CN116635530A - 用于富集腺相关病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于使用阴离子交换色谱和区带超速离心来富集腺相关病毒颗粒的方法。

Description

用于富集腺相关病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种用于使用阴离子交换色谱和区带超速离心来富集腺相关病毒(AAV)颗粒的方法。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是小型非致病性卫星病毒，据信其需要辅助腺病毒来进行复制。AAV在结构上与腺病毒相似，但具有更小的二十面体核衣壳。AAV为无包膜病毒，其单链DNA基因组在末端处具有至少一个反向末端重复序列(ITR)。例如，AAV2血清型可以具有约4.7千碱基(kb)的单链DNA基因组，其在末端处具有两个145个核苷酸长的ITR。病毒不编码聚合酶，并且因此依赖于细胞聚合酶来进行基因组复制。ITR侧接两种病毒基因—分别编码非结构蛋白和结构蛋白的rep(复制)和cap(衣壳)。通过使用两种启动子和替代性剪接，rep基因编码被称为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的四种调节蛋白。这些蛋白质参与AAV基因组复制和封装。cap基因通过替代性剪接和转译起始来产生三种衣壳蛋白VP1(病毒粒子蛋白1)、VP2和VP3。针对AAV2的VP1、VP2和VP3的分子量分别为87kDa、72kDa和62kDa。这些衣壳蛋白组装成具有60个亚基的近似球形的蛋白质壳。AAV结构简单和非致病性性质使重组AAV(rAAV)成为有用的基因疗法载体。AAV基因疗法载体可以感染复制细胞和非复制细胞两者，并且在不整合到宿主细胞的基因组中的情况下引入转基因。rAAV载体由于其高效价、感染广泛范围的细胞的能力、轻微的免疫应答和整体安全性而通常是优选的。已发现rAAV基因疗法载体对许多疾病(包括糖尿病和其他胰腺疾患)非常有用。
用于基因疗法的rAAV颗粒的产生也产生各种杂质。因此，仍然需要有效地从杂质中纯化rAAV颗粒的方法。
发明内容
本发明在至少一个实施例中通过提供公开了一种用于纯化用于基因疗法的rAAV颗粒或治疗有效的rAAV颗粒的方法来解决现有技术的一个或多个问题。在纯化之前，治疗有效的rAAV颗粒处于还包括AAV产生杂质的组合物中。AAV产生杂质包括：第一部分，其具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的净电荷；以及第二部分，其具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的密度。至少一个实施例的方法包括以下步骤：通过阴离子交换色谱(AEX)从组合物中去除第一部分，以及通过区带超速离心(ZUC)从组合物中去除第二部分。在AEX和ZUC步骤之后，组合物基本上不含AAV产生杂质。在改进中，AAV产生杂质的第一部分或第二部分是治疗无效的rAAV颗粒。
在至少一个实施例中，公开了一种用于纯化用于基因疗法的rAAV颗粒或治疗有效的rAAV颗粒的方法。在纯化之前，治疗有效的rAAV颗粒处于还包括治疗无效的rAAV颗粒的组合物中。至少一个实施例的方法包括：通过AEX从组合物中去除至少一些治疗无效的rAAV颗粒。在去除步骤之后，至少一个实施例的方法进一步包括：通过ZUC来处理组合物。在AEX和ZUC步骤之后，组合物基本上不含治疗无效的rAAV颗粒。
附图说明
图1A和图1B示出了来自通过分析超速离心分离的rAAV制剂的颗粒分布廓线(profile)。
图2A、图2B、图3A和图3B示出了含有轻型衣壳和重型衣壳的rAAV制剂对感染rAAV的细胞中的转基因表达的影响。
图4、图5A、图5B、图6A、图6B、图7、图8A、图8B、图9A、图9B、图10、图11A、图11B、图11C、图11D、图12A和图12B为示出标记的轻型衣壳和重型衣壳感染HepG2细胞的图像。
图13为各种实施例的纯化方法的步骤的流程图。
图14为示出各种实施例的AEX处理的步骤的流程图。
图15为示出各种实施例的AEX处理后的切向流过滤处理的步骤的流程图。
图16为示出各种实施例的ZUC处理的步骤的流程图。
图17为示出各种实施例的AEX处理后的切向流过滤处理的步骤的流程图。
图18为Zeta电位分析，示出了重型衣壳、ZUC轻型衣壳和AEX轻型衣壳之间的净电荷相对于pH的差异。
图19示出了来自阴离子交换色谱后的rAAV制剂的颗粒分布廓线。rAAV制剂通过分析超速离心被分离。
图20为来自阴离子交换色谱后的rAAV制剂的轻型衣壳和重型衣壳的低温电子显微镜图像。箭头指示致密颗粒(即，重型衣壳)和“非致密”颗粒(即，轻型衣壳)。
图21为示出进行区带超速离心的rAAV制剂的不同级分(fraction)的载体基因组效价和密度的图表。
图22示出了来自区带超速离心后的rAAV制剂的颗粒分布廓线。rAAV制剂通过分析超速离心被分离。
图23A和图23B为含有通过区带超速离心分离的rAAV制剂的级分的凝胶。图23A为针对VP衣壳蛋白染色的凝胶蛋白印迹。图23B为含有从超速离心级分分离出的DNA的碱性琼脂糖凝胶。
图24为来自区带超速离心后的rAAV制剂的轻型衣壳和重型衣壳的低温电子显微镜图像。箭头指示致密颗粒(即，重型衣壳)和“非致密”颗粒(即，轻型衣壳)。
图25A和图25B示出了对进行阴离子交换色谱和区带超速离心的rAAV制剂的分析。图25A示出了阴离子交换色谱期间的rAAV制剂的吸收光谱。图25B示出了针对区带超速离心期间的rAAV制剂的不同级分的衣壳和载体基因组效价。
图26示出了针对在有和没有在先阴离子交换色谱处理的情况下进行区带超速离心的rAAV制剂的不同级分的衣壳效价。
图27A、图27B和图27C示出了对当经受阴离子交换色谱和区带超速离心时的轻型衣壳的分析。图27A示出了阴离子交换色谱期间的rAAV制剂的吸收光谱。图27A中以圆圈标记的峰随后通过区带超速离心被处理。图27B示出了针对图27A中以圆圈标记的峰在区带超速离心期间的不同级分的衣壳和载体基因组效价。图27B中以圆圈标记的峰再次通过阴离子交换色谱被处理。图27C示出了图27B中以圆圈标记的峰在阴离子交换色谱期间的吸收光谱。
图28示出了在使用亲和树脂(诸如AVB Sepharose)进行免疫色谱纯化后、在阴离子交换色谱处理后以及在区带超速离心处理后作为杂质的与Rep蛋白相关的rAAV的浓度。图28突显了阴离子交换色谱处理从包含治疗有效的rAAV的经AVB Sepharose纯化的组合物中去除了相当大浓度的与Rep蛋白相关的rAAV。图28进一步突显了区带超速离心处理进一步去除了与未被阴离子交换色谱处理去除的Rep蛋白相关的rAAV。
图29示出了阴离子交换色谱处理期间与Rep蛋白相关的rAAV的去除。在组合物已通过阴离子交换色谱被处理后，对Rep蛋白的浓度进行了评定。洗脱液和洗涤液均不含相当大浓度的Rep蛋白。当阴离子交换色谱柱再生以去除上样、洗涤和洗脱步骤后残留的杂质时，鉴定出相当大浓度的Rep蛋白。
图30示出了区带超速离心处理期间与Rep蛋白相关的rAAV的去除。与未被分离的级分(即，“库后(Post-pool)”)相比，分离的级分(即，“库”)具有显著更低的Rep蛋白浓度。还应注意，与库后级分相比，库级分中包封的载体基因组的浓度显著增加。
图31示出了在使用亲和树脂(诸如AVB Sepharose)进行免疫色谱纯化后、在阴离子交换色谱处理后以及在区带超速离心处理后作为杂质的脱去酰胺基的衣壳的去除。图31突显了阴离子交换色谱处理从包含治疗有效的rAAV的经AVB Sepharose纯化的组合物中去除了相当大浓度的脱去酰胺基的衣壳。图31进一步突显了区带超速离心处理进一步去除了未被阴离子交换色谱处理去除的脱去酰胺基的衣壳。
图32示出了阴离子交换色谱处理期间脱去酰胺基的衣壳的去除。在组合物已通过阴离子交换色谱被处理后，对脱去酰胺基的衣壳的浓度进行了评定。洗脱液含有显著降低浓度的脱去酰胺基的衣壳。在洗脱的洗涤缓冲液中并且当阴离子交换色谱柱再生以去除上样、洗涤和洗脱步骤后残留的杂质时，鉴定出了相当大浓度的脱去酰胺基的衣壳。
图33示出了区带超速离心处理期间脱去酰胺基的衣壳的去除。与未被分离的级分(即，“库后”)相比，分离的级分(即，“库”)具有显著更低的脱去酰胺基的衣壳的浓度。还应注意，与库后级分相比，库级分中包封的载体基因组的浓度显著增加。
具体实施方式
视需要，本文中公开本发明的详细实施例；然而，应理解，所公开的实施例仅为示例性的且可以各种及替代形式体现。
除在实例中或在另有明确指示之处之外，本说明书中指示材料的量或者反应和/或使用的条件的所有数值数量都应理解为由字“约”修饰。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。在一个实例中，术语“约”理解为在本领域中的正常公差范围内，例如在均值的2个标准偏差内。在不同实例中，“约”是指±0.0001％、±0.0005％、±0.001％、±0.005％、±0.01％、±0.05％、±0.1％、±0.5％、±1％、±5％或±10％的变化性。在其他实例中，“约”可理解为在±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％或±2％内。
除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值都用术语“约”修饰。所有范围都包括范围的端点。首字母缩略词或其他缩写的第一定义适用于相同缩写在本文中的所有后续使用，并且在细节上作必要修改后适用于最初定义的缩写的正常语法变体；并且除非明确地相反陈述，否则属性的量度通过与先前或之后针对相同属性所参考的相同的技术来确定。
除非另外指示，否则本文中所用的所有技术及科学术语皆具有与一般熟习本发明所属技术者通常所理解的含义相同的含义。
还应理解，本公开不限于下述特定实施例和方法，因为特定组分和/或条件当然可以变化。此外，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的且并不意欲以任何方式限制本发明。
还必须注意，除非上下文另外明确地指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(该)(the)”包含复数个指示物。举例而言，以单数形式提及组分意欲包含复数个组分。
术语“或”及“和”可互换地使用且可理解为意谓“和/或”。
术语“包含(comprising)”与“具有(with)”、“包括(including)”、“具有(having)”、“含有(containing)”或“其特征在于(characterized by)”同义。这些术语为包括性的和开放式的，并且不排除附加的未列出的元件或方法步骤。
表述“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分。当此短语出现在一个权利要求主体的子句中而非紧接在前言之后时，其仅限制该子句中所阐述的要素；该权利要求总体上不排除其他要素。
短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限于指定材料或步骤及实质上不影响要求保护的主题的基本及新颖特征的那些材料或步骤。
术语“包含”、“由...组成”和“基本上由...组成”可以替代地使用。当使用这三个术语中的一者时，本发明公开和要求保护的主题可包括使用其他两个术语中的任一者。
如本文所用，术语“异源基因”、“异源序列”、“异源”、“异源调节序列”、“异源转基因”或“转基因”意指提及的基因或调节序列并非天然存在于AAV载体或颗粒中并已被人工引入其中。例如，这些术语是指包含异源基因和异源调节序列两者的核酸，该异源基因和该异源调节序列可操作地连接到控制该基因在宿主细胞中的表达的异源基因。设想到本文的转基因可以编码：生物分子(例如，治疗性生物分子)，诸如蛋白质(例如，酶)、多肽、肽、RNA(例如，tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA、siRNA、miRNA、pre-miRNA、lncRNA、snoRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA)；基因或碱基编辑系统(例如，CRISPR基因编辑系统)的一个或多个组分，反义寡核苷酸(AON)、反义寡核苷酸(AON)介导的外显子跳跃、触发无意义介导衰变(NMD)的毒性外显子、或显性负性突变体。
应理解术语“载体”是指当与适当控制元件相关时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何基因元件，诸如核酸分子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、杆粒、迷你质粒(例如，缺乏细菌元件的质粒)、狗骨头DNA(例如，最小闭合线性构造)、染色体、病毒、病毒粒子等。“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作地连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或体外表达系统来提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，诸如粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中的质粒)、人工染色体和掺入重组多核苷酸的病毒。
术语“重组”是指通过使用重组DNA技术形成的核酸分子或蛋白质。例如，可以通过组合核酸序列和序列元件来形成重组核酸分子。重组蛋白可以是由已接受重组核酸分子的细胞产生的蛋白质。
术语“编码(encodes)”、“经编码(encoded)”和“编码(encoding)”是指核酸分子(诸如基因、互补DNA(cDNA)或信使RNA(mRNA))中用以充当模板的核苷酸的特定序列的固有属性，该模板用于在生物过程中合成其他聚合物和大分子。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和转译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中的编码链与用作基因或cDNA转录的模板的非编码链均可称为编码基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
本发明涉及一种纯化用于基因疗法的rAAV颗粒或治疗有效的rAAV颗粒的方法。治疗有效的rAAV颗粒包括已知方法中公开的或可以根据已知方法制备的rAAV颗粒，例如，如US 9,504,762、WO 2019/222136、US 2019/0376081和WO 2019/217513中公开的，其公开内容据此以其整体以引用方式并入本文。
根据本发明，rAAV颗粒的产生是低效的过程，该过程产生包含治疗无效的rAAV颗粒的各种杂质。这些杂质限制了纯化技术进一步将治疗有效的rAAV颗粒与杂质分离的能力。为此，本发明人已通过从杂质中分离出治疗有效的rAAV颗粒的开发方法解决了现有技术中的局限性。
在各种实施例中，从包含治疗有效的rAAV颗粒和AAV产生杂质(包含治疗无效的rAAV颗粒)的组合物纯化治疗有效的rAAV颗粒的方法和过程。各种实施例的组合物是rAAV颗粒的产物。AAV产生杂质还可以包括：具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的净电荷的杂质，或具有不同于AAV颗粒的密度的杂质。
各种实施例的方法和过程包括使组合物经受AEX，其中具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的净电荷的杂质被从组合物中去除。这些杂质包含治疗无效的rAAV颗粒。已发现，由于存在治疗无效的rAAV颗粒(其可溶性低于治疗有效的rAAV颗粒并易于聚集)，因此ZUC用于纯化治疗有效的rAAV颗粒的用途在很大程度上受到限制。尽管不希望受理论的束缚，但这些属性会使ZUC分离治疗有效的rAAV颗粒的容量过载。例如，未经AEX处理的治疗无效的rAAV颗粒可能在ZUC期间沉淀，并阻止与治疗有效的rAAV颗粒分离。为此，AEX从组合物中去除足够数量的治疗无效的rAAV颗粒，使得具有增加的浓度的治疗有效的rAAV颗粒的组合物可以通过ZUC被高效地上样和处理。例如，增加的浓度的治疗有效的rAAV颗粒为每次都可以通过ZUC处理的经济上可行的数量。例如，AEX处理可以允许通过ZUC处理至少每次上样0.1x 10e16个载体基因组(vg)至每次上样10x 10e17个vg的效价。在各种实施例中，治疗无效的rAAV颗粒包含具有相关Rep蛋白的衣壳。在其他实施例中，治疗无效的rAAV颗粒包含衣壳，该衣壳带有具有脱去酰胺基的N末端氨基酸的一种或多种VP1蛋白。
在各种改进中，AEX去除或去除至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99+％或100％的具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的净电荷的杂质。在其他改进中，通过AEX去除的杂质的百分比为介于以上提供的任何两个百分比之间的范围。在各种改进中，AEX从组合物中去除或去除至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99％+的治疗无效的rAAV颗粒。在其他改进中，通过AEX从组合物中去除的治疗无效的rAAV颗粒的百分比为介于以上提供的任何两个百分比之间的范围。
在各种改进中，AEX允许通过ZUC对组合物进行后续处理，或者允许原始组合物具有通过ZUC处理的更大数量的治疗有效的rAAV颗粒。
在各种改进中，AEX将组合物中的污染性病毒浓度降低至少以下Log10值：至少2、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4、至少2.5、至少2.6、至少2.7、至少2.8、至少2.9、至少3、至少3.1、至少至少3.2、至少3.3、至少3.4、至少3.5、至少3.6、至少3.7、至少3.8、至少3.9、至少4、至少4.1、至少4.2、至少4.3、至少4.4、至少4.5、至少4.6、至少4.7、至少4.8、至少4.9、至少5、至少5.1、至少5.2、至少5.3、至少5.4、至少5.5、至少5.6、至少5.7、至少5.8、至少5.9、至少6、至少6.1、至少6.2、至少6.3、至少6.4、至少6.5、至少6.6、至少6.7、至少6.8、至少6.9或至少7。
