成物の細胞内からの回収の困難性である。米国特
許第４，３３６，３３６号明細書は特に遺伝子生成物の
回収の問題に向けられものであり、遺伝的に変成された
細菌による蛋白質の合成及び分泌の方法を提供するもの
である。
【００１５】真核生物宿主‐ベクター系におけるウィル
スの使用は最近の研究及び考察の相当量の主題を占める
ものであった。しかしながら、ウィルスベクター系も又
それらの有用性を減少する相当な不利益及び制限を有す
るものである。例えば、多くの真核生物ウィルスベクタ
ーは哺乳動物系において腫瘍発生或いは腫瘍形成性であ
り、それにより、遺伝子生成物の発生及び偶発的な感染
を伴う深刻な健康及び安全問題についての潜在的可能性
を形成し得るものである。更に、幾つかの真核生物宿主
‐ウィルスベクター系においては、遺伝子生成物それ自
体が抗ウィルス活性を示し、それにより、その蛋白質の
産生を減少させる。その様な例としてD.Gheysen及びW.
Fiers、1 J. Molec. Applied Genet. 385-394 (1982)
により記載されている真核生物宿主‐ウィルスベクター
系における僅かに１００単位のインターフェロンが原因
となって生じたシミアンウィルス４０の産生におけ８０
％の減少が挙げられる。
スの使用は最近の研究及び考察の相当量の主題を占める
ものであった。しかしながら、ウィルスベクター系も又
それらの有用性を減少する相当な不利益及び制限を有す
るものである。例えば、多くの真核生物ウィルスベクタ
ーは哺乳動物系において腫瘍発生或いは腫瘍形成性であ
り、それにより、遺伝子生成物の発生及び偶発的な感染
を伴う深刻な健康及び安全問題についての潜在的可能性
を形成し得るものである。更に、幾つかの真核生物宿主
‐ウィルスベクター系においては、遺伝子生成物それ自
体が抗ウィルス活性を示し、それにより、その蛋白質の
産生を減少させる。その様な例としてD.Gheysen及びW.
Fiers、1 J. Molec. Applied Genet. 385-394 (1982)
により記載されている真核生物宿主‐ウィルスベクター
系における僅かに１００単位のインターフェロンが原因
となって生じたシミアンウィルス４０の産生におけ８０
％の減少が挙げられる。
【００１６】真核生物宿主‐ウィルスベクター系の使用
に内在するもう１つの問題は、ウィルスの形態により提
起されるものである。例えば、それらは数少ない制限部
位を有するにすぎないので、外因性ＤＮＡを単純なウィ
ルスの適当な箇所に挿入することはより容易である。し
かしながら、真核生物遺伝子はしばしば大きすぎて単純
ウィルスに嵌め込むことが出来ないことがある。即ち、
ウィルスの形態上の理由により、単純ウィルス内に入れ
ることのできる外因性ＤＮＡの量は制限される。他方、
外因性ＤＮＡを複雑ウィルスに特定の位置に挿入するこ
とはそれらが多くの制限部位を有するためにより困難で
ある。
に内在するもう１つの問題は、ウィルスの形態により提
起されるものである。例えば、それらは数少ない制限部
位を有するにすぎないので、外因性ＤＮＡを単純なウィ
ルスの適当な箇所に挿入することはより容易である。し
かしながら、真核生物遺伝子はしばしば大きすぎて単純
ウィルスに嵌め込むことが出来ないことがある。即ち、
ウィルスの形態上の理由により、単純ウィルス内に入れ
ることのできる外因性ＤＮＡの量は制限される。他方、
外因性ＤＮＡを複雑ウィルスに特定の位置に挿入するこ
とはそれらが多くの制限部位を有するためにより困難で
ある。
【００１７】本発明は、バキュロウィルス及びバキュロ
ウィルスゲノム中のプロモーターを利用して真核生物宿
主‐ベクター系内にウィルス発現ベクターを生成するこ
とにより上記した制限の多くを克服するものである。よ
り詳しくは、バキュロウィルス オートグラファ・カリ
フォルニカ（Autographa californica）（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）及びそれに関連したポリヘドリン プロモーターを
利用して真核宿主昆虫細胞内にある選択された遺伝子の
極めて高いレベルの発現を行う能力のある組換えウィル
ス発現ベクターを生成することが可能であることが見出
された。この系の得られた遺伝子生成物は、細胞培地中
に効率的に分泌され得、蛋白質生成物の採取に伴う殆ん
どの困難性を緩和するものである。更に、又より重要な
ことに、この系は哺乳動物において腫瘍形成性或いは腫
瘍生成性のものではない。真核生物宿主‐ウィルスベク
ター系におけるバキュロウィルスを利用することの理論
的な利点は、N.J. Panopoulos 編「植物科学における遺
伝子工学（Genetic Engineering in the Plant Scienc
e）」（New York, Praeger Publishers, 1981 pp. 203
〜224 ）のL.K. Miller による「無脊椎動物における遺
伝子工学のためのウィルスベクター（A Virus Vector f
or Genetic Engineering in Invertebrates ）」により
詳細に論じられている。
ウィルスゲノム中のプロモーターを利用して真核生物宿
主‐ベクター系内にウィルス発現ベクターを生成するこ
とにより上記した制限の多くを克服するものである。よ
り詳しくは、バキュロウィルス オートグラファ・カリ
フォルニカ（Autographa californica）（ＡｃＭＮＰ
Ｖ）及びそれに関連したポリヘドリン プロモーターを
利用して真核宿主昆虫細胞内にある選択された遺伝子の
極めて高いレベルの発現を行う能力のある組換えウィル
ス発現ベクターを生成することが可能であることが見出
された。この系の得られた遺伝子生成物は、細胞培地中
に効率的に分泌され得、蛋白質生成物の採取に伴う殆ん
どの困難性を緩和するものである。更に、又より重要な
ことに、この系は哺乳動物において腫瘍形成性或いは腫
瘍生成性のものではない。真核生物宿主‐ウィルスベク
ター系におけるバキュロウィルスを利用することの理論
的な利点は、N.J. Panopoulos 編「植物科学における遺
伝子工学（Genetic Engineering in the Plant Scienc
e）」（New York, Praeger Publishers, 1981 pp. 203
〜224 ）のL.K. Miller による「無脊椎動物における遺
伝子工学のためのウィルスベクター（A Virus Vector f
or Genetic Engineering in Invertebrates ）」により
詳細に論じられている。
【００１８】その最も広い範囲において、本発明は、ウ
ィルス転移ベクター、組換えウィルス転移ベクター及び
組換えウィルス発現ベクターの製造方法を提供するもの
である。得られた組換えウィルス発現ベクターは、宿主
昆虫細胞内において選ばれた遺伝子を発現する能力を有
する。本発明に従えば、バキュロウィルス遺伝子を含ん
でなるバキュロウィルスＤＮＡ或いは該バキュロウィル
ス遺伝子のプロモーターを含むその一部を切断して少な
くとも該プロモーターを含有するＤＮＡ断片を得る。好
ましい方法においては、適当なバキュロウィルス、例え
ば好ましくはバキュロウィルス オートグラファ・カリ
フォルニカ（ＡｃＭＮＰＶ）、のポリヘドリン遺伝子及
び側面隣接ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡを先ず単離す
る。所望ＤＮＡを次いで適当な制限操作により切断す
る。これにより、その幾つかがポリヘドリンプロモータ
ー及びポリヘドリン蛋白質或いはその一部をコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片を
生成する。その様な１つのＤＮＡ断片は、ポリヘドリン
プロモーターとポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮＡ
配列を含んでなるＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片である。次に、上
記ＤＮＡ断片を適当なクローニングヴィークル、例え
ば、プラスミドｐＵＣ８中に挿入することにより転移ベ
クターを調製する。従って、ポリヘドリン転移ベクター
と称される好ましい転移ベクターは、ポリヘドリンプロ
モーターと、ある選ばれた遺伝子或いはその一部をクロ
ーニングするために利用可能な部位とを、その選ばれた
遺伝子がポリヘドリンプロモーターの転写制御下にある
ように含有する適当なクローニングヴィークルよりなる
ものである。好ましい転移ベクターは、ポリヘドリン蛋
白質或いはその一部をコードするＤＮＡ配列を含んでも
又含まなくてもよいものである。
ィルス転移ベクター、組換えウィルス転移ベクター及び
組換えウィルス発現ベクターの製造方法を提供するもの
である。得られた組換えウィルス発現ベクターは、宿主
昆虫細胞内において選ばれた遺伝子を発現する能力を有
する。本発明に従えば、バキュロウィルス遺伝子を含ん
でなるバキュロウィルスＤＮＡ或いは該バキュロウィル
ス遺伝子のプロモーターを含むその一部を切断して少な
くとも該プロモーターを含有するＤＮＡ断片を得る。好
ましい方法においては、適当なバキュロウィルス、例え
ば好ましくはバキュロウィルス オートグラファ・カリ
フォルニカ（ＡｃＭＮＰＶ）、のポリヘドリン遺伝子及
び側面隣接ＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡを先ず単離す
る。所望ＤＮＡを次いで適当な制限操作により切断す
る。これにより、その幾つかがポリヘドリンプロモータ
ー及びポリヘドリン蛋白質或いはその一部をコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片を
生成する。その様な１つのＤＮＡ断片は、ポリヘドリン
プロモーターとポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮＡ
配列を含んでなるＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片である。次に、上
記ＤＮＡ断片を適当なクローニングヴィークル、例え
ば、プラスミドｐＵＣ８中に挿入することにより転移ベ
クターを調製する。従って、ポリヘドリン転移ベクター
と称される好ましい転移ベクターは、ポリヘドリンプロ
モーターと、ある選ばれた遺伝子或いはその一部をクロ
ーニングするために利用可能な部位とを、その選ばれた
遺伝子がポリヘドリンプロモーターの転写制御下にある
ように含有する適当なクローニングヴィークルよりなる
ものである。好ましい転移ベクターは、ポリヘドリン蛋
白質或いはその一部をコードするＤＮＡ配列を含んでも
又含まなくてもよいものである。
【００１９】組換え転移ベクターは、その後上記転移ベ
クターの利用可能なクローニング部位中に選ばれた遺伝
子或いはその部分を挿入することにより調製される。潜
在的には、本発明の転移ベクターには任意の遺伝子或い
は複数の遺伝子をクローン化させ、バキュロウィルスプ
ロモーター配列とカップリングさせることが出来る。更
に、適当な組換えＤＮＡ手法により、上記の好ましい転
移ベクターから、ポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列を、得られたクローン化遺伝子生成物が選ばれた
蛋白質それ自体となるように欠失することができる。或
いは又、ポリヘドリン蛋白質をコードする配列が欠失さ
れない場合、或いはポリヘドリン蛋白質をコードする少
なくとも１つの配列が好ましい転移ベクターから欠失さ
れない場合には、得られたクローン化された遺伝子生成
物は、選ばれた蛋白質及びポリヘドリン蛋白質或いはそ
の一部よりなるハイブリッド、即ち融合蛋白質であるで
あろう。
クターの利用可能なクローニング部位中に選ばれた遺伝
子或いはその部分を挿入することにより調製される。潜
在的には、本発明の転移ベクターには任意の遺伝子或い
は複数の遺伝子をクローン化させ、バキュロウィルスプ
ロモーター配列とカップリングさせることが出来る。更
に、適当な組換えＤＮＡ手法により、上記の好ましい転
移ベクターから、ポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列を、得られたクローン化遺伝子生成物が選ばれた
蛋白質それ自体となるように欠失することができる。或
いは又、ポリヘドリン蛋白質をコードする配列が欠失さ
れない場合、或いはポリヘドリン蛋白質をコードする少
なくとも１つの配列が好ましい転移ベクターから欠失さ
れない場合には、得られたクローン化された遺伝子生成
物は、選ばれた蛋白質及びポリヘドリン蛋白質或いはそ
の一部よりなるハイブリッド、即ち融合蛋白質であるで
あろう。
【００２０】組換え発現ベクターを製造するためには、
組換え転移ベクターを適当なバキュロウィルスＤＮＡと
組換えを行うように接触させることにより所望の遺伝子
物質をバキュロウィルスゲノム中に組入れる。組換えを
達成する好ましい手段は、公知のトランスフェクション
の方法である。トランスフェクションの方法は、１００
％のウィルス中においては起こらないので得られる結果
は非組換え体及び組換え体の混合物である。宿主昆虫細
胞内で選ばれた遺伝子を発現する能力を有する組換えバ
キュロウィルス発現ベクターは、その後、この組換え及
び非組換えバキュロウィルスの混合物から適当なスクリ
ーニング或いは遺伝子選択技術により選択される。発現
ベクターを選択する１つの手段は、ポリヘドリン遺伝子
の挿入不活化により感染細胞の核内にウィルスの封入体
（occlusion ）を欠くウィルスを同定及び単離すること
により行われる。
組換え転移ベクターを適当なバキュロウィルスＤＮＡと
組換えを行うように接触させることにより所望の遺伝子
物質をバキュロウィルスゲノム中に組入れる。組換えを
達成する好ましい手段は、公知のトランスフェクション
の方法である。トランスフェクションの方法は、１００
％のウィルス中においては起こらないので得られる結果
は非組換え体及び組換え体の混合物である。宿主昆虫細
胞内で選ばれた遺伝子を発現する能力を有する組換えバ
キュロウィルス発現ベクターは、その後、この組換え及
び非組換えバキュロウィルスの混合物から適当なスクリ
ーニング或いは遺伝子選択技術により選択される。発現
ベクターを選択する１つの手段は、ポリヘドリン遺伝子
の挿入不活化により感染細胞の核内にウィルスの封入体
（occlusion ）を欠くウィルスを同定及び単離すること
により行われる。
【００２１】本発明は又上記方法により製造された組換
えバキュロウィルス発現ベクターに向けられたものであ
る。その様な発現ベクターは、ウィルスゲノムに連結さ
れ、その中で安定である少なくとも１つの選ばれた遺伝
子或いはその部分を含有する感染性バキュロウィルスを
含んでなるものである。昆虫細胞或いは昆虫内における
発現ベクターの複製に際して、選ばれた遺伝子はバキュ
ロウィルスの転写信号の制御下、或いはそれ自身のプロ
モーターの制御下のいずれかにおいて発現され得る。バ
キュロウィルス発現ベクターの１例として、β‐インタ
ーフェロンに対する遺伝子をポリヘドリンプロモーター
の転写制御下にあるような位置にＡｃＭＮＰＶゲノム中
に挿入して含有する組換えＡｃＭＮＰＶウィルスがあ
る。潜在的には、任意のバキュロウィルスプロモーター
及び昆虫細胞系統を使用することができる。
えバキュロウィルス発現ベクターに向けられたものであ
る。その様な発現ベクターは、ウィルスゲノムに連結さ
れ、その中で安定である少なくとも１つの選ばれた遺伝
子或いはその部分を含有する感染性バキュロウィルスを
含んでなるものである。昆虫細胞或いは昆虫内における
発現ベクターの複製に際して、選ばれた遺伝子はバキュ
ロウィルスの転写信号の制御下、或いはそれ自身のプロ
モーターの制御下のいずれかにおいて発現され得る。バ
キュロウィルス発現ベクターの１例として、β‐インタ
ーフェロンに対する遺伝子をポリヘドリンプロモーター
の転写制御下にあるような位置にＡｃＭＮＰＶゲノム中
に挿入して含有する組換えＡｃＭＮＰＶウィルスがあ
る。潜在的には、任意のバキュロウィルスプロモーター
及び昆虫細胞系統を使用することができる。
【００２２】本発明は更に上記方法により生成された転
移ベクターに向けられたものである。少なくともポリヘ
ドリンプロモーター配列と、選ばれた遺伝子或いはその
一部の挿入のために利用可能なクローニング部位とを、
選ばれた遺伝子がポリヘドリンプロモーターの転写制御
下にあるように含んでなる好ましいポリヘドリン転移ベ
クターをバキュロウィルスの遺伝子操作のための中間ヴ
ィークルとして使用する。このポリヘドリン転移ベクタ
ーはポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮＡの配列を全
く含まなくても或いはその全て或いは一部を含んでもよ
い。本発明は更に上記方法で製造された組換え転移ベク
ターに向けられるものである。ポリヘドリンプロモータ
ーとカップリングされた選ばれた遺伝子或いはその一部
を含んでなる本発明の好ましい転移ベクターは、所望の
遺伝情報をバキュロウィルスゲノム中に組込むためのヴ
ィークルとして使用される。
移ベクターに向けられたものである。少なくともポリヘ
ドリンプロモーター配列と、選ばれた遺伝子或いはその
一部の挿入のために利用可能なクローニング部位とを、
選ばれた遺伝子がポリヘドリンプロモーターの転写制御
下にあるように含んでなる好ましいポリヘドリン転移ベ
クターをバキュロウィルスの遺伝子操作のための中間ヴ
ィークルとして使用する。このポリヘドリン転移ベクタ
ーはポリヘドリン蛋白質をコードするＤＮＡの配列を全
く含まなくても或いはその全て或いは一部を含んでもよ
い。本発明は更に上記方法で製造された組換え転移ベク
ターに向けられるものである。ポリヘドリンプロモータ
ーとカップリングされた選ばれた遺伝子或いはその一部
を含んでなる本発明の好ましい転移ベクターは、所望の
遺伝情報をバキュロウィルスゲノム中に組込むためのヴ
ィークルとして使用される。
【００２３】本発明は、選ばれた遺伝子の真核生物宿主
昆虫細胞内における発現を促進するために宿主‐ベクタ
ー系においてバキュロウィルスプロモーターを使用する
ことに基づいている。特に、ポリヘドリン蛋白質は、ウ
ィルス感染真核生物宿主細胞内において最も豊富に合成
される蛋白質の１つであるので、好ましい方法は選ばれ
た遺伝子がポリヘドリンプロモーターとカップリングさ
れるようにこの選ばれた遺伝子の適当なバキュロウィル
スゲノム中への組込みを含むものである。その様な組換
えバキュロウィルスは、選ばれた遺伝子生成物の合成の
ための有効な機構を提供するものである。従って、本発
明は、宿主昆虫細胞から合成され且つ効率的に分泌され
る極めて高いレベルの目的遺伝子生成物、例えばβ‐イ
ンターフェロン、として有意義な有用性を有するもので
ある。本発明の実施に際して使用されるバキュロウィル
スはオートグラファ・カリフォルニカ（ＡｃＭＮＰＶ）
である。このバキュロウィルスは下記の如く特徴付けら
れる。その自然の感染性形態において、ＡｃＭＮＰＶは
通常ウィルス封入体（occlusion ）中に見出される。こ
れらのウィルス封入体は、通常、ポリヘドリン蛋白質サ
ブユニットの構造配列を含むパラ結晶蛋白質マトリック
ス内に包埋された数個のウィルス粒子を含有する。封入
体は適当な宿主昆虫により摂取され、それが腸の内腔に
到達するとアルカリ性状態が封入体の解離を引起こし、
ウィルスを放出する。ウィルスは腸壁の細胞を侵し、そ
れらの細胞の核に移動し、複製を行う。これらの細胞内
において２つの感染形態、即ち細胞外すなわち非封入ウ
ィルス形態、及び封入ウィルスがこれらの細胞において
生成される。細胞外ウィルスは細胞の表面から芽を出
し、その他の細胞を感染する。感染後約１２時間後に細
胞外ウィルス発芽における減少、ポリヘドリン合成の開
始及び封入ウィルス粒子の増大した産生が生ずる。極め
て多量の封入体が感染細胞及び組織中に産生され、最終
的に昆虫を溶解する。このウィルスの封入形態はその他
の昆虫への感染の広がりの原因となるものである。
昆虫細胞内における発現を促進するために宿主‐ベクタ
ー系においてバキュロウィルスプロモーターを使用する
ことに基づいている。特に、ポリヘドリン蛋白質は、ウ
ィルス感染真核生物宿主細胞内において最も豊富に合成
される蛋白質の１つであるので、好ましい方法は選ばれ
た遺伝子がポリヘドリンプロモーターとカップリングさ
れるようにこの選ばれた遺伝子の適当なバキュロウィル
スゲノム中への組込みを含むものである。その様な組換
えバキュロウィルスは、選ばれた遺伝子生成物の合成の
ための有効な機構を提供するものである。従って、本発
明は、宿主昆虫細胞から合成され且つ効率的に分泌され
る極めて高いレベルの目的遺伝子生成物、例えばβ‐イ
ンターフェロン、として有意義な有用性を有するもので
ある。本発明の実施に際して使用されるバキュロウィル
スはオートグラファ・カリフォルニカ（ＡｃＭＮＰＶ）
である。このバキュロウィルスは下記の如く特徴付けら
れる。その自然の感染性形態において、ＡｃＭＮＰＶは
通常ウィルス封入体（occlusion ）中に見出される。こ
れらのウィルス封入体は、通常、ポリヘドリン蛋白質サ
ブユニットの構造配列を含むパラ結晶蛋白質マトリック
ス内に包埋された数個のウィルス粒子を含有する。封入
体は適当な宿主昆虫により摂取され、それが腸の内腔に
到達するとアルカリ性状態が封入体の解離を引起こし、
ウィルスを放出する。ウィルスは腸壁の細胞を侵し、そ
れらの細胞の核に移動し、複製を行う。これらの細胞内
において２つの感染形態、即ち細胞外すなわち非封入ウ
ィルス形態、及び封入ウィルスがこれらの細胞において
生成される。細胞外ウィルスは細胞の表面から芽を出
し、その他の細胞を感染する。感染後約１２時間後に細
胞外ウィルス発芽における減少、ポリヘドリン合成の開
始及び封入ウィルス粒子の増大した産生が生ずる。極め
て多量の封入体が感染細胞及び組織中に産生され、最終
的に昆虫を溶解する。このウィルスの封入形態はその他
の昆虫への感染の広がりの原因となるものである。
【００２４】細胞培養培地内において容易に培養するこ
とのできる細胞外ウィルスが本発明の例示方法において
使用される。細胞外ウィルス及び封入ウィルスは同一の
ゲノムを有するが異った表現型特性を示す。これらの封
入体の主たる構造成分であるポリヘドリンはほぼ２９，
０００の分子量の蛋白質である。ＡｃＭＮＰＶゲノムの
特性付けは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンの遺伝子は、Ｄ
ＮＡ制限地図の０ポイントから約４０００塩基対下流の
ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片における約１２００の塩基対の隣接
ＤＮＡ配列まで認められることを示している（G.E. Smi
th、J.M. Vlak 及びM.D. Summers、45 J. Virol. 215-2
25 (1983) 参照）。全ＡｃＭＮＰＶゲノムの地図（遺伝
子地図）はJ.M. Vlak及びG.E. Smith、4 J. Virol. 111
8-1121 (1982)に示されており、ポリヘドリン遺伝子の
ＤＮＡ配列はHooft van Iddekinge 、G.E. Smith及びM.
