JP2023548067A - アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス - Google Patents

アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス Download PDF

Info

Publication number
JP2023548067A
JP2023548067A JP2023524885A JP2023524885A JP2023548067A JP 2023548067 A JP2023548067 A JP 2023548067A JP 2023524885 A JP2023524885 A JP 2023524885A JP 2023524885 A JP2023524885 A JP 2023524885A JP 2023548067 A JP2023548067 A JP 2023548067A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
raav
capsid
aav
composition
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023524885A
Other languages
English (en)
Inventor
マガ，ジョン
ヴォラ，ハルミット
シス，ラフル
ゴールド，ダニエル
リシ，アナント
ツァン，ヤンホン
トラン，キーウ
Original Assignee
バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド filed Critical バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド
Publication of JP2023548067A publication Critical patent/JP2023548067A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離を使用して、アデノ随伴ウイルス粒子を濃縮するためのプロセスを提供する。【選択図】図１３

Description

本発明は、アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離を使用してアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を濃縮するためのプロセスに関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製のためにヘルパーアデノウイルスを必要とすると考えられている小さな非病原性サテライトウイルスである。ＡＡＶは、アデノウイルスと構造的に類似しているが、より小さい正二十面体ヌクレオカプシドを有する。ＡＡＶは、末端に少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有する一本鎖ＤＮＡゲノムを有する非エンベロープウイルスである。例えば、ＡＡＶ２血清型は、末端に２つの１４５ヌクレオチド長のＩＴＲを有する、約４．７キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを有することができる。このウイルスは、ポリメラーゼをコードしないため、ゲノム複製のために細胞ポリメラーゼに依存する。ＩＴＲは、２つのウイルス遺伝子－それぞれ、非構造タンパク質及び構造タンパク質をコードする、ｒｅｐ（複製）及びｃａｐ（カプシド）に隣接する。ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーター及び選択的スプライシングの使用により、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０と呼ばれる４つの調節タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶゲノム複製及びパッケージングに関与している。ｃａｐ遺伝子は、選択的スプライシング及び翻訳の開始によって、３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１（ビリオンタンパク質１）、ＶＰ２及びＶＰ３を生じさせる。ＡＡＶ２についてのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の分子量は、それぞれ、８７、７２、及び６２ｋＤａである。これらのカプシドタンパク質は、６０個のサブユニットのほぼ球形のタンパク質シェルに集合する。ＡＡＶ構造の単純さ及び非病原性の性質は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を有用な遺伝子治療ベクターにする。ＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、複製及び非複製細胞の両方に感染し、宿主細胞のゲノムに組み込まずに導入遺伝子を導入することができる。ｒＡＡＶベクターは、その高い力価、広範な細胞に感染する能力、軽度の免疫応答、及び全体的な安全性のためにしばしば好ましい。ｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、糖尿病及び他の膵臓障害を含む多くの疾患に非常に有用であることが見出されている。
遺伝子治療のためのｒＡＡＶ粒子の産生はまた、様々な不純物を産生する。したがって、ｒＡＡＶ粒子を不純物から効果的に精製するプロセスが依然として必要である。
本発明は、少なくとも一実施形態において、遺伝子治療のためのｒＡＡＶ粒子又は治療上有効なｒＡＡＶ粒子を精製するための方法が開示され、それを提供することによって、先行技術の１つ以上の問題を解決する。精製前に、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ産生不純物も含む組成物中にある。ＡＡＶ産生不純物は、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する第１の部分と、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する第２の部分と、を含む。少なくとも一実施形態の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって組成物から第１の部分を除去し、ゾーン超遠心分離（ＺＵＣ）によって組成物から第２の部分を除去するステップを含む。ＡＥＸ及びＺＵＣステップ後、組成物は、ＡＡＶ産生不純物を実質的に欠いている。改良において、ＡＡＶ産生不純物の第１の部分又は第２の部分は、治療上無効なｒＡＡＶ粒子である。
少なくとも一実施形態において、遺伝子治療のためのｒＡＡＶ粒子又は治療上有効なｒＡＡＶ粒子を精製するための方法が開示される。精製前に、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、治療上無効なｒＡＡＶ粒子も含む組成物中にある。少なくとも一実施形態の方法は、ＡＥＸによって、組成物から治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも一部を除去することを含む。除去ステップの後、少なくとも一実施形態の方法は、ＺＵＣにより組成物を処理することを更に含む。ＡＥＸ及びＺＵＣステップの後、組成物は、治療上無効なｒＡＡＶ粒子を実質的に欠いている。
分析的超遠心分離によって分離されたｒＡＡＶ調製物からの粒子分布プロファイルを示す。 分析的超遠心分離によって分離されたｒＡＡＶ調製物からの粒子分布プロファイルを示す。 ｒＡＡＶに感染した細胞中の導入遺伝子発現に対する軽及び重カプシドを含有するｒＡＡＶ調製物の影響を示す。 ｒＡＡＶに感染した細胞中の導入遺伝子発現に対する軽及び重カプシドを含有するｒＡＡＶ調製物の影響を示す。 ｒＡＡＶに感染した細胞中の導入遺伝子発現に対する軽及び重カプシドを含有するｒＡＡＶ調製物の影響を示す。 ｒＡＡＶに感染した細胞中の導入遺伝子発現に対する軽及び重カプシドを含有するｒＡＡＶ調製物の影響を示す。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 ＨｅｐＧ２細胞に感染している標識した軽及び重カプシドを示す画像である。 様々な実施形態の精製方法のステップのフローチャートである。 様々な実施形態のＡＥＸ処理のステップを示すフローチャートである。 様々な実施形態のＡＥＸ処理後のタンジェンシャルフロー濾過処理のステップを示すフローチャートである。 様々な実施形態のＺＵＣ処理のステップを示すフローチャートである。 様々な実施形態のＡＥＸ処理後のタンジェンシャルフロー濾過処理のステップを示すフローチャートである。 重カプシド、ＺＵＣ軽カプシド、及びＡＥＸ軽カプシドの間のｐＨに対する正味電荷の差を示すゼータ電位分析である。 アニオン交換クロマトグラフィー後のｒＡＡＶ調製物からの粒子分布プロファイルを示す。ｒＡＡＶ調製物を分析的超遠心分離によって分離した。 アニオン交換クロマトグラフィー後のｒＡＡＶ調製物からの軽及び重カプシドの低温電子顕微鏡画像である。矢印は、高密度粒子（すなわち、重カプシド）及び「非高密度」粒子（すなわち、軽カプシド）を示す。 ゾーン超遠心分離を受けているｒＡＡＶ調製物の異なる画分のベクターゲノム力価及び密度を示すグラフである。 ゾーン超遠心分離後のｒＡＡＶ調製物からの粒子分布プロファイルを示す。ｒＡＡＶ調製物を分析的超遠心分離によって分離した。 ゾーン超遠心分離によって分離されたｒＡＡＶ調製物の画分を含有するゲルである。図２３Ａは、ＶＰカプシドタンパク質について染色されたゲルウェスタンブロットである。図２３Ｂは、超遠心分離画分から単離されたＤＮＡを含有するアルカリアガロースゲルである。 ゾーン超遠心分離後のｒＡＡＶ調製物からの軽及び重カプシドの低温電子顕微鏡画像である。矢印は、高密度粒子（すなわち、重カプシド）及び「非高密度」粒子（すなわち、軽カプシド）を示す。 アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離を受けているｒＡＡＶ調製物の分析を示す。図２５Ａは、アニオン交換クロマトグラフィーの間のｒＡＡＶ調製物の吸収スペクトルを示す。図２５Ｂは、ゾーン超遠心分離の間のｒＡＡＶ調製物の異なる画分についてのカプシド及びベクターゲノム力価を示す。 アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離を受けているｒＡＡＶ調製物の分析を示す。図２５Ａは、アニオン交換クロマトグラフィーの間のｒＡＡＶ調製物の吸収スペクトルを示す。図２５Ｂは、ゾーン超遠心分離の間のｒＡＡＶ調製物の異なる画分についてのカプシド及びベクターゲノム力価を示す。 事前のアニオン交換クロマトグラフィー処理を伴う、及び伴わない、ゾーン超遠心分離を受けているｒＡＡＶ調製物の異なる画分についてのカプシド力価を示す。 アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離に供した場合の軽カプシドの分析を示す。図２７Ａは、アニオン交換クロマトグラフィーの間のｒＡＡＶ調製物の吸収スペクトルを示す。図２７Ａの丸で囲まれたピークは、その後、ゾーン超遠心分離によって処理された。図２７Ｂは、ゾーン超遠心分離中の図２７Ａの丸で囲まれたピークの異なる画分についてのカプシド及びベクターゲノム力価を示す。図２７Ｂの丸で囲まれたピークを、再びアニオン交換クロマトグラフィーによって処理した。図２７Ｃは、アニオン交換クロマトグラフィー中の図２７Ｂの丸で囲まれたピークの吸収スペクトルを示す。 ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの親和性樹脂を使用した免疫クロマトグラフィー精製後、アニオン交換クロマトグラフィー処理後、及びゾーン超遠心分離処理後の、不純物であるＲｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶの濃度を示す。図２８は、アニオン交換クロマトグラフィー処理が、治療上有効なｒＡＡＶを含む、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製組成物から、Ｒｅｐタンパク質に関連する十分な濃度のｒＡＡＶを除去したことを強調する。図２８は更に、ゾーン超遠心分離処理が、アニオン交換クロマトグラフィー処理によって除去されなかったＲｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶを更に除去したことを強調している。 アニオン交換クロマトグラフィー処理中のＲｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶの除去を示す。組成物をアニオン交換クロマトグラフィーによって処理した後、Ｒｅｐタンパク質の濃度を評価した。溶出物も洗浄物も、十分な濃度のＲｅｐタンパク質を含有しなかった。アニオン交換クロマトグラフィーカラムを再生成して、充填、洗浄、及び溶出ステップ後に残った不純物を除去したときに、十分な濃度のＲｅｐタンパク質を同定した。 ゾーン超遠心分離処理中のＲｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶの除去を示す。単離された画分（すなわち、「プール」）は、単離されなかった画分（すなわち、「プール後」）と比較して、顕著に低い濃度のＲｅｐタンパク質を有する。封入されたベクターゲノムの濃度は、プール後画分と比較して、プール画分において大幅に増加することにも留意されたい。 ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの親和性樹脂を使用した免疫クロマトグラフィー精製後、アニオン交換クロマトグラフィー処理後、及びゾーン超遠心分離処理後の、不純物である脱アミド化カプシドの除去を示す。図３１は、アニオン交換クロマトグラフィー処理が、治療上有効なｒＡＡＶを含むＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製組成物から十分な濃度の脱アミド化カプシドを除去したことを強調する。図３１は、ゾーン超遠心分離処理が、アニオン交換クロマトグラフィー処理によって除去されなかった脱アミド化カプシドを更に除去したことを更に強調する。 アニオン交換クロマトグラフィー処理中の脱アミド化カプシドの除去を示す。組成物をアニオン交換クロマトグラフィーによって処理した後、脱アミド化カプシドの濃度を評価した。溶出液は、十分に減少した濃度の脱アミド化カプシドを含有した。十分な濃度の脱アミド化カプシドを、溶出した洗浄緩衝液中で同定し、アニオン交換クロマトグラフィーカラムを再生成して、充填、洗浄、及び溶出ステップ後に残った不純物を除去した場合。 ゾーン超遠心分離処理中の脱アミド化カプシドの除去を示す。単離された画分（すなわち、「プール」）は、単離されなかった画分（すなわち、「プール後」）と比較して、顕著に低い濃度の脱アミド化カプシドを有する。封入されたベクターゲノムの濃度は、プール後画分と比較して、プール画分において大幅に増加することにも留意されたい。
必要に応じて、本開示の詳細な実施形態が、本明細書に開示されるが、開示された実施形態は、単なる例示であり、様々な代替形態で実施され得ることが理解されるべきである。
実施例、又は別途明示的に示される場合を除き、材料の量又は反応及び／若しくは使用の条件を示す本明細書における全ての数値量は、「約」という単語によって修飾されるものとして理解されるべきである。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。一例では、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。異なる例において、「約」は、±０．０００１％、±０．０００５％、±０．００１％、±０．００５％、±０．０１％、±０．０５％、±０．１％、±０．５％、±１％、±５％、又は±１０％の変動性を指す。更なる例において、「約」は、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、又は±２％以内であると理解することができる。
文脈から別段で明示されていない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。全ての範囲は、範囲のエンドポイントを含む。頭字語又は他の略語の最初の定義は、同じ略語の本明細書における後続の全ての使用に適用され、最初に定義された略語の通常の文法的変形に準用して適用される。そして、明示的に反対に述べられていない限り、特性の測定は、同じ特性について以前又は後で参照されるものと同じ技術によって決定される。
別途示されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
特定の構成要素及び／又は条件は、もちろん、変化し得るため、本開示は、以下に記載される特定の実施形態及び方法に限定されないことも理解されたい。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、いかなる方法でも限定することを意図しない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことにも留意されたい。例えば、単数形の構成要素への言及は、複数の構成要素を含むことが意図される。
「又は」及び「及び」という用語は、互換的に使用することができ、「及び／又は」を意味すると理解することができる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「とともに」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である。これらの用語は、包括的かつオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素又は方法のステップを除外するものではない。
「からなる」という語句は、特許請求の範囲に指定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。この語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に表示された場合、その条項に記載されている要素のみを限定し、他の要素は全体として特許請求の範囲から除外されない。
「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、指定された材料又はステップに加えて、特許請求の範囲の主題の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語は、代替的に使用することができる。これらの３つの用語のうちの１つが使用される場合、本開示及び特許請求の範囲の主題は、他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」、「異種配列」、「異種」、「異種調節配列」、「異種導入遺伝子」、又は「導入遺伝子」という用語は、参照される遺伝子又は調節配列が、ＡＡＶベクター又は粒子中には天然に存在せず、その中に人工的に導入されることを意味する。例えば、これらの用語は、異種遺伝子、及び宿主細胞中でその遺伝子の発現を制御する異種遺伝子に作動可能に連結された異種調節配列の両方を含む核酸を指す。本明細書の導入遺伝子は、生体分子（例えば、治療用生体分子）、例えば、タンパク質（例えば、酵素）、ポリペプチド、ペプチド、ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、小ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡ）、遺伝子若しくは塩基編集システムの１つ以上の成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）媒介性エクソンスキッピング、ナンセンス媒介性崩壊（ＮＭＤ）を引き起こす毒エクソン、又はドミナントネガティブ変異体をコードできることが企図されている。
「ベクター」という用語は、核酸分子、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、バクミド、ミニプラスミド（例えば、細菌エレメントを欠くプラスミド）、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（例えば、最小限の閉鎖線形構築物）、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝子エレメントを指すものと理解され、これは適切な制御エレメントと会合したときに複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移行することができる。「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞又はインビトロ発現系によって供給され得る。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、裸又はリポソームに含まれる）、人工染色体、及び組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルスなどの、当該技術分野で既知の全てのものが含まれる。
「組換え」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用することによって形成される核酸分子又はタンパク質を指す。例えば、組換え核酸分子は、核酸配列及び配列エレメントを組み合わせることによって形成することができる。組換えタンパク質は、組換え核酸分子を受けた細胞によって産生されるタンパク質であり得る。
「コードする」、「コードされた」、及び「コードすること」という用語は、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの核酸分子におけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生体系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表で提供されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖との両方が、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすることと称され得る。
本発明は、遺伝子治療のためのｒＡＡＶ粒子又は治療上有効なｒＡＡＶ粒子を精製する方法に関する。治療上有効なｒＡＡＶ粒子には、例えば、ＵＳ９，５０４，７６２、ＷＯ２０１９／２２２１３６、ＵＳ２０１９／０３７６０８１、及びＷＯ２０１９／２１７５１３に開示されているように、既知の方法に開示されているか、又はそれに従って作製され得るｒＡＡＶ粒子が含まれ、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明によれば、ｒＡＡＶ粒子の産生は、治療上無効なｒＡＡＶ粒子を含む様々な不純物を産生する非効率的なプロセスである。これらの不純物は、治療上有効なｒＡＡＶ粒子を不純物から更に分離する精製技術の能力を制限する。この目的のために、本発明者らは、治療上有効なｒＡＡＶ粒子を不純物から単離する方法を開発することによって、現在の最新技術の限界を解決した。
様々な実施形態において、治療上有効なｒＡＡＶ粒子及び治療上無効なｒＡＡＶ粒子を含むＡＡＶ産生不純物を含む組成物から治療上有効なｒＡＡＶ粒子を精製する方法及びプロセス。様々な実施形態の組成物は、ｒＡＡＶ粒子の産生である。ＡＡＶ産生不純物はまた、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する不純物、又はＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する不純物を含み得る。
様々な実施形態の方法及びプロセスは、組成物をＡＥＸに供することを含み、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する不純物が、組成物から除去される。これらの不純物は、治療上無効なｒＡＡＶ粒子を含む。治療上有効なｒＡＡＶ粒子の精製のためのＺＵＣの使用は、治療上有効なｒＡＡＶ粒子よりも可溶性が低く、凝集しやすい、治療上無効なｒＡＡＶ粒子の存在のために実質的に制限されることが発見された。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの特性は、治療上有効なｒＡＡＶ粒子を単離するＺＵＣの能力に過負荷をかけ得る。例えば、ＡＥＸ処理のない治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、ＺＵＣ中に沈殿し、治療上有効なｒＡＡＶ粒子からの分離を阻止し得る。この目的のために、ＡＥＸは、治療上有効なｒＡＡＶ粒子の濃度を増加させた組成物が、ＺＵＣによって効率的に充填及び処理され得るように、組成物から十分な量の治療上無効なｒＡＡＶ粒子を除去する。例えば、増加した濃度の治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、ＺＵＣによって毎回処理することができる経済的に実行可能な量である。例えば、ＡＥＸ処理は、１充填当たり少なくとも０．１×１０ｅ１６ベクターゲノム（ｖｇ）の力価を、１充填当たり１０×１０ｅ１７ｖｇまで、ＺＵＣによって処理することを可能にし得る。様々な実施形態において、治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、関連するＲｅｐタンパク質を有するカプシドを含む。他の実施形態において、治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、脱アミド化Ｎ末端アミノ酸を有する１つ以上のＶＰ１タンパク質を有するカプシドを含む。
様々な改良において、ＡＥＸは、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する不純物の少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９＋％、又は１００％を除去又は除去する。他の改良において、ＡＥＸによって除去される不純物のパーセンテージは、上記で提供されたいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。様々な改良において、ＡＥＸは、組成物から治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は９９％＋を除去又は除去する。他の改良において、ＡＥＸによって組成物から除去された治療上無効なｒＡＡＶ粒子のパーセンテージは、上記で提供されたいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸは、ＺＵＣによる組成物の後続処理を可能にするか、又は元の組成物が、ＺＵＣによって処理される、より多くの量の治療上有効なｒＡＡＶ粒子を有することを可能にする。
様々な改良において、ＡＥＸは、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６、少なくとも３．７、少なくとも３．８、少なくとも３．９、少なくとも４、少なくとも４．１、少なくとも４．２、少なくとも４．３、少なくとも４．４、少なくとも４．５、少なくとも４．６、少なくとも４．７、少なくとも４．８、少なくとも４．９、少なくとも５、少なくとも５．１、少なくとも５．２、少なくとも５．３、少なくとも５．４、少なくとも５．５、少なくとも５．６、少なくとも５．７、少なくとも５．８、少なくとも５．９、少なくとも６、少なくとも６．１、少なくとも６．２、少なくとも６．３、少なくとも６．４、少なくとも６．５、少なくとも６．６、少なくとも６．７、少なくとも６．８、少なくとも６．９、又は少なくとも７の少なくともＬｏｇ１０値まで組成物中の汚染ウイルス濃度を低下させる。
様々な改良において、ＡＥＸステップは、強い塩基性アニオン交換樹脂を含有する膜フィルター又はカラムを通して組成物を処理することを含む。強塩基性アニオン交換樹脂の例としては、四級化ポリエチレンイミンが挙げられ、Ｉ型樹脂は、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）などのトリメチルアンモニウム基を有し、ＩＩ型樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）などのジメチルエタノールアミン基を有する。強塩基性アニオン交換樹脂を有するフィルター又はカラムの例としては、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（Ｐａｌｌ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＰＯＲＯＳ ５０ ＸＱ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ｑ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ－ＱＡ（ＢＩＡ分離）、Ｎｕｖｉａ Ｑ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｍｏｎｏ Ｑ（Ｃｙｔｉｖａ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｑ－ＳＴＡＴ（ＴＯＳＯＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳｕｐｅｒＱ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ Ｉｍｐｒｅｓ（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ、Ｃｙｔｉｖａ）が挙げられる。弱塩基性アニオン交換樹脂の例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジメチルアミノプロピル、又はジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）が挙げられる。弱塩基性アニオン交換樹脂を有するフィルター及びカラムの例としては、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ ＰＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｐｏｒｏｓ ５０ Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＰＯＲＯＳ５０ＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ（Ｍ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ ＤＥＡＥ Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＤＥＡＥ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＮＨ２－７５０Ｆ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ６５０ Ｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。ＡＥＸで使用するための好適な緩衝液及び緩衝剤には、例えば、Ｎ－メチルピペラジン、ピペラジン、ビス－トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、ビス－トリスプロパン、ＭＥＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＢＴＰ、リン酸緩衝液Ｎ－メチルジエタノールアミン、１，３－ジアミノプロパン、エタノールアミン、酢酸ナトリウム若しくは酢酸リチウムなどの酢酸、又はクエン酸塩などの様々な供給源から与えられたイオンが挙げられ得る。様々な改良において、カラムのベッドの高さは、少なくとも７センチメートル（ｃｍ）、７ｃｍ、７．１ｃｍ、７．２ｃｍ、７．３ｃｍ、７．４ｃｍ、７．５ｃｍ、７．６ｃｍ、７．７ｃｍ、７．８ｃｍ、７．９ｃｍ、８ｃｍ、８．１ｃｍ、８．２ｃｍ、８．３ｃｍ、８．４ｃｍ、８．５ｃｍ、８．６ｃｍ、８．７ｃｍ、８．８ｃｍ、８．９ｃｍ、９ｃｍ、９．１ｃｍ、９．２ｃｍ、９．３ｃｍ、９．４ｃｍ、９．５ｃｍ、９．６ｃｍ、９．７ｃｍ、９．８ｃｍ、９．９ｃｍ、１０ｃｍ、１０．１ｃｍ、１０．２ｃｍ、１０．３ｃｍ、１０．４ｃｍ、１０．５ｃｍ、１０．６ｃｍ、１０．７ｃｍ、１０．８ｃｍ、１０．９ｃｍ、１１ｃｍ、１１．１ｃｍ、１１．２ｃｍ、１１．３ｃｍ、１１．４ｃｍ、１１．５ｃｍ、１１．６ｃｍ、１１．７ｃｍ、１１．８ｃｍ、１１．９ｃｍ、１２ｃｍ、１２．１ｃｍ、１２．２ｃｍ、１２．３ｃｍ、１２．４ｃｍ、１２．５ｃｍ、１２．６ｃｍ、１２．７ｃｍ、１２．８ｃｍ、１２．９ｃｍ、１３ｃｍ、１３．１ｃｍ、１３．２ｃｍ、１３．３ｃｍ、１３．４ｃｍ、１３．５ｃｍ、１３．６ｃｍ、１３．７ｃｍ、１３．８ｃｍ、１３．９ｃｍ、１４ｃｍ、１４．１ｃｍ、１４．２ｃｍ、１４．３ｃｍ、１４．４ｃｍ、１４．５ｃｍ、１４．６ｃｍ、１４．７ｃｍ、１４．８ｃｍ、１４．９ｃｍ、又は１５ｃｍである。他の改良において、カラムのベッドの高さは、１５ｃｍ超（１５．１ｃｍ、１５．２ｃｍ、１５．３ｃｍ、１５．４ｃｍ、１５．５ｃｍ、１５．６ｃｍ、１５．７ｃｍ、１５．８ｃｍ、１５．９ｃｍ、１６ｃｍ、１６．１ｃｍ、１６．２ｃｍ、１６．３ｃｍ、１６．４ｃｍ、１６．５ｃｍ、１６．６ｃｍ、１６．７ｃｍ、１６．８ｃｍ、１６．９ｃｍ、１７ｃｍ、１７．１ｃｍ、１７．２ｃｍ、１７．３ｃｍ、１７．４ｃｍ、１７．５ｃｍ、１７．６ｃｍ、１７．７ｃｍ、１７．８ｃｍ、１７．９ｃｍ、１８ｃｍ、１８．１ｃｍ、１８．２ｃｍ、１８．３ｃｍ、１８．４ｃｍ、１８．５ｃｍ、１８．６ｃｍ、１８．７ｃｍ、１８．８ｃｍ、１８．９ｃｍ、１９ｃｍ、１９．１ｃｍ、１９．２ｃｍ、１９．３ｃｍ、１９．４ｃｍ、１９．５ｃｍ、１９．６ｃｍ、１９．７ｃｍ、１９．８ｃｍ、１９．９ｃｍ、２０ｃｍ、２０．１ｃｍ、２０．２ｃｍ、２０．３ｃｍ、２０．４ｃｍ、２０．５ｃｍ、２０．６ｃｍ、２０．７ｃｍ、２０．８ｃｍ、２０．９ｃｍ、２１ｃｍ、２１．１ｃｍ、２１．２ｃｍ、２１．３ｃｍ、２１．４ｃｍ、２１．５ｃｍ、２１．６ｃｍ、２１．７ｃｍ、２１．８ｃｍ、２１．９ｃｍ、２２ｃｍ、２２．１ｃｍ、２２．２ｃｍ、２２．３ｃｍ、２２．４ｃｍ、２２．５ｃｍ、２２．６ｃｍ、２２．７ｃｍ、２２．８ｃｍ、２２．９ｃｍ、２３ｃｍ、２３．１ｃｍ、２３．２ｃｍ、２３．３ｃｍ、２３．４ｃｍ、２３．５ｃｍ、２３．６ｃｍ、２３．７ｃｍ、２３．８ｃｍ、２３．９ｃｍ、２４ｃｍ、２４．１ｃｍ、２４．２ｃｍ、２４．３ｃｍ、２４．４ｃｍ、２４．５ｃｍ、２４．６ｃｍ、２４．７ｃｍ、２４．８ｃｍ、２４．９ｃｍ、２５ｃｍ、２５．１ｃｍ、２５．２ｃｍ、２５．３ｃｍ、２５．４ｃｍ、２５．５ｃｍ、２５．６ｃｍ、２５．７ｃｍ、２５．８ｃｍ、２５．９ｃｍ、２６ｃｍ、２６．１ｃｍ、２６．２ｃｍ、２６．３ｃｍ、２６．４ｃｍ、２６．５ｃｍ、２６．６ｃｍ、２６．７ｃｍ、２６．８ｃｍ、２６．９ｃｍ、２７ｃｍ、２７．１ｃｍ、２７．２ｃｍ、２７．３ｃｍ、２７．４ｃｍ、２７．５ｃｍ、２７．６ｃｍ、２７．７ｃｍ、２７．８ｃｍ、２７．９ｃｍ、２８ｃｍ、２８．１ｃｍ、２８．２ｃｍ、２８．３ｃｍ、２８．４ｃｍ、２８．５ｃｍ、２８．６ｃｍ、２８．７ｃｍ、２８．８ｃｍ、２８．９ｃｍ、２９ｃｍ、２９．１ｃｍ、２９．２ｃｍ、２９．３ｃｍ、２９．４ｃｍ、２９．５ｃｍ、２９．６ｃｍ、２９．７ｃｍ、２９．８ｃｍ、２９．９ｃｍ、３０ｃｍ）である。他の改良において、カラムのベッドの高さは、上記で提供されたいずれか２つのベッドの高さの間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ操作は、少なくとも６、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、又は１１のｐＨで行われる。他の改良において、ＡＥＸ操作が行われるｐＨは、上記で提供されたいずれか２つのｐＨの間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ操作は、少なくともセ氏４度（℃）、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、又は３６℃の温度で行われる。他の改良において、ＡＥＸ操作が行われる温度は、上記で提供されたいずれか２つの温度の間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ処理のためにＡＥＸカラムに充填された組成物は、少なくとも１リットル当たり０．１×１０ｅ１６ベクターゲノム（ｖｇ／Ｌ）、０１５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、０．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、１×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、１．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、２×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、２．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、３×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、３．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、４×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、４．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、５．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、６×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、６．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、７×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、７．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、８×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、８．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、９×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、９．５×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌ、又は１０×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌの力価を有する。他の改良において、力価は、上記で提供されたいずれか２つの力価の間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ処理のためにＡＥＸカラムに充填された組成物は、少なくとも０．０ミリジーメンス／センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）、０．０ｍＳ／ｃｍ、０．００１ｍＳ／ｃｍ、０．００２ｍＳ／ｃｍ、０．００３ｍＳ／ｃｍ、０．００４ｍＳ／ｃｍ、０．００５ｍＳ／ｃｍ、０．００６ｍＳ／ｃｍ、０．００７ｍＳ／ｃｍ、０．００８ｍＳ／ｃｍ、０．００９ｍＳ／ｃｍ、０．０１ｍＳ／ｃｍ、０．０２ｍＳ／ｃｍ、０．０３ｍＳ／ｃｍ、０．０４ｍＳ／ｃｍ、０．０５ｍＳ／ｃｍ、０．０６ｍＳ／ｃｍ、０．０７ｍＳ／ｃｍ、０．０８ｍＳ／ｃｍ、０．０９ｍＳ／ｃｍ、０．１ｍＳ／ｃｍ、０．１ｍＳ／ｃｍ、０．２ｍＳ／ｃｍ、０．３ｍＳ／ｃｍ、０．４ｍＳ／ｃｍ、０．５ｍＳ／ｃｍ、０．６ｍＳ／ｃｍ、０．７ｍＳ／ｃｍ、０．８ｍＳ／ｃｍ、０．９ｍＳ／ｃｍ、１ｍＳ／ｃｍ、１．１ｍＳ／ｃｍ、１．２ｍＳ／ｃｍ、１．３ｍＳ／ｃｍ、１．４ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、１．６ｍＳ／ｃｍ、１．７ｍＳ／ｃｍ、１．８ｍＳ／ｃｍ、１．９ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、２．１ｍＳ／ｃｍ、２．２ｍＳ／ｃｍ、２．３ｍＳ／ｃｍ、２．４ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、２．６ｍＳ／ｃｍ、２．７ｍＳ／ｃｍ、２．８ｍＳ／ｃｍ、２．９ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、３．１ｍＳ／ｃｍ、３．２ｍＳ／ｃｍ、３．３ｍＳ／ｃｍ、３．４ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、３．６ｍＳ／ｃｍ、３．７ｍＳ／ｃｍ、３．８ｍＳ／ｃｍ、３．９ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、４．１ｍＳ／ｃｍ、４．２ｍＳ／ｃｍ、４．３ｍＳ／ｃｍ、４．４ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、４．６ｍＳ／ｃｍ、４．７ｍＳ／ｃｍ、４．８ｍＳ／ｃｍ、４．９ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、５．１ｍＳ／ｃｍ、５．２ｍＳ／ｃｍ、５．３ｍＳ／ｃｍ、５．４ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、５．６ｍＳ／ｃｍ、５．７ｍＳ／ｃｍ、５．８ｍＳ／ｃｍ、５．９ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、６．１ｍＳ／ｃｍ、６．２ｍＳ／ｃｍ、６．３ｍＳ／ｃｍ、６．４ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、６．６ｍＳ／ｃｍ、６．７ｍＳ／ｃｍ、６．８ｍＳ／ｃｍ、６．９ｍＳ／ｃｍ、又は７ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。他の改良において、ＡＥＸ処理のためにＡＥＸカラムに充填された組成物は、１ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。他の改良において、ＡＥＸカラムに充填された組成物の導電率は、上記で提供されたいずれか２つの導電率の間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ処理のためにＡＥＸカラムに充填された組成物は、少なくとも７、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、又は１１のｐＨを有する。他の改良において、ＡＥＸカラムに充填された組成物のｐＨは、上記で提供されたいずれか２つのｐＨの間の範囲である。