在各种改进中，AEX步骤包括：通过含有强碱性阴离子交换树脂的膜过滤器或柱来处理组合物。强碱性阴离子交换树脂的实例包括：季铵化聚乙烯亚胺、具有三甲基铵基团(诸如三甲基-铵乙基(TMAE))的I型树脂以及具有二甲基乙醇胺基团(诸如二乙基氨基乙基(DEAE))的II型树脂。具有强碱性阴离子交换树脂的过滤器或柱的实例包括：Mustang Q(Pall)、Sartobind Q(Sartorius)、POROS 50HQ(Thermofisher)、POROS 50XQ(Thermofisher)、Fractogel TMAE(EMD Millipore)、Fractogel DEAE(EMD Millipore)、Eshmuno Q(EMD Millipore)、CIMmultus-QA(BIA分离)、NuviaQ(Bio-Rad)、Q Sepharose XL(Cytiva)、Q Sepharose HP(Cytiva)、Capto Q Impres(Cytiva)、Source 15Q(Cytiva)、Source30Q(Cytiva)、Mono Q(Cytiva)、TSKgel Q-STAT(TOSOH bioscience)、TSKgelSuperQ-5PW(20)(Tosoh Biosciences)、Toyopearl SuperQ 650M(Tosoh Biosciences)、Toyopearl GigaCap Q 650M(Tosoh Biosciences)和Capto Adhere Impres(Multimodal，Cytiva)。弱碱性阴离子交换树脂的实例包括二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基丙基或二乙基氨基丙基(ANX)。具有弱碱性阴离子交换树脂的过滤器和柱的实例包括：SartobindSTIC PA(Sartorius)、DEAE Sepharose FF(Cytiva)、Poros 50D(Thermofisher)、POROS50PI(ThermoFisher)、Fractogel EMD DEAE(M)(EMD Millipore)、MacroPrep DEAESupport(Bio-Rad)、DEAE Ceramic HyperD 20(Sartorius)、Toyopearl NH2-750F(TosohBiosciences)或Toyopearl DEAE 650M(Sigma Aldrich)。用于与AEX一起使用的合适的缓冲液和缓冲剂可以包括从各种源贡献的离子，诸如，例如，N-甲基哌嗪；哌嗪、双-三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、双-三丙烷、MES、Hepes、BTP；磷酸盐缓冲液N-甲基二乙醇胺；1,3-二氨基丙烷；乙醇胺；乙酸，诸如乙酸钠或乙酸锂；或柠檬酸盐等。在各种改进中，柱的床高度为至少7厘米(cm)、7cm、7.1cm、7.2cm、7.3cm、7.4cm、7.5cm、7.6cm、7.7cm、7.8cm、7.9cm、8cm、8.1cm、8.2cm、8.3cm、8.4cm、8.5cm、8.6cm、8.7cm、8.8cm、8.9cm、9cm、9.1cm、9.2cm、9.3cm、9.4cm、9.5cm、9.6cm、9.7cm、9.8cm、9.9cm、10cm、10.1cm、10.2cm、10.3cm、10.4cm、10.5cm、10.6cm、10.7cm、10.8cm、10.9cm、11cm、11.1cm、11.2cm、11.3cm、11.4cm、11.5cm、11.6cm、11.7cm、11.8cm、11.9cm、12cm、12.1cm、12.2cm、12.3cm、12.4cm、12.5cm、12.6cm、12.7cm、12.8cm、12.9cm、13cm、13.1cm、13.2cm、13.3cm、13.4cm、13.5cm、13.6cm、13.7cm、13.8cm、13.9cm、14cm、14.1cm、14.2cm、14.3cm、14.4cm、14.5cm、14.6cm、14.7cm、14.8cm、14.9cm或15cm。在其他改进中，柱的床高度大于15cm(15.1cm、15.2cm、15.3cm、15.4cm、15.5cm、15.6cm、15.7cm、15.8cm、15.9cm、16cm、16.1cm、16.2cm、16.3cm、16.4cm、16.5cm、16.6cm、16.7cm、16.8cm、16.9cm、17cm、17.1cm、17.2cm、17.3cm、17.4cm、17.5cm、17.6cm、17.7cm、17.8cm、17.9cm、18cm、18.1cm、18.2cm、18.3cm、18.4cm、18.5cm、18.6cm、18.7cm、18.8cm、18.9cm、19cm、19.1cm、19.2cm、19.3cm、19.4cm、19.5cm、19.6cm、19.7cm、19.8cm、19.9cm、20cm、20.1cm、20.2cm、20.3cm、20.4cm、20.5cm、20.6cm、20.7cm、20.8cm、20.9cm、21cm、21.1cm、21.2cm、21.3cm、21.4cm、21.5cm、21.6cm、21.7cm、21.8cm、21.9cm、22cm、22.1cm、22.2cm、22.3cm、22.4cm、22.5cm、22.6cm、22.7cm、22.8cm、22.9cm、23cm、23.1cm、23.2cm、23.3cm、23.4cm、23.5cm、23.6cm、23.7cm、23.8cm、23.9cm、24cm、24.1cm、24.2cm、24.3cm、24.4cm、24.5cm、24.6cm、24.7cm、24.8cm、24.9cm、25cm、25.1cm、25.2cm、25.3cm、25.4cm、25.5cm、25.6cm、25.7cm、25.8cm、25.9cm、26cm、26.1cm、26.2cm、26.3cm、26.4cm、26.5cm、26.6cm、26.7cm、26.8cm、26.9cm、27cm、27.1cm、27.2cm、27.3cm、27.4cm、27.5cm、27.6cm、27.7cm、27.8cm、27.9cm、28cm、28.1cm、28.2cm、28.3cm、28.4cm、28.5cm、28.6cm、28.7cm、28.8cm、28.9cm、29cm、29.1cm、29.2cm、29.3cm、29.4cm、29.5cm、29.6cm、29.7cm、29.8cm、29.9cm、30cm)。在其他改进中，柱的床高度为介于以上提供的任何两个床高度之间的范围。
在各种改进中，AEX操作在以下pH处进行：至少6、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11。在其他改进中，进行AEX操作所处的pH为介于以上提供的任何两个pH之间的范围。
在各种改进中，AEX操作在以下温度进行：至少4摄氏度(℃)、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃。在其他改进中，进行AEX操作所处的温度为介于以上提供的任何两个温度之间的范围。
在各种改进中，上样到AEX柱上进行AEX处理的组合物具有以下效价：至少每升0.1x 10e16个载体基因组(vg/L)、015x 10e16 vg/L、0.5x 10e16 vg/L、1x 10e16 vg/L、1.5x 10e16 vg/L、2x 10e16 vg/L、2.5x 10e16 vg/L、3x 10e16 vg/L、3.5x 10e16 vg/L、4x 10e16 vg/L、4.5x 10e16 vg/L、5x 10e16 vg/L、5.5x 10e16 vg/L、6x 10e16 vg/L、6.5x 10e16 vg/L、7x 10e16 vg/L、7.5x 10e16 vg/L、8x 10e16 vg/L、8.5x 10e16 vg/L、9x 10e16vg/L、9.5x 10e16 vg/L或10x 10e16 vg/L。在其他改进中，效价为介于以上提供的任何两个效价之间的范围。
在各种改进中，上样到AEX柱上进行AEX处理的组合物具有以下电导率：至少0.0毫西门子/厘米(mS/cm)、0.0mS/cm、0.001mS/cm、0.002mS/cm、0.003mS/cm、0.004mS/cm、0.005mS/cm、0.006mS/cm、0.007mS/cm、0.008mS/cm、0.009mS/cm、0.01mS/cm、0.02mS/cm、0.03mS/cm、0.04mS/cm、0.05mS/cm、0.06mS/cm、0.07mS/cm、0.08mS/cm、0.09mS/cm、0.1mS/cm、0.1mS/cm、0.2mS/cm、0.3mS/cm、0.4mS/cm、0.5mS/cm、0.6mS/cm、0.7mS/cm、0.8mS/cm、0.9mS/cm、1mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm、3mS/cm、3.1mS/cm、3.2mS/cm、3.3mS/cm、3.4mS/cm、3.5mS/cm、3.6mS/cm、3.7mS/cm、3.8mS/cm、3.9mS/cm、4mS/cm、4.1mS/cm、4.2mS/cm、4.3mS/cm、4.4mS/cm、4.5mS/cm、4.6mS/cm、4.7mS/cm、4.8mS/cm、4.9mS/cm、5mS/cm、5.1mS/cm、5.2mS/cm、5.3mS/cm、5.4mS/cm、5.5mS/cm、5.6mS/cm、5.7mS/cm、5.8mS/cm、5.9mS/cm、6mS/cm、6.1mS/cm、6.2mS/cm、6.3mS/cm、6.4mS/cm、6.5mS/cm、6.6mS/cm、6.7mS/cm、6.8mS/cm、6.9mS/cm或7mS/cm。在其他改进中，上样到AEX柱上进行AEX处理的组合物具有小于1mS/cm的电导率。在其他改进中，上样到AEX柱上的组合物的电导率为介于以上提供的任何两个电导率之间的范围。
在各种改进中，上样到AEX柱上进行AEX处理的组合物具有以下pH：至少7、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11。在其他改进中，上样到AEX柱上的组合物的pH为介于以上提供的任何两个pH之间的范围。
在各种改进中，在使组合物行进通过AEX柱后，用缓冲液洗涤柱。在各种改进中，洗涤缓冲液的电导率为至少1mS/cm、1mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm、3mS/cm、3.1mS/cm、3.2mS/cm、3.3mS/cm、3.4mS/cm、3.5mS/cm、3.6mS/cm、3.7mS/cm、3.8mS/cm、3.9mS/cm、4mS/cm、4.1mS/cm、4.2mS/cm、4.3mS/cm、4.4mS/cm、4.5mS/cm、4.6mS/cm、4.7mS/cm、4.8mS/cm、4.9mS/cm、5mS/cm、5.1mS/cm、5.2mS/cm、5.3mS/cm、5.4mS/cm、5.5mS/cm、5.6mS/cm、5.7mS/cm、5.8mS/cm、5.9mS/cm、6mS/cm、6.1mS/cm、6.2mS/cm、6.3mS/cm、6.4mS/cm、6.5mS/cm、6.6mS/cm、6.7mS/cm、6.8mS/cm、6.9mS/cm或7mS/cm。在其他改进中，洗涤缓冲液的电导率大于7mS/cm。在其他改进中，洗涤缓冲液的电导率为介于以上提供的任何两个电导率之间的范围。
当用各种实施例的洗涤缓冲液洗涤柱时，监测离开柱的洗涤缓冲液在260纳米(nm)和280nm波长处的紫外(UV)吸光度并计算260nm波长与280nm波长的比率(A260:A280)可以消除人为错误和不同纯化之间的差异。在各种改进中，离开柱的洗涤缓冲液的A260:A280为至少0.5、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5。在其他改进中，离开柱的洗涤缓冲液的A260:A280比率为介于以上提供的任何两个比率之间的范围。
在各种改进中，在用洗涤缓冲液洗涤AEX柱后，用含有一定浓度的缓冲剂的洗脱缓冲液来洗脱组合物。在各种改进中，缓冲剂的浓度为至少0.5mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、71mM、72mM、73mM、74mM、75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、101mM、102mM、103mM、104mM、105mM、106mM、107mM、108mM、109mM、110mM、111mM、112mM、113mM、114mM、115mM、116mM、117mM、118mM、119mM、120mM、121mM、122mM、123mM、124mM、125mM、126mM、127mM、128mM、129mM、130mM、131mM、132mM、133mM、134mM、135mM、136mM、137mM、138mM、139mM、140mM、141mM、142mM、143mM、144mM、145mM、146mM、147mM、148mM、149mM、150mM、151mM、152mM、153mM、154mM、155mM、156mM、157mM、158mM、159mM、160mM、161mM、162mM、163mM、164mM、165mM、166mM、167mM、168mM、169mM、170mM、171mM、172mM、173mM、174mM或175mM。在其他改进中，缓冲剂的浓度为介于以上提供的任何两个浓度之间的范围。各种改进的洗脱缓冲液还具有以下电导率：至少1mS/cm、1mS/cm、1.1mS/cm、1.2mS/cm、1.3mS/cm、1.4mS/cm、1.5mS/cm、1.6mS/cm、1.7mS/cm、1.8mS/cm、1.9mS/cm、2mS/cm、2.1mS/cm、2.2mS/cm、2.3mS/cm、2.4mS/cm、2.5mS/cm、2.6mS/cm、2.7mS/cm、2.8mS/cm、2.9mS/cm、3mS/cm、3.1mS/cm、3.2mS/cm、3.3mS/cm、3.4mS/cm、3.5mS/cm、3.6mS/cm、3.7mS/cm、3.8mS/cm、3.9mS/cm、4mS/cm、4.1mS/cm、4.2mS/cm、4.3mS/cm、4.4mS/cm、4.5mS/cm、4.6mS/cm、4.7mS/cm、4.8mS/cm、4.9mS/cm、5mS/cm、5.1mS/cm、5.2mS/cm、5.3mS/cm、5.4mS/cm、5.5mS/cm、5.6mS/cm、5.7mS/cm、5.8mS/cm、5.9mS/cm、6mS/cm、6.1mS/cm、6.2mS/cm、6.3mS/cm、6.4mS/cm、6.5mS/cm、6.6mS/cm、6.7mS/cm、6.8mS/cm、6.9mS/cm、7mS/cm、7.1mS/cm、7.2mS/cm、7.3mS/cm、7.4mS/cm、7.5mS/cm、7.6mS/cm、7.7mS/cm、7.8mS/cm、7.9mS/cm、8mS/cm、8.1mS/cm、8.2mS/cm、8.3mS/cm、8.4mS/cm、8.5mS/cm、8.6mS/cm、8.7mS/cm、8.8mS/cm、8.9mS/cm、9mS/cm、9.1mS/cm、9.2mS/cm、9.3mS/cm、9.4mS/cm、9.5mS/cm、9.6mS/cm、9.7mS/cm、9.8mS/cm、9.9mS/cm或10mS/cm。在其他改进中，洗脱缓冲液的电导率为介于以上提供的任何两个电导率之间的范围。
在各种改进中，AEX操作包括通过AEX柱对组合物进行处理，洗涤步骤或洗脱步骤按以下流速进行：至少50厘米/小时(cm/hr)、50cm/hr、55cm/hr、60cm/hr、65cm/hr、70cm/hr、75cm/hr、80cm/hr、85cm/hr、90cm/hr、95cm/hr、100cm/hr、105cm/hr、110cm/hr、115cm/hr、120cm/hr、125cm/hr、130cm/hr、135cm/hr、140cm/hr、145cm/hr、150cm/hr、155cm/hr、160cm/hr、170cm/hr、180cm/hr、190cm/hr、200cm/hr、210cm/hr、220cm/hr、230cm/hr、240cm/hr、250cm/hr、260cm/hr、270cm/hr、280cm/hr、290cm/hr或300cm/hr。在其他改进中，进行AEX操作所处的流速为介于以上提供的任何两个流速之间的范围。
在洗脱步骤期间，当被洗脱的组合物在光程长处达到260nm波长(A260)处的UV吸光度时，组合物的收集开始。在各种改进中，当被洗脱的组合物达到至少0.1吸光度单位(AU)/cm、0.1AU/cm、0.15AU/cm、0.2AU/cm、0.25AU/cm、0.3AU/cm、0.35AU/cm、0.4AU/cm、0.45AU/cm、0.5AU/cm、0.55AU/cm、0.6AU/cm、0.65AU/cm、0.7AU/cm、0.75AU/cm、0.8AU/cm、0.85AU/cm、0.9AU/cm、0.95AU/cm或1AU/cm时，组合物的收集开始。在其他改进中，收集开始时的吸光度为介于以上提供的任何两个吸光度之间的范围。
在洗脱步骤期间，当被洗脱的组合物已达到为组合物达到的最大A260的一定百分比的A260时，组合物的收集结束。在各种改进中，该百分比为至少0.1％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在其他改进中，最大A260的该一定百分比为介于以上提供的任何两个百分比之间的范围。
在各种改进中，从AEX柱或洗脱液洗脱的组合物的pH为或被调节到：至少6、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或11。在其他改进中，从AEX柱洗脱的组合物的pH为介于以上提供的任何两个pH之间的范围。
各种实施例的方法和过程包括使组合物经受ZUC，其中具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的密度的杂质被从组合物中去除。
在各种改进中，ZUC去除或去除至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99+％或100％的具有不同于治疗有效的rAAV颗粒的密度的杂质。在其他改进中，通过ZUC去除的杂质的百分比为介于以上提供的任何两个百分比之间的范围。在各种改进中，ZUC将组合物中的污染性病毒浓度降低至少以下Log10值：至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4、至少2.5、至少2.6、至少2.7、至少2.8、至少2.9、至少3、至少3.1、至少3.2、至少3.3、至少3.4、至少3.5、至少3.6、至少3.7、至少3.8、至少3.9或至少4。
在ZUC处理的各种改进中，向组合物中加入梯度化合物，并将组合物上样在转子中的缓冲层和覆盖层之间以进行区带超速离心。在ZUC已完成后，将置换溶液泵送到转子中，以迫使缓冲层、组合物和覆盖层脱离ZUC转子。替代地，在不使用置换溶液的情况下，将缓冲层、组合物和覆盖层从ZUC转子泵出。在用层对ZUC转子上样和卸样(unloading)时，ZUC转子可以旋转或静止。在ZUC处理中，覆盖层首先被泵送到旋转或静止的ZUC转子中，随后是与梯度化合物和缓冲层一起的组合物。缓冲层、覆盖层和置换溶液也含有梯度化合物。梯度形成组合物的实例包括氯化铯(CsCl)、碘克沙醇或蔗糖。缓冲层防止颗粒(例如，治疗有效的rAAV)在转子的壁上造粒，并且覆盖层防止颗粒从由梯度化合物形成的梯度中迁移出来。在改进中，梯度化合物在缓冲层、组合物和覆盖层中的浓度彼此不同。在其他改进中，缓冲层中的梯度化合物的浓度大于组合物。在进一步的改进中，化合物中的梯度的浓度大于覆盖层。
在各种改进中，缓冲层、组合物、覆盖层或置换溶液中的梯度化合物的浓度为至少15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％。在其他改进中，缓冲层、组合物、覆盖层或置换溶液中的梯度化合物的浓度为以上提供的任何两个浓度的范围。