D. Summers、131 Virology 561-565 (1983) に示されて
いる。
とのできる細胞外ウィルスが本発明の例示方法において
使用される。細胞外ウィルス及び封入ウィルスは同一の
ゲノムを有するが異った表現型特性を示す。これらの封
入体の主たる構造成分であるポリヘドリンはほぼ２９，
０００の分子量の蛋白質である。ＡｃＭＮＰＶゲノムの
特性付けは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンの遺伝子は、Ｄ
ＮＡ制限地図の０ポイントから約４０００塩基対下流の
ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片における約１２００の塩基対の隣接
ＤＮＡ配列まで認められることを示している（G.E. Smi
th、J.M. Vlak 及びM.D. Summers、45 J. Virol. 215-2
25 (1983) 参照）。全ＡｃＭＮＰＶゲノムの地図（遺伝
子地図）はJ.M. Vlak及びG.E. Smith、4 J. Virol. 111
8-1121 (1982)に示されており、ポリヘドリン遺伝子の
ＤＮＡ配列はHooft van Iddekinge 、G.E. Smith及びM.
D. Summers、131 Virology 561-565 (1983) に示されて
いる。
【００２５】ポリヘドリン蛋白質の構造及び機能はそれ
が公知の最も高度に発現された真核生物遺伝子の１つで
あるので、相当に興味深いものである。ＡｃＭＮＰＶで
感染されたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera f
rugiperda ）細胞において、ポリヘドリンはそれが感染
細胞中の全蛋白質の５０％以上を形成し、感染細胞リッ
トル当り０．２ｇを越えるポリヘドリン蛋白質が生成さ
れるような高割合に蓄積される。この遺伝子は次の理由
により又興味深いものである：(1) ＡｃＭＮＰＶのポリ
ヘドリン遺伝子はバキュロウィルス中に高度に保存され
ているＤＮＡ配列を含有すること、(2) ゲノムのこの領
域において密接に関連した株間の組換えが高い頻度で起
こり、組換え子孫におけるポリヘドリン遺伝子の分離及
び発現を可能にする、及び(3) 遺伝子の発現が宿主、組
織、及び細胞系統依存性であること、である。
が公知の最も高度に発現された真核生物遺伝子の１つで
あるので、相当に興味深いものである。ＡｃＭＮＰＶで
感染されたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera f
rugiperda ）細胞において、ポリヘドリンはそれが感染
細胞中の全蛋白質の５０％以上を形成し、感染細胞リッ
トル当り０．２ｇを越えるポリヘドリン蛋白質が生成さ
れるような高割合に蓄積される。この遺伝子は次の理由
により又興味深いものである：(1) ＡｃＭＮＰＶのポリ
ヘドリン遺伝子はバキュロウィルス中に高度に保存され
ているＤＮＡ配列を含有すること、(2) ゲノムのこの領
域において密接に関連した株間の組換えが高い頻度で起
こり、組換え子孫におけるポリヘドリン遺伝子の分離及
び発現を可能にする、及び(3) 遺伝子の発現が宿主、組
織、及び細胞系統依存性であること、である。
【００２６】遺伝子工学者の観点からは、ポリヘドリン
遺伝子はウィルスがそれなしでも細胞培養液中で複製が
可能なので不必要である。この遺伝子の発現の高い割合
及びそれがウィルス複製に必須ではないという事実のた
めに、ポリヘドリンプロモーター及びＡｃＭＮＰＶの遺
伝子を組換え遺伝子の発現のための系の一部として使用
することの可能性が相当な考察の源泉となっていた（E.
B. Carstens 、S.T. Tjia 及びW. Doerfler 、99 Virol
ogy 386-398 (1979)；P. Dobos及びM.A. Cochran、103
Virology 446-464 (1980) ；H.A. Wood 、102 Virology
21-27 (1980)；J.E. Maruniak 及びM.D. Summers、109
Virology 25-34 (1981) ；L.K. Miller 、"A Virus Ve
ctor for Genetic Engineering in Invertebrates"
〔N.J. Panopoulos 編Genetic Engineerring in the Pl
ant Science （New York、PraegerPublishers、1981 p
p. 203〜224 ）中に掲載〕、及びL.K. Miller 等219 Sc
ience 715-721 (1983)；G.E. Smith、M.J. Fraser 及び
M.D. Summers、J. Virol、584-593 (1983)参照）。しか
しながら、本発明の前にはだれもその様な系を開発する
ことができなかった。
遺伝子はウィルスがそれなしでも細胞培養液中で複製が
可能なので不必要である。この遺伝子の発現の高い割合
及びそれがウィルス複製に必須ではないという事実のた
めに、ポリヘドリンプロモーター及びＡｃＭＮＰＶの遺
伝子を組換え遺伝子の発現のための系の一部として使用
することの可能性が相当な考察の源泉となっていた（E.
B. Carstens 、S.T. Tjia 及びW. Doerfler 、99 Virol
ogy 386-398 (1979)；P. Dobos及びM.A. Cochran、103
Virology 446-464 (1980) ；H.A. Wood 、102 Virology
21-27 (1980)；J.E. Maruniak 及びM.D. Summers、109
Virology 25-34 (1981) ；L.K. Miller 、"A Virus Ve
ctor for Genetic Engineering in Invertebrates"
〔N.J. Panopoulos 編Genetic Engineerring in the Pl
ant Science （New York、PraegerPublishers、1981 p
p. 203〜224 ）中に掲載〕、及びL.K. Miller 等219 Sc
ience 715-721 (1983)；G.E. Smith、M.J. Fraser 及び
M.D. Summers、J. Virol、584-593 (1983)参照）。しか
しながら、本発明の前にはだれもその様な系を開発する
ことができなかった。
【００２７】本出願人等による実験は、もう１つの遺伝
子生成物、１０Ｋも又ポリヘドリンに匹敵する高レベル
で発現されることを示している（G.E. Smith、J.M. Vla
k 及びM.D. Summers、45 J.Virol 215-225 (1983）参
照）。この生成される１０Ｋ蛋白質は非構造的のようで
あり、感染の後期において多量に産生される。１０ＫＡ
ｃＭＮＰＶ蛋白質遺伝子の位置はＨｉｎｄ III断片Ｐ及
びＱに認められている。ポリヘドリンプロモーター及び
構造遺伝子と同様にこのプロモーターは、組換え遺伝子
の発現のためのＡｃＭＮＰＶを使用する系の一部として
のその有利な用途としての考察の対象であった。しかし
ながら、本発明までにこのプロモーターのその様な有利
な用途を可能にするような系は開発されていなかった。
本発明の例示方法に従えば、ＡｃＭＮＰＶの特別の株、
Ｍ３或いはＥ２が利用される。しかしながら、当業者に
は、その他のバキュロウィルス及びその他のバキュロウ
ィルス株が組換えバキュロウィルス転移及び発現ベクタ
ーの製造に適当であることが明らかであろう。特に、密
接に関連し、天然に存在するバキュロウィルス株トリコ
プルシア・ニ（Tricho-plusia ni）ＭＮＰＶ、ラキプル
シア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、ガレリア・メ
ロネラ（Galleria mellonella ）ＭＮＰＶ及び任意のプ
ラーク精製株、例えば本実験室において特性付けられ、
G.E. Smith及びM.D. Summers， 30 J. Virol. 828-838
(1979)及びG.E. Smith及びM.D. Summers, 33 J. Virol.
311-319 (1980) により説明されているＡｃＭＮＰＶの
Ｅ２、Ｒ９、Ｓ１及びＳ３株などを有利に使用すること
ができる。これら及びその他の株についての説明は、更
にG.E. Smith及びM.D. Summers, 89 Virology 517-527
(1978)に記載されている。
子生成物、１０Ｋも又ポリヘドリンに匹敵する高レベル
で発現されることを示している（G.E. Smith、J.M. Vla
k 及びM.D. Summers、45 J.Virol 215-225 (1983）参
照）。この生成される１０Ｋ蛋白質は非構造的のようで
あり、感染の後期において多量に産生される。１０ＫＡ
ｃＭＮＰＶ蛋白質遺伝子の位置はＨｉｎｄ III断片Ｐ及
びＱに認められている。ポリヘドリンプロモーター及び
構造遺伝子と同様にこのプロモーターは、組換え遺伝子
の発現のためのＡｃＭＮＰＶを使用する系の一部として
のその有利な用途としての考察の対象であった。しかし
ながら、本発明までにこのプロモーターのその様な有利
な用途を可能にするような系は開発されていなかった。
本発明の例示方法に従えば、ＡｃＭＮＰＶの特別の株、
Ｍ３或いはＥ２が利用される。しかしながら、当業者に
は、その他のバキュロウィルス及びその他のバキュロウ
ィルス株が組換えバキュロウィルス転移及び発現ベクタ
ーの製造に適当であることが明らかであろう。特に、密
接に関連し、天然に存在するバキュロウィルス株トリコ
プルシア・ニ（Tricho-plusia ni）ＭＮＰＶ、ラキプル
シア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、ガレリア・メ
ロネラ（Galleria mellonella ）ＭＮＰＶ及び任意のプ
ラーク精製株、例えば本実験室において特性付けられ、
G.E. Smith及びM.D. Summers， 30 J. Virol. 828-838
(1979)及びG.E. Smith及びM.D. Summers, 33 J. Virol.
311-319 (1980) により説明されているＡｃＭＮＰＶの
Ｅ２、Ｒ９、Ｓ１及びＳ３株などを有利に使用すること
ができる。これら及びその他の株についての説明は、更
にG.E. Smith及びM.D. Summers, 89 Virology 517-527
(1978)に記載されている。
【００２８】本発明の方法に従えば、有利に利用される
のはポリヘドリン構造遺伝子及びプロモーターである。
この遺伝子はＳ１ヌクレアーゼ実験により認められてい
る。ポリヘドリンコード領域の５′末端のヌクレオチド
配列及び転写開始から２００塩基上流が図３に示されて
いる。図３に示された部位は、ポリヘドリンｍＲＮＡに
対して最も頻繁に使用される転写開始部位である。ＡＴ
Ｇ翻訳開始信号（Ａ残基割当て位置＋１を有する）は転
写開始部位からほぼ５８塩基目に起こり、その後引続き
内部オープン読取りが２５５におけるＨｉｎｄ IIIの部
位まで及びこれを含んで行われる。多くの真核生物構造
遺伝子において同様の位置に見られる「ＴＡＴＡ」及び
「ＣＡＡＴ」ボックスはそれぞれ転写開始部位から上流
の２５及び３５番目の塩基間及び６０及び７０番目の塩
基間の間に位置している。転写開始部位から７８塩基上
流及び９０塩基上流の中心には直接繰返し配列「ＣＡＣ
ＡＡＡＣＴ」がある。更にＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺
伝子は翻訳開始コドンに先立ち５８塩基の非翻訳リーダ
ー配列を有し、且つＡｃＭＮＰＶポリヘドリンｍＲＮＡ
についての適当な実験操作により示唆される如く、何等
の介在配列も存在しない。上記Smith 、Vlak及びSummer
s の文献、及びG.F. Rohrman等、121 Virology 51-60
(1982) 参照。
のはポリヘドリン構造遺伝子及びプロモーターである。
この遺伝子はＳ１ヌクレアーゼ実験により認められてい
る。ポリヘドリンコード領域の５′末端のヌクレオチド
配列及び転写開始から２００塩基上流が図３に示されて
いる。図３に示された部位は、ポリヘドリンｍＲＮＡに
対して最も頻繁に使用される転写開始部位である。ＡＴ
Ｇ翻訳開始信号（Ａ残基割当て位置＋１を有する）は転
写開始部位からほぼ５８塩基目に起こり、その後引続き
内部オープン読取りが２５５におけるＨｉｎｄ IIIの部
位まで及びこれを含んで行われる。多くの真核生物構造
遺伝子において同様の位置に見られる「ＴＡＴＡ」及び
「ＣＡＡＴ」ボックスはそれぞれ転写開始部位から上流
の２５及び３５番目の塩基間及び６０及び７０番目の塩
基間の間に位置している。転写開始部位から７８塩基上
流及び９０塩基上流の中心には直接繰返し配列「ＣＡＣ
ＡＡＡＣＴ」がある。更にＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺
伝子は翻訳開始コドンに先立ち５８塩基の非翻訳リーダ
ー配列を有し、且つＡｃＭＮＰＶポリヘドリンｍＲＮＡ
についての適当な実験操作により示唆される如く、何等
の介在配列も存在しない。上記Smith 、Vlak及びSummer
s の文献、及びG.F. Rohrman等、121 Virology 51-60
(1982) 参照。
【００２９】本発明の実施に当り、ポリヘドリン遺伝子
を有するＤＮＡをバキュロウィルスＡｃＭＮＰＶから単
離し、精製する。当業者には、この遺伝子はポリヘドリ
ン遺伝子を有する任意のバキュロウィルス、特に上記関
連性のある株から単離され得ることが判るであろう。所
望のＤＮＡを次いで適当な制限操作によりＥｃｏＲＩ制
限エンドヌクレアーゼで消化し、ポリヘドリン遺伝子を
含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片或いはその他
の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片はそ
の後適当なクローニングヴィークルのＥｃｏＲＩ部位に
クローン化し、転移ベクターを生成する。ＡｃＭＮＰゲ
ノムは、選ばれた遺伝子を効果的に部位‐特異的に導入
することができる知られた独特の制限部位を有していな
いのでキメラプラスミドベクター（転移ベクター）を構
成して遺伝子転移のための中間ヴィークルとしての役割
を果す必要がある。従って、選ばれた遺伝子をポリヘド
リンプロモーター配列に隣接するウィルスゲノム中に導
入するために、ポリヘドリン遺伝子を含んでなり、ポリ
ヘドリン転移ベクターと称される転移ベクターが構成さ
れ、クローニング部位は、その部位に適当に挿入される
遺伝子がポリヘドリンプロモーターの制御下にあるよう
に配置され、隣接ウィルスＤＮＡはポリヘドリン遺伝子
のいずれかの側に連結されている。この転移ベクターの
構成を図１及び図２に概略的に示す。更に隣接ウィルス
ＤＮＡの存在が、野性タイプのバキュロウィルスとの組
換えを容易にし、選ばれた遺伝子の複製ウィルスゲノム
中への転移を可能にしていることに注意すべきである。
従って、上記ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片は、それぞれプラスミ
ドｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８中にクローン化及びサブク
ローン化される。ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片中の２つのＢａｍ
ＨＩ制限部位は、その後、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開
始部位からほぼ２２０塩基のポリヘドリンプロモーター
配列から下流の３′方向に位置する単一ＢａｍＨＩクロ
ーニング部位を有するｐＡｃ１０１と称されるポリヘド
リン転移ベクターを産生するように除去される（図３参
照）。プラスミドｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８はポリヘド
リン転移ベクターの構成に利用されるプラスミドである
が、ポリヘドリン遺伝子及び隣接ウィルスＤＮＡが機能
的に導入される限り、その他の適当なクローニングヴィ
ークルが利用可能であることは当業者には明らかであろ
う。
を有するＤＮＡをバキュロウィルスＡｃＭＮＰＶから単
離し、精製する。当業者には、この遺伝子はポリヘドリ
ン遺伝子を有する任意のバキュロウィルス、特に上記関
連性のある株から単離され得ることが判るであろう。所
望のＤＮＡを次いで適当な制限操作によりＥｃｏＲＩ制
限エンドヌクレアーゼで消化し、ポリヘドリン遺伝子を
含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片或いはその他
の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片はそ
の後適当なクローニングヴィークルのＥｃｏＲＩ部位に
クローン化し、転移ベクターを生成する。ＡｃＭＮＰゲ
ノムは、選ばれた遺伝子を効果的に部位‐特異的に導入
することができる知られた独特の制限部位を有していな
いのでキメラプラスミドベクター（転移ベクター）を構
成して遺伝子転移のための中間ヴィークルとしての役割
を果す必要がある。従って、選ばれた遺伝子をポリヘド
リンプロモーター配列に隣接するウィルスゲノム中に導
入するために、ポリヘドリン遺伝子を含んでなり、ポリ
ヘドリン転移ベクターと称される転移ベクターが構成さ
れ、クローニング部位は、その部位に適当に挿入される
遺伝子がポリヘドリンプロモーターの制御下にあるよう
に配置され、隣接ウィルスＤＮＡはポリヘドリン遺伝子
のいずれかの側に連結されている。この転移ベクターの
構成を図１及び図２に概略的に示す。更に隣接ウィルス
ＤＮＡの存在が、野性タイプのバキュロウィルスとの組
換えを容易にし、選ばれた遺伝子の複製ウィルスゲノム
中への転移を可能にしていることに注意すべきである。
従って、上記ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片は、それぞれプラスミ
ドｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８中にクローン化及びサブク
ローン化される。ＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片中の２つのＢａｍ
ＨＩ制限部位は、その後、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開
始部位からほぼ２２０塩基のポリヘドリンプロモーター
配列から下流の３′方向に位置する単一ＢａｍＨＩクロ
ーニング部位を有するｐＡｃ１０１と称されるポリヘド
リン転移ベクターを産生するように除去される（図３参
照）。プラスミドｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８はポリヘド
リン転移ベクターの構成に利用されるプラスミドである
が、ポリヘドリン遺伝子及び隣接ウィルスＤＮＡが機能
的に導入される限り、その他の適当なクローニングヴィ
ークルが利用可能であることは当業者には明らかであろ
う。
【００３０】このポリヘドリン転移ベクターは、その後
選ばれた遺伝子を挿入するために、転写開始部位の近
辺、即ちポリヘドリン遺伝子の約−５８〜末端までのポ
リヘドリン合成をコードする配列の幾つか或いは全てを
欠失することにより変成することができる（図３参
照）。ＢａｍＨＩ制限部位配列を有する天然或いは合成
オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡリンカーを次いで欠失
部位に挿入し、ＤＮＡセグメントのカップリングをその
制限部位において行う。転移ベクターの変成は図２に概
略的に示されており、ポリヘドリンコード配列を欠失す
る手段はin vitroの突然変異誘発によるものである。し
かしながら、当業者にはポリヘドリンコード配列の一部
或いは全部を欠失するために代替的な操作方法が利用可