様々な改良において、カラムは、組成物を、ＡＥＸカラムを通して流した後、緩衝液で洗浄される。様々な改良において、洗浄緩衝液の導電率は、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、１ｍＳ／ｃｍ、１．１ｍＳ／ｃｍ、１．２ｍＳ／ｃｍ、１．３ｍＳ／ｃｍ、１．４ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、１．６ｍＳ／ｃｍ、１．７ｍＳ／ｃｍ、１．８ｍＳ／ｃｍ、１．９ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、２．１ｍＳ／ｃｍ、２．２ｍＳ／ｃｍ、２．３ｍＳ／ｃｍ、２．４ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、２．６ｍＳ／ｃｍ、２．７ｍＳ／ｃｍ、２．８ｍＳ／ｃｍ、２．９ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、３．１ｍＳ／ｃｍ、３．２ｍＳ／ｃｍ、３．３ｍＳ／ｃｍ、３．４ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、３．６ｍＳ／ｃｍ、３．７ｍＳ／ｃｍ、３．８ｍＳ／ｃｍ、３．９ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、４．１ｍＳ／ｃｍ、４．２ｍＳ／ｃｍ、４．３ｍＳ／ｃｍ、４．４ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、４．６ｍＳ／ｃｍ、４．７ｍＳ／ｃｍ、４．８ｍＳ／ｃｍ、４．９ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、５．１ｍＳ／ｃｍ、５．２ｍＳ／ｃｍ、５．３ｍＳ／ｃｍ、５．４ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、５．６ｍＳ／ｃｍ、５．７ｍＳ／ｃｍ、５．８ｍＳ／ｃｍ、５．９ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、６．１ｍＳ／ｃｍ、６．２ｍＳ／ｃｍ、６．３ｍＳ／ｃｍ、６．４ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、６．６ｍＳ／ｃｍ、６．７ｍＳ／ｃｍ、６．８ｍＳ／ｃｍ、６．９ｍＳ／ｃｍ、又は７ｍＳ／ｃｍである。他の改良において、洗浄緩衝液の導電率は、７ｍＳ／ｃｍ超である。他の改良において、洗浄緩衝液の導電率は、上記で提供されたいずれか２つの導電率の間の範囲である。
カラムを様々な実施形態の洗浄緩衝液で洗浄する場合、カラムから出る洗浄緩衝液の２６０ナノメートル（ｎｍ）及び２８０ｎｍ波長での紫外線（ＵＶ）吸光度をモニタリングし、２６０ｎｍ波長対２８０ｎｍ波長の比（Ａ２６０：Ａ２８０）を計算することにより、ヒューマンエラー及び異なる精製間の変動を排除することができる。様々な改良において、カラムから出る洗浄緩衝液のＡ２６０：Ａ２８０は、少なくとも０．５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、又は１．５である。他の改良において、カラムから出る洗浄緩衝液のＡ２６０：Ａ２８０比は、上記で提供されたいずれか２つの比の間の範囲である。
様々な改良において、組成物は、洗浄緩衝液でＡＥＸカラムを洗浄した後、ある濃度の緩衝剤を含有する溶出緩衝液で溶出される。様々な改良において、緩衝剤の濃度は、少なくとも０．５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４１ｍＭ、４２ｍＭ、４３ｍＭ、４４ｍＭ、４５ｍＭ、４６ｍＭ、４７ｍＭ、４８ｍＭ、４９ｍＭ、５０ｍＭ、５１ｍＭ、５２ｍＭ、５３ｍＭ、５４ｍＭ、５５ｍＭ、５６ｍＭ、５７ｍＭ、５８ｍＭ、５９ｍＭ、６０ｍＭ、６１ｍＭ、６２ｍＭ、６３ｍＭ、６４ｍＭ、６５ｍＭ、６６ｍＭ、６７ｍＭ、６８ｍＭ、６９ｍＭ、７０ｍＭ、７１ｍＭ、７２ｍＭ、７３ｍＭ、７４ｍＭ、７５ｍＭ、７６ｍＭ、７７ｍＭ、７８ｍＭ、７９ｍＭ、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、１２０ｍＭ、１２１ｍＭ、１２２ｍＭ、１２３ｍＭ、１２４ｍＭ、１２５ｍＭ、１２６ｍＭ、１２７ｍＭ、１２８ｍＭ、１２９ｍＭ、１３０ｍＭ、１３１ｍＭ、１３２ｍＭ、１３３ｍＭ、１３４ｍＭ、１３５ｍＭ、１３６ｍＭ、１３７ｍＭ、１３８ｍＭ、１３９ｍＭ、１４０ｍＭ、１４１ｍＭ、１４２ｍＭ、１４３ｍＭ、１４４ｍＭ、１４５ｍＭ、１４６ｍＭ、１４７ｍＭ、１４８ｍＭ、１４９ｍＭ、１５０ｍＭ、１５１ｍＭ、１５２ｍＭ、１５３ｍＭ、１５４ｍＭ、１５５ｍＭ、１５６ｍＭ、１５７ｍＭ、１５８ｍＭ、１５９ｍＭ、１６０ｍＭ、１６１ｍＭ、１６２ｍＭ、１６３ｍＭ、１６４ｍＭ、１６５ｍＭ、１６６ｍＭ、１６７ｍＭ、１６８ｍＭ、１６９ｍＭ、１７０ｍＭ、１７１ｍＭ、１７２ｍＭ、１７３ｍＭ、１７４ｍＭ、又は１７５ｍＭである。他の改良において、緩衝剤の濃度は、上記で提供されたいずれか２つの濃度の間の範囲である。様々な改良の溶出緩衝液はまた、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、１ｍＳ／ｃｍ、１．１ｍＳ／ｃｍ、１．２ｍＳ／ｃｍ、１．３ｍＳ／ｃｍ、１．４ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、１．６ｍＳ／ｃｍ、１．７ｍＳ／ｃｍ、１．８ｍＳ／ｃｍ、１．９ｍＳ／ｃｍ、２ｍＳ／ｃｍ、２．１ｍＳ／ｃｍ、２．２ｍＳ／ｃｍ、２．３ｍＳ／ｃｍ、２．４ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ、２．６ｍＳ／ｃｍ、２．７ｍＳ／ｃｍ、２．８ｍＳ／ｃｍ、２．９ｍＳ／ｃｍ、３ｍＳ／ｃｍ、３．１ｍＳ／ｃｍ、３．２ｍＳ／ｃｍ、３．３ｍＳ／ｃｍ、３．４ｍＳ／ｃｍ、３．５ｍＳ／ｃｍ、３．６ｍＳ／ｃｍ、３．７ｍＳ／ｃｍ、３．８ｍＳ／ｃｍ、３．９ｍＳ／ｃｍ、４ｍＳ／ｃｍ、４．１ｍＳ／ｃｍ、４．２ｍＳ／ｃｍ、４．３ｍＳ／ｃｍ、４．４ｍＳ／ｃｍ、４．５ｍＳ／ｃｍ、４．６ｍＳ／ｃｍ、４．７ｍＳ／ｃｍ、４．８ｍＳ／ｃｍ、４．９ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ、５．１ｍＳ／ｃｍ、５．２ｍＳ／ｃｍ、５．３ｍＳ／ｃｍ、５．４ｍＳ／ｃｍ、５．５ｍＳ／ｃｍ、５．６ｍＳ／ｃｍ、５．７ｍＳ／ｃｍ、５．８ｍＳ／ｃｍ、５．９ｍＳ／ｃｍ、６ｍＳ／ｃｍ、６．１ｍＳ／ｃｍ、６．２ｍＳ／ｃｍ、６．３ｍＳ／ｃｍ、６．４ｍＳ／ｃｍ、６．５ｍＳ／ｃｍ、６．６ｍＳ／ｃｍ、６．７ｍＳ／ｃｍ、６．８ｍＳ／ｃｍ、６．９ｍＳ／ｃｍ、７ｍＳ／ｃｍ、７．１ｍＳ／ｃｍ、７．２ｍＳ／ｃｍ、７．３ｍＳ／ｃｍ、７．４ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、７．６ｍＳ／ｃｍ、７．７ｍＳ／ｃｍ、７．８ｍＳ／ｃｍ、７．９ｍＳ／ｃｍ、８ｍＳ／ｃｍ、８．１ｍＳ／ｃｍ、８．２ｍＳ／ｃｍ、８．３ｍＳ／ｃｍ、８．４ｍＳ／ｃｍ、８．５ｍＳ／ｃｍ、８．６ｍＳ／ｃｍ、８．７ｍＳ／ｃｍ、８．８ｍＳ／ｃｍ、８．９ｍＳ／ｃｍ、９ｍＳ／ｃｍ、９．１ｍＳ／ｃｍ、９．２ｍＳ／ｃｍ、９．３ｍＳ／ｃｍ、９．４ｍＳ／ｃｍ、９．５ｍＳ／ｃｍ、９．６ｍＳ／ｃｍ、９．７ｍＳ／ｃｍ、９．８ｍＳ／ｃｍ、９．９ｍＳ／ｃｍ、又は１０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。他の改良において、溶出緩衝液の導電率は、上記で提供されたいずれか２つの導電率の間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸ操作は、ＡＥＸカラムを通した組成物の処理を含み、洗浄ステップ、又は溶出ステップは、少なくとも５０センチメートル／時（ｃｍ／ｈｒ）、５０ｃｍ／ｈｒ、５５ｃｍ／ｈｒ、６０ｃｍ／ｈｒ、６５ｃｍ／ｈｒ、７０ｃｍ／ｈｒ、７５ｃｍ／ｈｒ、８０ｃｍ／ｈｒ、８５ｃｍ／ｈｒ、９０ｃｍ／ｈｒ、９５ｃｍ／ｈｒ、１００ｃｍ／ｈｒ、１０５ｃｍ／ｈｒ、１１０ｃｍ／ｈｒ、１１５ｃｍ／ｈｒ、１２０ｃｍ／ｈｒ、１２５ｃｍ／ｈｒ、１３０ｃｍ／ｈｒ、１３５ｃｍ／ｈｒ、１４０ｃｍ／ｈｒ、１４５ｃｍ／ｈｒ、１５０ｃｍ／ｈｒ、１５５ｃｍ／ｈｒ、１６０ｃｍ／ｈｒ、１７０ｃｍ／ｈｒ、１８０ｃｍ／ｈｒ、１９０ｃｍ／ｈｒ、２００ｃｍ／ｈｒ、２１０ｃｍ／ｈｒ、２２０ｃｍ／ｈｒ、２３０ｃｍ／ｈｒ、２４０ｃｍ／ｈｒ、２５０ｃｍ／ｈｒ、２６０ｃｍ／ｈｒ、２７０ｃｍ／ｈｒ、２８０ｃｍ／ｈｒ、２９０ｃｍ／ｈｒ、又は３００ｃｍ／ｈｒの流量で行われる。他の改良において、ＡＥＸ操作が行われる流量は、上記で提供されたいずれか２つの流量の間の範囲である。
溶出ステップの間、溶出される組成物が、光路長で２６０ｎｍの波長（Ａ２６０）でＵＶ吸光度に達すると、組成物の収集が開始する。様々な改良において、溶出される組成物が、少なくとも０．１吸光度単位（ＡＵ）／ｃｍ、０．１ＡＵ／ｃｍ、０．１５ＡＵ／ｃｍ、０．２ＡＵ／ｃｍ、０．２５ＡＵ／ｃｍ、０．３ＡＵ／ｃｍ、０．３５ＡＵ／ｃｍ、０．４ＡＵ／ｃｍ、０．４５ＡＵ／ｃｍ、０．５ＡＵ／ｃｍ、０．５５ＡＵ／ｃｍ、０．６ＡＵ／ｃｍ、０．６５ＡＵ／ｃｍ、０．７ＡＵ／ｃｍ、０．７５ＡＵ／ｃｍ、０．８ＡＵ／ｃｍ、０．８５ＡＵ／ｃｍ、０．９ＡＵ／ｃｍ、０．９５ＡＵ／ｃｍ、又は１ＡＵ／ｃｍに達すると、組成物の収集が開始する。他の改良において、収集開始時の吸光度は、上記で提供されたいずれか２つの吸光度の間の範囲である。
溶出ステップの間、溶出される組成物が、組成物が到達する最大Ａ２６０のパーセンテージであるＡ２６０に達したときに組成物の収集は終了する。種々の改良において、パーセンテージは、少なくとも０．１％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、又は２５％である。他の改良において、最大Ａ２６０のパーセンテージは、上記で提供されたいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。
様々な改良において、ＡＥＸカラムから溶出した組成物又は溶出液のｐＨは、少なくとも６、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、又は１１であるか、又はそれらに調整される。他の改良において、ＡＥＸカラムから溶出した組成物のｐＨは、上記で提供されたいずれか２つのｐＨの間の範囲である。
様々な実施形態の方法及びプロセスは、組成物をＺＵＣに供することを含み、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する不純物が、組成物から除去される。
様々な改良において、ＺＵＣは、治療上有効なｒＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する不純物の少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９＋％、又は１００％を除去又は除去する。他の改良において、ＺＵＣによって除去される不純物のパーセンテージは、上記で提供されたいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。様々な改良において、ＺＵＣは、組成物中の汚染ウイルス濃度を、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６、少なくとも３．７、少なくとも３．８、少なくとも３．９、又は少なくとも４の少なくともＬｏｇ１０値低下させる。
ＺＵＣ処理の様々な改良において、勾配化合物が組成物に加えられ、組成物は、ゾーン超遠心分離のためにローター内のクッション層とオーバーレイ層との間に充填される。ＺＵＣが完了した後、置換溶液がローターにポンプで送られて、クッション層、組成物、及びオーバーレイ層をＺＵＣローターから強制的に取り出す。あるいは、クッション層、組成物、及びオーバーレイ層は、置換溶液を使用せずにＺＵＣローターからポンプで送られる。層を有するＺＵＣローターの充填及び非充填の両方において、ＺＵＣローターは回転していてもよいか、又は静止していてもよい。ＺＵＣ処理では、オーバーレイ層が、最初に回転しているか、又は静止したＺＵＣローターにポンプで送られ、続いて、勾配化合物及びクッション層を有する組成物がポンプで送られる。クッション層、オーバーレイ層、及び置換溶液はまた、勾配化合物を含有する。勾配形成組成物の例としては、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、イオジキサノール、又はスクロースが挙げられる。クッション層は、粒子（例えば、治療上有効なｒＡＡＶ）が、ローターの壁に対してペレット化するのを防ぎ、オーバーレイ層は、粒子が、勾配化合物によって形成された勾配から移動するのを防ぐ。改良では、クッション層、組成物、及びオーバーレイ層中の勾配化合物の濃度は互いに異なる。他の改良では、クッション層中の勾配化合物の濃度は、組成物よりも大きい。更なる改良では、化合物中の勾配の濃度は、オーバーレイ層よりも大きい。
様々な改良において、クッション層、組成物、オーバーレイ層、又は置換溶液中の勾配化合物の濃度は、少なくとも１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、又は７５％である。他の改良において、クッション層、組成物、オーバーレイ層、又は置換溶液中の勾配化合物の濃度は、上記で提供されたいずれか２つの濃度の範囲である。
様々な改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるオーバーレイ層の重量は、少なくとも１１７グラム、１１７ｇ、１１８ｇ、１１９ｇ、１２０ｇ、１２１ｇ、１２２ｇ、１２３ｇ、１２４ｇ、１２５ｇ、１２６ｇ、１２７ｇ、１２８ｇ、１２９ｇ、１３０ｇ、１３１ｇ、１３２ｇ、１３３ｇ、１３４ｇ、１３５ｇ、１３６ｇ、１３７ｇ、１３８ｇ、１３９ｇ、１４０ｇ、１４１ｇ、１４２ｇ、１４３ｇ、１４４ｇ、１４５ｇ、１４６ｇ、１４７ｇ、１４８ｇ、１４９ｇ、１５０ｇ、１５１ｇ、１５２ｇ、１５３ｇ、１５４ｇ、１５５ｇ、１５６ｇ、１５７ｇ、１５８ｇ、１５９ｇ、１６０ｇ、１６１ｇ、１６２ｇ、１６３ｇ、１６４ｇ、１６５ｇ、１６６ｇ、１６７ｇ、１６８ｇ、１６９ｇ、１７０ｇ、１７１ｇ、１７２ｇ、１７３ｇ、１７４ｇ、１７５ｇ、１７６ｇ、１７７ｇ、１７８ｇ、１７９ｇ、１８０ｇ、１８１ｇ、１８２ｇ、１８３ｇ、１８４ｇ、１８５ｇ、１８６ｇ、１８７ｇ、１８８ｇ、１８９ｇ、１９０ｇ、１９１ｇ、１９２ｇ、１９３ｇ、１９４ｇ、１９５ｇ、１９６ｇ、１９７ｇ、１９８ｇ、１９９ｇ、２００ｇ、２０１ｇ、２０２ｇ、２０３ｇ、２０４ｇ、２０５ｇ、２０６ｇ、２０７ｇ、２０８ｇ、２０９ｇ、２１０ｇ、２１１ｇ、２１２ｇ、２１３ｇ、２１４ｇ、２１５ｇ、２１６ｇ、２１７ｇ、２１８ｇ、２１９ｇ、２２０ｇ、２２１ｇ、２２２ｇ、２２３ｇ、２２４ｇ、２２５ｇ、２２６ｇ、２２７ｇ、２２８ｇ、２２９ｇ、２３０ｇ、２３１ｇ、２３２ｇ、２３３ｇ、２３４ｇ、２３５ｇ、２３６ｇ、２３７ｇ、２３８ｇ、２３９ｇ、２４０ｇ、２４１ｇ、２４２ｇ、２４３ｇ、２４４ｇ、２４５ｇ、２４６ｇ、２４７ｇ、２４８ｇ、２４９ｇ、２５０ｇ、２５１ｇ、２５２ｇ、２５３ｇ、２５４ｇ、２５５ｇ、２５６ｇ、２５７ｇ、２５８ｇ、２５９ｇ、２６０ｇ、２６１ｇ、２６２ｇ、２６３ｇ、２６４ｇ、２６５ｇ、２６６ｇ、２６７ｇ、２６８ｇ、２６９ｇ、２７０ｇ、２７１ｇ、２７２ｇ、２７３ｇ、２７４ｇ、２７５ｇ、２７６ｇ、２７７ｇ、２７８ｇ、２７９ｇ、２８０ｇ、２８１ｇ、２８２ｇ、２８３ｇ、２８４ｇ、２８５ｇ、２８６ｇ、２８７ｇ、２８８ｇ、２８９ｇ、２９０ｇ、２９１ｇ、２９２ｇ、２９３ｇ、２９４ｇ、２９５ｇ、２９６ｇ、２９７ｇ、２９８ｇ、２９９ｇ、３００ｇ、３０１ｇ、３０２ｇ、３０３ｇ、３０４ｇ、３０５ｇ、３０６ｇ、３０７ｇ、３０８ｇ、３０９ｇ、３１０ｇ、３１１ｇ、３１２ｇ、３１３ｇ、３１４ｇ、３１５ｇ、３１６ｇ、３１７ｇ、３１８ｇ、３１９ｇ、３２０ｇ、３２１ｇ、３２２ｇ、３２３ｇ、３２４ｇ、３２５ｇ、３２６ｇ、３２７ｇ、３２８ｇ、３２９ｇ、３３０ｇ、３３１ｇ、３３２ｇ、３３３ｇ、３３４ｇ、３３５ｇ、３３６ｇ、３３７ｇ、３３８ｇ、３３９ｇ、３４０ｇ、又は３４１ｇである。代替の改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるオーバーレイ層の重量は、少なくとも１１００ｇ、１１１０ｇ、１１２０ｇ、１１３０ｇ、１１４０ｇ、１１５０ｇ、１１６０ｇ、１１７０ｇ、１１８０ｇ、１１９０ｇ、１２００ｇ、１２１０ｇ、１２２０ｇ、１２３０ｇ、１２４０ｇ、１２５０ｇ、１２６０ｇ、１２７０ｇ、１２８０ｇ、１２９０ｇ、又は１３００ｇである。他の改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるオーバーレイ層の重量は、上記で提供されたいずれか２つの重量の間の範囲である。
様々な改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるクッション層の重量は、少なくとも５３４ｇ、５３４ｇ、５３５ｇ、５３６ｇ、５３７ｇ、５３８ｇ、５３９ｇ、５４０ｇ、５４１ｇ、５４２ｇ、５４３ｇ、５４４ｇ、５４５ｇ、５４６ｇ、５４７ｇ、５４８ｇ、５４９ｇ、５５０ｇ、５５１ｇ、５５２ｇ、５５３ｇ、５５４ｇ、５５５ｇ、５５６ｇ、５５７ｇ、５５８ｇ、５５９ｇ、５６０ｇ、５６１ｇ、５６２ｇ、５６３ｇ、５６４ｇ、５６５ｇ、５６６ｇ、５６７ｇ、５６８ｇ、５６９ｇ、５７０ｇ、５７１ｇ、５７２ｇ、５７３ｇ、５７４ｇ、５７５ｇ、５７６ｇ、５７７ｇ、５７８ｇ、５７９ｇ、５８０ｇ、５８１ｇ、５８２ｇ、５８３ｇ、５８４ｇ、５８５ｇ、５８６ｇ、５８７ｇ、５８８ｇ、５８９ｇ、５９０ｇ、５９１ｇ、５９２ｇ、５９３ｇ、５９４ｇ、５９５ｇ、５９６ｇ、５９７ｇ、５９８ｇ、５９９ｇ、６００ｇ、６０１ｇ、６０２ｇ、６０３ｇ、６０４ｇ、６０５ｇ、６０６ｇ、６０７ｇ、６０８ｇ、６０９ｇ、６１０ｇ、６１１ｇ、６１２ｇ、６１３ｇ、６１４ｇ、６１５ｇ、６１６ｇ、６１７ｇ、６１８ｇ、６１９ｇ、６２０ｇ、６２１ｇ、６２２ｇ、６２３ｇ、６２４ｇ、６２５ｇ、６２６ｇ、６２７ｇ、６２８ｇ、６２９ｇ、６３０ｇ、６３１ｇ、６３２ｇ、６３３ｇ、６３４ｇ、６３５ｇ、６３６ｇ、６３７ｇ、６３８ｇ、６３９ｇ、６４０ｇ、６４１ｇ、６４２ｇ、６４３ｇ、６４４ｇ、６４５ｇ、６４６ｇ、６４７ｇ、６４８ｇ、６４９ｇ、６５０ｇ、６５１ｇ、６５２ｇ、６５３ｇ、６５４ｇ、６５５ｇ、６５６ｇ、６５７ｇ、６５８ｇ、６５９ｇ、６６０ｇ、６６１ｇ、６６２ｇ、６６３ｇ、６６４ｇ、６６５ｇ、６６６ｇ、６６７ｇ、又は６６８ｇである。代替の改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるクッション層の重量は、少なくとも３６００ｇ、３６００ｇ、３６０１ｇ、３６０２ｇ、３６０３ｇ、３６０４ｇ、３６０５ｇ、３６０６ｇ、３６０７ｇ、３６０８ｇ、３６０９ｇ、３６１０ｇ、３６１１ｇ、３６１２ｇ、３６１３ｇ、３６１４ｇ、３６１５ｇ、３６１６ｇ、３６１７ｇ、３６１８ｇ、３６１９ｇ、３６２０ｇ、３６２１ｇ、３６２２ｇ、３６２３ｇ、３６２４ｇ、３６２５ｇ、３６２６ｇ、３６２７ｇ、３６２８ｇ、３６２９ｇ、３６３０ｇ、３６３１ｇ、３６３２ｇ、３６３３ｇ、３６３４ｇ、３６３５ｇ、３６３６ｇ、３６３７ｇ、３６３８ｇ、３６３９ｇ、３６４０ｇ、３６４１ｇ、３６４２ｇ、３６４３ｇ、３６４４ｇ、３６４５ｇ、３６４６ｇ、３６４７ｇ、３６４８ｇ、３６４９ｇ、３６５０ｇ、３６５１ｇ、３６５２ｇ、３６５３ｇ、３６５４ｇ、３６５５ｇ、３６５６ｇ、３６５７ｇ、３６５８ｇ、３６５９ｇ、３６６０ｇ、３６６１ｇ、３６６２ｇ、３６６３ｇ、３６６４ｇ、３６６５ｇ、３６６６ｇ、３６６７ｇ、３６６８ｇ、３６６９ｇ、３６７０ｇ、３６７１ｇ、３６７２ｇ、３６７３ｇ、３６７４ｇ、３６７５ｇ、３６７６ｇ、３６７７ｇ、３６７８ｇ、３６７９ｇ、３６８０ｇ、３６８１ｇ、３６８２ｇ、３６８３ｇ、３６８４ｇ、３６８５ｇ、３６８６ｇ、３６８７ｇ、３６８８ｇ、３６８９ｇ、３６９０ｇ、３６９１ｇ、３６９２ｇ、３６９３ｇ、３６９４ｇ、３６９５ｇ、３６９６ｇ、３６９７ｇ、３６９８ｇ、３６９９ｇ、又は３７００ｇである。他の改良において、ＺＵＣローターにポンプで送られるクッション層の重量は、上記で提供されたいずれか２つの重量の間の範囲である。
様々な改良において、ＺＵＣ処理のためにＺＵＣローターに充填される組成物は、少なくとも０．１×１０ｅ１６ｖｇ／充填、０．１×１０ｅ１６ｖｇ／充填、０．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、１×１０ｅ１６ｖｇ／充填、１．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、２×１０ｅ１６ｖｇ／充填、２．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、３×１０ｅ１６ｖｇ／充填、３．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、４×１０ｅ１６ｖｇ／充填、４．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、５．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、６×１０ｅ１６ｖｇ／充填、６．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、７×１０ｅ１６ｖｇ／充填、７．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、８×１０ｅ１６ｖｇ／充填、８．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、９×１０ｅ１６ｖｇ／充填、９．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填、１０×１０ｅ１６ｖｇ／充填、０．１×１０ｅ１７ｖｇ／充填、０．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、１×１０ｅ１７ｖｇ／充填、１．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、２×１０ｅ１７ｖｇ／充填、２．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、３×１０ｅ１７ｖｇ／充填、３．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、４×１０ｅ１７ｖｇ／充填、４．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、５．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、６×１０ｅ１７ｖｇ／充填、６．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、７×１０ｅ１７ｖｇ／充填、７．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、８×１０ｅ１７ｖｇ／充填、８．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、９×１０ｅ１７ｖｇ／充填、９．５×１０ｅ１７ｖｇ／充填、又は１０×１０ｅ１７ｖｇ／充填の力価を有する。他の改良において、力価は、上記で提供されたいずれか２つの力価の間の範囲である。
様々な改良において、ＺＵＣ処理のためにＺＵＣローターに充填される組成物の密度は、少なくとも１ミリリットル当たり１．３４７グラム（ｇ／ｍＬ）、１．３４７１ｇ／ｍＬ、１．３４７２ｇ／ｍＬ、１．３４７３ｇ／ｍＬ、１．３４７４ｇ／ｍＬ、１．３４７５ｇ／ｍＬ、１．３４７６ｇ／ｍＬ、１．３４７７ｇ／ｍＬ、１．３４７８ｇ／ｍＬ、１．３４７９ｇ／ｍＬ、１．３４８ｇ／ｍＬ、１．３４８１ｇ／ｍＬ、１．３４８２ｇ／ｍＬ、１．３４８３ｇ／ｍＬ、１．３４８４ｇ／ｍＬ、１．３４８５ｇ／ｍＬ、１．３４８６ｇ／ｍＬ、１．３４８７ｇ／ｍＬ、１．３４８８ｇ／ｍＬ、１．３４８９ｇ／ｍＬ、１．３４９ｇ／ｍＬ、１．３４９１ｇ／ｍＬ、１．３４９２ｇ／ｍＬ、１．３４９３ｇ／ｍＬ、１．３４９４ｇ／ｍＬ、１．３４９５ｇ／ｍＬ、１．３４９６ｇ／ｍＬ、１．３４９７ｇ／ｍＬ、１．３４９８ｇ／ｍＬ、１．３４９９ｇ／ｍＬ、１．３５ｇ／ｍＬ、１．３５０１ｇ／ｍＬ、１．３５０２ｇ／ｍＬ、１．３５０３ｇ／ｍＬ、１．３５０４ｇ／ｍＬ、１．３５０５ｇ／ｍＬ、１．３５０６ｇ／ｍＬ、１．３５０７ｇ／ｍＬ、１．３５０８ｇ／ｍＬ、１．３５０９ｇ／ｍＬ、１．３５１ｇ／ｍＬ、１．３５１１ｇ／ｍＬ、１．３５１２ｇ／ｍＬ、１．３５１３ｇ／ｍＬ、１．３５１４ｇ／ｍＬ、１．３５１５ｇ／ｍＬ、１．３５１６ｇ／ｍＬ、１．３５１７ｇ／ｍＬ、１．３５１８ｇ／ｍＬ、１．３５１９ｇ／ｍＬ、１．３５２ｇ／ｍＬ、１．３５２１ｇ／ｍＬ、１．３５２２ｇ／ｍＬ、１．３５２３ｇ／ｍＬ、１．３５２４ｇ／ｍＬ、１．３５２５ｇ／ｍＬ、１．３５２６ｇ／ｍＬ、１．３５２７ｇ／ｍＬ、１．３５２８ｇ／ｍＬ、１．３５２９ｇ／ｍＬ、１．３５３ｇ／ｍＬ、１．３５３１ｇ／ｍＬ、１．３５３２ｇ／ｍＬ、１．３５３３ｇ／ｍＬ、１．３５３４ｇ／ｍＬ、１．３５３５ｇ／ｍＬ、１．３５３６ｇ／ｍＬ、１．３５３７ｇ／ｍＬ、１．３５３８ｇ／ｍＬ、１．３５３９ｇ／ｍＬ、１．３５４ｇ／ｍＬ、１．３５４１ｇ／ｍＬ、１．３５４２ｇ／ｍＬ、１．３５４３ｇ／ｍＬ、１．３５４４ｇ／ｍＬ、１．３５４５ｇ／ｍＬ、１．３５４６ｇ／ｍＬ、１．３５４７ｇ／ｍＬ、１．３５４８ｇ／ｍＬ、１．３５４９ｇ／ｍＬ、１．３５５ｇ／ｍＬ、１．３５５１ｇ／ｍＬ、１．３５５２ｇ／ｍＬ、１．３５５３ｇ／ｍＬ、１．３５５４ｇ／ｍＬ、１．３５５５ｇ／ｍＬ、１．３５５６ｇ／ｍＬ、１．３５５７ｇ／ｍＬ、１．３５５８ｇ／ｍＬ、１．３５５９ｇ／ｍＬ、１．３５６ｇ／ｍＬ、１．３５６１ｇ／ｍＬ、１．３５６２ｇ／ｍＬ、１．３５６３ｇ／ｍＬ、１．３５６４ｇ／ｍＬ、１．３５６５ｇ／ｍＬ、１．３５６６ｇ／ｍＬ、１．３５６７ｇ／ｍＬ、１．３５６８ｇ／ｍＬ、１．３５６９ｇ／ｍＬ、１．３５７ｇ／ｍＬ、１．３５７１ｇ／ｍＬ、１．３５７２ｇ／ｍＬ、１．３５７３ｇ／ｍＬ、１．３５７４ｇ／ｍＬ、１．３５７５ｇ／ｍＬ、１．３５７６ｇ／ｍＬ、１．３５７７ｇ／ｍＬ、１．３５７８ｇ／ｍＬ、１．３５７９ｇ／ｍＬ、１．３５８ｇ／ｍＬ、１．３５８１ｇ／ｍＬ、１．３５８２ｇ／ｍＬ、１．３５８３ｇ／ｍＬ、１．３５８４ｇ／ｍＬ、１．３５８５ｇ／ｍＬ、１．３５８６ｇ／ｍＬ、１．３５８７ｇ／ｍＬ、１．３５８８ｇ／ｍＬ、１．３５８９ｇ／ｍＬ、１．３５９ｇ／ｍＬ、１．３５９１ｇ／ｍＬ、１．３５９２ｇ／ｍＬ、１．３５９３ｇ／ｍＬ、１．３５９４ｇ／ｍＬ、１．３５９５ｇ／ｍＬ、１．３５９６ｇ／ｍＬ、１．３５９７ｇ／ｍＬ、１．３５９８ｇ／ｍＬ、１．３５９９ｇ／ｍＬ、１．３６ｇ／ｍＬ、１．３６０１ｇ／ｍＬ、１．３６０２ｇ／ｍＬ、１．３６０３ｇ／ｍＬ、１．３６０４ｇ／ｍＬ、１．３６０５ｇ／ｍＬ、１．３６０６ｇ／ｍＬ、１．３６０７ｇ／ｍＬ、１．３６０８ｇ／ｍＬ、１．３６０９ｇ／ｍＬ、１．３６１ｇ／ｍＬ、１．３６１１ｇ／ｍＬ、１．３６１２ｇ／ｍＬ、１．３６１３ｇ／ｍＬ、１．３６１４ｇ／ｍＬ、１、１．３６７５ｇ／ｍＬ、１．３６７６ｇ／ｍＬ、１．３６７７ｇ／ｍＬ、１．３６７８ｇ／ｍＬ、１．３６７９ｇ／ｍＬ、１．３６８ｇ／ｍＬ、１．３６８１ｇ／ｍＬ、１．３６８２ｇ／ｍＬ、１．３６８３ｇ／ｍＬ、１．３６８４ｇ／ｍＬ、１．３６８５ｇ／ｍＬ、１．３６８６ｇ／ｍＬ、１．３６８７ｇ／ｍＬ、１．３６８８ｇ／ｍＬ、１．３６８９ｇ／ｍＬ、１．３６９ｇ／ｍＬ、１．３６９１ｇ／ｍＬ、１．３６９２ｇ／ｍＬ、１．３６９３ｇ／ｍＬ、１．３６９４ｇ／ｍＬ、１．３６９５ｇ／ｍＬ、１．３６９６ｇ／ｍＬ、１．３６９７ｇ／ｍＬ、１．３６９８ｇ／ｍＬ、１．３６９９ｇ／ｍＬ、１．３７ｇ／ｍＬ、１．３７０１ｇ／ｍＬ、１．３７０２ｇ／ｍＬ、１．３７０３ｇ／ｍＬ、１．３７０４ｇ／ｍＬ、１．３７０５ｇ／ｍＬ、１．３７０６ｇ／ｍＬ、１．３７０７ｇ／ｍＬ、１．３７０８ｇ／ｍＬ、１．３７０９ｇ／ｍＬ、又は１．３７１ｇ／ｍＬである。他の改良において、ＺＵＣ処理のためにＺＵＣローターに充填される組成物の密度は、上記で提供されたいずれか２つの密度の間の範囲である。
様々な改良において、クッション層、組成物、オーバーレイ層、又は置換溶液は、少なくとも毎分２０ミリリットル（ｍＬ／分）、２０ｍＬ／分、２１ｍＬ／分、２２ｍＬ／分、２３ｍＬ／分、２４ｍＬ／分、２５ｍＬ／分、２６ｍＬ／分、２７ｍＬ／分、２８ｍＬ／分、２９ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、３１ｍＬ／分、３２ｍＬ／分、３３ｍＬ／分、３４ｍＬ／分、３５ｍＬ／分、３６ｍＬ／分、３７ｍＬ／分、３８ｍＬ／分、３９ｍＬ／分、４０ｍＬ／分、４１ｍＬ／分、４２ｍＬ／分、４３ｍＬ／分、４４ｍＬ／分、４５ｍＬ／分、４６ｍＬ／分、４７ｍＬ／分、４８ｍＬ／分、４９ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、５１ｍＬ／分、５２ｍＬ／分、５３ｍＬ／分、５４ｍＬ／分、５５ｍＬ／分、５６ｍＬ／分、５７ｍＬ／分、５８ｍＬ／分、５９ｍＬ／分、６０ｍＬ／分、６１ｍＬ／分、６２ｍＬ／分、６３ｍＬ／分、６４ｍＬ／分、６５ｍＬ／分、６６ｍＬ／分、６７ｍＬ／分、６８ｍＬ／分、６９ｍＬ／分、又は７０ｍＬ／分の流量でＺＵＣローターに充填される。代替の改良において、クッション層、組成物、オーバーレイ層、又は置換溶液は、２００ｍＬ／分以上の流量でＺＵＣローターに充填される。他の改良において、クッション層、組成物、オーバーレイ層、又は置換溶液が、ＺＵＣローターに充填される流量は、上記で提供されたいずれか２つの流量の間の範囲である。
充填後、充填されたＺＵＣローターは、ある速度で一定期間遠心分離されて、勾配を形成し、密度によって粒子を分離する。
様々な改良において、ＺＵＣローターは、少なくとも毎分１００００回転（ｒｐｍ）、１００００ｒｐｍ、１１０００ｒｐｍ、１２０００ｒｐｍ、１３０００ｒｐｍ、１４０００ｒｐｍ、１５０００ｒｐｍ、１６０００ｒｐｍ、１７０００ｒｐｍ、１８０００ｒｐｍ、１９０００ｒｐｍ、２００００ｒｐｍ、２１０００ｒｐｍ、２２０００ｒｐｍ、２３０００ｒｐｍ、２４０００ｒｐｍ、２５０００ｒｐｍ、２６０００ｒｐｍ、２７０００ｒｐｍ、２８０００ｒｐｍ、２９０００ｒｐｍ、３００００ｒｐｍ、３１０００ｒｐｍ、３２０００ｒｐｍ、３３０００ｒｐｍ、３４０００ｒｐｍ、３５０００ｒｐｍ、３６０００ｒｐｍ、３７０００ｒｐｍ、３８０００ｒｐｍ、３９０００ｒｐｍ、４００００ｒｐｍ、４１０００ｒｐｍ、４２０００ｒｐｍ、４３０００ｒｐｍ、４４０００ｒｐｍ、４５０００ｒｐｍ、４６０００ｒｐｍ、４７０００ｒｐｍ、４８０００ｒｐｍ、４９０００ｒｐｍ、又は５００００ｒｐｍで遠心分離される。他の改良において、ＺＵＣローターが遠心分離される速度は、上記で提供されたいずれか２つの速度の間の範囲である。
代替の改良において、ＺＵＣローターは、少なくとも５００００ｇの力（Ｇ）、５００００Ｇ、５５０００Ｇ、６００００Ｇ、６５０００Ｇ、７００００Ｇ、７５０００Ｇ、８００００Ｇ、８５０００Ｇ、９００００Ｇ、９５０００Ｇ、１０００００Ｇ、１０５０００Ｇ、１１００００Ｇ、１１５０００Ｇ、１２００００Ｇ、又は１２５０００Ｇで遠心分離される。他の代替の改良において、ＺＵＣローターが遠心分離される速度は、上記で提供されたいずれか２つの速度の間の範囲である。
様々な改良において、ＺＵＣローターは、少なくとも１３時間（ｈｒ）、１３ｈｒ、１３．５ｈｒ、１４ｈｒ、１４．５ｈｒ、１５ｈｒ、１５．５ｈｒ、１６ｈｒ、１６．５ｈｒ、１７ｈｒ、１７．５ｈｒ、１８ｈｒ、１８．５ｈｒ、１９ｈｒ、１９．５ｈｒ、２０ｈｒ、２０．５ｈｒ、２１ｈｒ、２１．５ｈｒ、２２ｈｒ、２２．５ｈｒ、２３ｈｒ、２３．５ｈｒ、２４ｈｒ、２４．５ｈｒ、又は２５ｈｒ、遠心分離される。他の改良において、充填されたＺＵＣローターが遠心分離される時間は、上記で提供されたいずれか２つの時間の間の範囲である。
様々な改良において、充填されたＺＵＣローターは、少なくとも１０℃、１０℃、１０．５℃、１１℃、１１．５℃、１２℃、１２．５℃、１３℃、１３．５℃、１４℃、１４．５℃、１５℃、１５．５℃、１６℃、１６．５℃、１７℃、１７．５℃、１８℃、１８．５℃、１９℃、１９．５℃、２０℃、２０．５℃、２１℃、２１．５℃、２２℃、２２．５℃、２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃、２６．５℃、２７℃、２７．５℃、２８℃、２８．５℃、２９℃、２９．５℃、３０℃、３０．５℃、３１℃、３１．５℃、３２℃、３２．５℃、３３℃、３３．５℃、３４℃、３４．５℃、３５℃、３５．５℃、又は３６℃の温度で遠心分離される。他の改良において、充填されたＺＵＣローターが遠心分離される温度は、上記で証明されたいずれか２つの温度の間の範囲である。
粒子が超遠心分離によって分離された後、クッション層、組成物、及びオーバーレイ層をＺＵＣローターから押し出すために置換溶液をローターにポンプで送ることによって、ＺＵＣで処理された組成物を回収するために、充填されたローターを静止させるか、又はある速度（例えば、１０００ｒｐｍ、１５００ｒｐｍ、２０００ｒｐｍ、２５００ｒｐｍ、３０００ｒｐｍ、３５００ｒｐｍ、４０００ｒｐｍ、４５００ｒｐｍ、又は５０００）で遠心分離することができる。様々な改良において、充填されたローターは、少なくとも０分（分）、少なくとも１分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分、２５０分、２６０分、２７０分、２８０分、２９０分、３００分、３１０分、３２０分、３３０分、３４０分、３５０分、又は３６０分間遠心分離される。他の改良において、ローターが遠心分離される時間は、上記で提供されたいずれか２つの時間の間の範囲である。
様々な実施形態において、ＡＥＸ及びＺＵＣは、ＡＡＶ産生不純物の少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９＋％、又は１００％を除去又は除去する。異なる実施形態において、ＡＥＸ及びＺＵＣによって除去されるＡＡＶ産生不純物のパーセンテージは、上記のいずれか２つのパーセンテージの間の範囲である。改良において、組成物は、ＡＥＸ及びＺＵＣ処理後にＡＡＶ産生不純物を実質的に欠いている。上述のように、ｒＡＡＶが産生されるとき、目的の完全な導入遺伝子を含有する重カプシド、目的の導入遺伝子の一部を含有する部分的カプシド、及び軽カプシドの混合物が存在する。以下に強調されるように、空及び軽カプシドは、治療上有効性を有さず、異種タンパク質、核酸などへの患者の曝露を増加させ、それによって患者における有害な免疫反応の可能性を増加させる。したがって、空及び軽カプシドは、可能な限りＡＡＶから除去すべきであることが好ましい。ＡＥＸ及びＺＵＣの併用は、９９＋％の純度の重及び部分的カプシドを得ることができ、ＺＵＣ処理はＡＥＸ後に行われる。これに関して、ＡＥＸが最初のステップとして使用されない場合、空及び軽カプシドはＺＵＣの容量を過負荷にし、その結果、ＺＵＣ処理中に沈殿をもたらす。他方で、ＺＵＣなしでＡＥＸを使用すると、空及び軽カプシドは完全に除去されない。したがって、本発明は、少なくとも８５％の純度である（すなわち、軽及び空カプシドを含まない）、ＡＡＶ重及びカプシドを精製する方法に関する。更なる改良において、重及び部分的カプシドは、少なくとも９０％の純度であるか、重及び部分的カプシドは、９９＋％の純度であるか、又は組成物は、検出可能な軽若しくは空カプシドを有しない。
様々な実施形態の方法及びプロセスは、ＡＥＸ処理とＺＵＣ処理との間にタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を介して組成物を処理することを含む。このＴＦＦステップは、限外濾過及びダイアフィルトレーションのステップを含み、ＡＥＸ溶出緩衝液は、組成物から除去され、ＺＵＣ処理のための勾配形成化合物を含む充填緩衝液に置き換えられる。
様々な改良において、ＴＦＦのために充填されたＡＥＸで処理された組成物は、少なくとも０．１×１０ｅ１７ｖｇ／平方メートル（ｍ２）、０．１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、０．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、１．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、２×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、２．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、３×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、３．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、４×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、４．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、５．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、６×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、６．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、７×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、７．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、８×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、８．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、９×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、９．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、又は１０×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２の力価を有する。他の改良において、力価は、上記で提供されたいずれか２つの力価の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも１平方インチ当たり２ポンド（ｐｓｉ）（０．１３７８９５ｂａｒ）、２ｐｓｉ（０．１３７８９５ｂａｒ）、３ｐｓｉ（０．２０６８４３ｂａｒ）、４ｐｓｉ（０．２７５７９ｂａｒ）、５ｐｓｉ（０．３４４７３８ｂａｒ）、６ｐｓｉ（０．４１３６８５ｂａｒ）、７ｐｓｉ（０．４８２６３３ｂａｒ）、８ｐｓｉ（０．５５１５８１ｂａｒ）、９ｐｓｉ（０．６２０５２８ｂａｒ）、１０ｐｓｉ（０．６８９４７６ｂａｒ）、１１ｐｓｉ（０．７５８４２３ｂａｒ）、１２ｐｓｉ（０．８２７３７１ｂａｒ）、１３ｐｓｉ（０．８９６３１８ｂａｒ）、１４ｐｓｉ（０．９６５２６６ｂａｒ）、１５ｐｓｉ（１．０３４２１ｂａｒ）、１６ｐｓｉ（１．１０３１６ｂａｒ）、１７ｐｓｉ（１．１７２１１ｂａｒ）、１８ｐｓｉ（１．２４１０６ｂａｒ）、１９ｐｓｉ（１．３１ｂａｒ）、２０ｐｓｉ（１．３７８９５ｂａｒ）、２１ｐｓｉ（１．４４７９ｂａｒ）、２２ｐｓｉ（１．５１６８５ｂａｒ）、２３ｐｓｉ（１．５８５７９ｂａｒ）、２４ｐｓｉ（１．６５４７４ｂａｒ）、２５ｐｓｉ（１．７２３６９ｂａｒ）、２６ｐｓｉ（１．７９２６４ｂａｒ）、２７ｐｓｉ（１．８６１５８ｂａｒ）、２８ｐｓｉ（１．９３０５３ｂａｒ）、２９ｐｓｉ（１．９９９４８ｂａｒ）、３０ｐｓｉ（２．０６８４３ｂａｒ）、３１ｐｓｉ（２．１３７３７ｂａｒ）、３２ｐｓｉ（２．２０６３２ｂａｒ）、３３ｐｓｉ（２．２７５２７ｂａｒ）、３４ｐｓｉ（２．３４４２２ｂａｒ）、３５ｐｓｉ（２．４１３１７ｂａｒ）、３６ｐｓｉ（２．４８２１１ｂａｒ）、３７ｐｓｉ（２．５５１０６ｂａｒ）、３８ｐｓｉ（２．６２００１ｂａｒ）、３９ｐｓｉ（２．６８８９６ｂａｒ）、４０ｐｓｉ（２．７５７９ｂａｒ）、４１ｐｓｉ（２．８２６８５ｂａｒ）、４２ｐｓｉ（２．８９５８ｂａｒ）、４３ｐｓｉ（２．９６４７５ｂａｒ）、４４ｐｓｉ（３．０３３６９ｂａｒ）、４５ｐｓｉ（３．１０２６４ｂａｒ）、４６ｐｓｉ（３．１７１５９ｂａｒ）、４７ｐｓｉ（３．２４０５４ｂａｒ）、４８ｐｓｉ（３．３０９４８ｂａｒ）、４９ｐｓｉ（３．３７８４３ｂａｒ）、又は５０ｐｓｉ（３．４４７３８ｂａｒ）の膜間圧力（ＴＭＰ）にてＡＥＸで処理された組成物を濾過する。他の改良において、ＡＥＸで処理された組成物のためのＴＦＦのＴＭＰは、上記で提供されたいずれか２つのＴＭＰの間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも１Ｌ／分／ｍ２、１Ｌ／分／ｍ２、２Ｌ／分／ｍ２、３Ｌ／分／ｍ２、４Ｌ／分／ｍ２、５Ｌ／分／ｍ２、６Ｌ／分／ｍ２、７Ｌ／分／ｍ２、８Ｌ／分／ｍ２、９Ｌ／分／ｍ２、１０Ｌ／分／ｍ２、１１Ｌ／分／ｍ２、１２Ｌ／分／ｍ２、１３Ｌ／分／ｍ２、１４Ｌ／分／ｍ２、又は１５Ｌ／分／ｍ２の交差流又は残余分流量で、ＡＥＸで処理された組成物を濾過する。他の改良において、ＡＥＸで処理された組成物のためのＴＦＦの交差流は、上記で提供されたいずれか２つの交差流の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、又は９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬの残余分濃度までＡＥＸで処理された組成物を濾過する。他の改良において、残余分濃度は、上記で提供されたいずれか２つの濃度の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、ＴＦＦ緩衝液に対して０以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、又は１５のダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のダイアフィルトレーションで、ＡＥＸで処理された組成物をダイアフィルトレーションする。