在各种改进中，泵送到ZUC转子中的覆盖层的重量为至少117克(g)、117g、118g、119g、120g、121g、122g、123g、124g、125g、126g、127g、128g、129g、130g、131g、132g、133g、134g、135g、136g、137g、138g、139g、140g、141g、142g、143g、144g、145g、146g、147g、148g、149g、150g、151g、152g、153g、154g、155g、156g、157g、158g、159g、160g、161g、162g、163g、164g、165g、166g、167g、168g、169g、170g、171g、172g、173g、174g、175g、176g、177g、178g、179g、180g、181g、182g、183g、184g、185g、186g、187g、188g、189g、190g、191g、192g、193g、194g、195g、196g、197g、198g、199g、200g、201g、202g、203g、204g、205g、206g、207g、208g、209g、210g、211g、212g、213g、214g、215g、216g、217g、218g、219g、220g、221g、222g、223g、224g、225g、226g、227g、228g、229g、230g、231g、232g、233g、234g、235g、236g、237g、238g、239g、240g、241g、242g、243g、244g、245g、246g、247g、248g、249g、250g、251g、252g、253g、254g、255g、256g、257g、258g、259g、260g、261g、262g、263g、264g、265g、266g、267g、268g、269g、270g、271g、272g、273g、274g、275g、276g、277g、278g、279g、280g、281g、282g、283g、284g、285g、286g、287g、288g、289g、290g、291g、292g、293g、294g、295g、296g、297g、298g、299g、300g、301g、302g、303g、304g、305g、306g、307g、308g、309g、310g、311g、312g、313g、314g、315g、316g、317g、318g、319g、320g、321g、322g、323g、324g、325g、326g、327g、328g、329g、330g、331g、332g、333g、334g、335g、336g、337g、338g、339g、340g或341g。在替代性改进中，泵送到ZUC转子中的覆盖层的重量为至少1100g、1110g、1120g、1130g、1140g、1150g、1160g、1170g、1180g、1190g、1200g、1210g、1220g、1230g、1240g、1250g、1260g、1270g、1280g、1290g或1300g。在其他改进中，泵送到ZUC转子中的覆盖层的重量为介于以上提供的任何两个重量之间的范围。
在各种改进中，泵送到ZUC转子中的缓冲层的重量为至少534g、534g、535g、536g、537g、538g、539g、540g、541g、542g、543g、544g、545g、546g、547g、548g、549g、550g、551g、552g、553g、554g、555g、556g、557g、558g、559g、560g、561g、562g、563g、564g、565g、566g、567g、568g、569g、570g、571g、572g、573g、574g、575g、576g、577g、578g、579g、580g、581g、582g、583g、584g、585g、586g、587g、588g、589g、590g、591g、592g、593g、594g、595g、596g、597g、598g、599g、600g、601g、602g、603g、604g、605g、606g、607g、608g、609g、610g、611g、612g、613g、614g、615g、616g、617g、618g、619g、620g、621g、622g、623g、624g、625g、626g、627g、628g、629g、630g、631g、632g、633g、634g、635g、636g、637g、638g、639g、640g、641g、642g、643g、644g、645g、646g、647g、648g、649g、650g、651g、652g、653g、654g、655g、656g、657g、658g、659g、660g、661g、662g、663g、664g、665g、666g、667g或668g。在替代性改进中，泵送到ZUC转子中的缓冲层的重量为至少3600g、3600g、3601g、3602g、3603g、3604g、3605g、3606g、3607g、3608g、3609g、3610g、3611g、3612g、3613g、3614g、3615g、3616g、3617g、3618g、3619g、3620g、3621g、3622g、3623g、3624g、3625g、3626g、3627g、3628g、3629g、3630g、3631g、3632g、3633g、3634g、3635g、3636g、3637g、3638g、3639g、3640g、3641g、3642g、3643g、3644g、3645g、3646g、3647g、3648g、3649g、3650g、3651g、3652g、3653g、3654g、3655g、3656g、3657g、3658g、3659g、3660g、3661g、3662g、3663g、3664g、3665g、3666g、3667g、3668g、3669g、3670g、3671g、3672g、3673g、3674g、3675g、3676g、3677g、3678g、3679g、3680g、3681g、3682g、3683g、3684g、3685g、3686g、3687g、3688g、3689g、3690g、3691g、3692g、3693g、3694g、3695g、3696g、3697g、3698g、3699g或3700g。在其他改进中，泵送到ZUC转子中的缓冲层的重量为介于以上提供的任何两个重量之间的范围。
在各种改进中，上样到ZUC转子中进行ZUC处理的组合物具有以下效价：至少0.1x10e16个vg/上样、0.1x 10e16个vg/上样、0.5x 10e16个vg/上样、1x 10e16个vg/上样、1.5x10e16个vg/上样、2x 10e16个vg/上样、2.5x 10e16个vg/上样、3x 10e16个vg/上样、3.5x10e16个vg/上样、4x 10e16个vg/上样、4.5x 10e16个vg/上样、5x 10e16个vg/上样、5.5x10e16个vg/上样、6x 10e16个vg/上样、6.5x 10e16个vg/上样、7x 10e16个vg/上样、7.5x10e16个vg/上样、8x 10e16个vg/上样、8.5x 10e16个vg/上样、9x 10e16个vg/上样、9.5x10e16个vg/上样、10x 10e16个vg/上样、0.1x 10e17个vg/上样、0.5x 10e17个vg/上样、1x10e17个vg/上样、1.5x 10e17个vg/上样、2x 10e17个vg/上样、2.5x 10e17个vg/上样、3x10e17个vg/上样、3.5x 10e17个vg/上样、4x 10e17个vg/上样、4.5x 10e17个vg/上样、5x10e17个vg/上样、5.5x 10e17个vg/上样、6x 10e17个vg/上样、6.5x 10e17个vg/上样、7x10e17个vg/上样、7.5x 10e17个vg/上样、8x 10e17个vg/上样、8.5x 10e17个vg/上样、9x10e17个vg/上样、9.5x 10e17个vg/上样或10x10e17个vg/上样。在其他改进中，效价为介于以上提供的任何两个效价之间的范围。
在各种改进中，上样到ZUC转子中进行ZUC处理的组合物的密度为至少1.347克每毫升(g/mL)、1.3471g/mL、1.3472g/mL、1.3473g/mL、1.3474g/mL、1.3475g/mL、1.3476g/mL、1.3477g/mL、1.3478g/mL、1.3479g/mL、1.348g/mL、1.3481g/mL、1.3482g/mL、1.3483g/mL、1.3484g/mL、1.3485g/mL、1.3486g/mL、1.3487g/mL、1.3488g/mL、1.3489g/mL、1.349g/mL、1.3491g/mL、1.3492g/mL、1.3493g/mL、1.3494g/mL、1.3495g/mL、1.3496g/mL、1.3497g/mL、1.3498g/mL、1.3499g/mL、1.35g/mL、1.3501g/mL、1.3502g/mL、1.3503g/mL、1.3504g/mL、1.3505g/mL、1.3506g/mL、1.3507g/mL、1.3508g/mL、1.3509g/mL、1.351g/mL、1.3511g/mL、1.3512g/mL、1.3513g/mL、1.3514g/mL、1.3515g/mL、1.3516g/mL、1.3517g/mL、1.3518g/mL、1.3519g/mL、1.352g/mL、1.3521g/mL、1.3522g/mL、1.3523g/mL、1.3524g/mL、1.3525g/mL、1.3526g/mL、1.3527g/mL、1.3528g/mL、1.3529g/mL、1.353g/mL、1.3531g/mL、1.3532g/mL、1.3533g/mL、1.3534g/mL、1.3535g/mL、1.3536g/mL、1.3537g/mL、1.3538g/mL、1.3539g/mL、1.354g/mL、1.3541g/mL、1.3542g/mL、1.3543g/mL、1.3544g/mL、1.3545g/mL、1.3546g/mL、1.3547g/mL、1.3548g/mL、1.3549g/mL、1.355g/mL、1.3551g/mL、1.3552g/mL、1.3553g/mL、1.3554g/mL、1.3555g/mL、1.3556g/mL、1.3557g/mL、1.3558g/mL、1.3559g/mL、1.356g/mL、1.3561g/mL、1.3562g/mL、1.3563g/mL、1.3564g/mL、1.3565g/mL、1.3566g/mL、1.3567g/mL、1.3568g/mL、1.3569g/mL、1.357g/mL、1.3571g/mL、1.3572g/mL、1.3573g/mL、1.3574g/mL、1.3575g/mL、1.3576g/mL、1.3577g/mL、1.3578g/mL、1.3579g/mL、1.358g/mL、1.3581g/mL、1.3582g/mL、1.3583g/mL、1.3584g/mL、1.3585g/mL、1.3586g/mL、1.3587g/mL、1.3588g/mL、1.3589g/mL、1.359g/mL、1.3591g/mL、1.3592g/mL、1.3593g/mL、1.3594g/mL、1.3595g/mL、1.3596g/mL、1.3597g/mL、1.3598g/mL、1.3599g/mL、1.36g/mL、1.3601g/mL、1.3602g/mL、1.3603g/mL、1.3604g/mL、1.3605g/mL、1.3606g/mL、1.3607g/mL、1.3608g/mL、1.3609g/mL、1.361g/mL、1.3611g/mL、1.3612g/mL、1.3613g/mL、1.3614g/mL、1、1.3675g/mL、1.3676g/mL、1.3677g/mL、1.3678g/mL、1.3679g/mL、1.368g/mL、1.3681g/mL、1.3682g/mL、1.3683g/mL、1.3684g/mL、1.3685g/mL、1.3686g/mL、1.3687g/mL、1.3688g/mL、1.3689g/mL、1.369g/mL、1.3691g/mL、1.3692g/mL、1.3693g/mL、1.3694g/mL、1.3695g/mL、1.3696g/mL、1.3697g/mL、1.3698g/mL、1.3699g/mL、1.37g/mL、1.3701g/mL、1.3702g/mL、1.3703g/mL、1.3704g/mL、1.3705g/mL、1.3706g/mL、1.3707g/mL、1.3708g/mL、1.3709g/mL或1.371g/mL。在其他改进中，上样到ZUC转子中进行ZUC处理的组合物的密度为介于以上提供的任何两个密度之间的范围。
在各种改进中，缓冲层、组合物、覆盖层或置换溶液按以下流速被上样到ZUC转子中：至少每分钟20毫升(mL/min)、20mL/min、21mL/min、22mL/min、23mL/min、24mL/min、25mL/min、26mL/min、27mL/min、28mL/min、29mL/min、30mL/min、31mL/min、32mL/min、33mL/min、34mL/min、35mL/min、36mL/min、37mL/min、38mL/min、39mL/min、40mL/min、41mL/min、42mL/min、43mL/min、44mL/min、45mL/min、46mL/min、47mL/min、48mL/min、49mL/min、50mL/min、51mL/min、52mL/min、53mL/min、54mL/min、55mL/min、56mL/min、57mL/min、58mL/min、59mL/min、60mL/min、61mL/min、62mL/min、63mL/min、64mL/min、65mL/min、66mL/min、67mL/min、68mL/min、69mL/min或70mL/min。在替代性改进中，缓冲层、组合物、覆盖层或置换溶液以200mL/min或更大的流速被上样到ZUC转子中。在其他改进中，缓冲层、组合物、覆盖层或置换溶液被上样到ZUC转子中的流速为介于以上提供的任何两个流速之间的范围。
上样后，被上样的ZUC转子以一定速度离心并达一定时间段，以形成梯度并按密度分离颗粒。
在各种改进中，ZUC转子离心至少每分钟10000转(rpm)、10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm、16000rpm、17000rpm、18000rpm、19000rpm、20000rpm、21000rpm、22000rpm、23000rpm、24000rpm、25000rpm、26000rpm、27000rpm、28000rpm、29000rpm、30000rpm、31000rpm、32000rpm、33000rpm、34000rpm、35000rpm、36000rpm、37000rpm、38000rpm、39000rpm、40000rpm、41000rpm、42000rpm、43000rpm、44000rpm、45000rpm、46000rpm、47000rpm、48000rpm、49000rpm或50000rpm。在其他改进中，ZUC转子离心的速度为介于以上提供的任何两个速度之间的范围。
在替代性改进中，ZUC转子离心至少50000g力(G)、50000G、55000G、60000G、65000G、70000G、75000G、80000G、85000G、90000G、95000G、100000G、105000G、110000G、115000G、120000G或125000G。在其他替代性改进中，ZUC转子离心的速度为介于以上提供的任何两个速度之间的范围。
在各种改进中，ZUC转子离心达至少13小时(hr)、13hr、13.5hr、14hr、14.5hr、15hr,15.5hr、16hr、16.5hr、17hr、17.5hr、18hr、18.5hr、19hr、19.5hr、20hr、20.5hr、21hr、21.5hr、22hr、22.5hr、23hr、23.5hr、24hr、24.5hr或25hr。在其他改进中，被上样的ZUC转子离心的时间段为介于以上提供的任何两个时间之间的范围。
在各种改进中，被上样的ZUC转子在以下温度离心：至少10℃、10℃、10.5℃、11℃、11.5℃、12℃、12.5℃、13℃、13.5℃、14℃、14.5℃、15℃、15.5℃、16℃、16.5℃、17℃、17.5℃、18℃、18.5℃、19℃、19.5℃、20℃、20.5℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃、28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃或36℃。在其他改进中，被上样的ZUC转子离心所处的温度为介于以上提供的任何两个温度之间的范围。
在颗粒已通过超速离心被分离后，被上样的转子可以静止或以一定速度(例如，1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm或5000rpm)离心，以便通过将置换溶液泵送到转子中以将缓冲层、组合物和覆盖层从ZUC转子推出而回收经ZUC处理的组合物。在各种改进中，被上样的转子离心达至少0分钟(min)、至少1分钟、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、130min、140min、150min、160min、170min、180min、190min、200min、210min、220min、230min、240min、250min、260min、270min、280min、290min、300min、310min、320min、330min、340min、350min或360min。在其他改进中，转子离心所达时间为介于以上提供的任何两个时间之间的范围。
在各种改进中，AEX和ZUC去除或去除至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99+％或100％的AAV产生杂质。在不同的实施例中，通过AEX和ZUC去除的AAV产生杂质的百分比为以上列出的任何两个百分比之间的范围。在改进中，组合物在AEX和ZUC处理后基本上不含AAV产生杂质。如上所述，当rAAV产生时，存在以下项的混合物：含有完整目标转基因的重型衣壳；含有目标转基因的一部分的部分衣壳；以及轻型衣壳。如以下所突显的，空衣壳和轻型衣壳没有治疗功效，并且增加了患者对异源蛋白、核酸等的暴露，从而增加了患者中的不良免疫应答的可能性。因此，优选的是应尽可能多地从AAV中去除空衣壳和轻型衣壳。AEX和ZUC的组合使用能够获得99+％纯度的重型衣壳和部分衣壳，其中ZUC处理在AEX之后。就这一点而言，如果不将AEX用作第一步，则空衣壳和轻型衣壳使ZUC的容量过载，并导致ZUC处理期间的沉淀。另一方面，如果在没有ZUC的情况下使用AEX，则不会完全去除空衣壳和轻型衣壳。因此，本发明涉及纯化AAV重型和衣壳的方法，其纯度为至少85％(即，不含轻型衣壳和空衣壳)。在进一步的改进中，重型衣壳和部分衣壳的纯度为至少90％，重型衣壳和部分衣壳的纯度为99+％，或者组合物没有可检测到的轻型衣壳或空衣壳。
各种实施例的方法和过程包括：在AEX和ZUC处理之间经由切向流过滤(TFF)来处理组合物。该TFF步骤包括超滤和渗滤的步骤，其中AEX洗脱缓冲液被从组合物中去除，并以用于ZUC处理的包含梯度形成化合物的上样缓冲液置换。
在各种改进中，针对TFF上样的经AEX处理的组合物具有以下效价：至少0.1x10e17vg/平方米(m2)、0.1x 10e17 vg/m2、0.5x 10e17 vg/m2、1x 10e17 vg/m2、1.5x 10e17vg/m2、2x 10e17 vg/m2、2.5x 10e17 vg/m2、3x 10e17 vg/m2、3.5x 10e17 vg/m2、4x 10e17vg/m2、4.5x 10e17 vg/m2、5x 10e17 vg/m2、5.5x 10e17 vg/m2、6x 10e17 vg/m2、6.5x 10e17vg/m2、7x 10e17 vg/m2、7.5x 10e17 vg/m2、8x 10e17 vg/m2、8.5x 10e17 vg/m2、9x 10e17vg/m2、9.5x 10e17 vg/m2或10x 10e17 vg/m2。在其他改进中，效价为介于以上提供的任何两个效价之间的范围。