能であり、欠失部位に代替的合成又は天然のオリゴヌク
レオチドリンカー配列を挿入することが可能であり、及
び選ばれた遺伝子及びその一部が組込まれる代替的変成
ポリヘドリン転移ベクターを本発明において適当に利用
できることが明らかであろう。
選ばれた遺伝子を挿入するために、転写開始部位の近
辺、即ちポリヘドリン遺伝子の約−５８〜末端までのポ
リヘドリン合成をコードする配列の幾つか或いは全てを
欠失することにより変成することができる（図３参
照）。ＢａｍＨＩ制限部位配列を有する天然或いは合成
オリゴヌクレオチドを含むＤＮＡリンカーを次いで欠失
部位に挿入し、ＤＮＡセグメントのカップリングをその
制限部位において行う。転移ベクターの変成は図２に概
略的に示されており、ポリヘドリンコード配列を欠失す
る手段はin vitroの突然変異誘発によるものである。し
かしながら、当業者にはポリヘドリンコード配列の一部
或いは全部を欠失するために代替的な操作方法が利用可
能であり、欠失部位に代替的合成又は天然のオリゴヌク
レオチドリンカー配列を挿入することが可能であり、及
び選ばれた遺伝子及びその一部が組込まれる代替的変成
ポリヘドリン転移ベクターを本発明において適当に利用
できることが明らかであろう。
【００３１】本発明の標準的クローニング技術に従え
ば、選ばれた遺伝子、例えばヒトβ‐インターフェロン
合成をコードするＩＦＮ‐β遺伝子、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ合成をコードするＣＡ
Ｔ遺伝子、及びヒトインターロイキン‐２合成をコード
するＩＬ２遺伝子をその後ポリヘドリン転移ベクターの
利用可能な制限部位に挿入し、組換え転移ベクターを生
成する。β‐インターフェロン遺伝子の転移ベクターｐ
Ａｃ３８０中への挿入は図４に概略的に示されている。
更に、ＩＦＮ‐β、ＣＡＴ及びインターロイキン‐２は
ポリヘドリン転移ベクターにクローニングし、ポリヘド
リンプロモーター配列とカップリングさせるための遺伝
子の具体例であるが、本発明或いはその上記代替的形態
においては、潜在的に任意の選ばれた遺伝子が利用可能
であることが認識されるであろう。組換え転移ベクター
の遺伝子であるポリヘドリン‐選択遺伝子ハイブリッド
はその後適当なバキュロウィルス、例えばバキュロウィ
ルスＡｃＭＮＰＶ、のゲノム中に転移され、宿主昆虫細
胞内においてβインターフェロンをコードする遺伝子を
発現する能力を有する組換えウィルス発現ベクターを生
成する。ハイブリッド遺伝子の転移は例えばスポドプテ
ラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）などの宿
主昆虫細胞内のトランスフェクションの方法により達成
される（J.P.Burand 等、101 Virology 286-290 (1980)
参照）。組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐
βを利用するこの方法は図５に概略的に図示されてい
る。トランスフェクション後のＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡの
複製の際に、ハイブリッド遺伝子は組換えベクターとＡ
ｃＭＮＰＶ ＤＮＡ間の組換えによりＡｃＭＮＰＶ Ｄ
ＮＡに転移される。従って非組換え及び組換えバキュロ
ウィルスを含んだ混合物が生成され、その内後者がＩＦ
Ｎ‐β遺伝子を発現する能力を有するものである。トラ
ンスフェクションがハイブリッド遺伝子をバキュロウィ
ルスゲノム中に転移するための好ましい方法であるが、
当業者にはその他の方法もハイブリッド遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノム中に挿入するために適当であることが
理解されるであろう。更に、ハイブリッド遺伝子の配列
と他の株の対応する配列間に組換えを行わせるに十分な
相同性が存在する限りにおいて、組換えは切換え転移ベ
クターとその他のバキュロウィルス株との間に達成する
こともできる。例えば、その様な組換えは上記株、トリ
コプルシア・ニ（Trichoplusia ni ）ＭＮＰＶ、ラキプ
ルシア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、及びガレリ
ア・メロネラ（Galleriamellonella ）ＭＮＰＶ並びに
ＡｃＭＮＰＶ株Ｅ２、Ｒ９、Ｓ１及びＳ３のいずれから
単離された遺伝子との間に生じ得る。又、組換えは相同
的配列を含有しないと思われるゲノムの領域においても
生じ得ることが可能である。これについての機構は理解
されていない。
ば、選ばれた遺伝子、例えばヒトβ‐インターフェロン
合成をコードするＩＦＮ‐β遺伝子、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ合成をコードするＣＡ
Ｔ遺伝子、及びヒトインターロイキン‐２合成をコード
するＩＬ２遺伝子をその後ポリヘドリン転移ベクターの
利用可能な制限部位に挿入し、組換え転移ベクターを生
成する。β‐インターフェロン遺伝子の転移ベクターｐ
Ａｃ３８０中への挿入は図４に概略的に示されている。
更に、ＩＦＮ‐β、ＣＡＴ及びインターロイキン‐２は
ポリヘドリン転移ベクターにクローニングし、ポリヘド
リンプロモーター配列とカップリングさせるための遺伝
子の具体例であるが、本発明或いはその上記代替的形態
においては、潜在的に任意の選ばれた遺伝子が利用可能
であることが認識されるであろう。組換え転移ベクター
の遺伝子であるポリヘドリン‐選択遺伝子ハイブリッド
はその後適当なバキュロウィルス、例えばバキュロウィ
ルスＡｃＭＮＰＶ、のゲノム中に転移され、宿主昆虫細
胞内においてβインターフェロンをコードする遺伝子を
発現する能力を有する組換えウィルス発現ベクターを生
成する。ハイブリッド遺伝子の転移は例えばスポドプテ
ラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）などの宿
主昆虫細胞内のトランスフェクションの方法により達成
される（J.P.Burand 等、101 Virology 286-290 (1980)
参照）。組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐
βを利用するこの方法は図５に概略的に図示されてい
る。トランスフェクション後のＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡの
複製の際に、ハイブリッド遺伝子は組換えベクターとＡ
ｃＭＮＰＶ ＤＮＡ間の組換えによりＡｃＭＮＰＶ Ｄ
ＮＡに転移される。従って非組換え及び組換えバキュロ
ウィルスを含んだ混合物が生成され、その内後者がＩＦ
Ｎ‐β遺伝子を発現する能力を有するものである。トラ
ンスフェクションがハイブリッド遺伝子をバキュロウィ
ルスゲノム中に転移するための好ましい方法であるが、
当業者にはその他の方法もハイブリッド遺伝子をバキュ
ロウィルスゲノム中に挿入するために適当であることが
理解されるであろう。更に、ハイブリッド遺伝子の配列
と他の株の対応する配列間に組換えを行わせるに十分な
相同性が存在する限りにおいて、組換えは切換え転移ベ
クターとその他のバキュロウィルス株との間に達成する
こともできる。例えば、その様な組換えは上記株、トリ
コプルシア・ニ（Trichoplusia ni ）ＭＮＰＶ、ラキプ
ルシア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、及びガレリ
ア・メロネラ（Galleriamellonella ）ＭＮＰＶ並びに
ＡｃＭＮＰＶ株Ｅ２、Ｒ９、Ｓ１及びＳ３のいずれから
単離された遺伝子との間に生じ得る。又、組換えは相同
的配列を含有しないと思われるゲノムの領域においても
生じ得ることが可能である。これについての機構は理解
されていない。
【００３２】ＡｃＭＮＰＶゲノム中に導入された遺伝子
であるポリヘドリン‐選ばれた遺伝子ハイブリッドを含
む組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは、その後非組換え
及び組換えバキュロウィルスの混合物から選択される。
選択の１つの手段は、ウィルス封入体を産生しないウィ
ルス（Ｏ- と称される）で感染された宿主昆虫細胞によ
り形成されたプラークについてスクリーニングを行うこ
とである。組換えウィルスはポリヘドリン遺伝子の挿入
不活性化によりウィルス封入体の産生について欠陥を有
しているために、この様にして選択が容易に行われる。
トランスフェクションを行わされた細胞からの子孫ウィ
ルスから産生されたウィルスプラークのうち平均０．５
％が仮想的な組換えＯ- ウィルスからのものであろう。
従って、Ｏ- プラーク‐形成組換えウィルスからのＤＮ
Ａをその後精製し、及び適当な制限酵素で分析して組換
えＡｃＭＮＰＶベクターが選ばれた遺伝子を適当なＥｃ
ｏＲＩ‐Ｉ位置に挿入していることを確認する。上記選
択方法は、組換えバキュロウィルス‐選ばれた遺伝子発
現ベクターの選択のための有効且つ便利な手段を提供す
るが、しかし、本発明に従えば、その他の選択操作も又
利用可能であることが当業者には明らかであろう。真核
生物細胞内の外来ＤＮＡのin situ 検出のための比較的
便利な方法（即ち、標識化ＤＮＡプローブを感染された
動物細胞内に産生されたプラーク中に存在するウィルス
ＤＮＡにハイブリッド化する方法）はVillarreal及びBe
rg、196 Science 183-186(1977)、及びHeyday等、15 Ge
ne 53-65 (1981)に記載されている。
であるポリヘドリン‐選ばれた遺伝子ハイブリッドを含
む組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは、その後非組換え
及び組換えバキュロウィルスの混合物から選択される。
選択の１つの手段は、ウィルス封入体を産生しないウィ
ルス（Ｏ- と称される）で感染された宿主昆虫細胞によ
り形成されたプラークについてスクリーニングを行うこ
とである。組換えウィルスはポリヘドリン遺伝子の挿入
不活性化によりウィルス封入体の産生について欠陥を有
しているために、この様にして選択が容易に行われる。
トランスフェクションを行わされた細胞からの子孫ウィ
ルスから産生されたウィルスプラークのうち平均０．５
％が仮想的な組換えＯ- ウィルスからのものであろう。
従って、Ｏ- プラーク‐形成組換えウィルスからのＤＮ
Ａをその後精製し、及び適当な制限酵素で分析して組換
えＡｃＭＮＰＶベクターが選ばれた遺伝子を適当なＥｃ
ｏＲＩ‐Ｉ位置に挿入していることを確認する。上記選
択方法は、組換えバキュロウィルス‐選ばれた遺伝子発
現ベクターの選択のための有効且つ便利な手段を提供す
るが、しかし、本発明に従えば、その他の選択操作も又
利用可能であることが当業者には明らかであろう。真核
生物細胞内の外来ＤＮＡのin situ 検出のための比較的
便利な方法（即ち、標識化ＤＮＡプローブを感染された
動物細胞内に産生されたプラーク中に存在するウィルス
ＤＮＡにハイブリッド化する方法）はVillarreal及びBe
rg、196 Science 183-186(1977)、及びHeyday等、15 Ge
ne 53-65 (1981)に記載されている。
【００３３】選ばれた遺伝子の発現は、感染しやすい宿
主昆虫細胞、例えばスポドプテラ・フラギペルダ（Spod
optera frugiperda ）などを適当な生育培地中において
組換えバキュロウィルス‐選ばれた遺伝子発現ベクター
で感染させることにより達成される。ＡｃＭＮＰＶ発現
ベクターは感染性ウィルス粒子の複製及び組立てにより
昆虫細胞或いは昆虫内において増殖させる。これらの感
染性ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用して適当な昆虫細
胞中に選ばれた遺伝子を生成することが出来、この様に
して選ばれたＤＮＡ配列の感染細胞内における効率的な
発現が容易に行われる。感染時に、選ばれた遺伝子のＤ
ＮＡ配列に相補的であるＡｃＭＮＰＶ発現ベクター‐特
異性ｍＲＮＡが生成される。このベクター‐特異性ｍＲ
ＮＡは通常感染細胞内で翻訳されて選ばれた遺伝子によ
り完全に或いは部分的にコードされる蛋白質を生成し、
及び場合により選ばれた遺伝子生成物はグリコシル化、
分泌、ホスホリル化或いはその他の後‐翻訳変成などの
工程に付される。組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターによ
り生成された遺伝子生成物が選ばれた蛋白質のみのアミ
ノ酸配列よりなり、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンのアミノ
末端から得られた１個以上の追加のアミノ酸残基を含有
するハイブリッド蛋白質であるかどうか、或いは選ばれ
た蛋白質及びハイブリッド蛋白質の両生成物が生成され
るか否かは、ポリヘドリン転移ベクターが変成される方
法に応じて異る。選ばれた遺伝子に由来する単一の翻訳
開始信号（ＡＴＧ）のみがハイブリッド遺伝子配列中に
存在し、且つ選ばれた遺伝子が約−７５〜＋１位間のハ
イブリッド遺伝子配列内に存在するならば、選ばれた蛋
白質のみ、例えばβ‐インターフェロン、が生成される
（図３参照）。これに対して、選ばれた遺伝子が、ポリ
ヘドリンプロモーターに２つの翻訳開始部位即ち＋１位
におけるポリヘドリンＡＴＧ信号及び＋３とポリヘドリ
ンコード配列の末端の間の選ばれた遺伝子ＡＴＧ信号が
あるようにポリヘドリンプロモーターに融合される場合
には、ハイブリッド蛋白質及び選ばれた蛋白質の両者が
生成される可能性がある。しかしながら、生成される各
蛋白質の割合は第２のＡＴＧ信号の位置及び選ばれた遺
伝子の配列の性質に応じて異る。或いは又、遺伝子がそ
れ自身のＡＴＧ開始信号なしにポリヘドリンプロモータ
ーに融合される場合には、合成ＡＴＧ或いはポリヘドリ
ンＡＴＧ翻訳開始信号が蛋白質コード配列に選ばれた遺
伝子に対する正しい翻訳読み取り枠を維持するように融
合されることが要求される。生成される蛋白質生成物
は、ここでも又上記要因に依存する。
主昆虫細胞、例えばスポドプテラ・フラギペルダ（Spod
optera frugiperda ）などを適当な生育培地中において
組換えバキュロウィルス‐選ばれた遺伝子発現ベクター
で感染させることにより達成される。ＡｃＭＮＰＶ発現
ベクターは感染性ウィルス粒子の複製及び組立てにより
昆虫細胞或いは昆虫内において増殖させる。これらの感
染性ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用して適当な昆虫細
胞中に選ばれた遺伝子を生成することが出来、この様に
して選ばれたＤＮＡ配列の感染細胞内における効率的な
発現が容易に行われる。感染時に、選ばれた遺伝子のＤ
ＮＡ配列に相補的であるＡｃＭＮＰＶ発現ベクター‐特
異性ｍＲＮＡが生成される。このベクター‐特異性ｍＲ
ＮＡは通常感染細胞内で翻訳されて選ばれた遺伝子によ
り完全に或いは部分的にコードされる蛋白質を生成し、
及び場合により選ばれた遺伝子生成物はグリコシル化、
分泌、ホスホリル化或いはその他の後‐翻訳変成などの
工程に付される。組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターによ
り生成された遺伝子生成物が選ばれた蛋白質のみのアミ
ノ酸配列よりなり、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンのアミノ
末端から得られた１個以上の追加のアミノ酸残基を含有
するハイブリッド蛋白質であるかどうか、或いは選ばれ
た蛋白質及びハイブリッド蛋白質の両生成物が生成され
るか否かは、ポリヘドリン転移ベクターが変成される方
法に応じて異る。選ばれた遺伝子に由来する単一の翻訳
開始信号（ＡＴＧ）のみがハイブリッド遺伝子配列中に
存在し、且つ選ばれた遺伝子が約−７５〜＋１位間のハ
イブリッド遺伝子配列内に存在するならば、選ばれた蛋
白質のみ、例えばβ‐インターフェロン、が生成される
（図３参照）。これに対して、選ばれた遺伝子が、ポリ
ヘドリンプロモーターに２つの翻訳開始部位即ち＋１位
におけるポリヘドリンＡＴＧ信号及び＋３とポリヘドリ
ンコード配列の末端の間の選ばれた遺伝子ＡＴＧ信号が
あるようにポリヘドリンプロモーターに融合される場合
には、ハイブリッド蛋白質及び選ばれた蛋白質の両者が
生成される可能性がある。しかしながら、生成される各
蛋白質の割合は第２のＡＴＧ信号の位置及び選ばれた遺
伝子の配列の性質に応じて異る。或いは又、遺伝子がそ
れ自身のＡＴＧ開始信号なしにポリヘドリンプロモータ
ーに融合される場合には、合成ＡＴＧ或いはポリヘドリ
ンＡＴＧ翻訳開始信号が蛋白質コード配列に選ばれた遺
伝子に対する正しい翻訳読み取り枠を維持するように融
合されることが要求される。生成される蛋白質生成物
は、ここでも又上記要因に依存する。
【００３４】転移ベクター及び組換え発現ベクターの寄
託 組換えバキュロウィルス発現ベクターＡｃ３８０‐ＩＦ
Ｎ‐βはＡＴＣＣ（American Type Culture Collectio
n、Maryland州、Rockville ）に１９８３年５月１３日
に寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ ４００７１を与えられ
た。Ｅ．ｃｏｌｉＫ‐１２中の変成ポリヘドリン転移ベ
クターｐＡｃ３８０プラスミド及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ‐
１２中の組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β
はＡＲＣＣ（Agricutural Research Culture Collectio
n 、Illinois州Peoria）に１９８３年５月１３日に寄託
し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５４２８及びＮＲＲＬ
Ｂ−１５４２７にそれぞれ与えられた。変成ポリヘドリ
ン転移ベクターｐＡｃ３７３はＡＲＣＣに１９８４年５
月７日に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５７７８を
与えられた。
託 組換えバキュロウィルス発現ベクターＡｃ３８０‐ＩＦ
Ｎ‐βはＡＴＣＣ（American Type Culture Collectio
n、Maryland州、Rockville ）に１９８３年５月１３日
に寄託し、寄託番号ＡＴＣＣ ４００７１を与えられ
た。Ｅ．ｃｏｌｉＫ‐１２中の変成ポリヘドリン転移ベ
クターｐＡｃ３８０プラスミド及びＥ．ｃｏｌｉ Ｋ‐
１２中の組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β
はＡＲＣＣ（Agricutural Research Culture Collectio
n 、Illinois州Peoria）に１９８３年５月１３日に寄託
し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５４２８及びＮＲＲＬ
Ｂ−１５４２７にそれぞれ与えられた。変成ポリヘドリ
ン転移ベクターｐＡｃ３７３はＡＲＣＣに１９８４年５
月７日に寄託し、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５７７８を
与えられた。
【００３５】出発材料及び方法 プラスミドＤＮＡ 以下の具体例で使用されたプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ中
のｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８であり、Maryland州Gaithe
rsburgのBethesda Research Labs. から得られたもので
あった。ウィルスＤＮＡ 具体例において、ウィルスＤＮＡの出発源として使用さ
れたＡｃＭＮＰＶ、Ｍ３株、並びにＡｃＭＮＰＶ、Ｅ２
株及び野性タイプ、は本実験室においてG.E. Smith、及
びM.D. Summers、89 Virology 517-520 (1978)およびG.