様々な実施形態の方法及びプロセスは、ＺＵＣ処理後にＴＦＦを介して組成物を処理することを含む。ＴＦＦは、限外濾過及びダイアフィルトレーションのステップを含む。このＴＦＦステップは、勾配形成化合物を含むＺＵＣ緩衝液を組成物から除去し、ＡＥＸ溶出緩衝液に置き換えて、組成物から除去し、薬学的に許容される担体を含む製剤緩衝液に置き換えて、薬学的組成物を調製する、限外濾過及びダイアフィルトレーションのステップを含む。
様々な改良において、ＴＦＦのために充填されたＺＵＣで処理された組成物は、少なくとも０．１×１０ｅ１７ｖｇ／平方メートル（ｍ２）、０．１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、０．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、１．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、２×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、２．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、３×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、３．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、４×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、４．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、５．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、６×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、６．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、７×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、７．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、８×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、８．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、９×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、９．５×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２、又は１０×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２の力価を有する。他の改良において、力価は、上記で提供されたいずれか２つの力価の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも２ｐｓｉ（０．１３７８９５ｂａｒ）、２ｐｓｉ（０．１３７８９５ｂａｒ）、３ｐｓｉ（０．２０６８４３ｂａｒ）、４ｐｓｉ（０．２７５７９ｂａｒ）、５ｐｓｉ（０．３４４７３８ｂａｒ）、６ｐｓｉ（０．４１３６８５ｂａｒ）、７ｐｓｉ（０．４８２６３３ｂａｒ）、８ｐｓｉ（０．５５１５８１ｂａｒ）、９ｐｓｉ（０．６２０５２８ｂａｒ）、１０ｐｓｉ（０．６８９４７６ｂａｒ）、１１ｐｓｉ（０．７５８４２３ｂａｒ）、１２ｐｓｉ（０．８２７３７１ｂａｒ）、１３ｐｓｉ（０．８９６３１８ｂａｒ）、１４ｐｓｉ（０．９６５２６６ｂａｒ）、１５ｐｓｉ（１．０３４２１ｂａｒ）、１６ｐｓｉ（１．１０３１６ｂａｒ）、１７ｐｓｉ（１．１７２１１ｂａｒ）、１８ｐｓｉ（１．２４１０６ｂａｒ）、１９ｐｓｉ（１．３１ｂａｒ）、２０ｐｓｉ（１．３７８９５ｂａｒ）、２１ｐｓｉ（１．４４７９ｂａｒ）、２２ｐｓｉ（１．５１６８５ｂａｒ）、２３ｐｓｉ（１．５８５７９ｂａｒ）、２４ｐｓｉ（１．６５４７４ｂａｒ）、２５ｐｓｉ（１．７２３６９ｂａｒ）、２６ｐｓｉ（１．７９２６４ｂａｒ）、２７ｐｓｉ（１．８６１５８ｂａｒ）、２８ｐｓｉ（１．９３０５３ｂａｒ）、２９ｐｓｉ（１．９９９４８ｂａｒ）、３０ｐｓｉ（２．０６８４３ｂａｒ）、３１ｐｓｉ（２．１３７３７ｂａｒ）、３２ｐｓｉ（２．２０６３２ｂａｒ）、３３ｐｓｉ（２．２７５２７ｂａｒ）、３４ｐｓｉ（２．３４４２２ｂａｒ）、３５ｐｓｉ（２．４１３１７ｂａｒ）、３６ｐｓｉ（２．４８２１１ｂａｒ）、３７ｐｓｉ（２．５５１０６ｂａｒ）、３８ｐｓｉ（２．６２００１ｂａｒ）、３９ｐｓｉ（２．６８８９６ｂａｒ）、４０ｐｓｉ（２．７５７９ｂａｒ）、４１ｐｓｉ（２．８２６８５ｂａｒ）、４２ｐｓｉ（２．８９５８ｂａｒ）、４３ｐｓｉ（２．９６４７５ｂａｒ）、４４ｐｓｉ（３．０３３６９ｂａｒ）、４５ｐｓｉ（３．１０２６４ｂａｒ）、４６ｐｓｉ（３．１７１５９ｂａｒ）、４７ｐｓｉ（３．２４０５４ｂａｒ）、４８ｐｓｉ（３．３０９４８ｂａｒ）、４９ｐｓｉ（３．３７８４３ｂａｒ）、又は５０ｐｓｉ（３．４４７３８ｂａｒ）のＴＭＰにてＺＵＣで処理された組成物を濾過する。他の改良において、ＺＵＣで処理された組成物のためのＴＦＦのＴＭＰは、上記で提供されたいずれか２つのＴＭＰの間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも１Ｌ／分／ｍ２、１Ｌ／分／ｍ２、２Ｌ／分／ｍ２、３Ｌ／分／ｍ２、４Ｌ／分／ｍ２、５Ｌ／分／ｍ２、６Ｌ／分／ｍ２、７Ｌ／分／ｍ２、８Ｌ／分／ｍ２、９Ｌ／分／ｍ２、１０Ｌ／分／ｍ２、１１Ｌ／分／ｍ２、１２Ｌ／分／ｍ２、１３Ｌ／分／ｍ２、１４Ｌ／分／ｍ２、又は１５Ｌ／分／ｍ２の交差流又は残余分流量で、ＺＵＣで処理された組成物を濾過する。他の改良において、ＺＵＣで処理された組成物のためのＴＦＦの交差流は、上記で提供されたいずれか２つの交差流の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、少なくとも１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、２．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、３．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、４．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、５．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、６．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、７．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．１×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．２×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．３×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．４×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．５×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．６×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．７×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．８×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、８．９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、９×１０ｅ１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．１×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．２×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．３×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．４×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．５×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．６×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．７×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．８×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、１．９×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬ、又は２×１０ｅ１４ｖｇ／ｍＬの残余分濃度までＺＵＣで処理された組成物を濾過する。他の改良において、残余分濃度は、上記で提供されたいずれか２つの濃度の間の範囲である。
様々な改良において、ＴＦＦは、ＴＦＦ緩衝液に対して０以上、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、又は１５のダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）のダイアフィルトレーションで、ＺＵＣで処理された組成物をダイアフィルトレーションする。
定義
「アニオン交換クロマトグラフィー」又は「ＡＥＸ」は、共有結合した正に荷電した置換基を担持する固定したマトリックスを示すアニオン交換材料を通して混合物を流すことによって分析物を混合物から分離するプロセスを指す。「アニオン交換材料」は、通常、アニオン交換クロマトグラフィーカラムとして提供される。「アニオン交換材料」は、周囲の溶液（例えば、混合物）の同様に荷電した結合パートナー又はイオンのために、その非共有結合対イオンを交換する能力を有する。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「アニオン交換材料」は、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、更に、強イオン交換材料又は弱イオン交換材料として分類することができる。強アニオン交換材料は、四級アンモニウム基を有し、弱アニオン交換材料は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。アニオン交換クロマトグラフィーは、カラムを緩衝液で平衡化し、組成物をカラムを通して流し、カラムを洗浄し、カラムから組成物を溶出させるステップを含む。
「ゾーン超遠心分離」又は「ＺＵＣ」は、ゾーナルローターを使用して組成物を遠心分離するプロセスを指す。ゾーナルローター及びゾーン超遠心分離システムの例は、米国特許第６，０５１，１８９号、第７，８６２，４９４号、第７，８３７，６０９号、第９，８６２，９３６号、及び第９，９５６，５６４号に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ゾーン超遠心分離の一例は、成分の分離の基礎として、高密度溶液中に分散された構成粒子の浮力特性の差に依存する等密度の密度勾配沈降である。
「タンジェンシャルフロー濾過」又は「ＴＦＦ」は、限外濾過プロセスを指し、濃縮されるカプシドを含有する溶液は、限外濾過の濾過膜の表面に沿って接線方向に流れる。濾過膜は、カプシドが透過液として濾過膜を通って流れるのを防ぐ特定のカットオフ値を有する細孔径を有する。したがって、カプシドは残余分の一部である。タンジェンシャルフロー濾過はまた、元の溶液が透過液として除去され、別の溶液と置き換えられる、ダイアフィルトレーションも含む。例えば、タンジェンシャルフロー濾過は、アニオン交換クロマトグラフィー処理後の組成物からの溶出緩衝液を、ゾーン超遠心分離処理のための充填緩衝液に置き換える。別の例では、タンジェンシャルフロー濾過は、ゾーン超遠心分離処理後の組成物からの溶出緩衝液を、薬学的に許容される担体を含む製剤緩衝液ａで置き換えて、薬学的組成物を調製する。
「医薬品」は、ヒト及び哺乳動物を含む、対象動物における薬学的使用に好適な製品を指す。例えば、医薬品は、ｒＡＡＶビリオンである。
「薬学的組成物」は、ヒト及び哺乳動物を含む、対象動物における薬学的使用に好適な組成物を指す。薬学的組成物は、ＡＡＶビリオンなどの薬学的に有効な量の医薬品を含み、また、薬学的に許容される担体も含む。薬学的組成物は、有効成分、担体を構成する不活性成分、並びに任意の２つ以上の成分、又は１つ以上の成分の解離、又は１つ以上の成分の他の種類の反応若しくは相互作用からの組み合わせ、錯体形成、又は凝集から直接的又は間接的に生じる任意の産生物を含む組成物を包含する。したがって、薬学的組成物は、本明細書で提供されるビリオンと薬学的に許容される担体とを混合することによって作製された任意の組成物を包含する。
「薬学的に許容される担体」は、例えば、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、５％デキストロース水溶液、及び油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、並びに様々な種類の湿潤剤及び／又はアジュバントなどの、標準的な薬学的賦形剤、ビヒクル、希釈剤、安定剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体のうちのいずれかを指す。好適な薬学的担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，１９９５）に記載されている。使用される薬学的担体は、活性薬剤の意図された投与様式に依存し得る。典型的な投与様式には、経腸（例えば、経口）又は非経口（例えば、皮下、髄腔内、筋肉内、静脈内又は腹腔内注射、又は局所、経皮、若しくは経粘膜投与）が含まれる。「薬学的に許容される塩」は、例えば、金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）及びアンモニア又は有機アミンの塩を含む、薬学的用途のシュウ酸塩分解酵素組成物に配合することができる塩である。
「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」とは、生物学的又は他の方法で望ましくない材料を意味し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれている組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
「対象」は、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、哺乳動物クラスの任意のメンバー：ヒト、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、及び他の類人猿及びサル種、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、ウサギ、イヌ、及びネコなどの飼育動物、ラット、マウス、及びモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。非哺乳動物の例には、鳥、魚などが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。
「汚染ウイルス」は、製造プロセス中に組成物を汚染するウイルスを指す。汚染ウイルスは、対象への投与のための医薬品の安全性を損なう。汚染ウイルスの例としては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、レオウイルス（Ｒｅｏ－３）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ－４０）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はマウス白血病ウイルス（Ｘ－ＭｕＬＶ）などのレトロウイルスが挙げられる。
アデノ随伴ウイルス
治療上有効なｒＡＡＶ粒子には、ＵＳ９，５０４，７６２、ＷＯ２０１９／２２２１３６、及びＵＳ２０１９／０３７６０８１に開示されているｒＡＡＶ粒子が含まれ、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、カプシドによって封入されたゲノムを有する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、１３種類の特徴付けられたＡＡＶの血清型が存在する。ＡＡＶの一般的な情報及びレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出され得る。しかしながら、様々な血清型が、遺伝子レベルにおいても、構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることが周知であるため、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．のｐｐ．１６５－１７４、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型が、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明白に示し、全てが、３つの関連するカプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及びＩＴＲに対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によって更に示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化ＡＡＶゲノムから構成される感染性ウイルス粒子を指す。「組換えＡＡＶ」若しくは「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶビリオン」、又は「ｒＡＡＶウイルス粒子」、又は「ｒＡＡＶベクター粒子」、又は「ＡＡＶウイルス」は、本明細書に記載される少なくとも１つのカプシド又はＣａｐタンパク質及びカプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがｒＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれる。異なる実施形態のｒＡＡＶウイルス粒子には、ＥＰ２，６９８，１６３、ＥＰ２，８５９，０１６、ＥＰ３，０４４，２３１、ＥＰ３，３５２，７８７、ＥＰ３，４９１，００８、ＥＰ３，７９４，０１６、ＥＰ３，７９４，１１２、ＵＳ９，３９３，３２３、ＵＳ９，４４７，１６８、ＵＳ９，５０４，７６２、ＵＳ９，７６４，０４５、ＵＳ１０，１２４，０４１、ＵＳ１０，４６３，７１８、ＵＳ１０，５１２，６７５、ＵＳ１０，７０９，７９６、ＵＳ１０，７９２，３３６、ＵＳ２０１７／００８７２１９、ＵＳ２０１９／０３７６０８１、ＵＳ２０２０／００２４５７９、ＵＳ２０２０／００６１１６１、ＵＳ２０２０／００６９８１９、ＵＳ２０２０／０３６２３６８、ＷＯ２０１５／０３８６２５、ＷＯ２０１７／０５３６７７、ＷＯ２０１８／０２２６０８、ＷＯ２０１９／２１７５１３、ＷＯ２０１９／２２２１３２、ＷＯ２０１９／２２２１３６、ＷＯ２０２０／２３２０４４、ＷＯ２０２１／０９７１５７、ＷＯ２０２１／１８３８９５、及びＷＯ２０２１／２０２９４３に開示されているＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶ粒子が含まれ、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
「カプシド」は、ｒＡＡＶベクターゲノムがパッケージングされる構造を指す。カプシドは、ＶＰ１タンパク質又はＶＰ３タンパク質を含むが、より典型的には、天然のＡＡＶに見出されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てを含む。カプシドタンパク質の配列は、ｒＡＡＶビリオンの血清型を決定する。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ｉｓ ＡＡＶ－ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－２Ｇ９、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、若しくはＪａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ＿ｐｏ．６、ＡＡＶ＿ｐｏ．、ＡＡＶ＿ｐｏ．５、ＡＡＶ＿ＬＫ０３、ＡＡＶ＿ｒａ．１、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿ＹＮＭ、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿Ｂｒａｚｉｌ、ＡＡＶ＿ｍｏ．１、ＡＡＶ＿トリ＿ＤＡ－１、若しくはＡＡＶ＿マウス＿ＮＹ１、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらのいずれかのバリアント（例えば、
非天然混合血清型の開示に関する米国特許第８，３１８，４８０号を参照されたい）を含む、いくつかのＡＡＶ血清型に由来するものを含む。例示的なカプシドはまた、その全体が本明細書に組み込まれる、国際出願公開第ＷＯ２０１８／０２２６０８号及びＷＯ２０１９／２２２１３６号に提供される。カプシドタンパク質はまた、変異、キメラ、又はシャッフルされたタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであってもよい。カプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであってもよく、様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。様々な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子のカプシドは、ＡＡＶ－１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２７７５７．１）、ＡＡＶ－２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿６８０４２６．１）、ＡＡＶ－３（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４３９４１．１）、ＡＡＶ－３Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５２．１）、ＡＡＶ－４（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０４４９２７．１）、ＡＡＶ－５（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０６８４０９．１）、ＡＡＶ－６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５０．１）、ＡＡＶ－７（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７８．１）、ＡＡＶ－８（ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０７７１７９．１）、ＡＡＶ－９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４．１）、ＡＡＶ－１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７．１）、ＡＡＶ－１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３９．１）、ＡＡＶ－１２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＩ１６６３９．１）、ＡＡＶ－１３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＺ１０８１２．１）、又はＷＯ２０１８／０２２６０８及びＷＯ２０１９／２２２１３６に開示されているアミノ酸配列からのアミノ酸配列の一部と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するアセチル化又は非アセチル化ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質を有する。異なる血清型のＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１に説明されている。
「ＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶベクター」、「ベクターゲノム」、及び「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、ＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、並びにＡＡＶウイルスゲノムに対して異種である転写調節エレメントに作動可能に連結されたタンパク質コード配列に隣接するＡＡＶ３’ＩＴＲ（好ましくは、機能的治療タンパク質コード配列、例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、及びＰＡＨ）、すなわち、１つ以上のプロモーター及び／又はエンハンサー、並びに任意選択的に、ポリアデニル化配列、及び／又はタンパク質コード配列のエクソンの間に挿入された１つ以上のイントロンを有する、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸を指す。「目的の遺伝子」（ＧＯＩ）という用語は、ｒＡＡＶベクターゲノムを指すこともできる。一本鎖ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノム中に存在する核酸を指し、本明細書に開示される核酸配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかであり得る。そのような一本鎖核酸のサイズは、塩基で提供される。二本鎖ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、例えば、ｐＵＣ１９のＤＮＡ、又はｒＡＡＶベクター核酸を発現又は導入するために使用される二本鎖ウイルス、例えば、バキュロウイルスのゲノム中に存在する核酸を指す。そのような二本鎖核酸のサイズは、塩基対（ｂｐ）で提供される。「ＩＴＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ複製の開始点として、及びウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてシスに機能する、ｒＡＡＶゲノムの５’末端及び３’末端に見出される、当該技術分野において認知されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｒｅｐコード領域とともに、エンドソームからの効率的な除去及びレスキュー、並びに宿主細胞ゲノムへの２つの隣接するＩＴＲ間に介在するヌクレオチド配列の統合を提供する。特定のＡＡＶ関連ＩＴＲの配列は、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１）：３６４－３７９（２００５）に開示されている。ＩＴＲはまた、（ヘアピンのアームを形成する）ＡＡ’逆方向反復間の配列が、逆相補体中に存在する「フリップ」又は「フロップ」構成においても見出される（Ｗｉｌｍｏｔｔ，Ｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ３０．６（２０１９）：２０６－２１３）。異なる血清型のＡＡＶベクターゲノムの構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１に説明されている。幅広い構築物の利用可能性及び広範な特性決定のために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターゲノムは、血清型２に由来する。
「治療上有効なＡＡＶ」、「治療上有効なＡＡＶ粒子」、「治療用ＡＡＶ」、「治療上有効なｒＡＡＶ」、「治療上有効なｒＡＡＶ粒子」、「治療用ｒＡＡＶ」、及び「治療上有効なｒＡＡＶ」という用語は、感染した細胞が、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現するように、細胞を感染させることができる組換えＡＡＶを指す。この程度まで、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するカプシド又はベクターゲノム（ｖｇ）を有するＡＡＶ粒子を含むことができる。例えば、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる翻訳後修飾を有するカプシドを有することができる。他の例では、治療上有効なＡＡＶ粒子は、異なるサイズ／長さ、プラス又はマイナスの鎖配列、異なるフリップ／フロップＩＴＲ構成のフリップ／フロップ、フロップ／フリップ、フリップ／フリップ、フロップ／フロップなど）、異なる数のＩＴＲ（１、２、３など）、又は切断を有するｖｇを含有することができる。例えば、大きいタンパク質をコードする「完全」核酸が生成され、それによって機能的で完全長の遺伝子を再構築するように、５’末端切断及び３’末端切断を有する核酸間で、ｒＡＡＶ感染細胞において重複相同組換えが生じる。他の例では、５’末端切断及び３’末端切断を有する相補的核酸配列は、「完全」核酸が第２の鎖合成中に形成されるように、各々と相互作用する。「完全」核酸は、大きいタンパク質をコードし、それによって機能的で完全長の遺伝子を再構築する。治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、重カプシド、完全カプシド、又は部分的完全カプシドとも呼ばれる。
「治療有効量」という用語は、疾患、障害、又は状態に罹患しているか、又はそれらに罹りやすい対象に投与されたときに、疾患、障害、又は状態の症状の発症を治療、診断、予防、又は遅延させるのに十分な治療剤の量を意味する。治療有効量は、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンを介して投与されることが、当業者によって理解されるであろう。「治療上有効な」という用語は、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか、又はそれらに罹りやすい対象に投与されたときに、疾患、障害、及び／又は状態の症状の発症を治療、診断、予防、及び／又は遅延させるために治療剤の治療有効量が十分であるように十分に作用する治療剤の任意の要素又は組成物を指す。例えば、前述のように、治療上有効なｒＡＡＶは、感染細胞が目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現するように細胞を感染させることができる。治療上有効なｒＡＡＶは、治療上有効なｒＡＡＶによって感染した細胞によって使用されるベクターゲノムを有して、複製、転写、又は翻訳などの様々な方法によって目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を生成するために感染細胞によって使用される治療上有効なヌクレオチド配列を生成する。「治療剤」は、治療上有効なｒＡＡＶ又は治療用ｒＡＡＶウイルスを含むことにも留意されたい。
例として、治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン、ｒＡＡＶウイルス粒子、ｒＡＡＶベクター粒子、又はｒＡＡＶウイルスを指す、「治療用ｒＡＡＶウイルス」を使用して、インビボでタンパク質を置き換えるか、又は補充することができる。「治療用タンパク質」は、対応する内因性タンパク質の活性の喪失又は低減を置き換えるか、又は補う生物活性を有するポリペプチドである。例えば、機能的フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のための治療用タンパク質である。したがって、例えば、組換えｒＡＡＶ ＰＡＨウイルスは、ＰＫＵに罹患した対象の治療のための薬剤に使用され得る。薬剤は、静脈内（ＩＶ）投与によって投与されてもよく、薬剤の投与は、対象における神経伝達物質代謝産物又は神経伝達物質レベルを変化させるのに十分な、対象の血流中のＰＡＨタンパク質の発現をもたらす。任意選択的に、薬剤はまた、ｒＡＡＶ ＰＡＨウイルスの投与に関連する任意の肝毒性の予防及び／又は治療のための、予防的及び／又は治療的コルチコステロイドを含み得る。予防的又は治療的コルチコステロイド治療を含む薬剤は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はそれ以上のｍｇ／日のコルチコステロイドを含み得る。予防的又は治療的コルチコステロイドを含む薬剤は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０週間、又はそれ以上の連続的な期間にわたって投与され得る。ＰＫＵ療法は、任意選択的に、チロシン補充も含み得る。
「治療上無効なＡＡＶ粒子」、「治療上無効なＡＡＶ」、「治療上無効なｒＡＡＶ粒子」、又は「治療上無効なｒＡＡＶ」は、細胞に感染することができないＡＡＶ粒子、又は治療上無効なｒＡＡＶ粒子に感染した細胞が、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することができないＡＡＶ粒子を指す。治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、カプシドの単位用量当たりの有効性の低下の一因となり得、有効量の重／完全／部分的完全カプシドのために患者に導入される外来タンパク質の必要な増加による免疫応答のリスクを増加させ得る。治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するカプシド又はｖｇを有するＡＡＶ粒子を含むことができ、空カプシド又は軽カプシドと称される。例えば、空カプシドは、ｖｇを有しないか、又は定量化不可能若しくは検出不可能なｖｇ濃度を有する。別の例では、軽カプシドは、目的の遺伝子を発現しない不完全な発現カセットを有するｖｇを有し得る。一例では、軽カプシドのベクターゲノムは、カプシドによって感染した細胞が治療上有効なヌクレオチド配列を生成するのに不十分な１つ以上のサイズを有する。別の例の軽カプシドでは、軽カプシドのベクターゲノムは、同じ条件下で感染するが、カプシドによる感染を欠く細胞によるエレメントの発現と比較して、カプシドに感染した細胞によるエレメントの発現を低下させる１つ以上のサイズと、エレメントをコードする治療上有効なｒＡＡＶと、を有する。異なる例では、軽カプシドのベクターゲノムのサイズは、治療上有効なｒＡＡＶのベクターゲノムのサイズよりも、５０％以下、４９％以下、４８％以下、４７％以下、４６％以下、４５％以下、４４％以下、４３％以下、４２％以下、４１％以下、４０％以下、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、３５％以下、３４％以下、３３％以下、３２％以下、３１％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下である。空又は軽カプシドはまた、カプシドの感染性を損なう可能性がある異なるカプシド特性を有し得る。別の例では、治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、粒子に関連するＲｅｐタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子を含む。Ｒｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶは、例えば、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８タンパク質）、小さなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０タンパク質）、又はそれらの組み合わせを含む。Ｒｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶはまた、ＡＥＸ処理における洗浄若しくは再生ステップ、又はＺＵＣ処理中のプール後画分の単離などの異なるステップの間にカプシドで除去されるＲｅｐタンパク質を含むことができる。あるいは、Ｒｅｐタンパク質に関連するｒＡＡＶは、カプシドに結合する大きなＲｅｐタンパク質、小さなＲｅｐタンパク質、又はそれらの組み合わせも含み得る。そのような結合には、例えば、共有結合、イオン結合、水素／静電結合、又はファンデルワールス力などの異なる結合ストープ（ｓｔｏｐｅ）が含まれる。異なる例では、ベクターゲノムの一部がカプシド内に封入されていない場合、Ｒｅｐタンパク質は、カプシド又はベクターゲノムを含むｒＡＡＶ粒子の異なる部分に結合することができる。これらのカプシドは、ベクターゲノムを欠くことができるか、又は部分的／完全ベクターゲノムを有することができるが、細胞を感染させることができない。別の例では、治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、脱アミド化カプシドを有するｒＡＡＶ粒子を含む。例えば、脱アミド化カプシドは、脱アミド化ＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３タンパク質を有するカプシドを含む。例えば、ＶＰ１のＮ末端領域における保存されたＮＧ（Ａｓｐ－Ｇｌｙ）残基は、脱アミド化に対して脆弱である。異なる脱アミド化カプシド及び感染性、導入遺伝子発現、又は効力に対するそれらの効果は、Ｇｉｌｅｓ，Ａｐｒｉｌ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．“Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｃｈａｒｇｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２６．１２（２０１８）：２８４８－２８６２、及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ａｍｙ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｐｓｉｄｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅａ”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３１．１３－１４（２０２０）：７５６－７７４に記載されている。いかなる特定の理論にも拘束されないが、重／完全、又は部分的完全カプシドは、それらの電荷及び／又は密度において、軽又は空カプシドとは異なる。
「ＡＡＶ産生不純物」は、治療上有効なｒＡＡＶの有効性を損なう可能性のある不純物を指す。ＡＡＶ産生不純物は、ｒＡＡＶ調製の間に生じ、治療上無効なｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子の凝集体、外因性高分子量ＤＮＡ、小ヌクレオチド、タンパク質、緩衝成分などを含む。
ＡＡＶカプシドに組み込まれた導入遺伝子は、限定されず、治療的目的の任意の異種遺伝子であり得る。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種の核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節成分に作動可能に連結される。
導入遺伝子配列の組成は、得られたベクターが用いられる使用に依存する。例えば、あるタイプの導入遺伝子配列は、発現時に検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列には、限定するものではないが、ｂ－ラクタマーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８を含む膜結合タンパク質、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、及び当該技術分野で周知の他のものであって、それらに対する高親和性抗体が存在するか又は従来の手段によって生成することができるもの、並びに特にヘマグルチニン又はＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