在各种改进中，TFF在以下跨膜压力(TMP)过滤经AEX处理的组合物：至少2磅每平方英寸(psi)(0.137895巴)、2psi(0.137895巴)、3psi(0.206843巴)、4psi(0.27579巴)、5psi(0.344738巴)、6psi(0.413685巴)、7psi(0.482633巴)、8psi(0.551581巴)、9psi(0.620528巴)、10psi(0.689476巴)、11psi(0.758423巴)、12psi(0.827371巴)、13psi(0.896318巴)、14psi(0.965266巴)、15psi(1.03421巴)、16psi(1.10316巴)、17psi(1.17211巴)、18psi(1.24106巴)、19psi(1.31巴)、20psi(1.37895巴)、21psi(1.4479巴)、22psi(1.51685巴)、23psi(1.58579巴)、24psi(1.65474巴)、25psi(1.72369巴)、26psi(1.79264巴)、27psi(1.86158巴)、28psi(1.93053巴)、29psi(1.99948巴)、30psi(2.06843巴)、31psi(2.13737巴)、32psi(2.20632巴)、33psi(2.27527巴)、34psi(2.34422巴)、35psi(2.41317巴)、36psi(2.48211巴)、37psi(2.55106巴)、38psi(2.62001巴)、39psi(2.68896巴)、40psi(2.7579巴)、41psi(2.82685巴)、42psi(2.8958巴)、43psi(2.96475巴)、44psi(3.03369巴)、45psi(3.10264巴)、46psi(3.17159巴)、47psi(3.24054巴)、48psi(3.30948巴)、49psi(3.37843巴)或50psi(3.44738巴)。在其他改进中，针对经AEX处理的组合物的TFF的TMP为介于以上提供的任何两个TMP之间的范围。
在各种改进中，TFF以以下横流或渗余物流来过滤经AEX处理的组合物：至少1L/min/m2、1L/min/m2、2L/min/m2、3L/min/m2、4L/min/m2、5L/min/m2、6L/min/m2、7L/min/m2、8L/min/m2、9L/min/m2、10L/min/m2、11L/min/m2、12L/min/m2、13L/min/m2、14L/min/m2或15L/min/m2。在其他改进中，针对经AEX处理的组合物的TFF的横流为介于以上提供的任何两个横流之间的范围。
在各种改进中，TFF将经AEX处理的组合物过滤至以下渗余物浓度：至少1x10e13vg/mL、1x 10e13 vg/mL、1.1x 10e13 vg/mL、1.2x 10e13 vg/mL、1.3x 10e13 vg/mL、1.4x 10e13 vg/mL、1.5x 10e13 vg/mL、1.6x 10e13 vg/mL、1.7x 10e13 vg/mL、1.8x10e13vg/mL、1.9x 10e13 vg/mL、2x 10e13 vg/mL、2.1x 10e13 vg/mL、2.2x 10e13 vg/mL、2.3x 10e13 vg/mL、2.4x 10e13 vg/mL、2.5x 10e13 vg/mL、2.6x 10e13 vg/mL、2.7x10e13vg/mL、2.8x 10e13 vg/mL、2.9x 10e13 vg/mL、3x 10e13 vg/mL、3.1x 10e13 vg/mL、3.2x 10e13 vg/mL、3.3x 10e13 vg/mL、3.4x 10e13 vg/mL、3.5x 10e13 vg/mL、3.6x10e13vg/mL、3.7x 10e13 vg/mL、3.8x 10e13 vg/mL、3.9x 10e13 vg/mL、4x 10e13 vg/mL、4.1x 10e13 vg/mL、4.2x 10e13 vg/mL、4.3x 10e13 vg/mL、4.4x 10e13 vg/mL、4.5x10e13vg/mL、4.6x 10e13 vg/mL、4.7x 10e13 vg/mL、4.8x 10e13 vg/mL、4.9x 10e13 vg/mL、5x 10e13 vg/mL、5.1x 10e13 vg/mL、5.2x 10e13 vg/mL、5.3x 10e13 vg/mL、5.4x10e13vg/mL、5.5x 10e13 vg/mL、5.6x 10e13 vg/mL、5.7x 10e13 vg/mL、5.8x 10e13 vg/mL、5.9x 10e13 vg/mL、6x 10e13 vg/mL、6.1x 10e13 vg/mL、6.2x 10e13 vg/mL、6.3x10e13vg/mL、6.4x 10e13 vg/mL、6.5x 10e13 vg/mL、6.6x 10e13 vg/mL、6.7x 10e13 vg/mL、6.8x 10e13 vg/mL、6.9x 10e13 vg/mL、7x 10e13 vg/mL、7.1x 10e13 vg/mL、7.2x10e13vg/mL、7.3x 10e13 vg/mL、7.4x 10e13 vg/mL、7.5x 10e13 vg/mL、7.6x 10e13 vg/mL、7.7x 10e13 vg/mL、7.8x 10e13 vg/mL、7.9x 10e13 vg/mL、8x 10e13 vg/mL、8.1x10e13vg/mL、8.2x 10e13 vg/mL、8.3x 10e13 vg/mL、8.4x 10e13 vg/mL、8.5x 10e13 vg/mL、8.6x 10e13 vg/mL、8.7x 10e13 vg/mL、8.8x 10e13 vg/mL、8.9x 10e13 vg/mL或9x10e13vg/mL。在其他改进中，渗余物浓度为介于以上提供的任何两个浓度之间的范围。
在各种改进中，TFF将具有以下渗滤体积的经AEX处理的组合物渗滤到TFF缓冲器：0次或更多次、1次或更多次、2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、10次或更多次、11次或更多次、12次或更多次、13次或更多次、14次或更多次或15次渗滤。
各种实施例的方法和过程包括：在ZUC处理后经由TFF来处理组合物。TFF包括超滤和渗滤的步骤。该TFF步骤包括超滤和渗滤的步骤，其中包含梯度形成化合物的ZUC缓冲液被从组合物中去除，并以AEX洗脱缓冲液置换，该洗脱缓冲液被从组合物中去除，并以包含药用载体的制剂缓冲液置换，以制备药物组合物。
在各种改进中，针对TFF上样的经ZUC处理的组合物具有以下效价：至少0.1x10e17vg/平方米(m2)、0.1x 10e17 vg/m2、0.5x 10e17 vg/m2、1x 10e17 vg/m2、1.5x 10e17vg/m2、2x 10e17 vg/m2、2.5x 10e17 vg/m2、3x 10e17 vg/m2、3.5x 10e17 vg/m2、4x 10e17vg/m2、4.5x 10e17 vg/m2、5x 10e17 vg/m2、5.5x 10e17 vg/m2、6x 10e17 vg/m2、6.5x 10e17vg/m2、7x 10e17 vg/m2、7.5x 10e17 vg/m2、8x 10e17 vg/m2、8.5x 10e17 vg/m2、9x 10e17vg/m2、9.5x 10e17 vg/m2或10x 10e17 vg/m2。在其他改进中，效价为介于以上提供的任何两个效价之间的范围。
在各种改进中，TFF在以下TMP过滤经ZUC处理的组合物：至少2psi(0.137895巴)、2psi(0.137895巴)、3psi(0.206843巴)、4psi(0.27579巴)、5psi(0.344738巴)、6psi(0.413685巴)、7psi(0.482633巴)、8psi(0.551581巴)、9psi(0.620528巴)、10psi(0.689476巴)、11psi(0.758423巴)、12psi(0.827371巴)、13psi(0.896318巴)、14psi(0.965266巴)、15psi(1.03421巴)、16psi(1.10316巴)、17psi(1.17211巴)、18psi(1.24106巴)、19psi(1.31巴)、20psi(1.37895巴)、21psi(1.4479巴)、22psi(1.51685巴)、23psi(1.58579巴)、24psi(1.65474巴)、25psi(1.72369巴)、26psi(1.79264巴)、27psi(1.86158巴)、28psi(1.93053巴)、29psi(1.99948巴)、30psi(2.06843巴)、31psi(2.13737巴)、32psi(2.20632巴)、33psi(2.27527巴)、34psi(2.34422巴)、35psi(2.41317巴)、36psi(2.48211巴)、37psi(2.55106巴)、38psi(2.62001巴)、39psi(2.68896巴)、40psi(2.7579巴)、41psi(2.82685巴)、42psi(2.8958巴)、43psi(2.96475巴)、44psi(3.03369巴)、45psi(3.10264巴)、46psi(3.17159巴)、47psi(3.24054巴)、48psi(3.30948巴)、49psi(3.37843巴)或50psi(3.44738巴)。在其他改进中，针对经ZUC处理的组合物的TFF的TMP为介于以上提供的任何两个TMP之间的范围。
在各种改进中，TFF以以下横流或渗余物流来过滤经ZUC处理的组合物：至少1L/min/m2、1L/min/m2、2L/min/m2、3L/min/m2、4L/min/m2、5L/min/m2、6L/min/m2、7L/min/m2、8L/min/m2、9L/min/m2、10L/min/m2、11L/min/m2、12L/min/m2、13L/min/m2、14L/min/m2或15L/min/m2。在其他改进中，针对经ZUC处理的组合物的TFF的横流为介于以上提供的任何两个横流之间的范围。
在各种改进中，TFF将经ZUC处理的组合物过滤至以下渗余物浓度：至少1x10e13vg/mL、1x 10e13 vg/mL、1.1x 10e13 vg/mL、1.2x 10e13 vg/mL、1.3x 10e13 vg/mL、1.4x 10e13 vg/mL、1.5x 10e13 vg/mL、1.6x 10e13 vg/mL、1.7x 10e13 vg/mL、1.8x10e13vg/mL、1.9x 10e13 vg/mL、2x 10e13 vg/mL、2.1x 10e13 vg/mL、2.2x 10e13 vg/mL、2.3x 10e13 vg/mL、2.4x 10e13 vg/mL、2.5x 10e13 vg/mL、2.6x 10e13 vg/mL、2.7x10e13vg/mL、2.8x 10e13 vg/mL、2.9x 10e13 vg/mL、3x 10e13 vg/mL、3.1x 10e13 vg/mL、3.2x 10e13 vg/mL、3.3x 10e13 vg/mL、3.4x 10e13 vg/mL、3.5x 10e13 vg/mL、3.6x10e13vg/mL、3.7x 10e13 vg/mL、3.8x 10e13 vg/mL、3.9x 10e13 vg/mL、4x 10e13 vg/mL、4.1x 10e13 vg/mL、4.2x 10e13 vg/mL、4.3x 10e13 vg/mL、4.4x 10e13 vg/mL、4.5x10e13vg/mL、4.6x 10e13 vg/mL、4.7x 10e13 vg/mL、4.8x 10e13 vg/mL、4.9x 10e13 vg/mL、5x 10e13 vg/mL、5.1x 10e13 vg/mL、5.2x 10e13 vg/mL、5.3x 10e13 vg/mL、5.4x10e13vg/mL、5.5x 10e13 vg/mL、5.6x 10e13 vg/mL、5.7x 10e13 vg/mL、5.8x 10e13 vg/mL、5.9x 10e13 vg/mL、6x 10e13 vg/mL、6.1x 10e13 vg/mL、6.2x 10e13 vg/mL、6.3x10e13vg/mL、6.4x 10e13 vg/mL、6.5x 10e13 vg/mL、6.6x 10e13 vg/mL、6.7x 10e13 vg/mL、6.8x 10e13 vg/mL、6.9x 10e13 vg/mL、7x 10e13 vg/mL、7.1x 10e13 vg/mL、7.2x10e13vg/mL、7.3x 10e13 vg/mL、7.4x 10e13 vg/mL、7.5x 10e13 vg/mL、7.6x 10e13 vg/mL、7.7x 10e13 vg/mL、7.8x 10e13 vg/mL、7.9x 10e13 vg/mL、8x 10e13 vg/mL、8.1x10e13vg/mL、8.2x 10e13 vg/mL、8.3x 10e13 vg/mL、8.4x 10e13 vg/mL、8.5x 10e13 vg/mL、8.6x 10e13 vg/mL、8.7x 10e13 vg/mL、8.8x 10e13 vg/mL、8.9x 10e13 vg/mL、9x10e13vg/mL、1x 10e14 vg/mL、1.1x 10e14 vg/mL、1.2x 10e14 vg/mL、1.3x 10e14 vg/mL、1.4x 10e14 vg/mL、1.5x 10e14 vg/mL、1.6x 10e14 vg/mL、1.7x 10e14 vg/mL、1.8x10e14vg/mL、1.9x 10e14 vg/mL或2x 10e14 vg/mL。在其他改进中，渗余物浓度为介于以上提供的任何两个浓度之间的范围。
在各种改进中，TFF将具有以下渗滤体积的经ZUC处理的组合物渗滤到到TFF缓冲器：0次或更多次、1次或更多次、2次或更多次、3次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、6次或更多次、7次或更多次、8次或更多次、9次或更多次、10次或更多次、11次或更多次、12次或更多次、13次或更多次、14次或更多次或15次渗滤。
定义
“阴离子交换色谱”或“AEX”是指以下过程：通过使混合物流过阴离子交换材料来从混合物中分离出分析物，阴离子交换材料表示携带共价结合的带正电荷的取代基的固定基质。“阴离子交换材料”通常作为阴离子交换色谱柱来提供。“阴离子交换材料”具有以下能力：将其未共价结合的抗衡离子交换为周围溶液(例如，混合物)中带类似电荷的结合配偶体或离子。根据带电基团/取代基的化学性质，“阴离子交换材料”可以附加地被分类为强离子交换材料或弱离子交换材料，这取决于共价结合的带电取代基的强度。强阴离子交换材料具有季铵基团，并且弱阴离子交换材料具有二乙基氨基乙基基团作为带电取代基。阴离子交换色谱包括以下步骤：用缓冲液平衡柱，使组合物流过柱，洗涤柱，以及从柱洗脱组合物。
“区带超速离心”或“ZUC”是指使用区带转子对组合物进行离心的过程。区带转子和区带超速离心系统的实例公开于美国专利第6,051,189号；第7,862,494号；第7,837,609号；第9,862,936号；以及第9,956,564号中，所有这些美国专利以其整体以引用方式并入本文。区带超速离心的一个实例是等密度梯度沉降，其依赖于分散在高密度溶液中的成分颗粒的漂浮属性中的差异作为用于成分分离的基础。
“切向流过滤”或“TFF”是指超滤过程，其中含有待浓缩衣壳的溶液沿超滤过滤膜的表面切向地流动。过滤膜具有带有一定截止值的孔径，该截止值防止衣壳随渗透液流过过滤膜。因此，衣壳为渗余物的一部分。切向流过滤还包括渗滤，其中原始溶液作为渗透液被去除，并用另一种溶液置换。例如，切向流过滤用用于区带超速离心处理的上样缓冲液置换来自阴离子交换色谱处理后的组合物的洗脱缓冲液。在另一个实例中，切向流过滤用包含药用载体的制剂缓冲液置换来自区带超速离心处理后的组合物的洗脱缓冲液，以制备药物组合物。
“药物产品”是指适用于受试者动物(包括人类和哺乳动物)中的药物用途的产品。例如，药物产品为rAAV病毒粒子。
“药物组合物”是指适用于受试者动物(包括人类和哺乳动物)中的药物用途的组合物。药物组合物包含药理学有效量的药物产品(诸如AAV病毒粒子)，并且还包含药用载体。药物组合物涵盖包含活性成分和构成载体的惰性成分，以及直接地或间接地由这些成分中的任何两种或更多种的组合、络合或聚集，或者由这些成分中的一种或多种的解离，或者由这些成分中的一种或多种的其他类型的反应或相互作用产生的任何产物的组合物。因此，药物组合物涵盖通过混合本文提供的病毒粒子以及药用载体制成的任何组合物。
“药用载体”是指标准药物赋形剂、媒介物、稀释剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体(诸如，例如但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、5％右旋糖水溶液)和乳状液(诸如油/水或水/油乳状液)以及各种类型的润湿剂和/或佐剂中的任何一者。合适的药物载体和制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences,第19版(Mack PublishingCo.,Easton,1995)中有所描述。待使用的药物载体可以取决于活性剂的预期施用方式。典型的施用方式包括：肠内(例如，口服)或肠胃外(例如，皮下、鞘内、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或局部、经皮或经粘膜施用)。“药用盐”为可以被调配成用于药物用途的草酸盐降解酶组合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨盐或有机胺盐。
“药用”或“药理学上可接受的”意指并非在生物学上或其他方面不合需要的材料，即，该材料可以施用于个体，而不引起任何不合需要的生物学效应，也不与其被包含在其中的组合物中的组分中的任一种以有害方式相互作用。
“受试者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类中的任何成员：人类；非人灵长类动物，诸如黑猩猩以及其他猿类和猴类；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。该术语不指示特定的年龄或性别。
“污染性病毒”是指在产生期间污染组合物的病毒。污染性病毒危害用于施用到受试者中的药物产品的安全性。污染性病毒的实例包括：杆状病毒，诸如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)、脑心肌炎病毒(EMC)、猪细小病毒(PPV)、呼肠孤病毒(Reo-3)、猴空泡病毒40(SV-40)、水疱性口炎病毒(VSV)；或逆转录病毒，诸如鼠白血病病毒(X-MuLV)。
腺相关病毒
治疗有效的rAAV颗粒包括US 9,504,762、WO 2019/222136和US 2019/0376081中公开的rAAV颗粒，其公开内容据此以其整体以引用方式并入本文。