E. Smith及びM.D. Summers、39 J. Virol 125-137 (198
1)に記載される手法に従って、単離されたものであっ
た。ＩＦＮ‐β ＤＮＡ 具体例において使用されたＩＦＮ‐β遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は西ドイツ、Braunschweig Stockhein、Gesellsc
haft fur Biotechnologische Forschung（ＧＢＦ）のJo
hn Callins博士から得られたプラスミドｐＢＲ１３より
単離されたものであった。ＣＡＴ ＤＮＡ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Maryland州、Be
thesde国立癌研究所のBernard Moss及びMark Cochran両
博士より得られたプラスミドｐＢＲ３２８より単離され
たものであった。ＩＬ２ ＤＮＡ ヒトインターロイキン‐２（ＩＬ２）をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片は、New Jersey州、Nutley、Ho
ffman LaRoche Research Center のGrace Ju及びPeter
Lomedico両博士より得られたプラスミドｐＩＬ２‐２Ｂ
から単離されたものであった。細菌細胞 ｐＵＣ８プラスミドのクローニングのために具体例によ
り使用されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３はMaryland州、Ga
ithersburg、のBethesda Research Labs. から得られた
ものであった。ｐＢＲ３２５プラスミドのクローニング
のために具体例で使用されたＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１はTe
xas 州、Houston 、Baylor College of Medicine、のSa
vio Woo 博士から得られたものであった。酵素 以下の制限エンドヌクレアーゼはMaryland州、Gaithers
burg、Bethesda Research Laboratoriesから得られ、供
給者の推薦事項に従って使用された：ＥｃｏＲＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥII、
ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄ III。以下の酵素も
又Bethesda Research Laboratoriesから得られたもので
あった：仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ）、ＤＮＡリガーゼ、Ｂａ１３１エキソヌクレアー
ゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ。
のｐＢＲ３２５及びｐＵＣ８であり、Maryland州Gaithe
rsburgのBethesda Research Labs. から得られたもので
あった。ウィルスＤＮＡ 具体例において、ウィルスＤＮＡの出発源として使用さ
れたＡｃＭＮＰＶ、Ｍ３株、並びにＡｃＭＮＰＶ、Ｅ２
株及び野性タイプ、は本実験室においてG.E. Smith、及
びM.D. Summers、89 Virology 517-520 (1978)およびG.
E. Smith及びM.D. Summers、39 J. Virol 125-137 (198
1)に記載される手法に従って、単離されたものであっ
た。ＩＦＮ‐β ＤＮＡ 具体例において使用されたＩＦＮ‐β遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は西ドイツ、Braunschweig Stockhein、Gesellsc
haft fur Biotechnologische Forschung（ＧＢＦ）のJo
hn Callins博士から得られたプラスミドｐＢＲ１３より
単離されたものであった。ＣＡＴ ＤＮＡ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、Maryland州、Be
thesde国立癌研究所のBernard Moss及びMark Cochran両
博士より得られたプラスミドｐＢＲ３２８より単離され
たものであった。ＩＬ２ ＤＮＡ ヒトインターロイキン‐２（ＩＬ２）をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片は、New Jersey州、Nutley、Ho
ffman LaRoche Research Center のGrace Ju及びPeter
Lomedico両博士より得られたプラスミドｐＩＬ２‐２Ｂ
から単離されたものであった。細菌細胞 ｐＵＣ８プラスミドのクローニングのために具体例によ
り使用されたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３はMaryland州、Ga
ithersburg、のBethesda Research Labs. から得られた
ものであった。ｐＢＲ３２５プラスミドのクローニング
のために具体例で使用されたＥ．ｃｏｌｉ ＲＲ１はTe
xas 州、Houston 、Baylor College of Medicine、のSa
vio Woo 博士から得られたものであった。酵素 以下の制限エンドヌクレアーゼはMaryland州、Gaithers
burg、Bethesda Research Laboratoriesから得られ、供
給者の推薦事項に従って使用された：ＥｃｏＲＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥII、
ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄ III。以下の酵素も
又Bethesda Research Laboratoriesから得られたもので
あった：仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ）、ＤＮＡリガーゼ、Ｂａ１３１エキソヌクレアー
ゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ。
【００３６】方法 具体例において示されたクローニング操作に従って用い
られた標準的方法は、T.Maniatis，E.F.Fritsch 及びJ.
Sambrook、Molecular Cloning ：A LaboratoryManual
、Cold Spring Harbor Laboratories ，１９８２年に
記載されている。この参考文献は次の標準的方法の操作
を含むものである：Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドを用いるク
ローニング操作、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換、プラス
ミドＤＮＡ精製、ＤＮＡのフェノール抽出、ＤＮＡのエ
タノール沈澱、アガロースゲル電気泳動、アガロースゲ
ルからのＤＮＡ断片の精製、及び制限エンドヌクレアー
ゼ及びその他のＤＮＡ‐変成酵素反応。全ての場合にお
いて、ＤＮＡはフェノール抽出の後エタノール沈澱を行
って精製された。具体例において使用されたウィルスス
トックは、ＴＮＭ‐ＦＨ培地（W.F.Hink226 Nature(Lon
don)466-467(1970)参照）＋１０％ウシ胎児血清を用い
てスポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda)
細胞（ＩＰＬＢ‐Ｓｆ２１‐ＡＥ）中において調製さ
れ、滴定した。ウィルス及び細胞の培養方法はL.E.Volk
man及びM.D.Summers 19 J.Virol.820-832（1975年）、
及びL.E.Volkman 、M.D.Summers 及びC.H.Hsieh 19 J.V
irol.820-832（1976年）に説明されている。ウィルス生
長速度論はＳ．フルギペルダ及び１．５％アガロース重
層を用いて上記Valkman 等の方法により決定した。
られた標準的方法は、T.Maniatis，E.F.Fritsch 及びJ.
Sambrook、Molecular Cloning ：A LaboratoryManual
、Cold Spring Harbor Laboratories ，１９８２年に
記載されている。この参考文献は次の標準的方法の操作
を含むものである：Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドを用いるク
ローニング操作、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換、プラス
ミドＤＮＡ精製、ＤＮＡのフェノール抽出、ＤＮＡのエ
タノール沈澱、アガロースゲル電気泳動、アガロースゲ
ルからのＤＮＡ断片の精製、及び制限エンドヌクレアー
ゼ及びその他のＤＮＡ‐変成酵素反応。全ての場合にお
いて、ＤＮＡはフェノール抽出の後エタノール沈澱を行
って精製された。具体例において使用されたウィルスス
トックは、ＴＮＭ‐ＦＨ培地（W.F.Hink226 Nature(Lon
don)466-467(1970)参照）＋１０％ウシ胎児血清を用い
てスポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda)
細胞（ＩＰＬＢ‐Ｓｆ２１‐ＡＥ）中において調製さ
れ、滴定した。ウィルス及び細胞の培養方法はL.E.Volk
man及びM.D.Summers 19 J.Virol.820-832（1975年）、
及びL.E.Volkman 、M.D.Summers 及びC.H.Hsieh 19 J.V
irol.820-832（1976年）に説明されている。ウィルス生
長速度論はＳ．フルギペルダ及び１．５％アガロース重
層を用いて上記Valkman 等の方法により決定した。
【００３７】例 Ｉ ポリヘドリン転移ベクターの構成 本発明によるポリヘドリン転移ベクターを構成するため
に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子を含むＤＮＡ断片
をプラスミドｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化
した。これは、Ｍ３（G.E.Smith 及びM.D.Summers ，89
Virology 517-527(1978))と称されるＡｃＭＮＰＶのプ
ラーク‐精製株をウィルスＤＮＡ源として使用すること
により達成された。ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは上記参考文
献においてスミス（Smith)及びサマーズ（Summers)によ
り説明されているように、ウィルスから抽出し、塩化セ
シウム密度勾配における平衡遠心分離により精製した。
ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡはＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼにより完全に消化した。得られたＡｃＭＮＰＶ Ｅ
ｃｏＲＩ‐Ｉ断片を先ずｐＢＲ３２５中にクローン化し
てｐＩ１０を形成し、次いで標準的クローニング操作法
を用いてｐＵＣ８中にサブクローン化してｐＩ８を形成
した（図１参照）。この組換えプラスミドｐＩ８は３個
のＢａｍＨＩ認識部位を有する（図１参照）：１つは位
置４２１０におけるポリヘドリン遺伝子中に、１つは７
３００におけるｐＵＣ８において、及び１つは位置６１
６０におけるＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片におけるものである。
６１６０及び７３００における部位は、所望の遺伝子、
例えばＣＡＴ、ＩＬ２或いはＩＦＮ‐β遺伝子、がポリ
ヘドリンプロモーターに隣接した所望の位置（位置４２
１０）におけるｐＩ８中に便利にクローン化されるよう
にｐＩ８から除去される。ポリヘドリン遺伝子中に位置
していない約７３００におけるｐＩ８中のｐＵＣ８ Ｂ
ａｍＨＩ制限部位は次のようにして除去された：１０μ
ｇのｐＩ８をＰｓｔＩ及びＳｍａＩで消化し、このＤＮ
Ａを精製し、Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液（０．０３Ｍ酢酸
ナトリウム、ｐＨ４．４、０．２５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．００４５Ｍ ＺｎＣｌ２）プラス５００単位のＳ１
ヌクレアーゼ／ｍｌ中に再懸濁させた。この反応混合物
を３７℃において１５分間インキュベート後、ＤＮＡを
０．８％アガロースゲル中において電気泳動させた。高
分子量線状ＤＮＡをゲルから精製し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ８３細胞をアンピシリン耐性（ａｍｒ）、ガラクトシ
ダーゼ陰性（ｇａｌ- ）に形質転換するために使用し
た。ｐＵＣ８クローニング領域において、ＰｓｔＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳｍａＩ、及びＥｃｏＲＩ部位を有しないプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをｐＩ８ＳＰＳと
した（図１参照）。ＡｃＭＮＰＶ ＥｃｏＲＩ‐Ｉ（ｐ
Ｉ８ＳＰＳの一部）中の位置６１６０におけるＢａｍＨ
Ｉ（G.E.Smith ，J.M.Vlak及びM.D.Summers ，J.Virol.
45：215-225)を次のようにして除去した。即ち、１０μ
ｇのｐＩ８ＳＰＳを１０単位のＢａｍＨＩと５０μｇの
緩衝液中で混合し、３７℃でインキュベートした。３、
６、１２、２０及び３０分後に１０μｌずつのアリコー
トを取り、反応は１０ｍＭまでＥＤＴＡを添加すること
により停止させた。これらのアリコートをプールし、
０．７％アガロース中において電気泳動を行った。ゲル
から全長の線状ＤＮＡを単離し、上記Ｓ１ヌクレアーゼ
で処理し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環化させ
た。ＪＭ８３細胞はａｍｒ，ｇａｌ- に形質転換させ、
組換えプラスミドは位置６１６０にＢａｍＨＩ制限部位
が欠けるものと同定された。このプラスミドはポリヘド
リン遺伝子の翻訳開始部位から＋１７５塩基の位置４２
１０に単一のＢａｍＨＩクローニング部位を有し（図３
参照）、従って、「親」ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝
子転移ベクターであるｐＡｃ１０１と命名された（図１
参照）。
に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子を含むＤＮＡ断片
をプラスミドｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化
した。これは、Ｍ３（G.E.Smith 及びM.D.Summers ，89
Virology 517-527(1978))と称されるＡｃＭＮＰＶのプ
ラーク‐精製株をウィルスＤＮＡ源として使用すること
により達成された。ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡは上記参考文
献においてスミス（Smith)及びサマーズ（Summers)によ
り説明されているように、ウィルスから抽出し、塩化セ
シウム密度勾配における平衡遠心分離により精製した。
ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡはＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼにより完全に消化した。得られたＡｃＭＮＰＶ Ｅ
ｃｏＲＩ‐Ｉ断片を先ずｐＢＲ３２５中にクローン化し
てｐＩ１０を形成し、次いで標準的クローニング操作法
を用いてｐＵＣ８中にサブクローン化してｐＩ８を形成
した（図１参照）。この組換えプラスミドｐＩ８は３個
のＢａｍＨＩ認識部位を有する（図１参照）：１つは位
置４２１０におけるポリヘドリン遺伝子中に、１つは７
３００におけるｐＵＣ８において、及び１つは位置６１
６０におけるＥｃｏＲＩ‐Ｉ断片におけるものである。
６１６０及び７３００における部位は、所望の遺伝子、
例えばＣＡＴ、ＩＬ２或いはＩＦＮ‐β遺伝子、がポリ
ヘドリンプロモーターに隣接した所望の位置（位置４２
１０）におけるｐＩ８中に便利にクローン化されるよう
にｐＩ８から除去される。ポリヘドリン遺伝子中に位置
していない約７３００におけるｐＩ８中のｐＵＣ８ Ｂ
ａｍＨＩ制限部位は次のようにして除去された：１０μ
ｇのｐＩ８をＰｓｔＩ及びＳｍａＩで消化し、このＤＮ
Ａを精製し、Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液（０．０３Ｍ酢酸
ナトリウム、ｐＨ４．４、０．２５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．００４５Ｍ ＺｎＣｌ２）プラス５００単位のＳ１
ヌクレアーゼ／ｍｌ中に再懸濁させた。この反応混合物
を３７℃において１５分間インキュベート後、ＤＮＡを
０．８％アガロースゲル中において電気泳動させた。高
分子量線状ＤＮＡをゲルから精製し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ８３細胞をアンピシリン耐性（ａｍｒ）、ガラクトシ
ダーゼ陰性（ｇａｌ- ）に形質転換するために使用し
た。ｐＵＣ８クローニング領域において、ＰｓｔＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳｍａＩ、及びＥｃｏＲＩ部位を有しないプ
ラスミドを単離した。このプラスミドをｐＩ８ＳＰＳと
した（図１参照）。ＡｃＭＮＰＶ ＥｃｏＲＩ‐Ｉ（ｐ
Ｉ８ＳＰＳの一部）中の位置６１６０におけるＢａｍＨ
Ｉ（G.E.Smith ，J.M.Vlak及びM.D.Summers ，J.Virol.