これらのコード配列は、それらの発現を駆動する調節エレメントに関連する場合、酵素、放射線、比色、蛍光又は他の分光学的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、並びに免疫学的アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫組織化学を含む）を含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、ベータ－ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターで色又は光生成によって視覚的に測定することができる。
しかしながら、導入遺伝子は、典型的には、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、酵素、ドミナントネガティブ変異体、又は触媒ＲＮＡなどの、生物学及び医学において有用な産物をコードする非マーカー配列である。望ましいＲＮＡ分子は、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む。有用なＲＮＡ配列の一例は、処置される動物において標的の核酸配列の発現を阻害又は失わせる配列である。典型的には、好適な標的配列には、腫瘍標的及びウイルス性疾患が含まれる。そのような標的の例については、免疫原に関連するセクションで後述する腫瘍標的及びウイルスを参照されたい。
導入遺伝子は、遺伝子欠損を修正又は改善するために使用され得る。遺伝子欠損は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現する欠損、又は機能的な遺伝子産物が発現しない欠損を含み得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。ベクターは更に、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠損を修正又は改善するために、複数の導入遺伝子を含むことができる。ある状況では、異なる導入遺伝子は、タンパク質の各サブユニットをコードするために、又は異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために使用することができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合（例えば、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、又はジストロフィンタンパク質）に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を生成するために、異なるサブユニットの各々を含む組換えウイルスを細胞に感染させる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によってコードされていてもよい。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのＤＮＡが内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離された、各サブユニットをコードするＤＮＡを含む。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい場合、例えば、サブユニットをコードするＤＮＡの総サイズ及びＩＲＥＳが５キロベース（Ｋｂ）未満である場合に望ましい。また、標的細胞内の部分的ゲノムの組換えにより、より長いゲノム（すなわち、＞５（Ｋｂ））が実現可能であり得ることにも留意されたい。ＩＲＥＳの代替として、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によってＤＮＡが分離されていてもよい。例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ１）：１３－２１（Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）、Ｆｕｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）、Ｋｌｕｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（ｌＯ）：８ １１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、スペースが制限因子である場合の使用に非常に好適である。より多くの場合、導入遺伝子が大きい場合、マルチサブユニットからなる場合、又は２つの導入遺伝子が同時送達される場合、所望の導入遺伝子又はサブユニットを有するｒＡＡＶを共投与して、それらをインビボでコンカテマー化し、単一のベクターゲノムを形成することを可能とする。そのような実施形態では、宿主細胞での同時発現のために、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得、第２のＡＡＶは、異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、任意の生物学的に活性な産物又は他の産物（例えば、研究に望ましい産物）をコードすることができる。
好適な導入遺伝子は、当業者によって容易に選択することができる。導入遺伝子の選択は、本発明を限定するとみなすものではない。導入遺伝子は異種タンパク質であってもよく、この異種タンパク質は治療用タンパク質であってもよい。例示的な治療用タンパク質には、限定されないが、血液因子、例えば、ｂ－グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及び凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９など；増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ－９）、肝がん由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－ａ.）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－.ｂ.）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ－ａ受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ－１受容体及び可溶性ＩＩ型ＩＬ－１受容体）、可溶性ｇ／ｄ Ｔ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合断片など；酵素、例えば、ａ－グルコシダーゼ、イミグルカラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃａｒａｓｅ）、ｂ－グルコセレブロシダーゼ、及びアルグルセラーゼ；酵素活性化剤、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子；ケモカイン、例えば、１Ｐ－１０、インターフェロン－ガンマによって誘導されるモノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏａ／ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＲ－１ｂ、ＭＣＰ－１、ＰＦ－４など；血管新生剤、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－２）、神経膠腫由来増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン－２など；抗血管新生剤、例えば可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガストリン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ベータエンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワーファリン，ニューロテンシン、モチリン、甲状腺刺激ホルモン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維性酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトアルファ－１アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化性因子（ＮＣＦ）；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤；血管作用性腸管ペプチド；アンギオゲニン；アンギオトロピン；フィブリン；ヒルディン；ＩＦ－１受容体アンタゴニストなどが含まれる。いくつかの他の非限定的な目的のタンパク質の例には、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３及び４／５（ＮＴ－３及び４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；血友病関連凝固タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；遺伝性血管浮腫関連タンパク質、例えば、Ｃ１阻害剤；ジストロフィン、ミニジストロフィン、又はマイクロジストロフィン；リソソーム酸性リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；糖原病関連酵素、例えば、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、ＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えば、ＧＦＵＴ２）、アルドラーゼＡ、ｂ－エノラーゼ、及びグリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素（例えば、ベータ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；並びにそれらの任意のバリアントが含まれる。他の導入遺伝子には、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ、β－ミオシン重鎖、心筋トロポニンＴ、心筋トロポニンＩ、ミオシン心室必須軽鎖１、ミオシン心室調節軽鎖２、心筋αアクチン（ＡＣＴＣ）、α－トロポミオシン、タイチン、４つ半のＬＩＭタンパク質１をコードする導入遺伝子、及び国際出願公開第２０１４／１７０４７０号の米国特許番号に開示されている他の導入遺伝子が含まれる。ＡＡＶベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞中で又はウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にするような様式で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の制御エレメント又は配列を含む。本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は遠隔で作用する発現制御配列の両方を含む。好適な遺伝子には、Ａｎｇｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｎｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｅｒａ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．ｏｆ Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．７０，ｐａｇｅｓ２７２－２８８（２０１９）、及びＤｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｅｓ ｏｆ Ａｇｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５９，Ｉｓｓｕｅ６３７２，ｅａａｎ４６７２（２０１８）に述べられている遺伝子が含まれる。
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増大する配列；及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増大する配列が含まれる。天然の、構成的、誘導性、及び／又は組織特異的プロモーターを含む多くの発現制御配列が当該分野で既知であり、利用することができる。
構成的プロモーターの例には、限定するものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｌ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照のこと）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ｂ－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外来的に供給される化合物、温度などの環境因子、又は特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、若しくは複製細胞中のみ）の存在によって調節することができる。誘導性プロモーター及び誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むが限定するものではない、様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外来的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［ＷＯ９８／１００８８］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照のこと］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７）］、及びラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７）］が含まれる。この文脈において有用であり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、又は複製細胞中のみにより調節されるものである。
任意選択的に、導入遺伝子の天然のプロモーターが使用され得る。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが望まれる場合、天然のプロモーターが好ましいものであり得る。導入遺伝子の発現を、時間的若しくは発生的に、若しくは組織特異的な様式で、又は特異的な転写刺激に応答して調節しなければならない場合、天然プロモーターを使用することができる。更なる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、又はコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御エレメントはまた、天然の発現を模倣するために使用することができる。
導入遺伝子はまた、組織特異的プロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含み得る。例えば、骨格筋での発現が所望される場合、筋肉で活性なプロモーターが使用される必要がある。これらには、骨格ｂ－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、並びに天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５（１９９９）を参照のこと）。組織特異的であるプロモーターの例は、特に、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２，Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））について知られている。
組換えＡＡＶを用いて、例えば細胞培養において目的のタンパク質をインビトロで生成することができる。例えば、ＡＡＶは、インビトロで目的のタンパク質を生成するための方法で使用することができ、その方法は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを細胞培養物中の細胞と接触させ、それにより組換えＡＡＶが細胞中で目的のタンパク質を発現することとを含む。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１キロベース（ｋｂ）、少なくとも約０．２ｋｂ、少なくとも約０．３ｋｂ、少なくとも約０．４ｋｂ、少なくとも約０．５ｋｂ、少なくとも約０．６ｋｂ、少なくとも約０．７ｋｂ、少なくとも約０．８ｋｂ、少なくとも約０．９ｋｂ、少なくとも約１ｋｂ、少なくとも約１．１ｋｂ、少なくとも約１．２ｋｂ、少なくとも約１．３ｋｂ、少なくとも約１．４ｋｂ、少なくとも約１．５ｋｂ、少なくとも約１．６ｋｂ、少なくとも約１．７ｋｂ、少なくとも約１．８ｋｂ、少なくとも約２．０ｋｂ、少なくとも約２．２ｋｂ、少なくとも約２．４ｋｂ、少なくとも約２．６ｋｂ、少なくとも約２．８ｋｂ、少なくとも約３．０ｋｂ、少なくとも約３．２ｋｂ、少なくとも約３．４ｋｂ、少なくとも約３．５ｋｂの長さ、少なくとも約４．０ｋｂの長さ、少なくとも約５．０ｋｂの長さ、少なくとも約６．０ｋｂの長さ、少なくとも約７．０ｋｂの長さ、少なくとも約８．０ｋｂの長さ、少なくとも約９．０ｋｂの長さ、又は少なくとも約１０．０ｋｂの長さであることができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。
組換えＡＡＶを用いて、例えば哺乳動物などの動物において目的のタンパク質をインビボで生成することもできる。いくつかの実施形態は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶを提供することと、組換えＡＡＶを対象に投与し、それにより組換えＡＡＶは対象において目的のタンパク質を発現することとを含む、目的のタンパク質をインビボで生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、マウス、又はウシであることができる。目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のサイズは変動し得る。例えば、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．１ｋｂ、少なくとも約０．２ｋｂ、少なくとも約０．３ｋｂ、少なくとも約０．４ｋｂ、少なくとも約０．５ｋｂ、少なくとも約０．６ｋｂ、少なくとも約０．７ｋｂ、少なくとも約０．８ｋｂ、少なくとも約０．９ｋｂ、少なくとも約１ｋｂ、少なくとも約１．１ｋｂ、少なくとも約１．２ｋｂ、少なくとも約１．３ｋｂ、少なくとも約１．４ｋｂ、少なくとも約１．５ｋｂ、少なくとも約１．６ｋｂ、少なくとも約１．７ｋｂ、少なくとも約１．８ｋｂ、少なくとも約２．０ｋｂ、少なくとも約２．２ｋｂ、少なくとも約２．４ｋｂ、少なくとも約２．６ｋｂ、少なくとも約２．８ｋｂ、少なくとも約３．０ｋｂ、少なくとも約３．２ｋｂ、少なくとも約３．４ｋｂ、少なくとも約３．５ｋｂの長さ、少なくとも約４．０ｋｂの長さ、少なくとも約５．０ｋｂの長さ、少なくとも約６．０ｋｂの長さ、少なくとも約７．０ｋｂの長さ、少なくとも約８．０ｋｂの長さ、少なくとも約９．０ｋｂの長さ、又は少なくとも約１０．０ｋｂの長さであることができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは少なくとも約１．４ｋｂの長さである。
特に目的のものは、様々な疾患又は障害を治療するための１つ以上の治療用タンパク質を発現させるための組換えＡＡＶの使用である。疾患の非限定的な例には、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫などの癌；並びに多発性硬化症などの自己免疫疾患が含まれる。癌腫の非限定的な例には、食道癌；肝細胞癌；基底細胞癌、扁平上皮癌（種々の組織）；移行上皮癌を含む膀胱癌；気管支原性癌；結腸癌；大腸癌；胃癌；肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌；副腎皮質癌；甲状腺癌；膵臓癌；乳癌；卵巣癌；前立腺癌；腺癌；汗腺癌；脂腺癌；乳頭癌；乳頭腺癌；嚢胞腺癌；髄様癌；腎細胞癌；非浸潤性乳管癌又は胆管癌；絨毛癌；セミノーマ；胎児性癌；ウィルムス腫瘍；子宮頸癌；子宮癌；精巣癌；骨形成癌；上皮癌；並びに鼻咽頭癌が含まれる。肉腫の非限定的な例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏ ｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫が含まれる。固形腫瘍の非限定的な例には、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が含まれる。白血病の非限定的な例には、慢性骨髄増殖性症候群；急性骨髄性白血病；Ｂ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ球性白血病及び有毛細胞白血病を含む、慢性リンパ球性白血病；並びに急性リンパ芽球性白血病が含まれる。リンパ腫の例には、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中に開示されるｒＡＡＶ、及び方法を用いて治療することができる疾患の他の非限定的な例には、鎌状赤血球貧血症、嚢胞性線維症、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損１、テイ＝サックス病、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原病（ＧＳＤ、例えばＧＳＤタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、及びＸＩＶ）、ガラクトース血症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）、心筋症（例えば、肥大型心筋症、拡張型心筋症、不整脈原性右室心筋症など）及び血友病Ａ（古典的血友病）、血友病Ｂ（クリスマス病）などの血友病、ウィルソン病、ファブリー病、ゴーシェ病遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、並びにアルファ１アンチトリプシン欠損症を含む遺伝性疾患が含まれる。加えて、本明細書に開示されるｒＡＡＶ及び方法を使用して、肝臓における導入遺伝子の局所発現、又は肝臓若しくは肝細胞からの分泌タンパク質の発現によって治療することができる他の障害を治療することができる。
対象（例えば、対象の血清）において発現される異種タンパク質の量は変動し得る。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質は、少なくとも約９ミリグラム（ｍｇ）／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４９ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの量で対象の血清中で発現され得る。目的のタンパク質は、約９ｐｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約６００ｐｇ／ｍＬ、約７００ｐｇ／ｍＬ、約８００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬ、約１５００ｐｇ／ｍＬ、約２０００ｐｇ／ｍＬ、約２５００ｐｇ／ｍＬ、又はそれらの値のいずれか２つの間の範囲の量で対象の血清中で発現され得る。当業者は、目的のタンパク質が治療上効果的であるために必要な発現レベルは、目的の特定のタンパク質及び治療を受けている対象などの非限定的な因子によって変動し得るものであり、有効量のタンパク質は、過度の実験をすることなく当該技術分野で既知の従来の方法を用いて当業者によって容易に決定され得ることを理解するであろう。
アデノ随伴ウイルスを生成する方法
当該技術分野で既知の任意の方法は、本開示の新規のｒＡＡＶウイルス粒子の調製のために使用され得る。いくつかの実施形態において、新規のｒＡＡＶウイルス粒子は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）において生成される。いくつかの実施形態において、新規のｒＡＡＶウイルス粒子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）において生成される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子とともに導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムベクターを宿主細胞に提供することによって調製される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶゲノムベクターは、導入遺伝子、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子、及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、２つ以上のベクターを宿主細胞に提供することによって調製される。例えば、いくつかの実施形態において、導入遺伝子を含むＡＡＶゲノムベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）を有する細胞に導入される（例えば、トランスフェクト又は形質導入される）。いくつかの実施形態において、導入遺伝子、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）、及びＡＡＶ Ｃａｐ遺伝子を含むベクター（例えば、プラスミド又はバキュロウイルス）を含むＡＡＶゲノムベクターをトランスフェクト又は形質導入した細胞。
ＡＡＶウイルス粒子を作製する方法は、例えば、米国特許第６２０４０５９号、ＵＳ５７５６２８３、ＵＳ６２５８５９５、ＵＳ６２６１５５１、ＵＳ６２７０９９６、ＵＳ６２８１０１０、ＵＳ６３６５３９４、ＵＳ６４７５７６９、ＵＳ６４８２６３４、ＵＳ６４８５９６６、ＵＳ６９４３０１９、ＵＳ６９５３６９０、ＵＳ７０２２５１９、ＵＳ７２３８５２６、ＵＳ７２９１４９８及びＵＳ７４９１５０８、ＵＳ５０６４７６４、ＵＳ６１９４１９１、ＵＳ６５６６１１８、ＵＳ８１３７９４８、又は国際公開第１９９６／０３９５３０号、ＷＯ１９９８／０１００８８、ＷＯ１９９９／０１４３５４、ＷＯ１９９９／０１５６８５、ＷＯ１９９９／０４７６９１、ＷＯ２０００／０５５３４２、ＷＯ２０００／０７５３５３、ＷＯ２００１／０２３５９７、ＷＯ２０１５／１９１５０８、ＷＯ２０１９／２１７５１３、ＷＯ２０１８／０２２６０８、ＷＯ２０１９／２２２１３６、ＷＯ２０２０／２３２０４４、ＷＯ２０１９／２２２１３２、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－８（１９８９）、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４６４６－５０（１９９１）、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）、Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．，２１９：３７－４４（１９９６）、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２－９３（２０００）に記載されており、それらの各々の内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞又は非ヒト哺乳類細胞）などの細胞は、ｒＡＡＶを生成することができる。例えば、細胞は、ＡＡＶヘルパー機能、ＡＡＶ非ヘルパー機能、及び細胞がＡＡＶベクターゲノムを生成するために使用するヌクレオチド配列を提供する場合、ｒＡＡＶを生成することができる。様々な実施形態において、細胞がｒＡＡＶを生成するために使用するＡＡＶヘルパー機能、ＡＡＶ非ヘルパー機能、及びヌクレオチド配列は、例えば、トランスフェクション試薬によるトランスフェクションを介して、他の組換えウイルスによる形質導入／感染を介して、ヌクレオチド配列を細胞のゲノムに組み込むことによって、又は他の方法によって、細胞に送達されるベクターによって提供される。このような細胞の例には、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９、及びＭＲＣ－５細胞などの哺乳動物細胞株が含まれる。他の例では、使用される昆虫細胞株は、Ｓｆ９、ＳＦ２１、ＳＦ９００＋などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株、蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株、家蚕細胞株、例えば、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ細胞株、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などのＴｒｉｃｈｏｐｉｕｓｉａ ｎｉ細胞株、又はＡｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株などのＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞株由来であり得る。好ましい昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｆ－ＲＶＮ、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２ｌ、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍｌ、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８を含む、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞である。
以前に記載されるように、「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、バクミド、ミニプラスミド（例えば、細菌エレメントを欠くプラスミド）、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（例えば、最小限の閉鎖線形構築物）、染色体、ウイルス、ビリオン（例えば、バキュロウイルス）などの任意の遺伝子エレメントを指すものと理解され、これは適切な制御エレメントと会合したときに複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移行することができる。本明細書で使用される場合、「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子を指す。例示的な生物学的ベクターとしては、プラスミド、直鎖核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。任意のベクターが、昆虫細胞適合性である限り用いられ得る。ベクターは、昆虫細胞ゲノムに組み込まれ得るが、昆虫細胞中のベクターの存在は、永久的である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、既知の任意の手段、例えば、細胞の化学処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入され得る。バキュロウイルスベクター及びその使用方法は、昆虫細胞の分子工学に関する上記引用文献に記載されている。
細胞がｒＡＡＶベクターゲノムを生成するベクターは、目的の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入を可能にするための、プロモーター及びプロモーターの下流の制限部位を更に含み、プロモーター及び制限部位は、５’ＡＡＶ ＩＴＲの下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流に位置する。ベクターはまた、制限部位の下流及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの上流の転写後調節エレメントを更に含有し得る。ウイルス構築物は、制限部位に挿入され、プロモーターと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを更に含み得、ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質のコード領域を含む。
「ＡＡＶヘルパー」という用語は、増殖性ＡＡＶ複製のために今度はトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現産物は、特に以下のものを含む、多くの機能を有することが示されている：ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む。カプシド（Ｃａｐ）発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターゲノムから失われたトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
様々な実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能を提供するベクターは、カプシドタンパク質又はＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７．１）、ＡＡＶ２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２）、ＡＡＶ３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１７２９．１）、ＡＡＶ３Ｂ（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０５．１）、ＡＡＶ４（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９．１）、ＡＡＶ５（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６１５２．１）、ＡＡＶ６（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０４．１）、ＡＡＶ７（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６２６０．１）、ＡＡＶ８（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６２６１．１）、ＡＡＶ９（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２５０．１）、ＡＡＶ１０（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ６３１９６５．１）、ＡＡＶ１１（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ６３１９６６．１）、ＡＡＶ１２（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ８１３６４７．１）、ＡＡＶ１３（ＮＣＢＩ参照配列番号／Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＵ２８５５６２．１）、ｉｓ ＡＡＶ－ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ－ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、ＡＡＶ－ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－２Ｇ９、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、若しくはＪａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ＿ｐｏ．６、ＡＡＶ＿ｐｏ．、ＡＡＶ＿ｐｏ．５、ＡＡＶ＿ＬＫ０３、ＡＡＶ＿ｒａ．１、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿ＹＮＭ、ＡＡＶ＿ｂａｔ＿Ｂｒａｚｉｌ、ＡＡＶ＿ｍｏ．１、ＡＡＶ＿トリ＿ＤＡ－１、若しくはＡＡＶ＿マウス＿ＮＹ１、Ｂｂａ２１、Ｂｂａ２６、Ｂｂａ２７、Ｂｂａ２９、Ｂｂａ３０、Ｂｂａ３１、Ｂｂａ３２、Ｂｂａ３３、Ｂｂａ３４、Ｂｂａ３５、Ｂｂａ３６、Ｂｂａ３７、Ｂｂａ３８、Ｂｂａ４１、Ｂｂａ４２、Ｂｂａ４３、Ｂｂａ４４、Ｂｃｅ１４、Ｂｃｅ１５、Ｂｃｅ１６、Ｂｃｅ１７、Ｂｃｅ１８、Ｂｃｅ２０、Ｂｃｅ３５、Ｂｃｅ３６、Ｂｃｅ３９、Ｂｃｅ４０、Ｂｃｅ４１、Ｂｃｅ４２、Ｂｃｅ４３、Ｂｃｅ４４、Ｂｃｅ４５、Ｂｃｅ４６、Ｂｅｙ２０、Ｂｅｙ２２、Ｂｅｙ２３、Ｂｍａ４２、Ｂｍａ４３、Ｂｐｏ１、Ｂｐｏ２、Ｂｐｏ３、Ｂｐｏ４、Ｂｐｏ６、Ｂｐｏ８、Ｂｐｏ１３、Ｂｐｏ１８、Ｂｐｏ２０、Ｂｐｏ２３、Ｂｐｏ２４、Ｂｐｏ２７、Ｂｐｏ２８、Ｂｐｏ２９、Ｂｐｏ３３、Ｂｐｏ３５、Ｂｐｏ３６、Ｂｐｏ３７、Ｂｒｈ２６、Ｂｒｈ２７、Ｂｒｈ２８、Ｂｒｈ２９、Ｂｒｈ３０、Ｂｒｈ３１、Ｂｒｈ３２、Ｂｒｈ３３、Ｂｆｍ１７、Ｂｆｍ１８、Ｂｆｍ２０、Ｂｆｍ２１、Ｂｆｍ２４、Ｂｆｍ２５、Ｂｆｍ２７、Ｂｆｍ３２、Ｂｆｍ３３、Ｂｆｍ３４、Ｂｆｍ３５、ＡＡＶ－ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｈ３９、ＡＡＶ－ｒｈ４３、ＡＡＶａｎｃ８０Ｌ６５、又はそれらのいずれかのバリアントを含むが、これらに限定されない）に由来するｃａｐ遺伝子及び／又はｒｅｐ遺伝子は、組換えＡＡＶを生成するために本明細書で使用され得る 例示的なカプシドはまた、その全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第２０１８／０２２６０８及びＷＯ２０１９／２２２１３６にも提供される。上記で提供される各々のＮＣＢＩ参照配列番号又はＧｅｎｂａｎｋ受託番号も、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、血清型１、血清型２、血清型３、血清型３Ｂ、血清型４、血清型５、血清型６、血清型７、血清型８、血清型９、血清型１０、血清型１１、血清型１２、血清型１３、又はそれらのバリアントからのカプシドをコードする。
生成のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、カプシドを形成するのに十分な組換えカプシドタンパク質を産生する。これは、少なくともＶＰ１タンパク質及びＶＰ３タンパク質を含むが、より典型的には、天然のＡＡＶに見出されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の３つ全てを含む。カプシドタンパク質の配列は、宿主細胞によって産生されるＡＡＶビリオンの血清型を決定する。本発明で有用なカプシドには、１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は混合血清型を含む、いくつかのＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる（例えば、非天然の混合血清型の開示については、米国特許第８３１８４８０号を参照されたい）。カプシドタンパク質はまた、変異、キメラ、又はシャッフルされたタンパク質を含む、天然のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のバリアントであってもよい。カプシドタンパク質は、ＡＡＶの様々なクレード内のｒｈ．１０又は他のサブタイプのものであってもよく、様々なクレード及びサブタイプは、例えば、米国特許第７，９０６，１１１号に開示されている。幅広い構築物の利用可能性及び広範な特性決定のために、以下に開示される例示的なＡＡＶベクターは、血清型２に由来する。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９－６２３，２０００、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ９７：３４２８－３４３２，２０００、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４－２２３２，１９９８、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４－１５３２，２０００、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５－６６２４，２００１、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，２００１に説明されている。
様々な実施形態において、ＶＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。様々な実施形態において、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターなどの好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。別の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