“AAV”为腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒为具有被衣壳包封的基因组的单链DNA细小病毒。当前存在已被表征的十三种AAV血清型。AAV的一般信息和综述可见于例如Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,第1卷,第169-228页；和Berns,1990,Virology,第1743-1764页,Raven出版社,(纽约)中。然而，完全预期这些相同原理将适用于附加的AAV血清型，因为众所周知各种血清型在结构上和功能上、甚至在基因层面上非常紧密相关。(参见，例如，Blacklowe,1988,Parvoviruses and Human Disease,J.R.Pattison编的第165-174页；和Rose,Comprehensive Virology 3:1-61(1974))。例如，所有AAV血清型都明显表现出由同源rep基因介导的非常相似的复制属性；并且全都带有三种相关衣壳蛋白。通过异源双链分析来进一步表明相关性的程度，该异源双链分析揭示：血清型之间沿基因组长度的广泛交叉杂交；以及在末端存在对应于ITR的类似自退火片段。类似感染性模式还表明各血清型中的复制功能受到类似调节控制。
如本文所用，“AAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白以及被包裹的AAV基因组构成的感染性病毒颗粒。“重组AAV”或“rAAV”、“rAAV病毒粒子”或“rAAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”或“AAV病毒”是指由如本文所述的至少一个衣壳或Cap蛋白以及被包裹的rAAV载体基因组构成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，诸如要被递送到哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括rAAV载体的产生，因为此类载体被包含在rAAV载体颗粒内。不同实施例的rAAV病毒颗粒包括EP 2,698,163；EP 2,859,016；EP 3,044,231；EP 3,352,787；EP 3,491,008；EP 3,794,016；EP 3,794,112；US 9,393,323；US 9,447,168；US 9,504,762；US 9,764,045；US 10,124,041；US 10,463,718；US 10,512,675；US 10,709,796；US 10,792,336；US 2017/0087219；US 2019/0376081；US 2020/0024579；US 2020/0061161；US 2020/0069819；US 2020/0362368；WO 2015/038625；WO2017/053677；WO 2018/022608；WO 2019/217513；WO 2019/222132；WO 2019/222136；WO2020/232044；WO 2021/097157；WO 2021/183895；和WO 2021/202943中公开的AAV颗粒和rAAV颗粒，其公开内容据此以其整体以引用方式并入本文。
“衣壳”是指在其中封装rAAV载体基因组的结构。衣壳包括VP1蛋白或VP3蛋白，但更通常，VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白全部三种，如原生AAV中所发现。衣壳蛋白的序列决定了rAAV病毒粒子的血清型。rAAV病毒粒子包括衍生自多种AAV血清型的那些，包括：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、为AAV-rh.10(AAVrh10)、AAV-DJ(AAVDJ)、AAV-DJ8(AAVDJ8)、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle10-6、AAV Shuffle 10-8、AAVShuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型(true type)AAV(ttAAV)、UPENN AAV10、或日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_bat_YNM、AAV_bat_Brazil、AAV_mo.1、AAV_avian_DA-1、或AAV_mouse_NY1、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65或它们的任何变体(参见，例如，美国专利第8,318,480号的非天然混合血清型的其公开内容)。示例性衣壳也被提供于国际申请公开第WO 2018/022608号和第WO 2019/222136号中，这些国际申请公开以其整体并入本文。衣壳蛋白也可以为天然VP1、VP2和VP3的变体，包括突变蛋白、嵌合蛋白或改组蛋白。衣壳蛋白可以为rh.10或AAV的各种进化枝内的其他亚型的那些衣壳蛋白；各种进化枝和亚型公开于例如美国专利第7,906,111号中。在各种实施例中，AAV病毒颗粒的衣壳具有乙酰化或未乙酰化的VP1、VP2或VP3蛋白，其氨基酸序列具有与来自AAV-1(Genbank登录号AAD27757.1)、AAV-2(NCBI参考序列号YP_680426.1)、AAV-3(NCBI参考序列号NP_043941.1)、AAV-3B(Genbank登录号AAB95452.1)、AAV-4(NCBI参考序列号NP_044927.1)、AAV-5(NCBI参考序列号YP_068409.1)、AAV-6(Genbank登录号AAB95450.1)、AAV-7(NCBI参考序列号YP_077178.1)、AAV-8(NCBI参考序列号YP_077179.1)、AAV-9(Genbank登录号AAS99264.1)、AAV-10(Genbank登录号AAT46337.1)、AAV-11(Genbank登录号AAT46339.1)、AAV-12(Genbank登录号ABI16639.1)、AAV-13(Genbank登录号ABZ10812.1)的氨基酸序列或WO 2018/022608和WO 2019/222136中公开的任何氨基酸序列的一部分至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。不同血清型的AAV蛋白的构建和使用论述于Chao等人,Mol.Ther.2:619-623,2000；Davidson等人,PNAS 97:3428-3432,2000；Xiao等人,J.Virol.72:2224-2232,1998；Halbert等人,J.Virol.74:1524-1532,2000；Halbert等人,J.Virol.75:6615-6624,2001；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,2001中。
“AAV载体”、“rAAV载体”、“载体基因组”和“rAAV载体基因组”是指单链或双链核酸，其具有侧接以下项的AAV 5'反向末端重复(ITR)序列和AAV 3'ITR：可操作地连接到与AAV病毒基因组异源的转录调节元件(即，一个或多个启动子和/或增强子)的蛋白编码序列(优选地功能性治疗性蛋白编码序列；例如，FVIII、FIX和PAH)；以及任选地聚腺苷酸化序列和/或插入蛋白编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。术语“目标基因(GOI)”也可以指rAAV载体基因组。单链rAAV载体是指存在于AAV病毒颗粒的基因组中的核酸，并且可以是本文公开的核酸序列的有义链或反义链。此类单链核酸的尺寸以碱基来提供。双链rAAV载体是指存在于质粒的DNA中的核酸(例如，pUC19)或双链病毒(例如，杆状病毒)的基因组，其用于表达或转移rAAV载体核酸。此类双链核酸的尺寸以碱基对(bp)来提供。如本文所用，术语“ITR”是指在rAAV基因组的5'和3'端发现的现有技术识别区，其在顺式中用作DNA复制的起点并用作针对病毒基因组的包装信号。AAV ITR连同Rep编码区一起提供从核内体的高效切除和救援，以及内插在两个侧接ITR之间的核苷酸序列到宿主细胞基因组中的整合。某些AAV相关的ITR的序列由Yan等人,J.Virol.79(1):364-379(2005)公开。ITR也发现于“翻转(flip)”或“触发(flop)”构型中，在该构型中，在AA’反向重复序列(其形成发夹的臂)之间的序列存在于反向互补序列中(Wilmott,Patrick等人Human gene therapy methods30.6(2019):206-213)。不同血清型的AAV载体基因组的构建和使用论述于Chao等人,Mol.Ther.2:619-623,2000；Davidson等人,PNAS 97:3428-3432,2000；Xiao等人,J.Virol.72:2224-2232,1998；Halbert等人,J.Virol.74:1524-1532,2000；Halbert等人,J.Virol.75:6615-6624,2001；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,2001中。由于广泛构造可利用性和广泛表征，以下公开的例示性AAV载体基因组衍生自血清型2。
术语“治疗有效的AAV”、“治疗有效的AAV颗粒”、“治疗性AAV”、“治疗有效的rAAV”、“治疗有效的rAAV颗粒”、“治疗性rAAV”和“治疗有效的rAAV”是指重组AAV，其能够感染细胞，使得被感染的细胞表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。在这种程度上，治疗有效的rAAV颗粒可以包括：具有带有不同属性的衣壳或载体基因组(vg)的AAV颗粒。例如，治疗有效的rAAV颗粒可以具有带有不同转译后修饰的衣壳。在其他实例中，治疗有效的AAV颗粒可以含有vg，该vg具有不同的尺寸/长度、正或负链序列、不同的翻转/触发ITR构型翻转/触发、触发/翻转、翻转/翻转、触发/触发等)、不同数目的ITR(1个、2个、3个等)或截短。例如，被rAAV感染的细胞中具有5'端截短和3'端截短的核酸之间发生重叠同源重组，使得生成编码大蛋白的“完整”核酸，从而重建功能性全长基因。在其他实例中，具有5'端截短和3'端截短的互补核酸序列彼此相互作用，使得在第二链合成期间形成“完整”核酸。“完整”核酸编码大蛋白，从而重建功能性全长基因。治疗有效的rAAV颗粒也被称为重型衣壳、全衣壳或部分全衣壳。
术语“治疗有效量”意指：当被施用于患有或易患疾病、疾患或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防疾病、疾患或病症或延迟其症状发作的治疗剂的量。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案来施用。术语“治疗有效的”是指治疗剂的任何元件或组合物，其充分起作用，使得治疗有效量的治疗剂当被施用于患有或易患疾病、疾患和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防疾病、疾患和/或病症和/或延迟其症状发作。例如，如前所述，治疗有效的rAAV能够感染细胞，使得被感染的细胞表达(例如，通过转录和/或转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。治疗有效的rAAV具有载体基因组，该载体基因组由被治疗有效的rAAV感染的细胞使用以生成治疗有效的核苷酸序列，该治疗有效的核苷酸序列由被感染的细胞使用以通过各种方法(诸如复制、转录或转译)来生成目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。还应注意，“治疗剂”包括治疗有效的rAAV或治疗性rAAV病毒。
作为实例，“治疗性rAAV病毒”(其是指包含编码治疗性蛋白的异源多核苷酸的rAAV病毒粒子、rAAV病毒颗粒、rAAV载体颗粒或rAAV病毒)可以用于在体内置换或补充蛋白质。“治疗性蛋白”为多肽，其具有置换或补偿对应内源性蛋白的活性损失或降低的生物活性。例如，功能性苯丙氨酸羟化酶(PAH)为针对苯丙酮尿症(PKU)的治疗性蛋白。因此，例如，重组AAV PAH病毒可以用于用以治疗患有PKU的受试者的药剂。药剂可以通过静脉内(IV)施用来施用，并且药剂的施用导致PAH蛋白在受试者的血流中足以改变受试者中的神经递质代谢物或神经递质水平的表达。任选地，药剂还可以包含预防性和/或治疗性皮质类固醇，其用于预防和/或治疗与rAAV PAH病毒施用相关的任何肝毒性。包含预防性或治疗性皮质类固醇治疗的药剂可以包含至少5mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天、40mg/天、45mg/天、50mg/天、55mg/天、60mg/天或更多mg/天的皮质类固醇。包含预防性或治疗性皮质类固醇的药剂可以历经至少约3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间的连续时间段来施用。PKU疗法可任选地还包含酪氨酸补充剂。
“治疗无效的AAV颗粒”、“治疗无效的AAV”、“治疗无效的rAAV颗粒”或“治疗无效的rAAV”是指不能感染细胞的AAV颗粒，或者被治疗无效的rAAV颗粒感染的细胞不能表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。治疗无效的rAAV颗粒可导致每单位剂量衣壳的有效性降低，并可增加免疫应答的风险(由于需要增加被引入到患者中以获得有效量的重型/全/部分全衣壳的外源蛋白)。治疗无效的rAAV颗粒可以包括具有带有不同属性的衣壳或vg的AAV颗粒，并且被称为空衣壳或轻型衣壳。例如，空衣壳没有vg，或具有无法量化或无法检测到的vg浓度。在另一个实例中，轻型衣壳可以具有带有不表达目标基因的不完整表达盒的vg。在一个实例中，轻型衣壳的载体基因组具有一种或多种尺寸，该一种或多种尺寸不足以使被衣壳感染的细胞生成治疗有效的核苷酸序列。在另一个实例中，轻型衣壳的轻型衣壳载体基因组具有：一种或多种尺寸，该一种或多种尺寸减少由被衣壳感染的细胞进行的元件的表达；以及治疗有效的rAAV，该治疗有效的rAAV相对于由在相同条件下被感染但未被衣壳感染的细胞进行的元件的表达来编码元件。在不同的实例中，轻型衣壳的载体基因组的尺寸相比治疗有效的rAAV的载体基因组的尺寸为50％或更少、49％或更少、48％或更少、47％或更少、46％或更少、45％或更少、44％或更少、43％或更少、42％或更少、41％或更少、40％或更少、39％或更少、38％或更少、37％或更少、36％或更少、35％或更少、34％或更少、33％或更少、32％或更少、31％或更少、30％或更少、29％或更少、28％或更少、27％或更少、26％或更少、25％或更少、24％或更少、23％或更少、22％或更少、21％或更少、20％或更少、19％或更少、18％或更少、17％或更少、16％或更少、15％或更少、14％或更少、13％或更少、12％或更少、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或者1％或更少。空衣壳或轻型衣壳也可以具有可削弱衣壳感染性的不同衣壳属性。在另一个实例中，治疗无效的rAAV颗粒包括具有与颗粒相关的Rep蛋白的rAAV颗粒。与Rep蛋白相关的rAAV包括例如大Rep蛋白(例如，Rep78或Rep68蛋白)、小Rep蛋白(例如，Rep52或Rep40蛋白)或它们的组合。与Rep蛋白相关的rAAV还可以包括在不同的步骤(诸如AEX处理中的洗涤或再生步骤，或者ZUC处理期间的库后级分的分离)期间用衣壳去除的Rep蛋白。替代地，与Rep蛋白相关的rAAV也可以包括附着到衣壳的大Rep蛋白、小Rep蛋白或它们的组合。此类附着包括例如不同的键合stopes，诸如共价键合、离子键合、氢/静电键合或范德华力。在不同的实例中，当载体基因组的一部分没有被包封在衣壳内时，Rep蛋白可以附着到rAAV颗粒的不同部分，包括衣壳或载体基因组。这些衣壳可以没有载体基因组，或者具有部分/全载体基因组但不能感染细胞。在另一个实例中，治疗无效的rAAV颗粒包括具有脱去酰胺基的衣壳的rAAV颗粒。例如，脱去酰胺基的衣壳包括具有脱去酰胺基的VP1、VP2或VP3蛋白的衣壳。例如，VP1的N末端区中的保守NG(Asp-Gly)残基易受脱去酰胺基作用的影响。不同的脱去酰胺基的衣壳及其对感染性、转基因表达或效力的影响已由Giles,April R.等人"Deamidation ofAmino Acids on The Surface of Adeno-Associated Virus Capsids Leads to ChargeHeterogeneity and Altered Vector Function."Molecular Therapy 26.12(2018):2848-2862和Frederick,Amy等人"Engineered Capsids for Efficient Gene Deliveryto The Retina and Cornea"Human Gene Therapy 31.13-14(2020):756-774进行了描述。尽管不受任何特定理论的束缚，但重型衣壳、全衣壳或部分全衣壳在它们的电荷和/或密度方面不同于轻型衣壳或空衣壳。
“AAV产生杂质”是指可能损害治疗有效的rAAV功效的杂质。AAV产生杂质出现在rAAV制备期间，并且包括治疗无效的rAAV、rAAV颗粒的聚集体、外来高分子量DNA、小核苷酸、蛋白质、缓冲液组分等。
被并入到AAV衣壳中的转基因不受限制，并且可以是具有治疗意义的任何异源基因。转基因是与转基因侧接的载体序列异源的核酸序列，其编码目标多肽、蛋白质或其他产物。核酸编码序列与调节组分以允许转基因在宿主细胞中转录、转译和/或表达的方式可操作地连接。
转基因序列的组成将取决于所得载体的用途。例如，一类转基因序列包括报告序列，其在表达时产生可检测的信号。此类报告序列包括但不限于编码以下的DNA序列：b-内酰胺酶、b-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色萤光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合蛋白(包括例如CD2、CD4、CD8、流感血球凝集素蛋白和本领域中众所周知的其他存在或可通过常规方法产生针对其的高亲和力抗体的蛋白质)以及融合蛋白(包括与尤其来自血球凝集素或Myc的抗原标签域适当融合的膜结合蛋白)。
这些编码序列当与驱动其表达的调节元件相关联时提供可通过常规方法检测的信号，所述常规方法包括酶促、放射照相、比色、荧光或其他光谱分析、荧光激活细胞分选分析和免疫分析，包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫组织化学。例如，当标记序列是LacZ基因时，通过β-半乳糖苷酶活性测定来检测携带信号的载体的存在。当转基因是绿色荧光蛋白或荧光素酶时，携带信号的载体可以在光度计中通过颜色或光产生视觉测量。
然而，转基因通常是编码在生物学和医学上有用的产物(诸如蛋白质、多肽、RNA、酶、显性负性突变体或催化RNA)的非标记序列。需要的RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA、siRNA、小发夹RNA、反式剪接RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个实例是抑制或消除受治疗动物中靶核酸序列表达的序列。通常，合适的靶序列包括肿瘤靶和病毒性疾病。例如，此类靶标的实例参见以下在与免疫原有关的部分中鉴定的肿瘤靶标和病毒。