45：215-225)を次のようにして除去した。即ち、１０μ
ｇのｐＩ８ＳＰＳを１０単位のＢａｍＨＩと５０μｇの
緩衝液中で混合し、３７℃でインキュベートした。３、
６、１２、２０及び３０分後に１０μｌずつのアリコー
トを取り、反応は１０ｍＭまでＥＤＴＡを添加すること
により停止させた。これらのアリコートをプールし、
０．７％アガロース中において電気泳動を行った。ゲル
から全長の線状ＤＮＡを単離し、上記Ｓ１ヌクレアーゼ
で処理し、次いでＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環化させ
た。ＪＭ８３細胞はａｍｒ，ｇａｌ- に形質転換させ、
組換えプラスミドは位置６１６０にＢａｍＨＩ制限部位
が欠けるものと同定された。このプラスミドはポリヘド
リン遺伝子の翻訳開始部位から＋１７５塩基の位置４２
１０に単一のＢａｍＨＩクローニング部位を有し（図３
参照）、従って、「親」ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝
子転移ベクターであるｐＡｃ１０１と命名された（図１
参照）。
【００３８】例 II 転移ベクターの変成 選ばれた遺伝子の挿入のためのポリヘドリン遺伝子にお
ける適当な位置を決定するためにｐＡｃ１０１の他に多
くの転移ベクターを構成した（図２参照）。これらの転
移ベクターはポリヘドリンの８６アミノ‐末端残基及び
５′非‐翻訳ポリヘドリンｍＲＮＡ配列をコードする幾
つか或いは全てのＤＮＡ配列を除去し、次いで以下の方
法により削除の部位にＢａｍＨＩ認識部位を有するオリ
ゴヌクレオチド合成ＤＮＡリンカーを挿入することによ
り構成した。例Ｉと同様にしてｐＩ１０からのＥｃｏＲ
Ｉ乃至ＢａｍＨＩ断片（０〜４２１０）をｐＵＣ８中に
サブクローン化し、得られたプラスミドをｐＢ′と命名
した（図２参照）。この断片は＋１７５までのポリヘド
リン遺伝子及びポリヘドリン遺伝子に加えて４０００塩
基対のＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ配列を含有する。４２１０
位におけるＢａｍＨＩ部位の周りの欠失を次のようにし
てｐＢ′中に導入した（図２）：４０μｇのｐＢ′をＢ
ａｍＨＩで消化し、ＤＮＡを精製し、０．７％アガロー
スゲル上で電気泳動を行った。線状ＤＮＡ断片をゲルか
ら抽出し、０．５単位のＢａｌ３１エキソヌクレアーゼ
を有する１００μｌの緩衝液中において３０℃で４０分
間インキュベートした。１０μｌずつのアリコートを
１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５及び
４０分間隔で集め、反応は各アリコートに１０μｌの
０．２５Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより停止させ
た。これらのアリコートを集め、ＤＮＡを精製した。Ｄ
ＮＡの末端は４単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Klenow断片）を用いて１００μｌの緩衝液中におい
て２３℃で３０分間インキュベートさせて修復した。Ｄ
ＮＡを精製し、１μｇのホスホリル化ＢａｍＨＩリンカ
ー（５′‐ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ‐３′）を１００μｌ反
応混合物中に２０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に添
加した。室温で２時間インキュベーション後、ＤＮＡを
精製した。次いで、ＤＮＡペレットを１００μｌの緩衝
液＋２０単位のＢａｍＨＩ中に再懸濁させ、３７℃で４
時間消化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロース中で
電気泳動を行い、ゲルから８００塩基対欠失までのｐ
Ｂ′截頭プラスミドを精製した。ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて環化させ、ＪＭ８３細胞をａｍｒ、ｇ
ａｌ- に形質転換するために使用した。得られたクロー
ンはＢａｍＨＩ認識部位の位置に応じてｐＢ′Ｂａｌ
１、２、３などと称される突然変異プラスミドの「ライ
ブラリー（LIBRARY)」を構成した。数個のｐＢ′Ｂａｌ
欠失突然変異プラスミドを選択し、各々からのＸｈｏＩ
（１９００）からＢａｍＨＩリンカー（４０００〜４２
１０位）までの断片をアガロースゲルから精製した（断
片Ａ）（図２）。ＸｈｏＩ（１９００）からＢａｍＨＩ
（４２１０）までの断片をｐＡｃ１０１から除去し、残
存配列をアガロースゲルから精製した（断片Ｂ）（図
２）。断片Ａの各々約０．１μｇを０．１μｇの断片Ｂ
と混合し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを有する２０
μｌの緩衝液中においてインキュベートさせて連結し、
次いでＪＭ８３細胞をａｍｒ、ｇａｌ-に形質転換する
ために使用した。得られたプラスミドは、変成転移ベク
ターであり、例えばｐＢ′Ｂａｌ１１に由来する場合に
はｐＡｃ３１１、ｐＢ′Ｂａｌ６０に由来する場合には
ｐＡｃ３６０などのように命名した。この様にして、
「変成」転移ベクターを構成し、代表的なものはポリヘ
ドリン遺伝子における＋１７５〜−１００位におけるＢ
ａｍＨＩクローニング部位を有するものであった。４つ
の変成転移ベクター、ｐＡｃ３８０、ｐＡｃ３７３、ｐ
Ａｃ３１１及びｐＡｃ３６０におけるＢａｍＨＩ認識部
位の位置並びに親転移ベクターｐＡｃ１０１におけるそ
の位置は図３に示されている。
ける適当な位置を決定するためにｐＡｃ１０１の他に多
くの転移ベクターを構成した（図２参照）。これらの転
移ベクターはポリヘドリンの８６アミノ‐末端残基及び
５′非‐翻訳ポリヘドリンｍＲＮＡ配列をコードする幾
つか或いは全てのＤＮＡ配列を除去し、次いで以下の方
法により削除の部位にＢａｍＨＩ認識部位を有するオリ
ゴヌクレオチド合成ＤＮＡリンカーを挿入することによ
り構成した。例Ｉと同様にしてｐＩ１０からのＥｃｏＲ
Ｉ乃至ＢａｍＨＩ断片（０〜４２１０）をｐＵＣ８中に
サブクローン化し、得られたプラスミドをｐＢ′と命名
した（図２参照）。この断片は＋１７５までのポリヘド
リン遺伝子及びポリヘドリン遺伝子に加えて４０００塩
基対のＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ配列を含有する。４２１０
位におけるＢａｍＨＩ部位の周りの欠失を次のようにし
てｐＢ′中に導入した（図２）：４０μｇのｐＢ′をＢ
ａｍＨＩで消化し、ＤＮＡを精製し、０．７％アガロー
スゲル上で電気泳動を行った。線状ＤＮＡ断片をゲルか
ら抽出し、０．５単位のＢａｌ３１エキソヌクレアーゼ
を有する１００μｌの緩衝液中において３０℃で４０分
間インキュベートした。１０μｌずつのアリコートを
１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５及び
４０分間隔で集め、反応は各アリコートに１０μｌの
０．２５Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより停止させ
た。これらのアリコートを集め、ＤＮＡを精製した。Ｄ
ＮＡの末端は４単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Klenow断片）を用いて１００μｌの緩衝液中におい
て２３℃で３０分間インキュベートさせて修復した。Ｄ
ＮＡを精製し、１μｇのホスホリル化ＢａｍＨＩリンカ
ー（５′‐ｐＣＧＧＡＴＣＣＧ‐３′）を１００μｌ反
応混合物中に２０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと共に添
加した。室温で２時間インキュベーション後、ＤＮＡを
精製した。次いで、ＤＮＡペレットを１００μｌの緩衝
液＋２０単位のＢａｍＨＩ中に再懸濁させ、３７℃で４
時間消化させた。消化ＤＮＡを０．７％アガロース中で
電気泳動を行い、ゲルから８００塩基対欠失までのｐ
Ｂ′截頭プラスミドを精製した。ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて環化させ、ＪＭ８３細胞をａｍｒ、ｇ
ａｌ- に形質転換するために使用した。得られたクロー
ンはＢａｍＨＩ認識部位の位置に応じてｐＢ′Ｂａｌ
１、２、３などと称される突然変異プラスミドの「ライ
ブラリー（LIBRARY)」を構成した。数個のｐＢ′Ｂａｌ
欠失突然変異プラスミドを選択し、各々からのＸｈｏＩ
（１９００）からＢａｍＨＩリンカー（４０００〜４２
１０位）までの断片をアガロースゲルから精製した（断
片Ａ）（図２）。ＸｈｏＩ（１９００）からＢａｍＨＩ
（４２１０）までの断片をｐＡｃ１０１から除去し、残
存配列をアガロースゲルから精製した（断片Ｂ）（図
２）。断片Ａの各々約０．１μｇを０．１μｇの断片Ｂ
と混合し、１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを有する２０
μｌの緩衝液中においてインキュベートさせて連結し、
次いでＪＭ８３細胞をａｍｒ、ｇａｌ-に形質転換する
ために使用した。得られたプラスミドは、変成転移ベク
ターであり、例えばｐＢ′Ｂａｌ１１に由来する場合に
はｐＡｃ３１１、ｐＢ′Ｂａｌ６０に由来する場合には
ｐＡｃ３６０などのように命名した。この様にして、
「変成」転移ベクターを構成し、代表的なものはポリヘ
ドリン遺伝子における＋１７５〜−１００位におけるＢ
ａｍＨＩクローニング部位を有するものであった。４つ
の変成転移ベクター、ｐＡｃ３８０、ｐＡｃ３７３、ｐ
Ａｃ３１１及びｐＡｃ３６０におけるＢａｍＨＩ認識部
位の位置並びに親転移ベクターｐＡｃ１０１におけるそ
の位置は図３に示されている。
【００３９】例 III ポリヘドリン‐ＩＦＮ‐β遺伝子を含む組換え転移ベク
ターの構成 例Ｉ或いは例IIの方法に従って調製された転移ベクター
は、いずれも、利用される特別の変成転移ベクターに応
じて目的遺伝子が各種の位置においてポリヘドリン遺伝
子に結合されている組換え転移ベクターの構成に利用す
ることができる。ヒトβ‐インターフェロン合成をコー
ドするＩＦＮ‐β遺伝子の上記文献に示される標準的ク
ローニング技術を用いて変成転移ベクターの１つ、ｐＡ
ｃ３８０中への単一ＢａｍＨＩクローニング部位におけ
る挿入によりｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βと称されるプラ
スミドを形成する方法が図４に概略的に示されている。
ＩＦＮ‐β遺伝子は、ヒトＩＦＮ‐β（ｐＢＲ１３と称
される、H.Hauser等参照、297 Nature (London) 650-65
4(1982）及びG.Gross 等、9 Nucleic Acids Res ．2495
-2507(1981))のゲノムクローンから得られ、且つＩＦＮ
‐βに対する全蛋白質コード配列、ＡＴＧ翻訳開始信号
前の３個の追加塩基及びポリアデニル化に対する信号を
含む全ての非‐翻訳３′配列を含有する０．７６７キロ
ベースＨｉｎｃII断片として特徴付けられる。ＩＦＮ‐
βに対するヌクレオチド配列及び各種転写及び翻訳信号
の位置はR.Derynck 等285 Nature (London) 542-547(19
80）；G.Gross 等、9 Nucl.Acids Res．2495-2507(198
1）；及びS.Ohno及びT.Taniguchi ，78 Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 3505-3509(1981）などに記載されている。Ｉ
ＦＮ‐β遺伝子を含むＨｉｎｃII ＤＮＡ断片は、挿入
がＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターに隣接し、ポ
リヘドリン遺伝子と５′乃至３′配向であるようにＩＦ
Ｎ‐β遺伝子断片上の合成オリゴヌクレオチドリンカー
を用いてｐＡｃ３８０の利用可能なＢａｍＨＩ制限部位
に挿入される。ほぼ同様にして、ＩＦＮ‐β遺伝子をそ
の他の変成転移ベクターｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６０及
びｐＡｃ３７３及び親転移ベクターｐＡｃ１０１中にク
ローン化し、各々ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３
６０‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡ
ｃ１０１‐ＩＦＮ‐βと称される組換え転移ベクターを
形成した。潜在的には、その遺伝子或いは任意のその他
の選ばれた遺伝子は、ＢａｍＨＩ認識部位或いは転移ベ
クター内の任意の位置に挿入された任意のその他の適当
な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する任意の転移
ベクター中にクローン化することが可能である。更に、
例Ｉにおいて略述した如く、適当な制限エンドヌクレア
ーゼクローニング部位を、プラスミド中に取り込むこと
ができるＡｃＭＮＰＶゲノムの任意の断片における任意
の点において誘発することが出来るので、ＢａｍＨＩ認
識部位を挿入するためにポリヘドリン構造配列の一部又
は全部を欠失させる必要はない。
ターの構成 例Ｉ或いは例IIの方法に従って調製された転移ベクター
は、いずれも、利用される特別の変成転移ベクターに応
じて目的遺伝子が各種の位置においてポリヘドリン遺伝
子に結合されている組換え転移ベクターの構成に利用す
ることができる。ヒトβ‐インターフェロン合成をコー
ドするＩＦＮ‐β遺伝子の上記文献に示される標準的ク
ローニング技術を用いて変成転移ベクターの１つ、ｐＡ
ｃ３８０中への単一ＢａｍＨＩクローニング部位におけ
る挿入によりｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βと称されるプラ
スミドを形成する方法が図４に概略的に示されている。
ＩＦＮ‐β遺伝子は、ヒトＩＦＮ‐β（ｐＢＲ１３と称
される、H.Hauser等参照、297 Nature (London) 650-65
4(1982）及びG.Gross 等、9 Nucleic Acids Res ．2495
-2507(1981))のゲノムクローンから得られ、且つＩＦＮ
‐βに対する全蛋白質コード配列、ＡＴＧ翻訳開始信号
前の３個の追加塩基及びポリアデニル化に対する信号を
含む全ての非‐翻訳３′配列を含有する０．７６７キロ
ベースＨｉｎｃII断片として特徴付けられる。ＩＦＮ‐
βに対するヌクレオチド配列及び各種転写及び翻訳信号
の位置はR.Derynck 等285 Nature (London) 542-547(19
80）；G.Gross 等、9 Nucl.Acids Res．2495-2507(198
1）；及びS.Ohno及びT.Taniguchi ，78 Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 3505-3509(1981）などに記載されている。Ｉ
ＦＮ‐β遺伝子を含むＨｉｎｃII ＤＮＡ断片は、挿入
がＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターに隣接し、ポ
リヘドリン遺伝子と５′乃至３′配向であるようにＩＦ
Ｎ‐β遺伝子断片上の合成オリゴヌクレオチドリンカー
を用いてｐＡｃ３８０の利用可能なＢａｍＨＩ制限部位
に挿入される。ほぼ同様にして、ＩＦＮ‐β遺伝子をそ
の他の変成転移ベクターｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６０及
びｐＡｃ３７３及び親転移ベクターｐＡｃ１０１中にク
ローン化し、各々ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３
６０‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡ
ｃ１０１‐ＩＦＮ‐βと称される組換え転移ベクターを
形成した。潜在的には、その遺伝子或いは任意のその他
の選ばれた遺伝子は、ＢａｍＨＩ認識部位或いは転移ベ
クター内の任意の位置に挿入された任意のその他の適当
な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を有する任意の転移
ベクター中にクローン化することが可能である。更に、
例Ｉにおいて略述した如く、適当な制限エンドヌクレア
ーゼクローニング部位を、プラスミド中に取り込むこと
ができるＡｃＭＮＰＶゲノムの任意の断片における任意
の点において誘発することが出来るので、ＢａｍＨＩ認
識部位を挿入するためにポリヘドリン構造配列の一部又
は全部を欠失させる必要はない。
【００４０】例 IV ポリヘドリン‐ＩＦＮ‐β遺伝子のＡｃＭＮＰＶゲノム
への転移 例III の方法により調製された組換え転移ベクターは、
いずれも、ＡｃＭＮＰＶのゲノム中にＩＦＮ‐β遺伝子
を転移させるために使用して組換えバキュロウィルス発
現ベクターを形成することができる。転移はＣａ++及び
Ｓ．フルギペルダ（S.frugiperda）のような感染しやす
い昆虫宿主細胞の存在下においてトランスフェクション
（transfection）により行われた。F.L.Graham及びA.J.
Van Der Eb、52 Virology 456-467(1973）に記載されて
いる方法の修正方法を次のように利用した。ＡｃＭＮＰ
Ｖ（１μｇ）から抽出され精製されたＤＮＡを１〜１０
μｇの組換え転移ベクターＤＮＡ、特に組換え転移ベク
ターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βと混合し、ｍｌ当り１５
μｇの担体仔ウシ胸線ＤＮＡを有する１‐ＨＥＰＥＳ
（Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ′‐２‐エ
タンスルホン酸）‐緩衝塩水（ｐＨ７．０５）中で９５
０μｌにした。混合物を渦巻き混合機中で攪拌しながら
５０ｍｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を滴下し、沈澱を室温
で３０分間形成させた。１ｍｌの沈澱したＤＮＡを感染
しやすい昆虫宿主細胞、この場合にはＳ．フルギペル
ダ、に６０ｍｍ培養プレート内の２ｍｌの培地内におい
て添加した。４時間後、細胞単層を培地で洗浄し、１０
％ウシ胎児血清を含む２ｍｌの培地中において３日間イ
ンキュベートした。得られた子孫は組換え及び非組換え
ＡｃＭＮＰＶウィルスの混合物よりなるものであった。
への転移 例III の方法により調製された組換え転移ベクターは、
いずれも、ＡｃＭＮＰＶのゲノム中にＩＦＮ‐β遺伝子
を転移させるために使用して組換えバキュロウィルス発
現ベクターを形成することができる。転移はＣａ++及び
Ｓ．フルギペルダ（S.frugiperda）のような感染しやす
い昆虫宿主細胞の存在下においてトランスフェクション
（transfection）により行われた。F.L.Graham及びA.J.