生成のために、ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞は、ｒＡＡＶの生成を促進するためにＲｅｐタンパク質を産生する。細胞内で少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）及び少なくとも１つの小さなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が発現されると、感染性粒子が生成され得ることが分かっている。特定の実施形態において、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の４つ全てが発現される。あるいは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２、又はＲｅｐ６８及びＲｅｐ４０が発現される。以下の例は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の組み合わせの使用を示す。Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ－２又は他の血清型に由来することができる。様々な実施形態において、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。様々な実施形態において、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターなどの好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。他の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
ＡＡＶヘルパー機能を有する細胞はまた、カプシドの集合を助ける集合活性化タンパク質（ＡＡＰ）を生成することができる。様々な実施形態において、ＡＡＰをコードするヌクレオチド配列は、好適な発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結され得る。他の例では、ヌクレオチド配列は、ポリヘドリン（Ｐｏｌｈ）プロモーター、ΔＩＥ１プロモーター、ｐ５プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ４０プロモーター、メタロチオネインプロモーター、３９Ｋプロモーター、ｐ６．９プロモーター、及びｏｒｆ４６プロモーターなどのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結され得る。
「非ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシド集合に関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを捕捉する。ウイルスベースの付属機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型を除く）及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来することができる。
「非ＡＡＶヘルパー機能ベクター」という用語は、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。補助機能ベクターを、好適な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、ベクターは、次に、宿主細胞におけるＡＡＶビリオン生成を支持することができる。この用語から明示的に除外されるのは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス粒子など、自然界に存在する感染性ウイルス粒子である。したがって、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、又はコスミドの形態であり得る。特に、アデノウイルス遺伝子の完全相補体は、補助ヘルパー機能に必要ではないことが実証されている。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が不可能なアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製に対して許容的であることが示されている。Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域が、おそらく補助機能の提供に関与していないことを示している。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６：５０５。しかしながら、Ｅ１領域に欠損しているか、又はＥ４領域が欠損しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持することができない。したがって、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的又は間接的に、ＡＡＶ複製のために必要とされる可能性が高い。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１９２５、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体には次のものが含まれる。Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）、上記、Ｊａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９８１）、上記、Ｏｓｔｒｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９、Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５、Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２９２７、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）、Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｉｎ Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，１９９０））、Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、上記）、及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）、上記、Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供される補助機能の研究は、矛盾する結果をもたらしているが、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６－２１０は、最近、Ｅ１Ｂ５５ｋは、ＡＡＶビリオンの生成に必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋはそうではないことを報告している。加えて、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ５：９３８－９４５は、様々なＡｄ遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載している。特に好ましい補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及び無傷のＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。そのようなベクターは、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。
ｒＡＡＶウイルス粒子の生成に一般的に使用される宿主細胞には、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、及び米国特許第６１５６３０３、ＵＳ５３８７４８４、ＵＳ５７４１６８３、ＵＳ５６９１１７６、及びＵＳ５６８８６７６、米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号、並びに国際特許公開第２０００／０４７７５７、ＷＯ２０００／０２４９１６、及びＷＯ１９９６／０１７９４７に記載されている他の哺乳動物細胞株が含まれるが、これらに限定されず、これらの各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であり得る。ＡＡＶウイルス粒子の生成に使用され得る哺乳動物細胞の他の例としては、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、並びに哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子の生成に使用される宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターを含むが、これらに限定されない哺乳動物種に由来する細胞である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子の生成に使用される宿主細胞は、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞などを含むが、これらに限定されない、細胞種類に由来する細胞である。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、核酸、例えば、ベクター、例えば、昆虫細胞適合性ベクターを、そのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養物中で維持する方法のように、十分に証明されている。（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｊ（１９９５）、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）ｖｏｌ．６３，ｐｐ．３８２２－３８２８、Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）ｖｏｌ．８８，ｐｐ．４６４６－４６５０、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９９２）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．６９２２－６９３０、Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（１９９６）ｖｏｌ．２１９，ｐｐ．３７－４４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．（２０００）ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．３８２－３９３、及び米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたい）。使用され得る昆虫細胞株の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｆ９００＋、ショウジョウバエ細胞株、蚊細胞株、例えばＡｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株、家蚕細胞株、例えばＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ細胞株、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞株、例えばＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞株、又はＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ細胞株、例えばＡｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ細胞株に由来し得る。例示的な昆虫細胞は、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｆ－ＲＶＮ、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４、ＭＧ－１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、ＢＭ－Ｎ、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＡｏ３８を含む、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞である。
いくつかの実施形態において、新規のｒＡＡＶウイルス粒子は、昆虫細胞内で生成される。培養における昆虫細胞の増殖条件、及び培養における昆虫細胞における異種生成物の生成は、当該技術分野において周知であり、米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、ｒＡＡＶ生成のためのベクターを有する昆虫細胞が提供される。ｒＡＡＶ生成のためのヌクレオチド配列を有する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を使用して、これらのヌクレオチド配列を、ｒＡＡＶ生成のために昆虫細胞に送達することができる。ｒＢＶなどのバキュロウイルスは、節足動物のエンベロープＤＮＡウイルスであり、そのうち２つのメンバーは、細胞培養において組換えタンパク質を生成するための周知の発現ベクターである。バキュロウイルスは、円形の二本鎖ゲノム（８０～２００ｋｂｐ）を有し、これを操作して、特定の細胞への大きいゲノム含有量の送達を可能にすることができる。ベクターとして使用されるウイルスは、一般に、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａマルチカプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体ウイルス（Ｂｍ－ＮＰＶ）である（Ｋａｔｏｕ，Ｙａｓｕｈｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０４．２（２０１０）：２０４－２１４．）。バキュロウイルスは、一般に、組換えタンパク質の発現のための昆虫細胞の感染に使用される。特に、昆虫における異種遺伝子の発現は、例えば、米国特許第４，７４５，０５１号、Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３１（１９８６）：３１－４９、ＥＰ１２７８３９、ＥＰ１５５４７６、Ｖｌａｋ，Ｊｕｓｔ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６９．４（１９８８）：７６５－７７６、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌｏｉｓ Ｋ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４２．１（１９８８）：１７７－１９９、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ｌｕｉｓ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ７３．２（１９８８）：４０９－４１８、Ｍａｅｄａ，Ｓｕｓｕｍｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１５．６０２０（１９８５）：５９２－５９４、Ｌｅｂａｃｑ－Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ，ＡＮＮＥ－ＭＡＲＩＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ８．８（１９８８）：３１２９－３１３５、Ｓｍｉｔｈ，Ｇａｌｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ８２．２４（１９８５）：８４０４－８４０８、Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ａｔｓｕｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ５８．２－３（１９８７）：２７３－２８１、及びＭａｒｔｉｎ，Ｂｒｉａｎ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ７．２（１９８８）：９９－１０６に記載されているように達成することができる。タンパク質生成に使用することができる多数のバキュロウイルス株及びバリアント、並びに対応する許容昆虫宿主細胞は、Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖｅｒｎｅ Ａ．，ａｎｄ Ｍａｘ Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６．１（１９８８）：４７－５５、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．８（ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｅｔｌｏｗ ａｎｄ Ａ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２７７－２９８，１９８６）、Ｍａｅｄａ，Ｓｕｓｕｍｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１５．６０２０（１９８５）：５９２－５９４、及びＭｃＫｅｎｎａ，Ｋｅｖｉｎ Ａ．，Ｈｕａｚｈｕ Ｈｏｎｇ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ．Ｇｒａｎａｄｏｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ７１．１（１９９８）：８２－９０に記載されている。
組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成するために、ドナーベクター及びバクミド又は転写ベクター及び線状バキュロウイルスＤＮＡが使用される。バクミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌において、大きなプラスミドとして増殖する。昆虫細胞にトランスフェクトされると、バクミドはバキュロウイルスを生成する。従来のバキュロウイルスの生成、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ系では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける部位特異的転位により組換えバキュロウイルスを生成する。次いで、高分子量バクミドＤＮＡを単離し、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞にトランスフェクトし、そこから組換えバキュロウイルスを単離して増幅する。
昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターゲノムのためのヌクレオチド配列を有するか、又はｒＢＶを生成するためのＡＡＶヘルパー機能を提供するヌクレオチド配列を有するバクミドで別々にトランスフェクトすることができる。これらの異なるｒＢＶは、その後、ナイーブな昆虫細胞を共感染させて、ｒＡＡＶを生成するために使用される。
様々な実施形態において、トランスフェクション後の細胞は、トランスフェクション後、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約１４４時間、約１６８時間、約１９２時間、約２１６時間、約２４０時間、又はそれらの２つの時点のうちのいずれかの間の時間、培養される。
前述のように、増加した濃度の治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、ＺＵＣによって毎回処理することができる経済的に実行可能な量である。１つの例において、様々な実施形態のプロセスは、より大きな細胞培養体積を、ｒＡＡＶ生成に用いることができるように、より高い濃度のｒＡＡＶを生成することを可能にすることができる。例えば、ｒＡＡＶを生成することができる宿主細胞は、少なくとも５ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも１０ｍＬ、少なくとも２０ｍＬ、少なくとも５０ｍＬ、少なくとも１００ｍＬ、少なくとも５００ｍＬ、少なくとも１リットル（Ｌ）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、又は少なくとも２５００Ｌの体積で培養することができる。培養は、回転チューブ、振とうフラスコ、又はバイオリアクター中でも行われ得る。
清澄化：培養宿主細胞からｒＡＡＶビリオンを除去するために、多数の方法を用いることができる。一例において、細胞を溶解し、ウイルスを精製することができる。あるいは、ウイルスを上清中に発現させる。ｒＡＡＶビリオンは、遠心分離、濾過、タンジェンシャルフロー濾過、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製することができる。
そのような方法の一例では、昆虫細胞を、溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス－Ｃｌ ｐＨ＝８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシクロエート（ｄｅｏｘｙｃｈｌｏａｔｅ））中に再懸濁し、ガラスビーズを使用して溶解する。溶解物を、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）で処理し、４０００ｇで遠心分離し、上清を、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＨＥカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、及びＰＯＲＯＳ ＨＥ（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ３４６：４１３－３０，２００２）でクロマトグラフにかけた。
カプシド形成／感染性：ベクターゲノムのカプシド形成を評価するために、精製したＡＡＶビリオンをヌクレアーゼで処理して、任意の非カプシド形成ＤＮＡを分解することができる。カプシド形成したＤＮＡは、ヌクレアーゼから保護され、したがって、ヌクレアーゼ処理後に検出可能である。以下の実施例は、サザンブロッティングによって決定されるように、ベンゾナーゼ処理で生存するベクターゲノムを示す。
ビリオンの性能を評価するために、精製したｒＡＡＶビリオンを使用して、培養物中のＨＥＫ２９３細胞に感染させるか、又はマウス骨格筋に注入して、ＧＦＰを発現する細胞のスコアリングによってそれらの感染性を評価する。ペイロード遺伝子が光学的にアクセスできない場合、ウェスタンブロッティング、イムノアッセイ、ＰＣＲ、又は逆転写ＰＣＲ、又は機能的アッセイなどの他の検出技術を用いて、感染性を評価することができる。米国特許公開第２０１５／００７１８８３号の実施例３では、第ＶＩＩＩ因子発現ｒＡＡＶを有するＲａｇ２マウスの形質導入を評価するために、イムノアッセイ及び凝固アッセイを使用する。したがって、感染性の尺度は、ペイロード遺伝子及びモデルシステムに応じて変化し得る。
一般に、ビリオンは、１０７（１０＾７、１Ｅ０７）個のウイルスゲノムを含有するビリオン溶液の存在下でＨＥＫ２９３細胞をインキュベートすると、外来遺伝子が細胞によって検出可能な量で発現されるように、感染性である。あるいは、ビリオンは、１０＾６個のウイルスゲノムを含有するビリオン溶液の存在下でＨＥＫ２９３細胞をインキュベートすると、外来遺伝子が細胞によって検出可能な量で発現されるように、感染性である。
製剤：ｒＡＡＶの様々な製剤が、当該技術分野で知られている。精製されたｒＡＡＶは、任意選択の緩衝液、担体、及び／又は安定剤を含む生理食塩水中で希釈又は透析することができる。既知のＡＡＶ製剤には、ポラキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）、ＰＥＧ、糖、多価アルコール、又は多価イオン塩を使用するものが含まれる。例えば、米国特許第８，８５２，６０７号及び第７，７０４，７２１号を参照されたい。例示的な製剤は、１．３８ｍｇ／ｍｌのリン酸ナトリウム、一塩基性一水和物、１．４２ｍｇ／ｍｌのリン酸ナトリウム、二塩基性（乾燥）、８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌのマンニトール、及び２．０ｍｇ／ｍｌのポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）、ｐＨ７．４である。
他の例において、本発明のｒＡＡＶ医薬製剤は、治療のための保存及び／又は対象への投与のための有利な特性を有する製剤を提供するために、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。ある特定の実施形態において、本発明の医薬製剤は、少なくとも２週間、好ましくは少なくとも４週間、より好ましくは少なくとも６週間、及び更により好ましくは少なくとも約８週間、安定性の検出可能な変化なしに、６５℃未満で保存されることが可能である。これに関して、「安定した」という用語は、製剤中に存在するｒＡＡＶが、保存中にその物理的安定性、化学的安定性、及び／又は生物活性を本質的に保持することを意味する。本発明のある特定の実施形態において、医薬製剤中に存在する組換えＡＡＶウイルスは、－６５℃で定められた期間にわたる保存中、ヒト患者におけるその生物活性の少なくとも約８０％、より好ましくは、ヒト患者におけるその生物活性の少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％を保持する。
様々な例では、ｒＡＡＶを含む製剤は、１つ以上の緩衝剤を更に含む。他の緩衝剤は、Ｓｅｋ，Ｄ．“Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｏｌｄ ｈａｂｉｔｓ：ｍｏｖｉｎｇ ａｗａｙ ｆｒｏｍ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ３（２０１２）に開示されている。例えば、本発明の製剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、又は約１．４ｍｇ／ｍｌ～約１．６ｍｇ／ｍｌの濃度で二塩基性リン酸ナトリウムを含む。特に好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性（乾燥）リン酸ナトリウムを含む。本発明のｒＡＡＶ製剤での使用を見出され得る別の緩衝剤は、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物であり、これは、いくつかの実施形態において、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、又は約１．３ｍｇ／ｍｌ～約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度での使用を見出される。特に好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物を含む。本発明のなお一層特に好ましい実施形態において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、約１．４２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、及び約１．３８ｍｇ／ｍｌの一塩基性一水和物リン酸ナトリウムを含む。
別の態様において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌ、又は約８ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、塩化ナトリウムなどの１つ以上の等張剤を含んでもよい。特に好ましい実施形態において、本発明の製剤は、約８．１８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。当技術分野で知られている他の緩衝剤及び等張性剤が適切であり、本開示の製剤で使用するために日常的に使用することができる。
別の態様において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、１つ以上の増量剤を含み得る。例示的な充填剤としては、マンニトール、スクロース、デキストラン、ラクトース、トレハロース、及びポビドン（ＰＶＰ Ｋ２４）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の好ましい実施形態において、本発明の製剤は、マンニトールを含み、これは、約５ｍｇ／ｍｌ～約４０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約１５ｍｇ／ｍｌ～約２５ｍｇ／ｍｌの量で存在し得る。特に好ましい実施形態において、マンニトールは、約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
更に別の態様において、本発明のｒＡＡＶ製剤は、非イオン性界面活性剤であり得る１つ以上の界面活性剤を含んでもよい。
本開示の他の態様及び利点は、以下の例示的な実施例を考慮して理解されるであろう。
本発明の例示的な実施形態
実施例１－感染性及び導入遺伝子発現に対する軽カプシドの影響
以前に記載されているように、治療上有効なｒＡＡＶ粒子の産生は、完全に効率的なプロセスではない。ＡＡＶ産生は、治療上有効なｒＡＡＶ粒子、治療上無効なｒＡＡＶ粒子、及び産生不純物（例えば、低分子量ＤＮＡ及び小ヌクレオチド、外因性高分子量ＤＮＡ、緩衝成分など）の混合物をもたらす。治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、感染細胞が、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現するように、細胞を感染させることができる。この程度まで、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するカプシド又はｖｇを有するＡＡＶ粒子を含むことができる。例えば、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なる翻訳後修飾を有するカプシドを有することができる。他の例では、治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、異なるサイズ／長さ、プラス若しくはマイナスの鎖配列、異なるフリップ／フロップ逆方向末端反復（ＩＴＲ）構成、異なる数のＩＴＲ、又は切断を有するｖｇを有することができる。治療上有効なｒＡＡＶ粒子は、「重」、「完全」、又は「部分的」カプシドとも呼ばれる。治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、細胞に感染することができないか、又は治療上無効なｒＡＡＶ粒子に感染した細胞は、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することができない。治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、カプシドの単位用量当たりの有効性の低下の一因となり得、有効量の重／完全カプシドのために患者に導入される必要な増加した数の外来タンパク質による免疫応答のリスクを増加させ得る。治療上無効なｒＡＡＶ粒子は、異なる特性を有するカプシド又はｖｇを有するＡＡＶ粒子を含むことができ、空カプシド又は軽カプシドと称される。例えば、空カプシドは、ｖｇを有しないか、又は定量化不可能なｖｇ濃度を有する。空又は軽カプシドはまた、異なるカプシド特性を有することができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、重／完全／部分的完全カプシドは、それらの電荷及び／又は密度において、軽又は空カプシドとは異なる。
図１Ａ及び１Ｂは、分析的超遠心分離を使用したＡＡＶ調製物の例示的な粒子プロファイルを示す。図１Ｂに示されるように、いくつかの低分子量不純物が存在し得ることが分かり得るが、主な不純物は、約４％の空カプシド及び約６～７％の凝集体である。調製物からの治療上有効なカプシドは、約６２％の完全／重カプシド及び約２５％の部分的完全／部分的カプシドを含む。
図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、及び３Ｂは、目的の遺伝子の導入遺伝子発現に対する軽粒子の存在の効果を示す。ＨｅｐＧ２細胞を、目的の遺伝子＃１（ＧＯＩ１）についての導入遺伝子を有する治療上有効なｒＡＡＶ粒子（すなわち、重カプシド）、及び既知の濃度の治療上無効なｒＡＡＶ粒子（すなわち、軽カプシド）に感染させた。図２Ａ、２Ｂ、３Ａ、及び３Ｂに示されるように、軽カプシドの濃度の増加は、ＨｅｐＧ２細胞における導入遺伝子の発現を低下させた。図３Ｂは、軽カプシドが、細胞に感染するカプシドの約５０％を占める場合、相対的効力が約４８％低下することを強調している。したがって、軽粒子の存在は、ＨｅｐＧ２細胞内の重粒子の導入遺伝子の発現及び効力を低下させる。
図４、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１２Ａ、及び１２Ｂは、軽カプシドがＨｅｐＧ２細胞に結合することができ、ＨｅｐＧ２細胞に入ることができ、ＨｅｐＧ２細胞の核に入ることができることを示す。この研究では、重カプシドを、緑色蛍光を示すシアニン３（Ｃｙ３）染料又は赤色蛍光を示すシアニン５（Ｃｙ５）染料で標識した。軽カプシドもＣｙ３又はＣｙ５で標識した。具体的には、安定な結合を得るための重／軽カプシド上の一級アミンとの標識反応Ｃｙ３／Ｃｙ５ ＮＨＳエステル。
標識した粒子をＨｅｐＧ２細胞に加えた。具体的には、ＡＡＶ形質導入の前に、ＨｅｐＧ２細胞を、細胞イメージングプレート上に播種した。細胞を、標識したＡＡＶと４℃で１時間インキュベートして、細胞表面受容体に結合させ、エンドサイトーシスを阻害することによって内在化を阻止した。細胞を、３７℃で４～８時間インキュベートして、重及び軽カプシドが、ＨｅｐＧ２細胞を形質導入することを可能にした。次いで、細胞を、ＣＭＥＭ及びＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、共焦点顕微鏡用の退色防止剤で封入した。
図４は、強いシグナルを示さないシアニン染料を含まない対照を示すが、図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ、ＨｅｐＧ２細胞表面受容体に結合したＣｙ３標識及びＣｙ５標識軽粒子を示す。
図６Ａ及び６Ｂは、Ｃｙ３標識（左パネル）及びＣｙ５標識（右パネル）軽粒子が、３７℃での８時間のインキュベーション後にＨｅｐＧ２細胞の核内で検出されることを示す。
図７は、ＨｅｐＧ２細胞表面受容体に結合したＣｙ５標識重粒子を示す。
図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、及び９Ｂは、Ｃｙ３標識軽粒子及びＣｙ５標識重粒子の両方が、ＨｅｐＧ２細胞表面受容体に結合することを示す。
図１０は、Ｃｙ３標識軽粒子及びＣｙ５標識重粒子が、３７℃でのインキュベーションの８時間後にＨｅｐＧ２細胞の核内で検出されることを示す。
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄは、Ｃｙ３標識軽粒子及びＣｙ５標識重粒子の両方が、４℃で１時間後にＨｅｐＧ２細胞表面受容体に結合することを示す。図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、４℃で１時間であり、赤色はＣｙ５標識重粒子であり、緑色はＣ３標識軽粒子である。図１１Ｄは、３７℃で８時間後のＨｅｐＧ２細胞の核における重及び軽粒子の結合を示す。
上記のように、図１１Ｄは、３７℃で８時間後のＨｅｐＧ２細胞の核における重及び軽粒子の結合を示す。図１１Ｄはまた、Ｃｙ３標識軽粒子及びＣｙ５標識重粒子が、３７℃での８時間のインキュベーション後にＨｅｐＧ２細胞の核内で検出されることを示す。図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、強調された部分（ボックス及び矢印を参照）は、重及び軽粒子が同じ細胞機構を使用していることを示し得る、Ｃｙ３及びＣｙ５染料の共局在化を示す。この共局在化は、軽カプシドの存在によって引き起こされる有効性の低下を説明することができ、更に、軽カプシドを含まないか、又は実質的に含まない、すなわち、軽カプシドの９９％超、好ましくは９９．５％超を含まないＡＡＶ調製物を得ることの要求を実証することができる。
軽及び空カプシドの悪影響を考慮すると、それらの除去は、ＡＡＶ遺伝子治療剤の有効性を高めるために重要である。
実施例２－目的の遺伝子＃１、目的の遺伝子＃２、及び目的の遺伝子＃３をコードするＡＡＶカプシドの精製
以下の実施例は、ＧＯＩ１、目的の遺伝子＃２（ＧＯＩ２）、又は目的の遺伝子＃３（ＧＯＩ３）のいずれかを有するｒＡＡＶの産生を開示する。ＧＯＩ１は、５．５Ｋｂ未満のポリヌクレオチドサイズを有する。ＧＯＩ２は、６Ｋｂ未満のポリヌクレオチドサイズである。ＧＯＩ３は、５．５Ｋｂ未満のポリヌクレオチドサイズを有し、ＧＯＩ１とは異なる。ＧＯＩ１及びＧＯＩ２を有するｒＡＡＶを、ＡＡＶ５カプシドで偽型化した。ＧＯＩ３を有するｒＡＡＶを、ＡＡＶ９カプシドで偽型化した。
全ての下流カラム及びＴＦＦ操作は、周囲温度で実施される。中間プールは、延長された保持時間が必要な場合、冷却温度で保持される。
出発物質として、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、又はＧＯ３を有するＡＡＶカプシドを含有する無細胞培養液（「収集プール材料」）を使用した。
図１３に示されるように、収集プール材料の処理１０は、収集プール材料から１００個のカプシドを精製し、ＡＥＸ２００、ＴＦＦ３００、ＺＵＣ４００、ＴＦＦ５００を介してカプシドを処理し、カプシド６００の最終製剤を調製することを含む。ＡＡＶ５カプシドで偽型化したＧＯＩ１を有するｒＡＡＶを含有する収集プール材料の処理１１は、収集プール材料から１１０個のカプシドを精製し、ＡＥＸ２１０、ＴＦＦ３１０、ＺＵＣ４１０、ＴＦＦ５１０を介してカプシドを処理し、カプシド６１０の最終製剤を調製することを含む。ＡＡＶ５カプシドで偽型化したＧＯＩ２を有するｒＡＡＶを含有する収集プール材料の処理１２は、収集プール材料から１２０個のカプシドを精製し、ＡＥＸ２２０、ＴＦＦ３２０、ＺＵＣ４２０、ＴＦＦ５２０を介してカプシドを処理し、カプシド６２０の最終製剤を調製することを含む。ＡＡＶ９カプシドで偽型化したＧＯＩ３を有するｒＡＡＶを含有する収集プール材料の処理１３は、収集プール材料から１３０個のカプシドを精製し、ＡＥＸ２３０、ＴＦＦ３３０、ＺＵＣ４３０、ＴＦＦ５３０を介してカプシドを処理し、カプシド６２０の最終製剤を調製することを含む。
図１３のステップ１００、１０１、１０２、１０３において、ｒＡＡＶは、後続のＡＥＸ及びＺＵＣ処理のために収集プール材料から精製される。例えば、精製ステップ１１０、１２０は、ＡＡＶ５カプシドの親和性精製のためにＡＶＢ免疫クロマトグラフィーを使用して、ＧＯＩ１及びＧＯ２についての収集プール材料を処理することを含む。別の例では、精製ステップ１３０は、ＡＡＶ９カプシドの親和性精製のためにカラム免疫クロマトグラフィーを使用して、ＧＯＩ３についての収集プール材料を処理することを含む。ＡＥＸ及びＺＵＣ処理には、親和性カラム精製ＡＡＶカプシドを使用する。
図１４及び図１３のステップ２００に示されるように、重、部分的、軽、及び空のＡＡＶカプシドの混合物を有する単離されたカプシドは、ＡＥＸカラム、高分子、強又は弱アニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を使用してアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）に供される。ＡＥＸステップ２００は、カラムを平衡化するステップ２０１、カラムに収集プール材料を充填するステップ２０２、カラムを洗浄して不純物を除去するステップ２０３、並びにＡＡＶカプシドをＡＥＸカラムから溶出及び単離するステップ２０４を含む。ＧＯＩ１についての例では、ＡＥＸステップ２１０は、カラムを平衡化するステップ２１１、カラムに収集プール材料を充填するステップ２１２、カラムを洗浄して不純物を除去するステップ２１３、並びにＡＡＶカプシドをＡＥＸカラムから溶出及び単離するステップ２１４を含む。ＧＯＩ２についての例では、ＡＥＸステップ２２０は、カラムを平衡化するステップ２２１、カラムに収集プール材料を充填するステップ２２２、カラムを洗浄して不純物を除去するステップ２２３、並びにＡＡＶカプシドをＡＥＸカラムから溶出及び単離するステップ２２４を含む。ＧＯＩ３についての例では、ＡＥＸステップ２３０は、カラムを平衡化するステップ２３１、カラムに収集プール材料を充填するステップ２３２、カラムを洗浄して不純物を除去するステップ２３３、並びにＡＡＶカプシドをＡＥＸカラムから溶出及び単離するステップ２３４を含む。
異なるｐＨにおける以下のカプシドについてのゼータ電位を分析する：ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３についての重カプシド、ＡＥＸ溶出２０４、２１４、２２４、２３４後に抽出された軽カプシド、並びにステップ４００、４１０、４２０、４３０からのＺＵＣで処理されたカプシド。ＧＯＩ２についての図１８に示されるように、これらの軽カプシドの正味負電荷が重カプシドよりも低いため、ＡＥＸを使用して除去することができる軽カプシド集団が存在することを発見した。この軽カプシド集団もまた、一般的な２６０ｎｍ／２８０ｎｍの吸光度測定によって検出することができず、検出のためにより正確な測定（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー）を必要とする。