转基因可用于纠正或改善基因缺陷，所述基因缺陷可包括正常基因以低于正常水平表达的缺陷或功能基因产物不表达的缺陷。优选类型的转基因序列编码在宿主细胞中表达的治疗性蛋白或多肽。载体可以进一步包括多个转基因，例如，以纠正或减轻由多亚基蛋白引起的基因缺陷。在某些情况下，不同的转基因可以用于编码蛋白的每个亚基，或编码不同的肽或蛋白。当编码蛋白亚基的DNA的大小较大时，例如对于免疫球蛋白、血小板衍化生长因子或肌养蛋白蛋白，这是合乎需要的。为了使细胞产生多亚基蛋白，用含有不同亚基中的每一个的重组病毒感染细胞。替代地，蛋白的不同亚基可以由相同的转基因编码。在这种情况下，单个转基因包括编码亚基中的每一个的DNA，每个亚基的DNA由内部核酶进入位点(IRES)分开。这当编码亚基中的每一者的DNA的尺寸很小(例如，编码亚基和IRES的DNA的总尺寸小于五千碱基(Kb))时是可取的。还应注意，由于靶细胞中的部分基因组的重组，更长的基因组(即，>5(Kb))可能是可行的。作为IRES的替代方案，DNA可以由编码2A肽的序列分离，该2A肽在翻译后事件中自切割。参见，例如，Donnelly等人,J.Gen.Virol.,78(Pt 1):13-21(1997年1月)；Furler等人,Gene Ther.,8(11):864-873(2001年6月)；Klump等人,Gene Ther.,8(lO):811-817(2001年5月)。该2A肽显著小于IRES，使其在空间是限制因素时非常适合使用。更常见的是，当转基因较大由多个亚基组成，或者两个转基因被共递送时，携带所需转基因或亚基的rAAV被共施用，以允许它们在体内连环化(concatamerize)来形成单一载体基因组。在此类实施例中，第一AAV可以携带表达单个转基因的表达盒，并且第二AAV可以携带表达不同转基因的表达盒，用于在宿主细胞中共表达。然而，所选择的转基因可以编码任何生物活性产物或其他产物，例如研究所需的产物。
本领域技术人员可以容易地选择合适的转基因。转基因的选择不应被认为是对本发明的限制。转基因可为异源蛋白，并且该异源蛋白可为治疗性蛋白。示例性治疗性蛋白包括但不限于：血液因子(诸如β-球蛋白、血红蛋白、组织纤溶酶原活化剂)和凝血因子；集落刺激因子(CSF)；白介素，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生长因子，诸如角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、纤维母细胞生长因子(FGF，诸如碱性FGF和酸性FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、生长分化因子-9(GDF-9)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、肌肉抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养素、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-a.)、转化生长因子β(TGF-.b.)等；可溶性受体，诸如可溶性TNF-α.受体、可溶性VEGF受体、可溶性白介素受体(例如，可溶性IL-l受体及可溶性II型IL-l受体)、可溶性g/d T细胞受体、可溶性受体的配体结合片段等；酶类，诸如a-葡糖苷酶、伊米苷酶(imiglucarase)、b-葡糖脑苷脂酶和阿糖脑苷酶；酶活化剂，诸如组织纤溶酶原活化剂；趋化因子，诸如1P-10、通过干扰素-γ诱导的单核因子(Mig)、Groa/IL-8、RANTES、MIP-1a、MIP-1b.、MCP-1、PF-4等；血管生成剂，诸如血管内皮生长因子(VEGF，例如，VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2)、神经胶质瘤衍生生长因子、血管生成素、血管生成素-2；等；抗血管生成剂，诸如可溶性VEGF受体；蛋白质疫苗；神经活性肽，诸如神经生长因子(NGF)、缓激肽、胆囊收缩素、胃泌素、肠泌素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长抑素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾素、强啡肽、华法林、神经降压素、胃动素、促甲状腺素、神经肽Y、促黄体激素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、血管加压素、血管紧张素II、促甲状腺素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；溶栓剂；心房利尿钠肽；松弛素；胶质原纤维酸性蛋白；促卵泡激素(FSH)；人类α-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子(LIF)；组织因子，促黄体激素；巨噬细胞活化因子；肿瘤坏死因子(TNF)；嗜中性白细胞趋化因子(NCF)；金属蛋白酶的组织抑制剂；血管活性肠肽；血管生成素；促血管素(angiotropin)；纤维蛋白；水蛭素；IF-l受体拮抗剂；等。目标蛋白质的一些其他非限制性实例包括：睫状神经营养因子(CNTF)；大脑衍生神经营养因子(BDNF)；神经营养素3和4/5(NT-3和4/5)；神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)；芳族氨基酸脱羧酶(AADC)；血友病相关凝血蛋白，诸如因子VIII、因子IX、因子X；遗传性血管性水肿相关蛋白，诸如C1抑制剂；肌养蛋白、迷你肌养蛋白或微小肌养蛋白；溶酶体酸性脂肪酶；苯丙氨酸羟化酶(PAH)；糖原贮积病相关酶，诸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如，PHKA2)、葡萄糖转运蛋白(例如，GFUT2)、醛缩酶A、b-烯醇化酶和糖原合成酶；溶酶体酶(例如，β-N-乙酰基己糖胺酶A)；以及它们的任何变体。其他转基因包括：编码心肌肌球蛋白结合蛋白C、β-肌球蛋白重链、心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白I、肌球蛋白心室必需轻链1、肌球蛋白心室调节轻链2、心脏α肌动蛋白(ACTC)、α-原肌球蛋白、肌联蛋白、四个半LIM蛋白1的转基因；以及国际申请公开第WO 2014/170470号中的美国专利号中公开的其他转基因。AAV载体还包括可操作地连接到转基因的常规控制元件或序列，连接方式是允许在用质粒载体转染或被病毒感染的细胞中的其转录、转译和/或表达。如本文所用，“可操作地连接”的序列包括以下两者：与目标基因相邻的表达控制序列，以及以反式或在一定距离起作用来控制目标基因的表达控制序列。合适的基因包括Anguela等人“Entering the Modern Era of Gene Therapy”,Annual Rev.of Med.第70卷,第272-288页(2019)和Dunbar等人,“Gene Comes ofAge”,Science,第359卷,第6372期,eaan4672(2018)中论述的那些基因。
表达控制序列包括：适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA处理信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强转译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。本领域中已知并可采用大量表达控制序列，包括原生、组成性、诱导性和/或特定于组织的启动子。
组成性启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见，例如，Boshart等人,Cell,41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、b-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1启动子[Invitrogen]。诱导性启动子允许基因表达的调节，并且可以通过以下被调节：外源提供的化合物；环境因素，诸如温度；或特定生理状态(例如，急性期，细胞的特定分化状态)的存在，或仅存在于复制细胞中。诱导性启动子和诱导性系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad。许多其他系统已被描述，并且可以由本领域技术人员容易地选择。通过外源提供的化合物调节的诱导性启动子的实例包括：锌诱导性绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导性小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088]；蜕皮激素昆虫启动子[No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)]、四环素可抑制系统[Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)]、四环素诱导性系统[Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，还请参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)]、RU486诱导性系统[Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,GeneTher.,4:432-441(1997)]以及雷帕霉素诱导性系统[Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)]。在本上下文中可以有用的其他类型的诱导性启动子为通过特定生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)被调节的那些。
任选地，可以使用针对转基因的原生启动子。当希望转基因的表达应模仿原生表达时，原生启动子可以是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发展上、或以特定于组织的方式、或对特定转录刺激作出应答来被调节时，可以使用原生启动子。在另一实施例中，其他天然表达控制元件，诸如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列，也可用于模拟天然表达。
转基因还可以包括可操作地连接到特定于组织的启动子的基因。例如，如果需要在骨骼肌中表达，应该使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌养蛋白、肌肉肌酸激酶的基因的启动子，以及活性高于天然存在的启动子的合成肌肉启动子(参见Li等人,Nat.Biotech.,17:241-245(1999))。特定于组织的启动子的实例已知用于肝脏(白蛋白，Miyatake等人,J.Virol.,71:5124-32(1997)；B型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,Gene Ther.,3:1002-9(1996)；α-胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996))、骨骨钙蛋白(Stein等人,Mol.Biol.Rep.,24:185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等人,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996))、淋巴细胞(CD2，Hansal等人,J.Immunol.,161:1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)、神经元的(诸如特定于神经元的)烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因(Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991))和特定于神经元的vgf基因(Piccioli等人,Neuron,15:373-84(1995))等。
重组AAV可以用于在体外(例如，在细胞培养物中)产生目标蛋白质。例如，可以在用于在体外产生目标蛋白质的方法中使用AAV，其中该方法包括：提供包含编码异源蛋白的核苷酸序列的重组AAV；以及在细胞培养物中使重组AAV与细胞接触，由此重组AAV在细胞中表达目标蛋白质。编码目标蛋白质的核苷酸序列的尺寸可以变化。例如，核苷酸序列可以为至少约0.1千碱基(kb)、至少约0.2kb、至少约0.3kb、至少约0.4kb、至少约0.5kb、至少约0.6kb、至少约0.7kb、至少约0.8kb、至少约0.9kb、至少约1kb、至少约1.1kb、至少约1.2kb、至少约1.3kb、至少约1.4kb、至少约1.5kb、至少约1.6kb、至少约1.7kb、至少约1.8kb、至少约2.0kb、至少约2.2kb、至少约2.4kb、至少约2.6kb、至少约2.8kb、至少约3.0kb、至少约3.2kb、至少约3.4kb、至少约3.5kb长、至少约4.0kb长、至少约5.0kb长、至少约6.0kb长、至少约7.0kb长、至少约8.0kb长、至少约9.0kb长或至少约10.0kb长。在一些实施例中，核苷酸长度为至少约1.4kb。
重组AAV也可以用于在体内(例如，在诸如哺乳动物的动物中)产生目标蛋白质。一些实施例提供了一种用于在体内产生目标蛋白质的方法，其中该方法包括：提供包含编码目标蛋白质的核苷酸序列的重组AAV；以及向受试者施用重组AAV，由此重组AAV在受试者中表达目标蛋白质。在一些实施例中，受试者可以为非人类哺乳动物，例如，猴、狗、猫、小鼠或牛。编码目标蛋白质的核苷酸序列的尺寸可以变化。例如，核苷酸序列可以为至少约0.1kb、至少约0.2kb、至少约0.3kb、至少约0.4kb、至少约0.5kb、至少约0.6kb、至少约0.7kb、至少约0.8kb、至少约0.9kb、至少约1kb、至少约1.1kb、至少约1.2kb、至少约1.3kb、至少约1.4kb、至少约1.5kb、至少约1.6kb、至少约1.7kb、至少约1.8kb、至少约2.0kb、至少约2.2kb、至少约2.4kb、至少约2.6kb、至少约2.8kb、至少约3.0kb、至少约3.2kb、至少约3.4kb、至少约3.5kb长、至少约4.0kb长、至少约5.0kb长、至少约6.0kb长、至少约7.0kb长、至少约8.0kb长、至少约9.0kb长或至少约10.0kb长。在一些实施例中，核苷酸长度为至少约1.4kb。
尤其关注的是重组AAV表达一种或多种治疗性蛋白以治疗各种疾病或疾患的用途。疾病的非限制性实例包括癌症，诸如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤；以及自体免疫疾病，诸如多发性硬化症。癌的非限制性实例包括：食管癌；肝细胞癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌(各种组织)；膀胱癌，包括移行细胞癌；支气管癌；结肠癌；结肠直肠癌；胃癌；肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌；肾上腺皮质癌；甲状腺癌；胰腺癌；乳腺癌；卵巢癌；前列腺癌；腺癌；汗腺癌；皮脂腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；囊腺癌；髓样癌；肾细胞癌；导管原位癌或胆管癌；绒毛膜癌；精原细胞瘤；胚胎癌；威尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)；宫颈癌；子宫癌；睾丸癌；成骨癌(osteogenic carcinoma)；上皮癌(epithelieal carcinoma)；以及鼻咽癌。肉瘤的非限制性实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他软组织肉瘤。实体瘤的非限制性实例包括：神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、成神经细胞瘤以及成视网膜细胞瘤。白血病的非限制性实例包括：慢性骨髓增生性综合征；急性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞性白血病，包括B细胞CLL、T细胞CLL、前淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病；以及急性成淋巴细胞性白血病。淋巴瘤的实例包括但不限于B细胞淋巴瘤，诸如伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；等。
可以使用本文公开的rAAV和方法治疗的疾病的其他非限制性实例包括遗传性疾患，包括：镰状细胞贫血、囊性纤维化、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症1、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、苯丙酮尿症、粘多醣贮积症、糖原贮积病(GSD，例如，GSD类型I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV)、半乳糖血症、肌肉萎缩症(例如，杜氏肌肉萎缩症)、心肌病(例如，肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等)以及血友病(诸如A型血友病(经典血友病)和B型血友病(克雷司马斯病))、威尔逊氏病(Wilson’sdisease)、法布里病(Fabry Disease)、高雪氏症(Gaucher Disease)、遗传性血管性水肿(HAE)和α1抗胰蛋白酶缺乏症。另外，本文公开的rAAV和方法可以用于治疗其他疾患，这些疾患可以通过转基因在肝脏中的局部表达或通过来自肝脏或肝细胞的分泌性蛋白的表达来治疗。
在受试者(例如，受试者的血清)中表达的异源蛋白的量可以变化。例如，在一些实施例中，蛋白质在受试者的血清中表达的量可以为至少约9毫克(mg)/mL、至少约10mg/mL、至少约11mg/mL、至少约12mg/mL、至少约13mg/mL、至少约14mg/mL、至少约15mg/mL、至少约16mg/mL、至少约17mg/mL、至少约18mg/mL、至少约19mg/mL、至少约20mg/mL、至少约21mg/mL、至少约22mg/mL、至少约23mg/mL、至少约24mg/mL、至少约25mg/mL、至少约26mg/mL、至少约27mg/mL、至少约28mg/mL、至少约29mg/mL、至少约30mg/mL、至少约31mg/mL、至少约32mg/mL、至少约33mg/mL、至少约34mg/mL、至少约35mg/mL、至少约36mg/mL、至少约37mg/mL、至少约38mg/mL、至少约39mg/mL、至少约40mg/mL、至少约41mg/mL、至少约42mg/mL、至少约43mg/mL、至少约44mg/mL、至少约45mg/mL、至少约46mg/mL、至少约47mg/mL、至少约48mg/mL、至少约49mg/mL或至少约50mg/mL。目标蛋白质在受试者的血清中表达的量可以为约9pg/mL、约10pg/mL、约50pg/mL、约100pg/mL、约200pg/mL、约300pg/mL、约400pg/mL、约500pg/mL、约600pg/mL、约700pg/mL、约800pg/mL、约900pg/mL、约1000pg/mL、约1500pg/mL、约2000pg/mL、约2500pg/mL或介于这些值中的任何两者之间的范围。熟练技术人员将理解，治疗功效所需的目标蛋白质的表达水平可根据非限制性因素而变化，诸如特定的目标蛋白质和接受治疗的个体，并且蛋白质的有效量可易于由熟练技术人员使用本领域中已知的常规方法确定而无需过多的实验。