Van Der Eb、52 Virology 456-467(1973）に記載されて
いる方法の修正方法を次のように利用した。ＡｃＭＮＰ
Ｖ（１μｇ）から抽出され精製されたＤＮＡを１〜１０
μｇの組換え転移ベクターＤＮＡ、特に組換え転移ベク
ターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βと混合し、ｍｌ当り１５
μｇの担体仔ウシ胸線ＤＮＡを有する１‐ＨＥＰＥＳ
（Ｎ‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ′‐２‐エ
タンスルホン酸）‐緩衝塩水（ｐＨ７．０５）中で９５
０μｌにした。混合物を渦巻き混合機中で攪拌しながら
５０ｍｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を滴下し、沈澱を室温
で３０分間形成させた。１ｍｌの沈澱したＤＮＡを感染
しやすい昆虫宿主細胞、この場合にはＳ．フルギペル
ダ、に６０ｍｍ培養プレート内の２ｍｌの培地内におい
て添加した。４時間後、細胞単層を培地で洗浄し、１０
％ウシ胎児血清を含む２ｍｌの培地中において３日間イ
ンキュベートした。得られた子孫は組換え及び非組換え
ＡｃＭＮＰＶウィルスの混合物よりなるものであった。
【００４１】例 Ｖ 組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクターの選択 次に、例IVにより得られた非組換え及び組換えバキュロ
ウィルスの混合物からＡｃＭＮＰＶ組換え発現ベクター
を単離することが必要であった。この単離がポリヘドリ
ン構造遺伝子の全て或いは一部が欠失した組換え体にお
いて達成される方法は、（１）ポリヘドリンがこれらの
ウィルスにより全く生成されない、及び（２）非‐封入
（ポリヘドリンコートに欠ける）ウィルス形態が昆虫細
胞培養液中において生育可能であり、感染性であるとい
う事実を利用するものである。ポリヘドリン構造遺伝子
の全て或いは一部が欠失した組換えＡｃＭＮＰＶウィル
スにおいて、例えば組換え転移ベクターｐＡｃ１０１‐
ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３６０
‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡｃ３
８０‐ＩＦＮ‐β、とのトランスフェクションから得ら
れた組換え体において、組換えＡｃＭＮＰＶウィルスは
下記の如くして単離される。トランスフェクション後３
日目に培地中に存在する外部細胞ウィルスを、L.E.Volk
man 、M.D.Summers 及びC.H.Hsieh 、19 J.Virol.820-8
32(1976)に記載されている標準的ＡｃＭＮＰＶポリヘド
リンプラークアッセイにおいて使用した。発達したプラ
ークは、ウィルス封入体を生成する非組換えＡｃＭＮＰ
Ｖで感染された細胞或いはウィルス封入体を生成しない
組換えＡｃＭＮＰＶウィルスで感染された細胞のいずれ
かからの結果であった。後者のタイプのプラーク（Ｏ-
プラーク）は当初低倍率双眼顕微鏡の下においてそれら
の外観により前者（Ｏ+ プラーク）と識別された。Ｏ-
プラークはマークを付し、倒立顕微鏡により検査を行っ
たところ、個々のウィルス封入体が存在する場合には感
染細胞の核内に観察することができた。Ｏ- プラークか
らのウィルスをプラーク精製し、ＤＮＡを適当な制限酵
素で分析し、組換えＡｃＭＮＰＶベクターはＥｃｏＲＩ
‐Ｉの適当な位置に外来遺伝子を挿入して有しているこ
とを確認した。ウィルスゲノムにおけるその他の変化は
何等検出されなかった。次いで感染しやすい昆虫細胞に
標準操作を用いて感染させることにより多量の目的組換
えウィルスを得た。
ウィルスの混合物からＡｃＭＮＰＶ組換え発現ベクター
を単離することが必要であった。この単離がポリヘドリ
ン構造遺伝子の全て或いは一部が欠失した組換え体にお
いて達成される方法は、（１）ポリヘドリンがこれらの
ウィルスにより全く生成されない、及び（２）非‐封入
（ポリヘドリンコートに欠ける）ウィルス形態が昆虫細
胞培養液中において生育可能であり、感染性であるとい
う事実を利用するものである。ポリヘドリン構造遺伝子
の全て或いは一部が欠失した組換えＡｃＭＮＰＶウィル
スにおいて、例えば組換え転移ベクターｐＡｃ１０１‐
ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３６０
‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡｃ３
８０‐ＩＦＮ‐β、とのトランスフェクションから得ら
れた組換え体において、組換えＡｃＭＮＰＶウィルスは
下記の如くして単離される。トランスフェクション後３
日目に培地中に存在する外部細胞ウィルスを、L.E.Volk
man 、M.D.Summers 及びC.H.Hsieh 、19 J.Virol.820-8
32(1976)に記載されている標準的ＡｃＭＮＰＶポリヘド
リンプラークアッセイにおいて使用した。発達したプラ
ークは、ウィルス封入体を生成する非組換えＡｃＭＮＰ
Ｖで感染された細胞或いはウィルス封入体を生成しない
組換えＡｃＭＮＰＶウィルスで感染された細胞のいずれ
かからの結果であった。後者のタイプのプラーク（Ｏ-
プラーク）は当初低倍率双眼顕微鏡の下においてそれら
の外観により前者（Ｏ+ プラーク）と識別された。Ｏ-
プラークはマークを付し、倒立顕微鏡により検査を行っ
たところ、個々のウィルス封入体が存在する場合には感
染細胞の核内に観察することができた。Ｏ- プラークか
らのウィルスをプラーク精製し、ＤＮＡを適当な制限酵
素で分析し、組換えＡｃＭＮＰＶベクターはＥｃｏＲＩ
‐Ｉの適当な位置に外来遺伝子を挿入して有しているこ
とを確認した。ウィルスゲノムにおけるその他の変化は
何等検出されなかった。次いで感染しやすい昆虫細胞に
標準操作を用いて感染させることにより多量の目的組換
えウィルスを得た。
【００４２】例 VI ＡｃＭＮＰＶ組換え発現ベクターを使用したβ‐インタ
ーフェロンの製造 目的遺伝子生成物を製造するためには、組換えバキュロ
ウィルスは感染しやすい宿主昆虫細胞内で感染されなけ
ればならない。組換え転移ベクターｐＡｃ１０１‐ＩＦ
Ｎ‐β、ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３６０‐Ｉ
ＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡｃ３８０
‐ＩＦＮ‐β（図５参照）を用いた組換えにより形成さ
れたＡｃＭＮＰＶ発現ベクターの具体例に対して次の操
作を利用した。感染しやすいＳ．フラギペルダの宿主細
胞を先ず懸濁培養或いは単層（単分子層）において１〜
５×１０6 細胞／ｍｌ（最適発現のための細胞濃度は各
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターに応じて異る）の密度まで生
育させた。生育培地を除去し、細胞当り０．１〜１００
（最適濃度は変り得る）のプラーク形成単位の組換えウ
ィルス例えばＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β（図５）、を含有
する培地と２３℃において約１時間変換した。この接種
物は細胞上に残されても或いは除去されて適量の新しい
培地と交換されてもよい。クローン化されたＩＦＮ‐β
遺伝子からの蛋白質はＡｃ‐３８０‐ＩＦＮ‐β発現ベ
クターで感染されたＳ．フルギペルダ細胞内において感
染後約１２時間乃至感染後３日生成された。ウィルス蛋
白質合成、ウィルス組立て及び細胞溶解を含む全感染過
程は約７２時間で完結した。感染後５０〜６０時間の間
に蛋白質合成に顕著な減少が見られ、細胞溶解は感染後
約５０時間において最初に検出された。ＩＦＮ‐β遺伝
子の発現の機構は、宿主細胞の種類及び遺伝子がポリヘ
ドリン遺伝子にクローニングされた部位に応じて異っ
た。各組換えウィルスに対するＩＦＮ‐β発現の機構を
表１にまとめて示す。各発現ベクターで感染された細胞
内に感染後４８時間までに相当なレベルのインターフェ
ロンが検出された。検討された発現ベクターの中でＡｃ
３７３‐ＩＦＮ‐β及びＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βは最も
高いインターフェロン活性の力価を生成した（表１）。
インターフェロン活性の細胞内のレベルも又測定され、
表１に示されている。感染後４８時間においてＡｃ３７
３‐ＩＦＮ‐β及びＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞の
内部には全インターフェロン活性の５％未満が留まり、
これは、ＩＦＮ‐β分泌信号が認識され、蛋白質が感染
中に培地内に効率よく放出されたことを示している。感
染後１２時間において、Ａｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びＡ
ｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞からの培地は約１０，０
００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンを有し、感染後４２
時間までにほぼ５×１０6 ＩＵ／ｍｌの最大に増大し
た。
ーフェロンの製造 目的遺伝子生成物を製造するためには、組換えバキュロ
ウィルスは感染しやすい宿主昆虫細胞内で感染されなけ
ればならない。組換え転移ベクターｐＡｃ１０１‐ＩＦ
Ｎ‐β、ｐＡｃ３１１‐ＩＦＮ‐β、ｐＡｃ３６０‐Ｉ
ＦＮ‐β、ｐＡｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びｐＡｃ３８０
‐ＩＦＮ‐β（図５参照）を用いた組換えにより形成さ
れたＡｃＭＮＰＶ発現ベクターの具体例に対して次の操
作を利用した。感染しやすいＳ．フラギペルダの宿主細
胞を先ず懸濁培養或いは単層（単分子層）において１〜
５×１０6 細胞／ｍｌ（最適発現のための細胞濃度は各
ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターに応じて異る）の密度まで生
育させた。生育培地を除去し、細胞当り０．１〜１００
（最適濃度は変り得る）のプラーク形成単位の組換えウ
ィルス例えばＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β（図５）、を含有
する培地と２３℃において約１時間変換した。この接種
物は細胞上に残されても或いは除去されて適量の新しい
培地と交換されてもよい。クローン化されたＩＦＮ‐β
遺伝子からの蛋白質はＡｃ‐３８０‐ＩＦＮ‐β発現ベ
クターで感染されたＳ．フルギペルダ細胞内において感
染後約１２時間乃至感染後３日生成された。ウィルス蛋
白質合成、ウィルス組立て及び細胞溶解を含む全感染過
程は約７２時間で完結した。感染後５０〜６０時間の間
に蛋白質合成に顕著な減少が見られ、細胞溶解は感染後
約５０時間において最初に検出された。ＩＦＮ‐β遺伝
子の発現の機構は、宿主細胞の種類及び遺伝子がポリヘ
ドリン遺伝子にクローニングされた部位に応じて異っ
た。各組換えウィルスに対するＩＦＮ‐β発現の機構を
表１にまとめて示す。各発現ベクターで感染された細胞
内に感染後４８時間までに相当なレベルのインターフェ
ロンが検出された。検討された発現ベクターの中でＡｃ
３７３‐ＩＦＮ‐β及びＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βは最も
高いインターフェロン活性の力価を生成した（表１）。
インターフェロン活性の細胞内のレベルも又測定され、
表１に示されている。感染後４８時間においてＡｃ３７
３‐ＩＦＮ‐β及びＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞の
内部には全インターフェロン活性の５％未満が留まり、
これは、ＩＦＮ‐β分泌信号が認識され、蛋白質が感染
中に培地内に効率よく放出されたことを示している。感
染後１２時間において、Ａｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びＡ
ｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞からの培地は約１０，０
００ＩＵ／ｍｌのインターフェロンを有し、感染後４２
時間までにほぼ５×１０6 ＩＵ／ｍｌの最大に増大し
た。
【００４３】表 １ 各種発現ベクターにより感染されたＳ．フルギペルダ細
胞内におけるインターフェロン発現の機構を試験した。
これらの実験の結果は下記の通りである： 細胞内部 細 胞 外 部 ウィルス 106 IU／107 106 IU／107 106 IU/l (%) 細胞数 細胞数 Ac380-IFN-β 0.98 50.7 5,070 98.1 Ac373-IFN-β 0.98 50.7 5,070 98.1 Ac360-IFN-β 0.96 20.8 2,080 95.6 Ac311-IFN-β 0.013 1.4 140 99.1 Ac101-IFN-β 0.043 0.007 0.7 14.0 AcMNPV 0 0 0 0 ＡｃＭＮＰＶ感染細胞中のポリヘドリンの合成は同様な
時間的発現パターンに従うことが知られている。Ａｃ３
６０‐ＩＦＮ‐β中に産生されるインターフェロンの量
はより少なく、Ａｃ３１１‐ＩＦＮ‐βウィルス感染細
胞中においては尚少ないが９５％を超える活性が培地中
に存在した（表１）。Ａｃ１０１‐ＩＦＮ‐β感染細胞
中には比較的低レベルのインターフェロンが検出され、
その殆んどが細胞内のものであった（表１）。組換えウ
ィルス感染細胞の力価は、ＡｃＭＮＰＶ感染細胞の典型
的なものである培地ｍｌ当り３〜８×１０8 プラーク形
成単位の最大値に到達した。この様に、ＩＦＮ‐β遺伝
子のポリヘドリン遺伝子への挿入はウィルスの複製に何
等の大きな影響を及ぼさないように思われる。これを試
験するためには、２×１０6 個のＳ．フルギペルダ細胞
を、５×１０6 ＩＵ／ｍｌまでのＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐
β感染細胞培地中に産生されたインターフェロン或いは
５×１０3 ＩＵ／ｍｌの国際標準のヒトインターフェロ
ンで１２時間処理し、その後処理細胞を１００プラーク
形成単位のＡｃＭＮＰＶ或いはＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β
で感染させた。細胞のインターフェロンへの曝露は、発
達したウィルスプラーク数に測定可能な影響は及ぼさな
かった。水疱性口内炎ウィルス感作されたヒト羊膜ＷＩ
ＳＨ細胞におけるウィルスプラーク減少アッセイを用い
てインターフェロン活性の分析を行った。ウィルス粒子
を遠心分離で除去するとＡｃＭＮＰＶ感染細胞からの培
地中には何等のインターフェロン活性も測定されなかっ
た。しかしながら、インターフェロンアッセイの際にＡ
ｃＭＮＰＶウィルス含有培地を使用すると、１０００〜
３０００国際標準単位（ＩＵ）／ｍｌのインターフェロ
ンが生成され、ＡｃＭＮＰＶヴィリオンが明らかにＷＩ
ＳＨ細胞内に内因性インターフェロンを誘発したことを
示した。多くの種類のエンベローブに封入されたウィル
スがヒト細胞においてインターフェロンの産生を誘発す
ることが知られているので、これらの結果は予想された
ものであった。この影響を避けるために、以下の全ての
試料は試験前に遠心分離にかけられた。培地中に存在す
る血清アルブミン（６ｍｇ／ｍｌ）及び仔ウシ血清（１
０％）（W.F.Hink，226 Nature (London) 466-467(197
0）参照）がＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βで感染されたＳ．
フルギペルダ細胞内におけるＩＦＮ‐βの発現に必要で
あるか否かを決定するために１つの実験を行った。感染
後８時間目に培地を０〜１０％のウシ胎児血清を含有す
るGrace の培地（非血清アルブミン、T.C.C.Grace，195
Nature (London) 788-789(1962）参照）で交換した。
各変成培地について感染後４８時間後にインターフェロ
ン活性の分析を行った。無血清の場合には、インターフ
ェロン活性に約１０倍の減少があった。０．５％の血清
の添加により１０％の血清を含有する対照例におけるの
と同一レベルの活性が産生された。Ａｃ３８０‐ＩＦＮ
‐β感染細胞中のＩＦＮ‐βの特異活性は０．５％血清
を含有するGrace の培地中に産生された際には約５×１
０6 ＩＵ／ｍｇの蛋白質であった。精製β‐インターフ
ェロンの活性を２＋１０8 ＩＵ／ｍｌと想定すると（E.
Knight,Jr.,73 Proc.Natl.Acad.U.S.A.520-523(1976)参
照）、β‐インターフェロンは培地中の全蛋白質の約１
％を表わすであろう。
胞内におけるインターフェロン発現の機構を試験した。
これらの実験の結果は下記の通りである： 細胞内部 細 胞 外 部 ウィルス 106 IU／107 106 IU／107 106 IU/l (%) 細胞数 細胞数 Ac380-IFN-β 0.98 50.7 5,070 98.1 Ac373-IFN-β 0.98 50.7 5,070 98.1 Ac360-IFN-β 0.96 20.8 2,080 95.6 Ac311-IFN-β 0.013 1.4 140 99.1 Ac101-IFN-β 0.043 0.007 0.7 14.0 AcMNPV 0 0 0 0 ＡｃＭＮＰＶ感染細胞中のポリヘドリンの合成は同様な
時間的発現パターンに従うことが知られている。Ａｃ３
６０‐ＩＦＮ‐β中に産生されるインターフェロンの量
はより少なく、Ａｃ３１１‐ＩＦＮ‐βウィルス感染細
胞中においては尚少ないが９５％を超える活性が培地中
に存在した（表１）。Ａｃ１０１‐ＩＦＮ‐β感染細胞
中には比較的低レベルのインターフェロンが検出され、
その殆んどが細胞内のものであった（表１）。組換えウ
ィルス感染細胞の力価は、ＡｃＭＮＰＶ感染細胞の典型
的なものである培地ｍｌ当り３〜８×１０8 プラーク形
成単位の最大値に到達した。この様に、ＩＦＮ‐β遺伝
子のポリヘドリン遺伝子への挿入はウィルスの複製に何
等の大きな影響を及ぼさないように思われる。これを試
験するためには、２×１０6 個のＳ．フルギペルダ細胞
を、５×１０6 ＩＵ／ｍｌまでのＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐
β感染細胞培地中に産生されたインターフェロン或いは
５×１０3 ＩＵ／ｍｌの国際標準のヒトインターフェロ
ンで１２時間処理し、その後処理細胞を１００プラーク
形成単位のＡｃＭＮＰＶ或いはＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β
で感染させた。細胞のインターフェロンへの曝露は、発
達したウィルスプラーク数に測定可能な影響は及ぼさな
かった。水疱性口内炎ウィルス感作されたヒト羊膜ＷＩ
ＳＨ細胞におけるウィルスプラーク減少アッセイを用い
てインターフェロン活性の分析を行った。ウィルス粒子
を遠心分離で除去するとＡｃＭＮＰＶ感染細胞からの培
地中には何等のインターフェロン活性も測定されなかっ
た。しかしながら、インターフェロンアッセイの際にＡ
ｃＭＮＰＶウィルス含有培地を使用すると、１０００〜
３０００国際標準単位（ＩＵ）／ｍｌのインターフェロ
ンが生成され、ＡｃＭＮＰＶヴィリオンが明らかにＷＩ
ＳＨ細胞内に内因性インターフェロンを誘発したことを
示した。多くの種類のエンベローブに封入されたウィル
スがヒト細胞においてインターフェロンの産生を誘発す
ることが知られているので、これらの結果は予想された
ものであった。この影響を避けるために、以下の全ての
試料は試験前に遠心分離にかけられた。培地中に存在す
る血清アルブミン（６ｍｇ／ｍｌ）及び仔ウシ血清（１
０％）（W.F.Hink，226 Nature (London) 466-467(197
0）参照）がＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βで感染されたＳ．
フルギペルダ細胞内におけるＩＦＮ‐βの発現に必要で
あるか否かを決定するために１つの実験を行った。感染
後８時間目に培地を０〜１０％のウシ胎児血清を含有す
るGrace の培地（非血清アルブミン、T.C.C.Grace，195
Nature (London) 788-789(1962）参照）で交換した。
各変成培地について感染後４８時間後にインターフェロ
ン活性の分析を行った。無血清の場合には、インターフ
ェロン活性に約１０倍の減少があった。０．５％の血清
の添加により１０％の血清を含有する対照例におけるの
と同一レベルの活性が産生された。Ａｃ３８０‐ＩＦＮ
‐β感染細胞中のＩＦＮ‐βの特異活性は０．５％血清
を含有するGrace の培地中に産生された際には約５×１
０6 ＩＵ／ｍｇの蛋白質であった。精製β‐インターフ
ェロンの活性を２＋１０8 ＩＵ／ｍｌと想定すると（E.
Knight,Jr.,73 Proc.Natl.Acad.U.S.A.520-523(1976)参
照）、β‐インターフェロンは培地中の全蛋白質の約１
％を表わすであろう。
【００４４】更に、Ａｃ３７３‐ＩＦＮ‐β及びＡｃ３
８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞の培地中で測定されたインタ
ーフェロン活性の分析は１７，０００（１７Ｋ）及び２
０．５Ｋ分子量の２つのポリペプチドを明らかにした。
非グリコシル化及びグリコシル化ヒトＩＦＮ‐β蛋白質
の大きさは各々１７Ｋ及び２０．５Ｋポリペプチドに匹
敵するものであることが報告されている。感染後３０時
間目に１７ＫポリペプチドはＡｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感
染細胞中に作られており、感染後４８時間迄に１７Ｋ及
び２０．５Ｋポリペプチドの両者が検出された。Ａｃ３
１１‐ＩＦＮ‐β感染細胞内には１７Ｋポリペプチドの
みが感染後３０時間目及び４８時間目に検出された。Ａ
ｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感染細胞中には豊富に産生された
２３．５Ｋ蛋白質が観察された。この大きさは２１個の
アミノ酸信号ペプチドプラスポリヘドリン遺伝子の最初
の１０コドン由来の追加の１４個のアミノ酸及びＢａｍ
ＨＩリンカー配列を含む全インターフェロン蛋白質より
なるハイブリッド蛋白質に対して予想されたものであ
る。Ａｃ３８０‐ＩＦＮ‐βおよび（少ない程度で）Ａ
ｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感染細胞内で作られた１７Ｋ及び
２０．５Ｋ蛋白質はヒトＩＦＮ‐βモノクローナル抗体
と反応した。（ＩＦＮ‐βモノクローナル抗体はP.W.Tr
own 及びHoffman LaRoche社により提供された。）この
抗体の１７Ｋ蛋白質に対する反応性に対比して、２０．
５Ｋ蛋白質に対する反応性が減少されていることが注目
された。これは、幾分、２０．５Ｋよりも１７Ｋが細胞
中により高いレベルで蓄積するという事実によるもので
ある。更に、この抗体は例えば２０．５Ｋポリペプチド
のグリコシル化により部分的にマスクされている１７Ｋ
ポリペプチド上のエピトープと反応している可能性があ
る。この想像上のハイブリッド２３．５Ｋ及び３２Ｋ蛋
白質は又ＩＦＮ‐β抗体と反応した。ポリヘドリンに対
するポリクローナル抗体は、ＤＮＡ配列からハイブリッ
ド蛋白質のＮ‐末端に存在することが予想される２３．
５Ｋ蛋白質の１０個のアミノ酸及び３２Ｋ蛋白質の５７
個のアミノ酸を認識した。２０．５Ｋ ＩＦＮ‐βがグ
リコシル化されていることを示すために、Ａｃ３８０‐
ＩＦＮ‐β感染細胞を感染の後期において〔 3Ｈ〕マン
ノースで標識した。２０．５Ｋ ＩＦＮ‐β及び３個の
追加の蛋白質はＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞におい
て標識された主たるマンノース含有グリコ蛋白質であっ
た。
８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞の培地中で測定されたインタ
ーフェロン活性の分析は１７，０００（１７Ｋ）及び２
０．５Ｋ分子量の２つのポリペプチドを明らかにした。
非グリコシル化及びグリコシル化ヒトＩＦＮ‐β蛋白質
の大きさは各々１７Ｋ及び２０．５Ｋポリペプチドに匹
敵するものであることが報告されている。感染後３０時
間目に１７ＫポリペプチドはＡｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感
染細胞中に作られており、感染後４８時間迄に１７Ｋ及
び２０．５Ｋポリペプチドの両者が検出された。Ａｃ３
１１‐ＩＦＮ‐β感染細胞内には１７Ｋポリペプチドの
みが感染後３０時間目及び４８時間目に検出された。Ａ
ｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感染細胞中には豊富に産生された
２３．５Ｋ蛋白質が観察された。この大きさは２１個の
アミノ酸信号ペプチドプラスポリヘドリン遺伝子の最初
の１０コドン由来の追加の１４個のアミノ酸及びＢａｍ
ＨＩリンカー配列を含む全インターフェロン蛋白質より
なるハイブリッド蛋白質に対して予想されたものであ
る。Ａｃ３８０‐ＩＦＮ‐βおよび（少ない程度で）Ａ
ｃ３６０‐ＩＦＮ‐β感染細胞内で作られた１７Ｋ及び
２０．５Ｋ蛋白質はヒトＩＦＮ‐βモノクローナル抗体
と反応した。（ＩＦＮ‐βモノクローナル抗体はP.W.Tr
own 及びHoffman LaRoche社により提供された。）この
抗体の１７Ｋ蛋白質に対する反応性に対比して、２０．
５Ｋ蛋白質に対する反応性が減少されていることが注目
された。これは、幾分、２０．５Ｋよりも１７Ｋが細胞
中により高いレベルで蓄積するという事実によるもので
ある。更に、この抗体は例えば２０．５Ｋポリペプチド
のグリコシル化により部分的にマスクされている１７Ｋ
ポリペプチド上のエピトープと反応している可能性があ
る。この想像上のハイブリッド２３．５Ｋ及び３２Ｋ蛋
白質は又ＩＦＮ‐β抗体と反応した。ポリヘドリンに対
するポリクローナル抗体は、ＤＮＡ配列からハイブリッ
ド蛋白質のＮ‐末端に存在することが予想される２３．
５Ｋ蛋白質の１０個のアミノ酸及び３２Ｋ蛋白質の５７
個のアミノ酸を認識した。２０．５Ｋ ＩＦＮ‐βがグ
リコシル化されていることを示すために、Ａｃ３８０‐
ＩＦＮ‐β感染細胞を感染の後期において〔 3Ｈ〕マン
ノースで標識した。２０．５Ｋ ＩＦＮ‐β及び３個の
追加の蛋白質はＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β感染細胞におい
て標識された主たるマンノース含有グリコ蛋白質であっ
た。
【００４５】例 VII クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子及び ＡｃＭＮＰＶ組換え転移ベクターの構成 Ｅ．ｃｏｌｉ転置因子Ｔｎ９は、抗生物質クロラムフェ
ニコールに対する耐性を与える酵素クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する遺伝
子を含有する。ＣＡＴの真核生物ベクター内における発
現は動物細胞におけるプロモーターの発現を測定する便
利な手段であることが示されている。（M.Mackett 、G.