ＡＥＸ分離に使用される緩衝液及び溶液は、当該技術分野で知られている。このような緩衝液の例としては、１ｍＳ／ｃｍ以下又は１～７ｍＳ／ｃｍの導電率及び７～１０の範囲のｐＨを有するＡＥＸ平衡緩衝液、４～７ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率及び７～９の範囲のｐＨを有するＡＥＸ洗浄緩衝液、５～１０ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率及び７～９の範囲のｐＨを有するＡＥＸ溶出緩衝液、５３．２～７０．１ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有するＡＥＸストリップ緩衝液、並びに６～９の範囲のｐＨを有するＡＥＸ溶出プール調整緩衝液が挙げられる。
ＡＥＸカラムには、以下のパラメータが使用される：０．１×１０ｅ１６～１０×１０ｅ１６ｖｇ／Ｌの範囲の負荷容量、強いアニオン交換樹脂及び７～１５ｃｍの範囲のベッドの高さを有するカラム、並びに５０～１６０ｃｍ／ｈｒの範囲の流量。
単離されたカプシドを、ＡＥＸ処理の前後に０．２２ミクロン（μｍ）のフィルターで濾過する。
ＡＥＸ分離ステップの前に、単離されたカプシドのｐＨを、７～９の範囲のｐＨ及び３ｍＳ／ｃｍ以下の導電率に調整緩衝液で調整する。
ＡＥＸカラムは、一定体積のＡＥＸ平衡緩衝液で調製される。カラム後のｐＨ及び導電率は、７～１０の範囲のｐＨ及び１ｍＳ／ｃｍ以下又は１～７ｍＳ／ｃｍの導電率について確認される。
充填プールを適用し、カラムを、ＡＥＸ平衡緩衝液及びＡＥＸ洗浄緩衝液で洗浄する。溶出したＡＥＸ洗浄緩衝液の吸光度が、Ａ２６０＝Ａ２８０に達したときを特定するためにカラムを手動で観察する。Ａ２６０＝Ａ２８０クロスオーバーが観察されない場合、追加のＡＥＸ洗浄緩衝液をＡＥＸカラムに追加する。
ＡＥＸ溶出は、ＡＥＸカラムに一定体積のＡＥＸ溶出緩衝液を加えることによって達成される。
ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３についてのＡＥＸ処理２００、２１０、２２０、２３０のＡ２６０及びＡ２８０プロファイルを、可視化し、分析する。図２５Ａは、洗浄、溶出、及びストリップステップ中のＧＯＩ２についてのｒＡＡＶ調製のためのＡＥＸ処理のＡ２６０及びＡ２８０プロファイルを示す。
溶出プールのｐＨを、一定体積のＡＥＸ溶出プール調整緩衝液を用いて６～９に調整した。
一般に、ｖｇ及びカプシド（ｃｐ）力価は、それぞれのｖｇ及びカプシドを測定するのに好適な任意の方法で評価され得る。例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、ｖｇ力価を測定してもよく、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、Ｃｐ力価を測定してもよい。あるいは、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）－ＨＰＬＣを使用して、ｖｇ及びｃｐ力価を測定してもよい。加えて、ＲＰ（逆相）－ＨＰＬＣアッセイを使用して、ＶＰ比に対するプロセスパラメータの潜在的な影響を評価してもよい。
ｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムなどの標準的なｑＰＣＲシステムを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるｖｇ定量化に使用され得る。あるいは、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を、Ｖｇ定量化に使用してもよい。プライマー及びプローブは、ＡＡＶのＤＮＡを標的とするように設計されてもよく、ＰＣＲ中に蓄積するにつれて、その定量化を可能にする。ｄｄＰＣＲの例は、Ｐａｓｉ，Ｋ．Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｙｅａｒ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ｏｆ ＡＡＶ５－ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ．”Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３８２．１（２０２０）：２９－４０、Ｒｅｇａｎ，Ｊｏｈｎ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．“Ａ Ｒａｐｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ．”ＰｌｏＳ ｏｎｅ１０．３（２０１５）：ｅ０１１８２７０、及びＦｕｒｕｔａ－Ｈａｎａｗａ，Ｂｉｒｅｉ，Ｔｅｒｕｈｉｄｅ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，ａｎｄ Ｅｒｉｋｏ Ｕｃｈｉｄａ．“Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ３０．４（２０１９）：１２７－１３６に記載されている。ｖｇ定量化のための他のシステムには、ＳＥＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、及びサイズ交換クロマトグラフィー多角度光散乱が含まれ、これらは全て、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されている。
カプシドＥＬＩＳＡ（ｃｐ－ＥＬＩＳＡ）アッセイは、例えば、ＡＡＶ５カプシドＥＬＩＳＡ法を使用して無傷のカプシドを測定し、市販のキット（例えば、Ｐｒｏｇｅｎ ＰＲＡＡＶ５）を利用してもよい。このキットＥＬＩＳＡは、集合したＡＡＶ５又は他のカプシド上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体を利用する。カプシドは、プレート結合モノクローナル抗体上で捕捉され得、その後、検出抗体の結合が続き得る。アッセイシグナルは、コンジュゲートしたストレプトアビジンペルオキシダーゼの添加、続いて比色ＴＭＢ基質溶液の添加、及び反応を終了するための硫酸の添加によって生成され得る。試験試料の力価は、標的カプシド標準物の４パラメータ較正曲線から補間される。カプシド力価を定量化するための別のシステムは、ＳＥＣ－ＭＡＬＳであり、これは、ＷＯ２０２１／０６２１６４に記載されている。
重及び部分的ＡＡＶカプシドは、当該技術分野で既知の技術を使用して測定され得る。例えば、カプシドの総数は、カプシドタンパク質に特異的な抗体を使用してｃｐ－ＥＬＩＳＡを使用して測定され得る。重及び部分的カプシドは、存在するベクターゲノムを測定するためにｑＰＣＲを使用して測定され得る。
アニオン交換クロマトグラフィー２００、２１０、２２０、２３０後のＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３の調製物からの粒子分布プロファイルを分析する。図１９は、ＡＥＸによるＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物の処理が、軽及び空カプシド濃度を９．８％に減少させたことを示す。アニオン交換クロマトグラフィー２００、２１０、２２０、２３０後のＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３の調製物からの低温電子顕微鏡画像も分析される。図２０に示されるように、ＡＥＸ処理後のＧＯＩ２についてのｒＡＡＶ調製物の低温電子顕微鏡画像からのカプシドカウントは、５７．７％の高密度粒子（すなわち、重及び部分的カプシド）及び４２．３％の「非高密度」粒子（すなわち、軽カプシド）であった。したがって、ＡＥＸは、ｒＡＡＶ調製物から軽カプシドの全てを除去していない。
ＡＥＸ処理２００、２１０、２２０、２３０による汚染ウイルスの除去はまた、既知の濃度の汚染ウイルスを、単離されたカプシドに添加し、組成物をＡＥＸカラムを通して処理することによって評価される。表１に示すように、ＧＯＩ１のｒＡＡＶ調製物のＡＥＸ処理は、少なくとも２のＬｏｇ１０減少によって汚染ウイルスの濃度を減少させた。
Figure 2023548067000002
ＡＥＸ後、収集した溶出プールを、図１３のステップ３００において、第１のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）に供する。ＡＥＸカラム溶出プールを濃縮し、ゾーン超遠心分離のために調製物中のＴＦＦ緩衝液中でダイアフィルトレーションした。図１５に示されるように、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３００は、試料３０１（例えば、溶出液２０４）を提供し、試料を透過液／濾液３０３又は試料３０１に戻すことができる残余分３０２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ３０２を含む。ＧＯＩ１の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３１０は、試料３１１（例えば、溶出液２１４）を提供し、試料を透過液／濾液３１３又は試料３１１に戻すことができる残余分３１２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ３１２を含む。ＧＯＩ２の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３２０は、試料３２１（例えば、溶出液２２４）を提供し、試料を透過液／濾液３２３又は試料３２１に戻すことができる残余分３２２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ３２２を含む。ＧＯＩ３の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３３０は、試料３３１（例えば、溶出液２３４）を提供し、試料を透過液／濾液３３３又は試料３３１に戻すことができる残余分３３２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ３３２を含む。
０．１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２～１０×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２の範囲の充填物を限外濾過に充填し、１００ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜でダイアフィルトレーションし、プロセスをＴＭＰ及び交差流によって制御した。
ダイアフィルトレーションしたプールを、０．２２ｕＭのＰＶＤＦフィルターを使用して０．２μｍの濾過に供し、最終的なＴＦＦプールを生成する。
ＴＦＦプールは、長い保持時間が望まれる場合、ＺＵＣ処理の前に任意選択的に６０℃以下で凍結することができる。
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３００後、及び図１６に示されるように、ＴＦＦプールを、組成物３０２及び勾配を形成するために使用される成分（例えば、塩化セシウムなど）でゾーナルローターを充填するステップ４０１、充填したローターを遠心分離するステップ４０２、並びに特定した画分を収集するステップ４０３を含むＺＵＣ４００によって処理する。ＧＯＩ１の場合、ＺＵＣ４１０は、ゾーナルローター４１１を、組成物３１２及び勾配を形成するために使用される成分（例えば、塩化セシウムなど）で充填するステップを含み、充填したローター４１２を遠心分離し、特定した画分４１３を収集した。ＧＯＩ２の場合、ＺＵＣ４２０は、ゾーナルローターを、組成物３２２及び勾配を形成するために使用される成分（例えば、塩化セシウムなど）で充填するステップ４２１、充填したローターを遠心分離するステップ４２２、並びに特定した画分を収集するステップ４２３を含む。ＧＯＩ３の場合、ＺＵＣ４３０は、ゾーナルローターを、組成物３３２及び勾配を形成するために使用される成分（例えば、塩化セシウムなど）で充填するステップ４３１、充填したローターを遠心分離するステップ４３２、並びに特定した画分を収集するステップ４３３を含む。
ｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）調製物は、ＡＥＸ２００、２１０、２２０、２３０及びＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０によって処理される。ＺＵＣ軽カプシドを含有する画分を収集し、ＡＥＸによって再処理し、Ａ２６０及びＡ２８０プロファイルを可視化した。ＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物について図２７Ａ、２７Ｂ、及び２７Ｃに示されるように、ＡＥＸ中に、軽カプシドの集団が、重カプシドで溶出することも発見された。ｑＰＣＲにより、これらのカプシドの正味負電荷が重カプシドと同じであるにもかかわらず、これらのカプシドが、定量化可能な封入されたＤＮＡを全く有しないことが示されるため、この軽カプシドの集団は、ゾーン超遠心分離（ＺＵＣ）を使用して完全カプシドから更に分離することができる。図１３のステップ４００において、ＴＦＦ生成物を、ＴＦＦ－Ａ緩衝液でＴＦＦ生成物プールを希釈し、ＣｓＣｌ緩衝液を用いて、１５％～７５％の範囲のＣｓＣｌの最終濃度まで調整することによってＺＵＣに供した。ＣｓＣｌで調整した生成物プールの塩化セシウム未満であるＣｓＣｌ濃度（１５％～７５％ＣｓＣｌ）を有するオーバーレイ溶液、続いてＣｓＣｌで調整した生成物プール、次いでＣｓＣｌで調整した生成物プールの塩化セシウム未満であるＣｓＣｌ濃度（１５％～７５％ＣｓＣｌ）を有するクッション溶液を遠心分離機ローターにポンプで送った。回転中にＣｓＣｌ勾配が形成され、異なる密度で生成物形態を分画した。勾配からの画分をローターから回収した。ＺＵＣを周囲温度で行った。生成物プールを、インライン密度測定に基づいて、又は回収された画分の分析によって自動的に収集した。ＺＵＣは、以下のパラメータを使用して実行した。
ＧＯＩ１の場合、ＺＵＣローターに、０．１×１０ｅ１７ｖｇ／充填～１０×１０ｅ１７ｖｇ／充填の範囲の力価を有する組成物を充填する。ＺＵＣパラメータは、１０℃～３６℃の範囲の温度で１４～１６時間、８００００Ｇ～１２５０００Ｇの範囲の速度で組成物を遠心分離することを含む。
ＧＯＩ２の場合、ＺＵＣローターに、０．１×１０ｅ１６ｖｇ／充填～１０×１０ｅ１６ｖｇ／充填又は０．５×１０ｅ１６ｖｇ／充填～５０×１０ｅ１６ｖｇ／充填の範囲の力価を有する組成物を充填する。ＺＵＣパラメータは、１０℃～３６℃の範囲の温度で１５～２５時間、１００００ｒｐｍ～５００００ｒｐｍの範囲の速度で組成物を遠心分離することを含む。あるいは、ＺＵＣパラメータの１つは、５００００Ｇ～１０００００Ｇの範囲の速度で組成物を遠心分離することを含む。
ｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）の異なる収集した画分４０３、４１３、４２３、４３３の密度に対するＶｇ濃度を、ＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０により処理し、決定し、分析した。図２１は、画分２２までのｖｇの濃度の増加を示し、画分１８～２９は、ＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物について増加した濃度の重及び部分的カプシドを有することが特定された。画分１８～２９は、１．３０ｇ／ｍＬ超～１．４５ｇ／ｍＬ以下の範囲の密度を有したことに留意されたい。ｒＡＡＶの異なる収集した画分４０３、４１３、４２３、４３３（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）からの粒子分布プロファイルを、ＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０により処理し、また、分析した。図２２は、ＺＵＣによるｒＡＡＶ調製物の処理により、軽カプシド濃度が１．１％に低下したことを示す。
ＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０の後のｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）は、ウェスタンブロット、アルカリアガロースゲル、及び低温電子顕微鏡によって分析される。図２３Ａ及び２３Ｂは、ＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物について、高密度画分１８～２４が、より低い密度画分１０～１６より大きなゲノムサイズ（すなわち、重及び部分的カプシド）で有意に高い濃度のカプシドを有することを示す。図２４に示されるように、ＺＵＣ処理後のＧＯＩ２についてのｒＡＡＶ調製物の低温電子顕微鏡画像からのカプシドカウントは、８５．７％の高密度粒子（すなわち、重及び部分的カプシド）及び１４．３％の「非高密度」粒子（すなわち、軽カプシド）であった。したがって、ＺＵＣ単独は、ｒＡＡＶ調製物から軽カプシドの全てを除去していない。
ｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）の異なる収集した画分４０３、４１３、４２３、４３３のＶｇ濃度を、ＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０により処理し、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ＳＥＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、又はＳＥＣ－ＭＡＬＳによって決定した。ｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）の異なる収集した画分４０３、４１３、４２３、４３３のカプシド力価を、ＺＵＣ４００、４１０、４２０、４３０により処理し、ｃｐ－ＥＬＩＳＡ又はＳＥＣ－ＭＡＬＳによって決定した。ＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物について、図２５Ｂは、ｃｐ－ＥＬＩＳＡによって決定される各画分のカプシド力価、及びｑＰＣＲによって決定される各画分のｖｇ力価を示す。図２５Ｂに示されるように、画分１５～２６は、他の画分と比較して、より大きなカプシド及びｖｇ力価を有する。ＡＥＸ２００、２１０、２２０、２３０を用いて、又は用いずに処理したｒＡＡＶ（すなわち、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３）のカプシド力価を、ｃｐ－ＥＬＩＳＡによって決定した。図２６はまた、ＺＵＣ処理が、軽及び空カプシドで過負荷にならないように、ＡＥＸが、本質的に軽及び空カプシドを低減することを示す。
表２は、異なる力価負荷でのＺＵＣ処理後のＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物の特性を示す。
Figure 2023548067000003
表３は、異なる力価負荷でのＺＵＣ処理後のＧＯＩ２の別のｒＡＡＶ調製物の特性を示す。
Figure 2023548067000004
ＺＵＣ処理による汚染ウイルスの低減の分析も、ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３について評価される。バキュロウイルスの場合、ＺＵＣ処理は、２以上のＬｏｇ１０濃度（例えば、２．０９及び２．４６）を減少させた。
図１３のステップ５００において、ＺＵＣ溶出プールを濃縮し、安定化ＴＦＦ－Ｂ緩衝液中でダイアフィルトレーションする。図１７に示されるように、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ５００は、試料５０１（例えば、収集した画分４０３）を提供し、試料を透過液／濾液５０３又は試料５０１に戻すことができる残余分５０２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ５０２を含む。ＧＯＩ１の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ３１０は、試料５１１（例えば、収集した画分４１３）を提供し、試料を透過液／濾液５１３又は試料５１１に戻すことができる残余分５１２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ５１２を含む。ＧＯＩ２の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ５２０は、試料５２１（例えば、収集した画分４２３）を提供し、試料を透過液／濾液５２３又は試料５２１に戻すことができる残余分５２２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ５２２を含む。ＧＯＩ３の場合、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ５３０は、試料５３１（例えば、収集した画分４３３）を提供し、試料を透過液／濾液５３３又は試料５３１に戻すことができる残余分５３２にダイアフィルトレーション／限外濾過するステップ５３２を含む。０．１×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２～１０×１０ｅ１７ｖｇ／ｍ２の範囲の充填物を限外濾過に充填し、１００ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜でダイアフィルトレーションし、プロセスをＴＭＰ及び交差流によって制御した。
図１３のステップ６００において、合わせたＴＦＦ生成物プール材料を、製剤緩衝液中に所定の濃度まで希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過する。
ＧＯＩ２のｒＡＡＶ調製物の合わせたＡＥＸ（図２５Ａ）及びＺＵＣ（図２５Ｂ）処理により、約１．０Ｃｐ／Ｖｇ比の重及び部分的カプシドの本質的に純粋な調製物を得る。
ＧＯＩ１のｒＡＡＶ調製物について、ＡＥＸ及びＺＵＣによって処理したｒＡＡＶ生成物上で分析的超遠心分離分析を行う。処理したｒＡＡＶ生成におけるカプシド組成物は、０％の軽カプシド、３．９％のカプシド凝集体、７．６８％の中間又は部分的完全カプシド、及び８８．４％の重カプシドであった。
実施例３－ＡＡＶ産生不純物の除去：Ｒｅｐタンパク質及び脱アミド化カプシドに関連するｒＡＡＶ
Ｒｅｐタンパク質、特にＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、生成後にｒＡＡＶの濃度に関連したままであることが発見された。Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８に関連したこのｒＡＡＶは、細胞に感染することができない不純物であるか、又はＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８に関連したｒＡＡＶに感染した細胞は、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することができない場合がある。Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８に関連したｒＡＡＶは、カプシドの単位用量当たりの有効性の低下の一因となり得、有効量の重／完全／部分的完全カプシドのために患者に導入される外来タンパク質の必要な増加による免疫応答のリスクを増加させ得る。したがって、ＡＥＸ及びＺＵＣ処理は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８に関連するｒＡＡＶの濃度を低下させる。ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３調製物のＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８に関連したｒＡＡＶを、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって定量化する。このアッセイは、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８濃度を正確に測定する。カプシドは、ＡＶＢ処理、ＡＥＸ処理、及びＺＵＣ処理後に単離される。カプシドを変性させてウイルスタンパク質を解離させ、ＬＣ－ＭＳ分析の前にペプチドに消化する。Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８タンパク質由来のペプチドをＬＣ上で分離し、標的化ペプチドの複数の断片から得られたシグナルを、トリプル四重極質量分析計によって分析する。
図２８に示されるように、ＡＡＶ５カプシドについてのＡＶＢ免疫クロマトグラフィー中に、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの濃度は、治療上有効なｒＡＡＶで溶出する。ＧＯＩ１について、ＡＥＸ処理は、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの濃度を実質的に低下させたが、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの一部は、治療上有効なｒＡＡＶで溶出した。ＡＥＸ後、ＺＵＣ処理は、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの濃度を更に低下させた。例えば、ＡＥＸ及びＺＵＣ処理は、治療上有効なｒＡＡＶを含有する最終組成物が、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶを実質的に欠くように、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの濃度を除去した。
ＧＯＩ１について図２９に示されるように、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶは、洗浄及び溶出ステップの後、ＡＥＸカラム内に残る。Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶは、カラムが再生されたときにのみＡＥＸカラムを出る。
ＧＯＩ１について図３０に示されるように、ＺＵＣ処理はまた、治療上有効なｒＡＡＶを、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶから分離することにより、治療上有効なｒＡＡＶを、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶから精製することができる。特に、単離される「プール」画分は、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶをほとんど又は全く含有しないが、「プール後」画分は、Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶの十分に高い濃度を含有する。Ｒｅｐタンパク質に関連したｒＡＡＶは、空又は軽カプシドであることにも留意されたい。
カプシドの脱アミド化は、ｒＡＡＶによって提供される導入遺伝子の発現のｒＡＡＶ感染性を低下させることが示されている（Ｇｉｌｅｓ，Ａｐｒｉｌ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２６．１２（２０１８）：２８４８－２８６２）及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ａｍｙ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３１．１３－１４（２０２０）：７５６－７７４。したがって、脱アミド化カプシド（又は脱アミド化ｒＡＡＶ）を有するｒＡＡＶは、細胞に感染することができない不純物であるか、又は脱アミド化ｒＡＡＶに感染した細胞は、目的のエレメント（例えば、ヌクレオチド配列、タンパク質など）を、（例えば、転写及び／又は翻訳によって）発現することができない場合がある。脱アミド化ｒＡＡＶはまた、カプシドの単位用量当たりの有効性の低下の一因となり得、有効量の重／完全／部分的完全カプシドのために患者に導入される外来タンパク質の必要な増加による免疫応答のリスクを増加させ得る。したがって、ＡＥＸ及びＺＵＣ処理は、脱アミド化カプシドを有するｒＡＡＶの濃度を低下させる。ＧＯＩ１、ＧＯＩ２、及びＧＯＩ３のＮ末端におけるＶＰ１タンパク質の脱アミド化レベルを、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって定量化する。このアッセイは、ＶＰ１のＮ末端領域における脱アミド率を正確に測定する。カプシドは、ＡＶＢ処理、ＡＥＸ処理、及びＺＵＣ処理後に単離される。カプシドを変性させてウイルスタンパク質を解離させ、ＬＣ－ＭＳ分析の前にペプチドに消化する。標的脱アミド部位を有する標的ＶＰ１ Ｎ末端ペプチドの未修飾及び脱アミド化形態をＬＣ上で分離し、標的化ペプチドの複数の断片から得られたシグナルを、トリプル四重極質量分析計によって分析する。
ＧＯＩ１について図３１に示されるように、脱アミド化ｒＡＡＶの濃度は、ＡＡＶ５カプシドについてのＡＶＢ免疫クロマトグラフィー中に、治療上有効なｒＡＡＶで溶出する。ＡＥＸ処理は、脱アミド化ｒＡＡＶの濃度を実質的に低下させたが、脱アミド化ｒＡＡＶの一部は、治療上有効なｒＡＡＶで溶出した。ＡＥＸ後、ＺＵＣ処理により、脱アミド化ｒＡＡＶの濃度が更に低下した。例えば、ＡＥＸ及びＺＵＣ処理は、治療上有効なｒＡＡＶを含有する最終組成物が、脱アミド化ｒＡＡＶを実質的に欠くように、脱アミド化ｒＡＡＶの濃度を除去した。
ＧＯＩ１について図３２に示されるように、脱アミド化ｒＡＡＶは、洗浄ステップ中に除去され、カラムが再生されたときにのみＡＥＸカラムを出る。また、ＡＥＸ溶出液は、脱アミド化ｒＡＡＶの濃度が実質的に低下していることにも留意されたい。
ＧＯＩ１について図３３に示されるように、ＺＵＣ処理はまた、治療上有効なｒＡＡＶを脱アミド化ｒＡＡＶから分離することにより、治療上有効なｒＡＡＶは、精製された脱アミド化ｒＡＡＶであり得る。特に、単離される「プール」画分は、減少した濃度の脱アミド化ｒＡＡＶを含有するが、「プール後」画分は、十分に高い濃度の脱アミド化ｒＡＡＶを含有する。脱アミド化ｒＡＡＶは、空又は軽カプシドであることにも留意されたい。
例示的な実施形態が上記に説明されているが、これらの実施形態が、本発明の全ての可能な形態を説明することは意図されていない。むしろ、本明細書で使用される単語は、限定ではなく説明の単語であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが理解される。更に、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成してもよい。
例示的な実施形態が上記に説明されているが、これらの実施形態が、本発明の全ての可能な形態を説明することは意図されていない。むしろ、本明細書で使用される単語は、限定ではなく説明の単語であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが理解される。更に、様々な実施形態の特徴を組み合わせて、本発明の更なる実施形態を形成してもよい。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] 治療上有効な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法であって、前記方法が、
治療上有効なｒＡＡＶ粒子及びＡＡＶ産生不純物を含む組成物を提供するステップであって、前記ＡＡＶ産生不純物の第１の部分が、ＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する不純物を含み、前記ＡＡＶ産生不純物の第２の部分が、前記ＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する不純物を含む、ステップと、
アニオン交換クロマトグラフィーによって前記組成物から前記第１の部分を除去するステップと、
ゾーン超遠心分離によって前記組成物から前記第２の部分を除去するステップと、を含み、
アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後、前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物を実質的に欠いている、方法。
[２] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から少なくとも９５％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[３] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から少なくとも９９％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[４] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から９９＋％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[５] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９５％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[６] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９９％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[７] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から９９＋％純粋である、実施形態１に記載の方法。
[８] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、検出可能な治療上無効なｒＡＡＶ粒子を全く含まない、実施形態１に記載の方法。
[９] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、Ｒｅｐタンパク質に関連するカプシドを含む、実施形態５～８のいずれかに記載の方法。
[１０] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、アニオン交換クロマトグラフィーによって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、実施形態９に記載の方法。
[１１] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、ゾーン超遠心分離によって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、実施形態９に記載の方法。
[１２] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、結合したＲｅｐタンパク質を有するカプシドを含む、実施形態９に記載の方法。
[１３] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、脱アミド化アミノ酸を有する１つ以上のＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質を有するカプシドを含む、実施形態５～８のいずれかに記載の方法。
[１４] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムを欠いているか、又は検出不可能な濃度のヌクレオチドを封入しているカプシドを含む、実施形態５～８のいずれかに記載の方法。
[１５] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、カプシドによって感染した細胞が治療上有効なヌクレオチド配列を生成するのに不十分な１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドを含む、実施形態５～８のいずれかに記載の方法。
[１６] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、同じ条件下で感染するが、カプシドによる感染を欠く細胞によるエレメントの発現と比較して、前記カプシドに感染した細胞によるエレメントの発現を低下させる１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドと、前記エレメントをコードする治療上有効なｒＡＡＶと、を含む、実施形態５～８のいずれかに記載の方法。
[１７] 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂である、実施形態１に記載の方法。
[１８] 前記樹脂が、四級アンモニウム基で修飾される、実施形態１７に記載の方法。
[１９] 前記ゾーン超遠心分離が、塩化セシウム勾配を使用する、実施形態１に記載の方法。
[２０] 塩化セシウム勾配による前記ゾーン超遠心分離が、
溶出液にある濃度の塩化セシウムを添加することと、
回転遠心分離機ローター中で第１の塩化セシウム溶液をオーバーレイすることであって、前記第１の塩化セシウム溶液が、前記溶出液の前記塩化セシウム濃度よりも少ない塩化セシウム濃度を有する、オーバーレイすることと、
前記アニオン交換イオンクロマトグラフィーからの溶出液を添加することと、
第２の塩化セシウム溶液を添加することであって、前記第２の塩化セシウム溶液が、前記溶出液の前記塩化セシウム濃度よりも大きい塩化セシウム濃度を有する、添加することと、
前記回転遠心分離機ローターを遠心分離して、前記溶出液内に密度勾配を形成することと、
前記密度勾配から画分を収集することと、を含む、実施形態１９に記載の方法。
[２１] 治療上有効な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法であって、前記方法が、
治療上有効なｒＡＡＶ粒子及び治療上無効なｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供するステップと、
アニオン交換クロマトグラフィーによって前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも一部を除去するステップと、
ゾーン超遠心分離によって前記組成物を処理するステップと、を含み、
アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後、前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子を実質的に欠いている、方法。
[２２] 前記除去ステップが、ゾーン超遠心分離による前記組成物の後続処理を可能にする、実施形態２１に記載の方法。
[２３] 前記除去ステップが、前記提供するステップの前記組成物が、ゾーン超遠心分離によって処理される、より多くの量の治療上有効なｒＡＡＶ粒子を有することを可能にする、実施形態２１に記載の方法。
[２４] 前記除去ステップが、前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも０．１％を除去する、実施形態２１に記載の方法。
[２５] 前記除去ステップが、前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも５０％を除去する、実施形態２１に記載の方法。
[２６] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９５％純粋である、実施形態２１に記載の方法。
[２７] アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、検出可能な治療上無効なｒＡＡＶ粒子を全く含まない、実施形態２１に記載の方法。
[２８] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、Ｒｅｐタンパク質に関連するカプシドを含む、実施形態２１～２７のいずれかに記載の方法。
[２９] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、アニオン交換クロマトグラフィーによって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、実施形態２８に記載の方法。
[３０] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、ゾーン超遠心分離によって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、実施形態２８に記載の方法。
[３１] Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、結合したＲｅｐタンパク質を有するカプシドを含む、実施形態２８に記載の方法。
[３２] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、脱アミド化アミノ酸を有するＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質を有するカプシドを含む、実施形態２１～２７のいずれかに記載の方法。
[３３] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムを欠いているか、又は検出不可能な濃度のヌクレオチドを封入しているカプシドを含む、実施形態２１～２７のいずれかに記載の方法。
[３４] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、カプシドによって感染した細胞が治療上有効なヌクレオチド配列を生成するのに不十分な１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドを含む、実施形態２１～２７のいずれかに記載の方法。
[３５] 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、同じ条件下で感染するが、カプシドによる感染を欠く細胞によるエレメントの発現と比較して、前記カプシドに感染した細胞によるエレメントの発現を低下させる１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドと、前記エレメントをコードする治療上有効なｒＡＡＶと、を含む、実施形態２１～２７のいずれかに記載の方法。