产生腺相关病毒的方法
本领域已知的任何方法都可以用于制备本公开的新型rAAV病毒颗粒。在一些实施例中，新型rAAV病毒颗粒在哺乳动物细胞(例如，HEK293)中产生。在一些实施例中，新型rAAV病毒颗粒在昆虫细胞(例如，Sf9)中产生。在一些实施例中，通过向宿主细胞提供包含转基因连同Rep和Cap基因的AAV基因组载体来制备AAV病毒颗粒。在一些实施例中，AAV基因组载体包含转基因、AAV Rep基因和AAV Cap基因。在一些实施例中，通过向宿主细胞提供两种或更多种载体来制备rAAV病毒颗粒。例如，在一些实施例中，将包含转基因的AAV基因组载体引入(例如，转染或转导)到具有包含AAV Rep基因和AAV Cap基因的载体(例如，质粒或杆状病毒)的细胞中。在一些实施例中，用包含转基因的AAV基因组载体、包含AAV Rep基因的载体(例如，质粒或杆状病毒)和包含AAV Cap基因的载体(例如，质粒或杆状病毒)转染或转导细胞。
制备AAV病毒颗粒的方法在例如美国专利第US6204059号、第US5756283号、第US6258595号、第US6261551号、第US6270996号、第US6281010号、第US6365394号、第US6475769号、第US6482634号、第US6485966号、第US6943019号、第US6953690号、第US7022519号、第US7238526号、第US7291498号和第US7491508号、第US5064764号、第US6194191号、第US6566118号、第US8137948号；或国际公开第WO1996039530号、第WO1998010088号、第WO1999014354号、第WO1999015685号、第WO1999047691号、第WO2000055342号、第WO2000075353号、第WO2001023597号、第WO2015191508号、第WO2019217513号、第WO2018022608号、第WO2019222136号、第WO2020232044号、第WO2019222132号；Methods In Molecular Biology,Richard编,Humana出版社,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,牛津大学出版社(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.,219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)中有所描述；其中的每一者的内容以其整体以引用方式并入本文。
细胞(诸如，例如，昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞(例如，人类细胞或非人类哺乳动物细胞))能够生成rAAV。例如，当被提供AAV辅助功能、AAV非辅助功能以及细胞用以生成AAV载体基因组的核苷酸序列时，细胞能够生成rAAV。在各种实施例中，AAV辅助功能、AAV非辅助功能以及细胞用以生成rAAV的核苷酸序列由载体提供，该载体例如用转染试剂经由转染，用其他重组病毒经由转导/感染，通过将核苷酸序列整合到细胞基因组中或通过其他方法被递送至细胞。此类细胞的实例包括哺乳动物细胞系，诸如HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19和MRC-5细胞。在其他实例中，使用的昆虫细胞系可以来自于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)，诸如Sf9、SF21、SF900+；果蝇细胞系；蚊子细胞系，例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系；家蚕细胞系，例如家蚕(Bombyx mori)细胞系；粉纹夜蛾(Trichopiusia ni)细胞系，诸如HighFive细胞；或鳞翅目细胞系，诸如黑巫婆飞蛾(Ascalapha odorata)细胞系。优选的昆虫细胞为来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括High Five、Sf9、Sf-RVN、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAml、BM-N、Ha2302、Hz2E5和Ao38。
如前所述，应理解术语“载体”是指当与适当控制元件相关时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何基因元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、杆粒、迷你质粒(例如，缺乏细菌元件的质粒)、狗骨头DNA(例如，最小闭合线性构造)、染色体、病毒、病毒粒子(例如，杆状病毒)等。如本文所用，“昆虫细胞相容载体”是指能够对昆虫或昆虫细胞进行产生性转化或转染的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。可以采用任何载体，只要其为昆虫细胞相容的。载体可以整合到昆虫细胞基因组中，但载体在昆虫细胞中的存在不需要是永久性的，并且也包括短暂的游离型载体。载体可以通过任何已知的方法被引入，例如通过对细胞的化学处理、电穿孔或感染。杆状病毒载体及其使用方法描述于上文所引用的关于昆虫细胞的分子工程化的参考文献中。
细胞从其生成rAAV载体基因组的载体可以含有启动子以及在启动子下游的限制位点，以允许插入编码一个或多个目标蛋白质的多核苷酸，其中启动子和限制位点位于5'AAV ITR下游和3'AAV ITR上游。载体还可以含有在限制位点下游和3'AAV ITR上游的转录后调节元件。病毒构造可以进一步包含插入在限制位点并且与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中多核苷酸包含目标蛋白质的编码区。
术语“AAV辅助”是指AAV衍生编码序列，其可以被表达以提供AAV基因产物，该AAV基因产物继而在转化中发挥作用以进行产生性AAV复制。因此，AAV辅助功能包括主要AAV开放阅读框架(ORF)rep和cap两者。Rep表达产物已被证明具有许多功能，其中包括：识别、结合和切割DNA复制的AAV起点；DNA解旋酶活性；以及从AAV(或其他异源)启动子的转录的调节。衣壳(cap)表达产物提供必需的封装功能。AAV辅助功能用于补充AAV载体基因组中缺失的反式AAV功能。
在各种实施例中，提供AAV辅助功能的载体包含编码衣壳蛋白或Rep蛋白的核苷酸序列。来自任何AAV血清型的cap基因和/或rep基因(包括但不限于：AAV1(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_002077.1)、AAV2(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_001401.2)、AAV3(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_001729.1)、AAV3B(NCBI参考序列号/Genbank登录号AF028705.1)、AAV4(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_001829.1)、AAV5(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_006152.1)、AAV6(NCBI参考序列号/Genbank登录号AF028704.1)、AAV7(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_006260.1)、AAV8(NCBI参考序列号/Genbank登录号NC_006261.1)、AAV9(NCBI参考序列号/Genbank登录号AX753250.1)、AAV10(NCBI参考序列号/Genbank登录号AY631965.1)、AAV11(NCBI参考序列号/Genbank登录号AY631966.1)、AAV12(NCBI参考序列号/Genbank登录号DQ813647.1)、AAV13(NCBI参考序列号/Genbank登录号EU285562.1)、为AAV-rh.10(AAVrh10)、AAV-DJ(AAVDJ)、AAV-DJ8(AAVDJ8)、AAV-1、AAV-2、AAV-2G9、AAV-3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV-5、AAV-6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV-7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle10-6、AAVShuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV10、或日本AAV10血清型、AAV_po.6、AAV_po.、AAV_po.5、AAV_LK03、AAV_ra.1、AAV_bat_YNM、AAV_bat_Brazil、AAV_mo.1、AAV_avian_DA-1、或AAV_mouse_NY1、Bba21、Bba26、Bba27、Bba29、Bba30、Bba31、Bba32、Bba33、Bba34、Bba35、Bba36、Bba37、Bba38、Bba41、Bba42、Bba43、Bba44、Bce14、Bce15、Bce16、Bce17、Bce18、Bce20、Bce35、Bce36、Bce39、Bce40、Bce41、Bce42、Bce43、Bce44、Bce45、Bce46、Bey20、Bey22、Bey23、Bma42、Bma43、Bpo1、Bpo2、Bpo3、Bpo4、Bpo6、Bpo8、Bpo13、Bpo18、Bpo20、Bpo23、Bpo24、Bpo27、Bpo28、Bpo29、Bpo33、Bpo35、Bpo36、Bpo37、Brh26、Brh27、Brh28、Brh29、Brh30、Brh31、Brh32、Brh33、Bfm17、Bfm18、Bfm20、Bfm21、Bfm24、Bfm25、Bfm27、Bfm32、Bfm33、Bfm34、Bfm35、AAV-rh10、AAV-rh39、AAV-rh43、AAVanc80L65、或它们的任何变体)都可以在本文中使用以产生重组AAV。示例性衣壳也提供于国际申请第WO 2018/022608号和第WO 2019/222136号中，其以其整体并入本文。以上提供的每个NCBI参考序列号或Genbank登录号也以引用方式并入本文。在一些实施例中，AAV cap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型3、血清型3B、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其变体的衣壳。
对于产生，具有AAV辅助功能的细胞产生足以形成衣壳的重组衣壳蛋白。这包括至少VP1蛋白和VP3蛋白，但更通常，VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白全部三种，如原生AAV中所发现。衣壳蛋白的序列决定了由宿主细胞产生的AAV病毒粒子的血清型。本发明中有用的衣壳包含衍生自许多AAV血清型(包括1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或混合血清型)的那些衣壳(参见，例如，美国专利第8318480号的非天然混合血清型的其公开内容)。衣壳蛋白也可以为天然VP1、VP2和VP3的变体，包括突变蛋白、嵌合蛋白或改组蛋白。衣壳蛋白可以为rh.10或AAV的各种进化枝内的其他亚型的那些衣壳蛋白；各种进化枝和亚型公开于例如美国专利第7,906,111号中。由于广泛构造可用性和广泛表征，下面公开的例示性AAV载体衍生自血清型2。不同血清型的AAV载体和AAV蛋白的构造和使用论述于Chao等人,Mol.Ther.2:619-623,2000；Davidson等人,PNAS 97:3428-3432,2000；Xiao等人,J.Virol.72:2224-2232,1998；Halbert等人,J.Virol.74:1524-1532,2000；Halbert等人,J.Virol.75:6615-6624,2001；和Auricchio等人,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,2001中。
在各种实施例中，编码VP蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列。在各种实施例中，编码Rep蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列，诸如真核启动子。例如，核苷酸序列可以可操作地连接到真核启动子。在另一个实例中，核苷酸序列可以可操作地连接到杆状病毒启动子，诸如多角体蛋白(Polh)启动子、ΔIE1启动子、p5启动子、p10启动子、p40启动子、金属硫蛋白启动子、39K启动子、p6.9启动子和orf46启动子。
对于产生，具有AAV辅助功能的细胞产生Rep蛋白以促进rAAV的产生。已发现，当在细胞中表达至少一种大Rep蛋白(Rep78或Rep68)和至少一种小Rep蛋白(Rep52和Rep40)时，可以产生感染性颗粒。在特定实施例中，Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的所有四种都被表达。替代地，Rep78和Rep52、Rep78和Rep40、Rep68和Rep52或者Rep68和Rep40被表达。以下实例说明了Rep78/Rep52组合的使用。Rep蛋白可以衍生自AAV-2或其他血清型。在各种实施例中，编码Rep蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列。在各种实施例中，编码Rep蛋白的核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列，诸如真核启动子。例如，核苷酸序列可以可操作地连接到真核启动子。在其他实例中，核苷酸序列可以可操作地连接到杆状病毒启动子，诸如多角体蛋白(Polh)启动子、ΔIE1启动子、p5启动子、p10启动子、p40启动子、金属硫蛋白启动子、39K启动子、p6.9启动子和orf46启动子。
具有AAV辅助功能的细胞也可以产生帮助组装衣壳的组装活化蛋白(AAP)。在各种实施例中，编码AAP的核苷酸序列可以可操作地连接到合适的表达控制序列。例如，核苷酸序列可以可操作地连接到真核启动子。在其他实例中，核苷酸序列可以可操作地连接到杆状病毒启动子，诸如多角体蛋白(Polh)启动子、ΔIE1启动子、p5启动子、p10启动子、p40启动子、金属硫蛋白启动子、39K启动子、p6.9启动子和orf46启动子。
术语“非AAV辅助功能”是指AAV进行其复制所依赖的非AAV衍生病毒和/或细胞功能。因此，该术语包括AAV复制所需的蛋白质和RNA，包括参与AAV基因转录活化、特定于阶段的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅助功能可衍生自已知辅助病毒(诸如腺病毒、疱疹病毒(除1型单纯疱疹病毒以外)及痘疮病毒)中的任一者。
术语“非AAV辅助功能载体”一般是指包含提供附属功能的核苷酸序列的核酸分子。可以将附属功能载体转染到合适的宿主细胞中，其中载体随后能够支持宿主细胞中的AAV病毒粒子产生。明确排除在该术语之外的是如存在于自然界中的感染性病毒颗粒，诸如腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或牛痘病毒颗粒。因此，附属功能载体可以呈质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。特别地，已证明腺病毒基因的全补体对于附属辅助功能是不需要的。例如，不能进行DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体已被证明允许进行AAV复制。Ito等人,(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi等人,(1971)Virology45:317。类似地，E2B区和E3区内的突变体已被证明支持AAV复制，表明E2B区和E3区可能不参与提供附属功能。Carter等人,(1983)Virology 126:505。然而，E1区中有缺陷或已删除E4区的腺病毒无法支持AAV复制。因此，E1A区和E4区可能是直接地或间接地进行AAV复制所必需的。Laughlin等人,(1982).J.Virol.41:868；Janik等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter等人,(1983)Virology 126:505。其他被表征的Ad突变体包含：E1B(Laughlin等人(1982)，同上；Janik等人(1981)，同上；Ostrove等人,(1980)Virology 104:502)；E2A(Handa等人,(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss等人,(1976)J.Virol.17:140；Myers等人,(1980)J.Virol.35:665；Jay等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2927；Myers等人,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter,I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen编,1990)中的Adeno-Associated Virus Helper Functions)；E3(Carter等人(1983)，同上；以及E4(Carter等人(1983)，同上；Carter(1995))。虽然对由具有E1B编码区中的突变的腺病毒提供的附属功能的研究产生了相互矛盾的结果(Samulski等人,(1988)J.Virol.62:206-210)，但最近报告对于AAV病毒粒子产生需要E1B55k，而不需要E1B19k。另外，国际公开WO 97/17458和Matshushita等人,(1998)Gene Therapy 5:938-945描述了编码各种Ad基因的附属功能载体。特别优选的附属功能载体包含：腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4 ORF6编码区、腺病毒E2A 72kD编码区、腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。此类载体在国际公开第WO 01/83797号中有所描述。