Smith 及びB.Moss．1984 J.Virol，49:857-864及びそれ
に示される参考文献を参照）。ＡｃＭＮＰＶ‐ＣＡＴ発
現ベクターはバキュロウィルスベクター中における外来
遺伝子の産生を最適化するように設計された実験におい
て有用である。ＣＡＴ‐コード配列を含有する７７０塩
基対ＴａｑＩ ＤＮＡ断片をｐＢＲ３２８から単離し、
ｐＵＣ７のＡｃｃＩ部位にクローン化した。このＣＡＴ
‐コード配列をＢａｍＨＩで切り出し、ｐＡｃ３７３中
のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミド転移
ベクターをｐＡｃ３７３‐ＣＡＴと称する。
子及び ＡｃＭＮＰＶ組換え転移ベクターの構成 Ｅ．ｃｏｌｉ転置因子Ｔｎ９は、抗生物質クロラムフェ
ニコールに対する耐性を与える酵素クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に対する遺伝
子を含有する。ＣＡＴの真核生物ベクター内における発
現は動物細胞におけるプロモーターの発現を測定する便
利な手段であることが示されている。（M.Mackett 、G.
Smith 及びB.Moss．1984 J.Virol，49:857-864及びそれ
に示される参考文献を参照）。ＡｃＭＮＰＶ‐ＣＡＴ発
現ベクターはバキュロウィルスベクター中における外来
遺伝子の産生を最適化するように設計された実験におい
て有用である。ＣＡＴ‐コード配列を含有する７７０塩
基対ＴａｑＩ ＤＮＡ断片をｐＢＲ３２８から単離し、
ｐＵＣ７のＡｃｃＩ部位にクローン化した。このＣＡＴ
‐コード配列をＢａｍＨＩで切り出し、ｐＡｃ３７３中
のＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミド転移
ベクターをｐＡｃ３７３‐ＣＡＴと称する。
【００４６】例 VIII ヒトインターロイキン‐２遺伝子及びＡｃＭＮＰＶ組換
え 転移ベクターの構成 ヒトインターロイキン‐２（ＩＬ２）は有糸分裂促進剤
或いは抗原により刺戟されたヒトリンパ球内に微量に産
生される。ＩＬ‐２は当初培養液中のＴリンパ細胞の長
期間の生育を維持することのできる因子であると説明さ
れていた（D.A.Morgan、F.W.Ruscetti及びR.Gallo 、Sc
ience 193 ：1007-1008(1976))。それは、免疫応答の刺
戟及び維持において中心的役割を果たすようであり、あ
る種のヒトの病気に介在していたために、複雑なもので
あった（A.Altman、A.N.Theofilopoulos、R.Weiner、D.
H.KatzおよびF.J.Dixon ，J.Expl.Med．154:1403-1417
(1981))。大量のＩＬ‐２の製造のためにＡｃＭＮＰＶ
発現ベクターを使用することは、ヒト免疫系の臨床的診
断及び治療操作を非常に容易にすることが期待される。
最近、幾つかの実験室は、ＩＬ‐２の遺伝子の単離及び
プラスミドベクターを用いた細菌細胞中における生物学
的に活性なＩＬ‐２の製造を報告している（Rosenberg
等、Science 223 ：1412-1415(1984）及びその中の参考
文献参照）。ＩＬ２‐コード配列を含有する１０００塩
基対のＢａｍＨＩ断片をｐＩＬ２‐２Ｂから単離し、ｐ
Ａｃ３７３及びｐＡｃ３８０のＢａｍＨＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミド転移ベクターをｐＡｃ３７３‐
ＩＬ２及びｐＡｃ３８０‐ＩＬ２と称する。
え 転移ベクターの構成 ヒトインターロイキン‐２（ＩＬ２）は有糸分裂促進剤
或いは抗原により刺戟されたヒトリンパ球内に微量に産
生される。ＩＬ‐２は当初培養液中のＴリンパ細胞の長
期間の生育を維持することのできる因子であると説明さ
れていた（D.A.Morgan、F.W.Ruscetti及びR.Gallo 、Sc
ience 193 ：1007-1008(1976))。それは、免疫応答の刺
戟及び維持において中心的役割を果たすようであり、あ
る種のヒトの病気に介在していたために、複雑なもので
あった（A.Altman、A.N.Theofilopoulos、R.Weiner、D.
H.KatzおよびF.J.Dixon ，J.Expl.Med．154:1403-1417
(1981))。大量のＩＬ‐２の製造のためにＡｃＭＮＰＶ
発現ベクターを使用することは、ヒト免疫系の臨床的診
断及び治療操作を非常に容易にすることが期待される。
最近、幾つかの実験室は、ＩＬ‐２の遺伝子の単離及び
プラスミドベクターを用いた細菌細胞中における生物学
的に活性なＩＬ‐２の製造を報告している（Rosenberg
等、Science 223 ：1412-1415(1984）及びその中の参考
文献参照）。ＩＬ２‐コード配列を含有する１０００塩
基対のＢａｍＨＩ断片をｐＩＬ２‐２Ｂから単離し、ｐ
Ａｃ３７３及びｐＡｃ３８０のＢａｍＨＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミド転移ベクターをｐＡｃ３７３‐
ＩＬ２及びｐＡｃ３８０‐ＩＬ２と称する。
【００４７】例 IX ポリヘドリン‐ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノムへの転移 ポリヘドリン‐ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノム中への転移及び組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクター
の選択は、上記例IVに説明したように行った。ｐＡｃ３
７３‐ＩＬ２、ｐＡｃ３８０‐ＩＬ２及びｐＡｃ３７３
‐ＣＡＴから産生したＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは各々
Ａｃ３７３‐ＩＬ２、Ａｃ３８０‐ＩＬ２及びＡｃ３７
３‐ＣＡＴと称する。
ゲノムへの転移 ポリヘドリン‐ＩＬ２及びＣＡＴ遺伝子のＡｃＭＮＰＶ
ゲノム中への転移及び組換えＡｃＭＮＰＶ発現ベクター
の選択は、上記例IVに説明したように行った。ｐＡｃ３
７３‐ＩＬ２、ｐＡｃ３８０‐ＩＬ２及びｐＡｃ３７３
‐ＣＡＴから産生したＡｃＭＮＰＶ発現ベクターは各々
Ａｃ３７３‐ＩＬ２、Ａｃ３８０‐ＩＬ２及びＡｃ３７
３‐ＣＡＴと称する。
【００４８】例 Ｘ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＩＬ２の製造 Ｓ．フルギペルダ細胞をＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βについ
て説明したものと同様なＡｃ３７３‐ＩＬ２或いはＡｃ
３８０‐ＩＬ２発現ベクターで感染させた。感染後４８
時間目に培地及び感染細胞を集め、インターロイキンの
生物学的活性のレベルをGills 等、J.Immunol ．120 ：
2027-2032(1978）により説明されているＩＬ２アッセイ
を用いて測定した。このアッセイを用いて、ＩＬ２の特
異活性は蛋白質ｍｇ当り１×１０8 単位と測定された。
両発現ベクター共に高レベルのインターロイキン活性を
産生したが、しかし、Ａｃ３７３‐ＩＬ２はＡｃ３８０
‐ＩＬ２よりもほぼ４倍のインターロイキンを産生した
（表２参照）。インターロイキン活性の約８０％は培地
内に存在し、蛋白質が感染中細胞から効率的に分泌され
ることを示した。Hoffman-La Roche Research Center-
のGrace Ju博士により行われた別の実験においては、
Ｓ．フルギペルダ細胞をＡｃ３７３‐ＩＬ２及びＡｃ３
８０‐ＩＬ２で感染させ、インターロイキン活性を培地
内において感染後２４時間、４８時間、７２時間目に測
定した。新鮮な培地を２４時間及び４８時間目に適用し
た。実質的に全ての活性は感染後０〜２４時間及び２４
〜４８時間の間に産生された（表２）。ＩＬ２の特異活
性から、Ａｃ３７３‐ＩＬ２感染細胞のｌ当り少なくと
も１ｍｇのＩＬ２蛋白質が産生され、分泌されたと計算
される。Ａｃ３７３‐ＩＬ２及びＡｃ３８０‐ＩＬ２感
染細胞において合成された蛋白質の分析を行った。これ
らのＡｃＭＮＰＶ発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染
細胞においては作られない２つの蛋白質が多量に作られ
た。これらの新蛋白質は約１５．５Ｋ及び１６Ｋダルト
ンの大きさのものである。これは、ＤＮＡ配列から予想
されたインターロイキンの大きさが約１５．５Ｋである
という事実（蛋白質のアミノ末端の２０個のアミノ酸信
号ペプチドが除去されたと仮定して）と一致するもので
ある。
て説明したものと同様なＡｃ３７３‐ＩＬ２或いはＡｃ
３８０‐ＩＬ２発現ベクターで感染させた。感染後４８
時間目に培地及び感染細胞を集め、インターロイキンの
生物学的活性のレベルをGills 等、J.Immunol ．120 ：
2027-2032(1978）により説明されているＩＬ２アッセイ
を用いて測定した。このアッセイを用いて、ＩＬ２の特
異活性は蛋白質ｍｇ当り１×１０8 単位と測定された。
両発現ベクター共に高レベルのインターロイキン活性を
産生したが、しかし、Ａｃ３７３‐ＩＬ２はＡｃ３８０
‐ＩＬ２よりもほぼ４倍のインターロイキンを産生した
（表２参照）。インターロイキン活性の約８０％は培地
内に存在し、蛋白質が感染中細胞から効率的に分泌され
ることを示した。Hoffman-La Roche Research Center-
のGrace Ju博士により行われた別の実験においては、
Ｓ．フルギペルダ細胞をＡｃ３７３‐ＩＬ２及びＡｃ３
８０‐ＩＬ２で感染させ、インターロイキン活性を培地
内において感染後２４時間、４８時間、７２時間目に測
定した。新鮮な培地を２４時間及び４８時間目に適用し
た。実質的に全ての活性は感染後０〜２４時間及び２４
〜４８時間の間に産生された（表２）。ＩＬ２の特異活
性から、Ａｃ３７３‐ＩＬ２感染細胞のｌ当り少なくと
も１ｍｇのＩＬ２蛋白質が産生され、分泌されたと計算
される。Ａｃ３７３‐ＩＬ２及びＡｃ３８０‐ＩＬ２感
染細胞において合成された蛋白質の分析を行った。これ
らのＡｃＭＮＰＶ発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染
細胞においては作られない２つの蛋白質が多量に作られ
た。これらの新蛋白質は約１５．５Ｋ及び１６Ｋダルト
ンの大きさのものである。これは、ＤＮＡ配列から予想
されたインターロイキンの大きさが約１５．５Ｋである
という事実（蛋白質のアミノ末端の２０個のアミノ酸信
号ペプチドが除去されたと仮定して）と一致するもので
ある。
【００４９】表 ２ ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターで感染されたＳ．フルギペル
ダ細胞中のインターロイキン‐２活性の産生。感染No．
１において培地及び感染細胞の試料は感染後４８時間目
に集められた。感染No．２においては、培地の試料は感
染後２４時間、４８時間及び７２時間目に集められ、新
鮮な培地は感染後２４時間目、及び４８時間目に適用さ
れた。 感染No．１ a 細 胞 培 地 合 計 分泌活性 ベクター （単位／l) （単位／l) mg/l ％ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ２．５×１０7 １×１０8 １．２５ ８０％ Ａｃ３８０−ＩＬ２ １．０×１０7 ５×１０7 ０．６ ８４％ 感染No．２ b 時間数 培 地 合 計 ベクター （感染後） （単位／l) mg/l Ａｃ３７３−ＩＬ２ ２４ ５．１×１０7 ０．５ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ４８ ５．１×１０7 ０．５ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ７２ ４．８×１０6 ０．０５ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ２４ １．３×１０7 ０．１３ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ４８ １．３×１０7 ０．１３ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ７２ ６．４×１０6 ０．０６ ａ Texas A & M Universityで製造 ｂ Hoffman-La Roche Research Centerで製造
ダ細胞中のインターロイキン‐２活性の産生。感染No．
１において培地及び感染細胞の試料は感染後４８時間目
に集められた。感染No．２においては、培地の試料は感
染後２４時間、４８時間及び７２時間目に集められ、新
鮮な培地は感染後２４時間目、及び４８時間目に適用さ
れた。 感染No．１ a 細 胞 培 地 合 計 分泌活性 ベクター （単位／l) （単位／l) mg/l ％ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ２．５×１０7 １×１０8 １．２５ ８０％ Ａｃ３８０−ＩＬ２ １．０×１０7 ５×１０7 ０．６ ８４％ 感染No．２ b 時間数 培 地 合 計 ベクター （感染後） （単位／l) mg/l Ａｃ３７３−ＩＬ２ ２４ ５．１×１０7 ０．５ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ４８ ５．１×１０7 ０．５ Ａｃ３７３−ＩＬ２ ７２ ４．８×１０6 ０．０５ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ２４ １．３×１０7 ０．１３ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ４８ １．３×１０7 ０．１３ Ａｃ３８０−ＩＬ２ ７２ ６．４×１０6 ０．０６ ａ Texas A & M Universityで製造 ｂ Hoffman-La Roche Research Centerで製造
【００５０】例 XI ＡｃＭＮＰＶ発現ベクターを使用するＣＡＴの製造 Ｓ．フルギペルダ細胞をＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βについ
て説明したと同様にしてＡｃ３７３‐ＣＡＴで感染さ
せ、感染後２４時間目にＣＡＴ酵素活性を上記Mackett
等に記載された方法で細胞及び培地中において測定し
た。未感染細胞或いはＡｃＭＮＰＶで感染された細胞に
は検出可能なＣＡＴ酵素活性は存在しなかったが、しか
し、Ａｃ３７３‐ＣＡＴによっては細胞及び培地の両者
に高レベルの活性が産生された。Ａｃ３７３‐ＣＡＴ感
染細胞において合成された蛋白質の分析を行った。この
発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染細胞においては作
られなかった２７Ｋダルトンの新しい蛋白質が産生され
た。ＣＡＴの大きさはＤＮＡ配列から約２７Ｋであると
予測された。多量の２７Ｋ蛋白質が感染細胞及び培地の
両者に存在した。ポリアクリルアミドゲル上に観察され
た蛋白質の量からＡｃ３７３‐ＣＡＴ感染細胞のｌ当り
約４０ｍｇのＣＡＴ酵素が製造されるものと推定され
る。本発明及びそれによって提供される利点及び便宜は
本発明の幾つかの好ましい実施態様を説明するにすぎな
い上記記載より認められるであろう。本発明の範囲及び
精神から離れることなく、或いはその利点の如何なるも
のも害することなく物質、方法及び物質の使用量におい
て多くの変化をなし得ることが明らかである。更に、上
記発明が、本発明をバキュロウィルスゲノムの幾つかの
位置の任意の位置において、任意の選ばれた遺伝子を挿
入するために利用することができるという事実を利用す
ることに基づく用途を有することが認められるであろ
う。例えば、ポリヘドリン遺伝子の全て或いは一部が欠
失されていない組換えＡｃＭＮＰＶウィルスの単離に操
作が利用可能であるという事実は、本発明を多くの方法
において利用することを可能にするものである。これら
の用途はＡｃＭＮＰＶウィルスの封入形態のポリヘドリ
ン被覆が外部影響に対して極めて耐性であるという事実
を利用するものである。例えば、例III で述べた如く、
選ばれた遺伝子をウィルスゲノム中にポリヘドリン遺伝
子内以外の場所に、特に、選ばれた遺伝子が高いレベル
で発現されるように１０Ｋプロモーターにより制御され
るような場所に、クローン化することが出来る。このＡ
ｃＭＮＰＶウィルスは次いで単離され、安定な発現ベク
ターとして利用することができる。その様な安定な発現
ベクターは、将来ある指定された時に、目的蛋白質の製
造に使用する為に、組換えＡｃＭＮＰＶウィルスを適当
な宿主細胞及び十分な培地の培養液と共に１つの実験室
から別の実験室に移すことのできる安定な形態で利用で
きる。
て説明したと同様にしてＡｃ３７３‐ＣＡＴで感染さ
せ、感染後２４時間目にＣＡＴ酵素活性を上記Mackett
等に記載された方法で細胞及び培地中において測定し
た。未感染細胞或いはＡｃＭＮＰＶで感染された細胞に
は検出可能なＣＡＴ酵素活性は存在しなかったが、しか
し、Ａｃ３７３‐ＣＡＴによっては細胞及び培地の両者
に高レベルの活性が産生された。Ａｃ３７３‐ＣＡＴ感
染細胞において合成された蛋白質の分析を行った。この
発現ベクターによりＡｃＭＮＰＶ感染細胞においては作
られなかった２７Ｋダルトンの新しい蛋白質が産生され
た。ＣＡＴの大きさはＤＮＡ配列から約２７Ｋであると
予測された。多量の２７Ｋ蛋白質が感染細胞及び培地の
両者に存在した。ポリアクリルアミドゲル上に観察され
た蛋白質の量からＡｃ３７３‐ＣＡＴ感染細胞のｌ当り
約４０ｍｇのＣＡＴ酵素が製造されるものと推定され
る。本発明及びそれによって提供される利点及び便宜は
本発明の幾つかの好ましい実施態様を説明するにすぎな
い上記記載より認められるであろう。本発明の範囲及び
精神から離れることなく、或いはその利点の如何なるも
のも害することなく物質、方法及び物質の使用量におい
て多くの変化をなし得ることが明らかである。更に、上
記発明が、本発明をバキュロウィルスゲノムの幾つかの
位置の任意の位置において、任意の選ばれた遺伝子を挿
入するために利用することができるという事実を利用す
ることに基づく用途を有することが認められるであろ
う。例えば、ポリヘドリン遺伝子の全て或いは一部が欠
失されていない組換えＡｃＭＮＰＶウィルスの単離に操
作が利用可能であるという事実は、本発明を多くの方法
において利用することを可能にするものである。これら
の用途はＡｃＭＮＰＶウィルスの封入形態のポリヘドリ
ン被覆が外部影響に対して極めて耐性であるという事実
を利用するものである。例えば、例III で述べた如く、
選ばれた遺伝子をウィルスゲノム中にポリヘドリン遺伝
子内以外の場所に、特に、選ばれた遺伝子が高いレベル
で発現されるように１０Ｋプロモーターにより制御され
るような場所に、クローン化することが出来る。このＡ
ｃＭＮＰＶウィルスは次いで単離され、安定な発現ベク
ターとして利用することができる。その様な安定な発現
ベクターは、将来ある指定された時に、目的蛋白質の製
造に使用する為に、組換えＡｃＭＮＰＶウィルスを適当
な宿主細胞及び十分な培地の培養液と共に１つの実験室
から別の実験室に移すことのできる安定な形態で利用で
きる。
【００５１】この発現ベクターは又、特定の宿主昆虫
種、或いは広範囲の感染しやすい宿主昆虫種に毒性を有
する蛋白質を産生する遺伝子を選択し、その遺伝子をＡ
ｃＭＮＰＶ発現ベクター中にクローニングすることによ
り害虫集団を抑制するための系にも使用することが可能
である（これらの可能性はL.K.Miller等、219 Science7
15-721(1983）に論じられている）。組換え発現ベクタ
ーは、昆虫が害虫である植物或いは動物に適用すること
が出来、それが害虫により上記の如く摂取された場合に
は封入体は腸の内腔において解離し、組換えウィルスは
腸壁の細胞を侵し、複製を開始する。複製の際に、害虫
に毒性を有する蛋白質の遺伝子が発現され、昆虫の不能
化或いは死がもたらされる。その時間は、昆虫が野生タ
イプのＡｃＭＮＰＶウィルスを摂取した場合より遥かに
短く、この場合、昆虫はウィルス感染の程度に応じて異
る時間後に溶解される。これ及びその他の実験室におけ
る実験の示すところによれば、１０Ｋ蛋白質の発現は感
染後２４時間程度の早期に起こり、約４８時間目に高レ
ベルで起こることが判明している。その結果、１０Ｋプ
ロモーターの制御下にＡｃＭＮＰＶゲノム中にクローン
化される目的昆虫毒素をコードする遺伝子は又、そのタ
イムスケジュールに従って発現されることが予想され
る。昆虫の死或いは不能化はその選ばれた遺伝子の発現
の開始後間もなく起こることが予想され、その結果、昆
虫の野生タイプバキュロウィルスによる感染に対比し
て、その害虫の寄生する植物或いは動物に対する損傷が
同時に減少する。遺伝子は又、バキュロウィルスゲノム
中にポリヘドリン被覆が昆虫の腸のアルカリ性条件によ