Claims (35)

  1. 治療上有効な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法であって、前記方法が、
    治療上有効なｒＡＡＶ粒子及びＡＡＶ産生不純物を含む組成物を提供するステップであって、前記ＡＡＶ産生不純物の第１の部分が、ＡＡＶ粒子とは異なる正味電荷を有する不純物を含み、前記ＡＡＶ産生不純物の第２の部分が、前記ＡＡＶ粒子とは異なる密度を有する不純物を含む、ステップと、
    アニオン交換クロマトグラフィーによって前記組成物から前記第１の部分を除去するステップと、
    ゾーン超遠心分離によって前記組成物から前記第２の部分を除去するステップと、を含み、
    アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後、前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物を実質的に欠いている、方法。
  2. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から少なくとも９５％純粋である、請求項１に記載の方法。
  3. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から少なくとも９９％純粋である、請求項１に記載の方法。
  4. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、ＡＡＶ産生不純物から９９＋％純粋である、請求項１に記載の方法。
  5. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９５％純粋である、請求項１に記載の方法。
  6. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９９％純粋である、請求項１に記載の方法。
  7. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から９９＋％純粋である、請求項１に記載の方法。
  8. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、検出可能な治療上無効なｒＡＡＶ粒子を全く含まない、請求項１に記載の方法。
  9. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、Ｒｅｐタンパク質に関連するカプシドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、アニオン交換クロマトグラフィーによって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、請求項９に記載の方法。
  11. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、ゾーン超遠心分離によって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、請求項９に記載の方法。
  12. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、結合したＲｅｐタンパク質を有するカプシドを含む、請求項９に記載の方法。
  13. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、脱アミド化アミノ酸を有する１つ以上のＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質を有するカプシドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムを欠いているか、又は検出不可能な濃度のヌクレオチドを封入しているカプシドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、カプシドによって感染した細胞が治療上有効なヌクレオチド配列を生成するのに不十分な１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、同じ条件下で感染するが、カプシドによる感染を欠く細胞によるエレメントの発現と比較して、前記カプシドに感染した細胞によるエレメントの発現を低下させる１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドと、前記エレメントをコードする治療上有効なｒＡＡＶと、を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、ポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記樹脂が、四級アンモニウム基で修飾される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ゾーン超遠心分離が、塩化セシウム勾配を使用する、請求項１に記載の方法。
  20. 塩化セシウム勾配による前記ゾーン超遠心分離が、
    溶出液にある濃度の塩化セシウムを添加することと、
    回転遠心分離機ローター中で第１の塩化セシウム溶液をオーバーレイすることであって、前記第１の塩化セシウム溶液が、前記溶出液の前記塩化セシウム濃度よりも少ない塩化セシウム濃度を有する、オーバーレイすることと、
    前記アニオン交換イオンクロマトグラフィーからの溶出液を添加することと、
    第２の塩化セシウム溶液を添加することであって、前記第２の塩化セシウム溶液が、前記溶出液の前記塩化セシウム濃度よりも大きい塩化セシウム濃度を有する、添加することと、
    前記回転遠心分離機ローターを遠心分離して、前記溶出液内に密度勾配を形成することと、
    前記密度勾配から画分を収集することと、を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 治療上有効な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法であって、前記方法が、
    治療上有効なｒＡＡＶ粒子及び治療上無効なｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供するステップと、
    アニオン交換クロマトグラフィーによって前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも一部を除去するステップと、
    ゾーン超遠心分離によって前記組成物を処理するステップと、を含み、
    アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後、前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子を実質的に欠いている、方法。
  22. 前記除去ステップが、ゾーン超遠心分離による前記組成物の後続処理を可能にする、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記除去ステップが、前記提供するステップの前記組成物が、ゾーン超遠心分離によって処理される、より多くの量の治療上有効なｒＡＡＶ粒子を有することを可能にする、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記除去ステップが、前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも０．１％を除去する、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記除去ステップが、前記組成物から前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子の少なくとも５０％を除去する、請求項２１に記載の方法。
  26. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、治療上無効なｒＡＡＶ粒子から少なくとも９５％純粋である、請求項２１に記載の方法。
  27. アニオン交換クロマトグラフィー及びゾーン超遠心分離後の前記組成物が、検出可能な治療上無効なｒＡＡＶ粒子を全く含まない、請求項２１に記載の方法。
  28. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、Ｒｅｐタンパク質に関連するカプシドを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、アニオン交換クロマトグラフィーによって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、ゾーン超遠心分離によって治療上有効なｒＡＡＶ粒子から分離されるカプシド及びＲｅｐタンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
  31. Ｒｅｐタンパク質カプシドに関連する前記カプシドが、結合したＲｅｐタンパク質を有するカプシドを含む、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、脱アミド化アミノ酸を有するＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３カプシドタンパク質を有するカプシドを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、ベクターゲノムを欠いているか、又は検出不可能な濃度のヌクレオチドを封入しているカプシドを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、カプシドによって感染した細胞が治療上有効なヌクレオチド配列を生成するのに不十分な１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記治療上無効なｒＡＡＶ粒子が、同じ条件下で感染するが、カプシドによる感染を欠く細胞によるエレメントの発現と比較して、前記カプシドに感染した細胞によるエレメントの発現を低下させる１つ以上のサイズを有するベクターゲノムを有する前記カプシドと、前記エレメントをコードする治療上有効なｒＡＡＶと、を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
JP2023524885A 2020-11-02 2021-11-02 アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス Pending JP2023548067A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063108629P 2020-11-02 2020-11-02
US63/108,629 2020-11-02
PCT/US2021/057716 WO2022094461A1 (en) 2020-11-02 2021-11-02 Process for enriching adeno-associated virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023548067A true JP2023548067A (ja) 2023-11-15

Family

ID=78821859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023524885A Pending JP2023548067A (ja) 2020-11-02 2021-11-02 アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230407328A1 (ja)
EP (1) EP4237545A1 (ja)
JP (1) JP2023548067A (ja)
KR (1) KR20230078805A (ja)
CN (1) CN116635530A (ja)
AU (1) AU2021372262A1 (ja)
CA (1) CA3196778A1 (ja)
IL (1) IL302128A (ja)
MX (1) MX2023005041A (ja)
WO (1) WO2022094461A1 (ja)

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
FR2640638B1 (fr) 1988-12-20 1991-02-15 Commissariat Energie Atomique Bioreacteur et dispositif pour la culture de cellules animales
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5387484A (en) 1992-07-07 1995-02-07 International Business Machines Corporation Two-sided mask for patterning of materials with electromagnetic radiation
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
WO1996017947A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US5756283A (en) 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5688676A (en) 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
EP0968284B1 (en) 1996-11-20 2006-12-13 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
CA2303768C (en) 1997-09-19 2009-11-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
US6051189A (en) 1997-10-01 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army System and method for detection, identification and monitoring of submicron-sized particles
ES2235470T3 (es) 1998-03-20 2005-07-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes.
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6146874A (en) * 1998-05-27 2000-11-14 University Of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions
AU764130B2 (en) 1998-10-27 2003-08-14 Crucell Holland B.V. Improved AAV vector production
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
JP4693244B2 (ja) 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
WO2000075353A1 (en) 1999-06-02 2000-12-14 Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
WO2001083797A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US20030114289A1 (en) 2001-11-27 2003-06-19 Merino Sandra Patricia Centrifuge with removable core for scalable centrifugation
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
PT1625210E (pt) 2003-05-21 2011-03-15 Genzyme Corp Métodos para produzir preparações de vírions de aav recombinantes substancialmente livres de capsídeos vazios
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7491508B2 (en) 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
BRPI0511764B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Avigen Inc método de prevenção de agregação de vírions de vírus adeno-associado recombinante (raav) em uma preparação purificada de virions raav
GB0911870D0 (en) 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
US9956564B2 (en) 2011-09-21 2018-05-01 Beckman Coulter, Inc. Workflow support for zonal centrifugation
GB201210357D0 (en) 2012-06-12 2012-07-25 Ucl Business Plc Factor VIII sequences
EP2792742A1 (en) 2013-04-17 2014-10-22 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) Gene-therapy vectors for treating cardiomyopathy
PL3044231T3 (pl) 2013-09-12 2021-01-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Wektory aav zawierające gen kodujący czynnik viii
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN107428799A (zh) * 2015-01-13 2017-12-01 阿尔法韦士曼公司 纯化腺相关病毒(AAV)及/或重组腺相关病毒(rAAV)之方法及其梯度和流通式缓冲液
BR112018006074A2 (pt) 2015-09-24 2018-10-09 Biomarin Pharm Inc vetores de fator viii de vírus adeno-associado, partículas virais associadas e formulações terapêuticas compreendendo as mesmas
JP6994018B2 (ja) 2016-07-26 2022-01-14 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 新規アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質
SG11202010830WA (en) 2018-05-09 2020-11-27 Biomarin Pharm Inc Methods of treating phenylketonuria
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
US20200069819A1 (en) 2018-05-14 2020-03-05 Biomarin Pharmaceutical Inc. Stable expression of aav vectors in juvenile subjects
US20200362368A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Biomarin Pharmaceutical Inc. Methods of redosing gene therapy vectors
JP2022549679A (ja) 2019-09-27 2022-11-28 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド サイズ排除クロマトグラフィー及び多角度光散乱技術を使用した遺伝子療法ウイルス粒子のキャラクタリゼーション
WO2021097157A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of hereditary angioedema with liver-specific gene therapy vectors
WO2021183895A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of fabry disease with aav gene therapy vectors
AR122409A1 (es) 2020-04-03 2022-09-07 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la fenilcetonuria con aav y formulaciones terapéuticas

Also Published As

Publication number Publication date
CA3196778A1 (en) 2022-05-05
KR20230078805A (ko) 2023-06-02
AU2021372262A1 (en) 2023-06-01
MX2023005041A (es) 2023-05-17
IL302128A (en) 2023-06-01
US20230407328A1 (en) 2023-12-21
EP4237545A1 (en) 2023-09-06
CN116635530A (zh) 2023-08-22
WO2022094461A1 (en) 2022-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11767346B2 (en) Modified AAV capsid proteins and uses thereof
JP2018121653A (ja) ウイルスベクター精製における拡張可能な製造プラットフォームおよび遺伝子治療における使用のための高純度ウイルスベクター
US20210010028A1 (en) Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
US20220364114A1 (en) Controlled expression of viral proteins
US20240141377A1 (en) Controlled expression of viral proteins
JP2023548067A (ja) アデノ随伴ウイルスを濃縮するためのプロセス
AU2021270526B2 (en) Gene therapy with dysferlin dual vectors
US20210139933A1 (en) Recombinant adeno-associated viral vector for gene delivery
US20240132910A1 (en) USE OF HISTIDINE RICH PEPTIDES AS A TRANSFECTION REAGENT FOR rAAV AND rBV PRODUCTION
US20240124849A1 (en) Aav production systems for aav viral particles with improved infectivity
US20220049270A1 (en) Transgene cassettes, aav vectors, and aav viral vectors for expression of human codon-optimized cstb
TW202246515A (zh) 富含組胺酸之肽作為轉染試劑用於產生ｒＡＡＶ及ｒＢＶ之用途
TW202328446A (zh) 肌肉萎縮症之治療
WO2023147304A1 (en) Aav capsids for improved heart transduction and detargeting of liver

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230816

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230615

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230522

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20230615