り解離された場合に、毒性遺伝子生成物が放出されるよ
うにポリヘドリン構造配列に融合されるように挿入する
ことができた。本発明のその様な用途は、昆虫腸細胞に
おける組換え遺伝子の発現を行うことなく昆虫の被毒を
生ずるものと思われる。更に、上記具体例で測定された
よりも高いレベルの遺伝子発現が本発明を用いて可能で
あることが認められるであろう。例えば、ＩＦＮ‐β遺
伝子（或いはその他の任意の遺伝子）はバキュロウィル
スゲノム中に１回以上クローン化することが可能であ
る。特に、発現がポリヘドリンプロモーターの制御下に
おかれるようにコピーを挿入することが出来、その他の
コピーを発現が１０Ｋプロモーターの制御下にあるよう
に挿入することが可能であり、従って、他の幾つかのコ
ピーを種々のその他の制限部位に挿入することが出来、
各コピーは自らのプロモーター或いはバキュロウィルス
によりプロモーターとして認識される幾つかのその他の
ＤＮＡ配列を含有する。感染しやすい昆虫細胞中に感染
時に産生されるインターフェロン（或いはその他のポリ
ペプチド）の量は上記測定レベルをはるかに越える量と
なり得る。ここに開示されている本発明の一層の修正
は、当業者に可能であり、全てのその様な修正は請求の
範囲に規定される本発明の精神及び範囲内にあるものと
看做される。
種、或いは広範囲の感染しやすい宿主昆虫種に毒性を有
する蛋白質を産生する遺伝子を選択し、その遺伝子をＡ
ｃＭＮＰＶ発現ベクター中にクローニングすることによ
り害虫集団を抑制するための系にも使用することが可能
である（これらの可能性はL.K.Miller等、219 Science7
15-721(1983）に論じられている）。組換え発現ベクタ
ーは、昆虫が害虫である植物或いは動物に適用すること
が出来、それが害虫により上記の如く摂取された場合に
は封入体は腸の内腔において解離し、組換えウィルスは
腸壁の細胞を侵し、複製を開始する。複製の際に、害虫
に毒性を有する蛋白質の遺伝子が発現され、昆虫の不能
化或いは死がもたらされる。その時間は、昆虫が野生タ
イプのＡｃＭＮＰＶウィルスを摂取した場合より遥かに
短く、この場合、昆虫はウィルス感染の程度に応じて異
る時間後に溶解される。これ及びその他の実験室におけ
る実験の示すところによれば、１０Ｋ蛋白質の発現は感
染後２４時間程度の早期に起こり、約４８時間目に高レ
ベルで起こることが判明している。その結果、１０Ｋプ
ロモーターの制御下にＡｃＭＮＰＶゲノム中にクローン
化される目的昆虫毒素をコードする遺伝子は又、そのタ
イムスケジュールに従って発現されることが予想され
る。昆虫の死或いは不能化はその選ばれた遺伝子の発現
の開始後間もなく起こることが予想され、その結果、昆
虫の野生タイプバキュロウィルスによる感染に対比し
て、その害虫の寄生する植物或いは動物に対する損傷が
同時に減少する。遺伝子は又、バキュロウィルスゲノム
中にポリヘドリン被覆が昆虫の腸のアルカリ性条件によ
り解離された場合に、毒性遺伝子生成物が放出されるよ
うにポリヘドリン構造配列に融合されるように挿入する
ことができた。本発明のその様な用途は、昆虫腸細胞に
おける組換え遺伝子の発現を行うことなく昆虫の被毒を
生ずるものと思われる。更に、上記具体例で測定された
よりも高いレベルの遺伝子発現が本発明を用いて可能で
あることが認められるであろう。例えば、ＩＦＮ‐β遺
伝子（或いはその他の任意の遺伝子）はバキュロウィル
スゲノム中に１回以上クローン化することが可能であ
る。特に、発現がポリヘドリンプロモーターの制御下に
おかれるようにコピーを挿入することが出来、その他の
コピーを発現が１０Ｋプロモーターの制御下にあるよう
に挿入することが可能であり、従って、他の幾つかのコ
ピーを種々のその他の制限部位に挿入することが出来、
各コピーは自らのプロモーター或いはバキュロウィルス
によりプロモーターとして認識される幾つかのその他の
ＤＮＡ配列を含有する。感染しやすい昆虫細胞中に感染
時に産生されるインターフェロン（或いはその他のポリ
ペプチド）の量は上記測定レベルをはるかに越える量と
なり得る。ここに開示されている本発明の一層の修正
は、当業者に可能であり、全てのその様な修正は請求の
範囲に規定される本発明の精神及び範囲内にあるものと
看做される。
【図１】ＡｃＭＮＰＶのプラーク精製株、Ｍ３、プラス
ミドｐＢＲ３２５、及びプラスミドｐＵＣ８を用いて開
始した転移ベクター、ｐＡｃ１０１の構成の概略図を示
す。
ミドｐＢＲ３２５、及びプラスミドｐＵＣ８を用いて開
始した転移ベクター、ｐＡｃ１０１の構成の概略図を示
す。
【図２】プラスミドｐＩ１０、ｐＵＣ８及び合成Ｂａｍ
ＨＩリンカーを用いて開始した変成転移ベクターｐＡｃ
３１１、ｐＡｃ３６０、ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０
を構成するための概略図を示し、図中「ライブラリー」
という用語は、ポリヘドリン遺伝子における各可能性の
ある位置において欠失突然変異を誘発することにより構
成することのできる変成ｐＢ′Ｂａｌプラスミドのライ
ブラリーを表わす。プラスミドｐＢ′Ｂａｌ１１、ｐ
Ｂ′Ｂａｌ６０、ｐＢ′Ｂａｌ７３及びｐＢ′Ｂａｌ８
０を次いでこの突然変異プラスミドのライブラリーから
選択して更に転移ベクターｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６
０、ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０に変成した。
ＨＩリンカーを用いて開始した変成転移ベクターｐＡｃ
３１１、ｐＡｃ３６０、ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０
を構成するための概略図を示し、図中「ライブラリー」
という用語は、ポリヘドリン遺伝子における各可能性の
ある位置において欠失突然変異を誘発することにより構
成することのできる変成ｐＢ′Ｂａｌプラスミドのライ
ブラリーを表わす。プラスミドｐＢ′Ｂａｌ１１、ｐ
Ｂ′Ｂａｌ６０、ｐＢ′Ｂａｌ７３及びｐＢ′Ｂａｌ８
０を次いでこの突然変異プラスミドのライブラリーから
選択して更に転移ベクターｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６
０、ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０に変成した。
【図３】ＡｃＭＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の部分的ヌ
クレオチド配列及びその遺伝子のすぐ上流の配列を概略
的に示すものである。特徴的なＢａｍＨＩクローニング
部位の位置に加えて、欠失突然変異が誘発されて転移ベ
クターｐＡｃ１０１、ｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６０、ｐ
Ａｃ３７３及びｐＡｃ３８０を構成する点は矢印で示さ
れている。ポリヘドリン遺伝子の「ＴＡＴＡ」及び「Ｃ
ＡＡＴ」ボックスはそれらの配列の周りに描かれた長方
形により示されており、遺伝子の転写開始部位は、星印
で示されている。又、ポリヘドリン遺伝子の近くに位置
するＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIII 制限部位を示す。
クレオチド配列及びその遺伝子のすぐ上流の配列を概略
的に示すものである。特徴的なＢａｍＨＩクローニング
部位の位置に加えて、欠失突然変異が誘発されて転移ベ
クターｐＡｃ１０１、ｐＡｃ３１１、ｐＡｃ３６０、ｐ
Ａｃ３７３及びｐＡｃ３８０を構成する点は矢印で示さ
れている。ポリヘドリン遺伝子の「ＴＡＴＡ」及び「Ｃ
ＡＡＴ」ボックスはそれらの配列の周りに描かれた長方
形により示されており、遺伝子の転写開始部位は、星印
で示されている。又、ポリヘドリン遺伝子の近くに位置
するＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄIII 制限部位を示す。
【図４】好ましいＩＦＮ‐β遺伝子を転移ベクターｐＡ
ｃ３８０にクローニングして組換え発現ベクターｐＡｃ
３８０‐ＩＦＮ‐βを構成する概略図を示す。又、ＩＦ
Ｎ‐β遺伝子を含有する出発物質プラスミドｐＢＲ１３
も示す。プラスミドｐ７７０は、ｐＵＣ８に対する配列
及び合成オクタヌクレオチドＢａｍＨＩリンカーが隣接
した７６７塩基対ＨｉｎｃII断片に対する配列をも含有
する。この７６７塩基対断片はＩＦＮ‐βに対する全コ
ード配列を含有する。
ｃ３８０にクローニングして組換え発現ベクターｐＡｃ
３８０‐ＩＦＮ‐βを構成する概略図を示す。又、ＩＦ
Ｎ‐β遺伝子を含有する出発物質プラスミドｐＢＲ１３
も示す。プラスミドｐ７７０は、ｐＵＣ８に対する配列
及び合成オクタヌクレオチドＢａｍＨＩリンカーが隣接
した７６７塩基対ＨｉｎｃII断片に対する配列をも含有
する。この７６７塩基対断片はＩＦＮ‐βに対する全コ
ード配列を含有する。
【図５】組換え発現ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐β
の培養スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi
perda)細胞内におけるバキュロウィルスによるトランス
フェクション及びそれに引続く、培養Ｓ．フルギペルダ
細胞のプラーク‐精製組換えバキュロウィルスによる感
染の概略図を示す。
の培養スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi
perda)細胞内におけるバキュロウィルスによるトランス
フェクション及びそれに引続く、培養Ｓ．フルギペルダ
細胞のプラーク‐精製組換えバキュロウィルスによる感
染の概略図を示す。
【図６】ＡｃＭＮＰＶゲノムのＥｃｏＲＩ断片のＢａｍ
ＨＩクローニング部位に挿入されたＩＦＮ‐β遺伝子を
有する組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βを
示す。ポリヘドリンプロモーター配列はベタ黒で示さ
れ、ＥｃｏＲＩ‐Ｉ‐列はプラスミドｐＵＣ８中に組込
まれたものとして示されている。
ＨＩクローニング部位に挿入されたＩＦＮ‐β遺伝子を
有する組換え転移ベクターｐＡｃ３８０‐ＩＦＮ‐βを
示す。ポリヘドリンプロモーター配列はベタ黒で示さ
れ、ＥｃｏＲＩ‐Ｉ‐列はプラスミドｐＵＣ８中に組込
まれたものとして示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】或る選ばれたポリペプチドの合成方法にお
いて、感染しやすい宿主昆虫細胞を組換えバキュロウィ
ルス発現ベクターにより適切に感染させることよりな
り、その際該発現ベクターが、有効なバキュロウィルス
プロモーター及び該選ばれたポリペプチドの発現に対し
てコード化されている少なくとも１つの選ばれた遺伝子
を含む組換えバキュロウィルスゲノムであり、該選ばれ
た遺伝子が該ゲノム中バキュロウィルスプロモーター或
いはそれ自身のプロモーターの転写制御下におかれてい
ることを特徴とする上記方法。 - 【請求項２】バキュロウィルスプロモーターがポリヘド
リンプロモーターである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】バキュロウィルスプロモーターが１０Ｋプ
ロモーターである、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】或る選ばれたポリペプチドの合成方法にお
いて、感染しやすい宿主昆虫細胞を組換えバキュロウィ
ルス発現ベクターにより感染させることよりなり、その
際該発現ベクターが、バキュロウィルスポリヘドリン又
は１０Ｋプロモーター及び該バキュロウィルスポリヘド
リン又は１０Ｋプロモータの転写制御下におかれた或る
選ばれた遺伝子を含む組換えバキュロウィルスゲノムで
あることを特徴とする上記方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/498,858 US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1983-05-27 | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| US498858 | 1983-05-27 | ||
| US60969784A | 1984-05-16 | 1984-05-16 | |
| US609697 | 1984-05-16 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59108279A Division JPH0779700B2 (ja) | 1983-05-27 | 1984-05-28 | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0799989A true JPH0799989A (ja) | 1995-04-18 |
| JP2644447B2 JP2644447B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=27052974
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59108279A Expired - Lifetime JPH0779700B2 (ja) | 1983-05-27 | 1984-05-28 | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
| JP6097988A Expired - Lifetime JP2644447B2 (ja) | 1983-05-27 | 1994-04-12 | ポリペプチドの合成方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59108279A Expired - Lifetime JPH0779700B2 (ja) | 1983-05-27 | 1984-05-28 | 組換えバキユロウイルス発現ベクターの製法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0127839B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0779700B2 (ja) |
| KR (1) | KR910009203B1 (ja) |
| AT (1) | ATE78293T1 (ja) |
| AU (1) | AU581174B2 (ja) |
| BR (1) | BR8402666A (ja) |
| CA (1) | CA1222213A (ja) |
| DE (1) | DE3485810T2 (ja) |
| DK (1) | DK172401B1 (ja) |
| ES (1) | ES532825A0 (ja) |
| IE (1) | IE58011B1 (ja) |
| IL (1) | IL71906A (ja) |
| IN (1) | IN160416B (ja) |
| MX (1) | MX164250B (ja) |
| NO (1) | NO173944C (ja) |
| NZ (1) | NZ208259A (ja) |
| PH (1) | PH25395A (ja) |
Families Citing this family (148)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984002077A1 (en) * | 1982-11-30 | 1984-06-07 | Us Health | Process for producing poxvirus recombinants for expression of foreign genes |
| JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
| US5004687A (en) * | 1985-05-21 | 1991-04-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Insect virus vector with broadened host range |
| GB8521496D0 (en) * | 1985-08-29 | 1985-10-02 | Ciba Geigy Ag | Repressible yeast promoters |
| FR2593519B1 (fr) * | 1985-09-25 | 1994-01-07 | Oncogen | Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin |
| GR862412B (en) * | 1985-09-25 | 1987-01-23 | Oncogen | Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome |
| IL80529A0 (en) * | 1985-11-14 | 1987-02-27 | Daiichi Seiyaku Co | Method of producing peptides |
| JPS63167797A (ja) * | 1985-12-18 | 1988-07-11 | マイクロジエネシス，インコ−ポレイテイド | 選択された昆虫宿主細胞中で選択されたポリペプチドを製造する方法 |
| NZ221702A (en) * | 1986-09-08 | 1989-02-24 | Bishop David H L | Expression of human hepatitis b antigens in insects and cultured insect cells using recombinant baculoviruses |
| US5071748A (en) * | 1986-09-09 | 1991-12-10 | Genetics Institute, Inc. | Mixed baculovirus compositions and uses thereof |
| IE872748L (en) * | 1986-10-16 | 1988-04-16 | Arjomari Europ | Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells |
| WO1988005081A2 (en) * | 1986-12-30 | 1988-07-14 | Cetus Corporation | Novel plasminogen activator |
| US5041379A (en) * | 1987-03-16 | 1991-08-20 | American Biogenetic Science, Inc. | Heliothis expression systems |
| WO1988007082A1 (en) * | 1987-03-16 | 1988-09-22 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Recombinant baculovirus occlusion bodies in vaccines and biological insecticides |
| JPS6463395A (en) * | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| EP0364492A1 (en) * | 1987-06-30 | 1990-04-25 | The Upjohn Company | Virus proteins having reduced o-linked glycosylation |
| AU2136788A (en) * | 1987-07-24 | 1989-03-01 | Cetus Corporation | Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system |
| US5372943A (en) * | 1987-07-24 | 1994-12-13 | Cetus Corporation | Lipid microemulsions for culture media |
| AU2251488A (en) * | 1987-07-24 | 1989-03-01 | Cetus Corporation | Production of biologically active forms of csf using a baculovirus (acnpv)-insect cell expression system |
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