通常用于产生rAAV病毒颗粒的宿主细胞包括但不限于：HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系，如美国专利第US6156303号、第US5387484号、第US5741683号、第US5691176号和第US5688676号；美国专利申请公开第2002/0081721号以及国际专利公开第WO 2000047757号、第WO 2000024916号和第WO 1996017947号中所述，其中的每一者的内容以其整体以引用方式并入本文。在一些实施例中，HEK293细胞可以为HEK-293T细胞。可以用于产生AAV病毒颗粒的哺乳动物细胞的其他实例包括：A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2以及衍生自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。在一些实施例中，用于产生AAV病毒颗粒的宿主细胞为衍生自哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人类、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠。在一些实施例中，用于产生AAV病毒颗粒的宿主细胞为衍生自一定细胞类型的细胞，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。昆虫细胞用于表达异源蛋白的用途是有据可查的，如作为将核酸(诸如载体，例如，昆虫细胞相容载体)引入到此类细胞中的方法，以及保持培养中的此类细胞的方法。(参见，例如，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Richard编,Humana出版社,N J(1995)；O'Reilly等人,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORY MANUAL,牛津大学出版社(1994)；Samulski等人,J.Vir.(1989)第63卷,第3822-3828页；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA(1991)第88卷,第4646-4650页；Ruffing等人,J.Vir.(1992)第66卷,第6922-6930页；Kirnbauer等人,Vir.(1996)第219卷,第37-44页；Zhao等人,Vir.(2000)第272卷,第382-393页；以及美国专利第6,204,059号)。可以使用的昆虫细胞系的实例可以衍生自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)，诸如Sf9、Sf21、Sf900+；果蝇细胞系；蚊子细胞系，例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系；家蚕细胞系，例如，家蚕(Bombyxmori)细胞系；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系，诸如High Five细胞；或鳞翅目细胞系，诸如黑巫婆飞蛾(Ascalapha odorata)细胞系。例示性昆虫细胞为来自易受杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括High Five、Sf9、Sf-RVN、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及Ao38。
在一些实施例中，新型rAAV病毒颗粒在昆虫细胞中产生。培养中的昆虫细胞的生长条件以及培养中的昆虫细胞中的异源产物的产生在本领域中是众所周知的，参见美国专利第6,204,059号，其内容以其整体以引用方式并入本文。
在各种实施例中，提供具有用于rAAV产生的载体的昆虫细胞。具有用于rAAV产生的核苷酸序列的重组杆状病毒(rBV)可以用于将这些核苷酸序列递送到用于rAAV产生的昆虫细胞。杆状病毒(诸如rBV)为节肢动物的包膜DNA病毒，其中的两个成员为用于在细胞培养物中产生重组蛋白的众所周知的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80kbp至200kbp)，其可以经工程改造以允许将大基因组内含物递送到特定细胞。用作载体的病毒通常为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus)(AcMNPV)或家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus)(Bm-NPV)(Katou,Yasuhiro等人,Virology 404.2(2010):204-214.)。杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。特别地，异源基因在昆虫中的表达可以如例如美国专利第4,745,051号；Friesen,P.D.,和L.K.Miller.,Current topicsin microbiology and immunology 131(1986):31-49；EP 127839；EP 155476；Vlak,JustM.等人,Journal of General Virology 69.4(1988):765-776；Miller,Lois K.,AnnualReviews in Microbiology 42.1(1988):177-199；Carbonell,Luis F.等人,Gene 73.2(1988):409-418；Maeda,Susumu等人,Nature 315.6020(1985):592-594；Lebacq-Verheyden,ANNE-MARIE等人,Molecular and cellular biology 8.8(1988):3129-3135；Smith,Gale E.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences 82.24(1985):8404-8408；Miyajima,Atsushi等人,Gene 58.2-3(1987):273-281；以及Martin,Brian M.等人,DNA 7.2(1988):99-106中所述来实现。可以用于蛋白质产生的大量杆状病毒毒株和变体以及对应的容许昆虫宿主细胞在Luckow,Verne A.和Max D.Summers.,Bio/technology 6.1(1988):47-55；Miller等人(1986)Genetic Engineering,Principles andMethods,第8卷(J.Setlow和A.Hollaender编),Plenum出版社,纽约,第277-298页,1986)；Maeda,Susumu等人,Nature 315.6020(1985):592-594；以及McKenna,Kevin A.,HuazhuHong和Robert R.Granados.,Journal ofInvertebrate Pathology 71.1(1998):82-90中有所描述。
供体载体和杆粒或转移载体和线性化杆状病毒DNA用于生成重组杆状病毒(rBV)。杆粒在细菌(诸如大肠杆菌(Escherichia coli))中繁殖为大型质粒。当被转染到昆虫细胞中时，杆粒生成杆状病毒。传统杆状病毒生成(例如，如Invitrogen的Bac-to-Bac系统中的一种)通过在大肠杆菌(E.coli)中的特定于位点的转位来生成重组杆状病毒。高分子量杆粒DNA随后被分离并被转染到Sf9或Sf21细胞中，重组杆状病毒从该细胞中被分离并被扩增。
昆虫细胞可以分别用具有rAAV载体基因组的核苷酸序列或具有提供AAV辅助功能以生成rBV的核苷酸序列的杆粒被转染。这些不同rBV随后用于共感染初始昆虫细胞以生成rAAV。
在各种实施例中，转染后的细胞在转染后被培养达约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、约144小时、约168小时、约192小时、约216小时、约240小时或介于这些两个时间点中的任一者之间的时间。
如前所述，治疗有效的rAAV颗粒的增加的浓度是每次都可以通过ZUC处理的经济上可行的数量。在一个实例中，各种实施例的过程可以允许产生更大浓度的rAAV，使得更大的细胞培养物体积可以用于rAAV产生。例如，能够产生rAAV的宿主细胞可以按以下体积来培养：至少5毫升(mL)、至少10mL、至少20mL、至少50mL、至少100mL、至少500mL、至少1升(L)、至少10L、至少50L、至少100L、至少250L、至少500L、至少1000L、至少1500L、至少2000L或至少2500L。培养也可以发生在旋转管、摇瓶或生物反应器中。
净化：为了从培养的宿主细胞中去除rAAV病毒粒子，可以采用多种方法。在一个实例中，细胞被裂解并且病毒可以被纯化。替代地，将病毒表达到上清液中。rAAV病毒粒子可以通过离心、过滤、切向流过滤、色谱或它们的组合来被纯化。
在此类方法的一个实例中，昆虫细胞被重新悬浮在裂解缓冲液(20mM Tris-Cl pH＝8、150mM NaCl、0.5％脱氧氯酸盐)中，并使用玻璃珠被裂解。将裂解物用Benzonase(Sigma,St.Louis,Mo.)处理并以4000g离心，并将上清液在Streamline HE柱(Pharmacia)、Phenyl Sepharose和POROS HE上进行色谱分析(Potter等人,Methods Enzymol 346:413-30,2002)。
包裹性(Encapsidation)/感染性：为了评定载体基因组包裹性，经纯化的AAV病毒粒子可以用核酸酶处理，以降解任何未被包裹的DNA。被包裹的DNA将免受核酸酶的影响，并且因此在核酸酶处理后可被检测到。以下实例展示了如通过Southern印迹确定的在Benzonase处理后存活的载体基因组。
为了评定病毒粒子性能，将经纯化的rAAV病毒粒子用于感染培养中的HEK293细胞或注射到小鼠骨骼肌中，以通过针对表达GFP的细胞进行评分来评定其感染性。在有效负载基因无法通过光学方式被访问的情况下，可以采用其他检测技术(诸如蛋白印迹、免疫测定、PCR或逆转录PCR或功能测定)来评定感染性。在美国专利公开第2015/0071883号的实例3中，将免疫测定和凝血测定用于评定利用表达因子VIII的rAAV进行的Rag2小鼠的转导。因此，感染性的量度可以因有效负载基因和模型系统而异。
通常，病毒粒子具有感染性，因此在含有107(10^7、1E07)个病毒基因组的病毒粒子溶液存在下孵育HEK293细胞后，外源基因被细胞以可检测到的量表达。替代地，病毒粒子具有感染性，因此在含有10^6个病毒基因组的病毒粒子溶液存在下孵育HEK293细胞后，外源基因被细胞以可检测到的量表达。
制剂：rAAV的各种制剂在本领域中是已知的。经纯化的rAAV可以用任选的缓冲液、载体和/或稳定剂稀释或透析到盐水中。已知的AAV制剂包括使用泊洛沙姆(polaxamer)、PEG、糖、多元醇或多价离子盐的那些制剂。参见，例如，美国专利第8,852,607号和第7,704,721号。示例性制剂为1.38mg/ml磷酸二氢钠单水合物、1.42mg/ml磷酸氢二钠(干燥)、8.18mg/ml氯化钠、20mg/ml甘露醇和2.0mg/ml泊洛沙姆188(Pluronic F-68)，pH 7.4。
在其他实例中，本发明的rAAV药物制剂包含一种或多种药用赋形剂，以提供具有对于储存和/或向受试者施用以进行治疗而言的有利属性的制剂。在某些实施例中，本发明的药物制剂能够在<65℃储存达至少2周、优选地至少4周、更优选地至少6周并且还更优选地至少约8周的时间段，而没有可检测到的稳定性变化。就这一点而言，术语“稳定的”意指存在于制剂中的rAAV在储存期间基本上保持其物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性。在本发明的某些实施例中，药物制剂中存在的重组AAV病毒在-65℃储存达确定的时间段期间保持在人类患者中的其生物活性的至少约80％，更优选地在人类患者中的其生物活性的至少约85％、90％、95％、98％或99％。
在各种实例中，包含rAAV的制剂进一步包含一种或多种缓冲剂。其他缓冲剂公开于Sek,D."Breaking old habits:moving away from commonly used buffers inpharmaceuticals."European Pharmaceutical Review 3(2012)中。例如，本发明的制剂包含浓度为约0.1mg/ml至约3mg/ml、约0.5mg/ml至约2.5mg/ml、约1mg/ml至约2mg/ml或约1.4mg/ml至约1.6mg/ml的磷酸氢二钠。在特别优选的实施例中，本发明的rAAV制剂包含约1.42mg/ml的磷酸氢二钠(干燥)。可以用于本发明的rAAV制剂中的另一种缓冲剂为磷酸二氢钠单水合物，其在一些实施例中以约0.1mg/ml至约3mg/ml、约0.5mg/ml至约2.5mg/ml、约1mg/ml至约2mg/ml或约1.3mg/ml至约1.5mg/ml的浓度进行使用。在特别优选的实施例中，本发明的rAAV制剂包含约1.38mg/ml的磷酸二氢钠单水合物。在本发明的还更特别优选的实施例中，本发明的rAAV制剂包含约1.42mg/ml的磷酸氢二钠和约1.38mg/ml的磷酸二氢钠单水合物。
在另一方面，本发明的rAAV制剂可以包含一种或多种等渗剂，诸如氯化钠，优选地浓度为约1mg/ml至约20mg/ml，例如，约1mg/ml至约10mg/ml、约5mg/ml至约15mg/ml或约8mg/ml至约20mg/ml。在特别优选的实施例中，本发明的制剂包含约8.18mg/ml氯化钠。本领域中已知的其他缓冲剂和等渗剂是合适的，并且可以常规地被用于本公开的制剂中。
在另一方面，本发明的rAAV制剂可以包含一种或多种填充剂。示例性填充剂包括但不限于甘露醇、蔗糖、葡聚糖、乳糖、海藻糖和聚维酮(PVP K24)。在某些优选的实施例中，本发明的制剂包含甘露醇，其存在的量可以为从约5mg/ml到约40mg/ml、或从约10mg/ml到约30mg/ml、或从约15mg/ml到约25mg/ml。在特别优选的实施例中，甘露醇以约20mg/ml的浓度存在。
在又另一方面，本发明的rAAV制剂可以包含一种或多种表面活性剂，其可以为非离子型表面活性剂。
在考虑以下例示性实例后将理解本公开的其他方面和优点。
本发明的示例性实施例
实施例1-轻型衣壳对感染性和转基因表达的影响
如前所述，治疗有效的rAAV颗粒的生产并非是完全高效的过程。AAV产生导致治疗有效的rAAV颗粒、治疗无效的rAAV颗粒和产生杂质(例如，低分子量DNA和小核苷酸、外来高分子量DNA、缓冲液组分等)的混合物。治疗有效的rAAV颗粒能够感染细胞，使得受感染的细胞表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。在这种程度上，治疗有效的rAAV颗粒可以包括具有带有不同属性的衣壳或vg的AAV颗粒。例如，治疗有效的rAAV颗粒可以具有带有不同转译后修饰的衣壳。在其他实例中，治疗有效的rAAV颗粒可以具有vg，该vg具有不同的尺寸/长度、正或负链序列、不同的翻转/触发反向末端重复序列(ITR)构型、不同数目的ITR或截短。治疗有效的rAAV颗粒也被称为“重型”、“全”或“部分”衣壳。治疗无效的rAAV颗粒不能感染细胞，或者被治疗无效的rAAV颗粒感染的细胞不能表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。治疗无效的rAAV颗粒可导致每单位剂量衣壳的有效性降低，并可增加免疫应答的风险(由于需要增加数目的被引入到患者中以获得有效量的重型/全衣壳的外源蛋白)。治疗无效的rAAV颗粒可以包括具有带有不同属性的衣壳或vg的AAV颗粒，并且被称为空衣壳或轻型衣壳。例如，空衣壳没有vg，或具有无法量化的vg浓度。空衣壳或轻型衣壳也可以具有不同的衣壳属性。尽管不受任何特定理论的束缚，但重型/全/部分全衣壳在它们的电荷和/或密度方面不同于轻型衣壳或空衣壳。
图1A和图1B示出了使用分析超速离心的AAV制备的示例性颗粒廓线。如图1B所示，可以看出可能存在一些低分子量杂质，但主要的杂质为约4％的空衣壳和约6％至7％的聚集体。来自制剂的治疗有效的衣壳包括约62％的全/重型衣壳和约25％的部分全/部分衣壳。
图2A、图2B、图3A和图3B示出了轻型颗粒的存在对目标基因的转基因表达的影响。HepG2细胞感染了治疗有效的rAAV颗粒(即，重型衣壳)，其具有针对目标基因#1(GOI1)的转基因以及已知浓度的治疗无效的rAAV颗粒(即，轻型衣壳)。如图2A、图2B、图3A和图3B所示，增加轻型衣壳的浓度减少了HepG2细胞中的转基因表达。图3B突显了当轻型衣壳占感染细胞的衣壳的约50％时，相对效力降低了约48％。因此，轻型颗粒的存在减少了HepG2细胞中的重型颗粒的转基因表达和效力。
图4、图5A、图5B、图6A、图6B、图7、图8A、图8B、图9A、图9B、图10、图11A、图11B、图11C、图11D、图12A、图12B示出了轻型衣壳可以结合HepG2细胞，可以进入HepG2细胞，并且可以进入HepG2细胞的细胞核。对于该项研究，重型衣壳用显示绿色荧光的Cyanine 3(Cy3)染料或显示红色荧光的Cyanine 5(Cy5)染料来标记。轻型衣壳也用Cy3或Cy5来标记。具体地，标记使Cy3/Cy5 NHS酯与重型/轻型衣壳上的伯胺反应以产生稳定的键。
将标记的颗粒加入到HepG2细胞。具体地，在AAV转导之前，将HepG2细胞接种在细胞成像板上。将细胞与标记的AAV在4℃孵育达1小时，以结合细胞表面受体并通过抑制内吞作用来防止内化。将细胞在37℃孵育达4小时至8小时，以允许重型衣壳和轻型衣壳转导HepG2细胞。然后将细胞用CMEM和PBS洗涤，用4％PFA固定达10分钟，再用PBS洗涤三次，用抗褪色剂安置用于共聚焦显微镜。
图4示出了未示出强信号的不含Cyanine染料的对照，而图5A和图5B分别示出了与HepG2细胞表面受体结合的以Cy3标记和以Cy5标记的轻型颗粒。
图6A和图6B示出了在37℃孵育8小时后，在HepG2细胞的细胞核中检测到以Cy3标记(左图)和以Cy5标记(右图)的轻型颗粒。
图7示出了与HepG2细胞表面受体结合的以Cy5标记的重型颗粒。
图8A、图8B、图9A和图9B示出了以Cy3标记的轻型颗粒和以Cy5标记的重型颗粒两者都结合HepG2细胞表面受体。
图10示出了在37℃孵育8小时后，在HepG2细胞的细胞核中检测到以Cy3标记的轻型颗粒和以Cy5标记的重型颗粒。
图11A、图11B、图11C和图11D示出了在4℃1小时后，以Cy3标记的轻型颗粒和以Cy5标记的重型颗粒两者都结合HepG2细胞表面受体。图11A、图11B和图11C处于4℃1小时，其中红色为以Cy5标记的重型颗粒，并且绿色为以C3标记的轻型颗粒。图11D示出了在37℃8小时后，结合在HepG2细胞的细胞核中的重型和轻型颗粒。
如上所述，图11D示出了在37℃8小时后，结合在HepG2细胞的细胞核中的重型和轻型颗粒。图11D还示出了在37℃孵育8小时后，在HepG2细胞的细胞核中检测到以Cy3标记的轻型颗粒和以Cy5标记的重型颗粒。如图12A和图12B所示，突显的部分(参见框和箭头)示出了Cy3染料和Cy5染料的共定位，这可以表明重型颗粒和轻型颗粒正在使用相同的细胞机制。这种共定位可以解释由轻型衣壳的存在引起的降低的功效，并且进一步证明了期望获得不含或基本上不含(即，大于99％，优选地大于99.5％不含)轻型衣壳的AAV制剂。
鉴于轻型衣壳和空衣壳的负面影响，去除它们对于提高AAV基因治疗的功效很重要。
实施例2-编码目标基因#1、目标基因#2和目标基因#3的AAV衣壳的纯化
以下实例公开了利用GOI1、目标基因#2(GOI2)或目标基因#3(GOI3)的rAAV产生。GOI1具有小于5.5Kb的多核苷酸尺寸。GOI2为尺寸小于6Kb的多核苷酸。GOI3具有小于5.5Kb的多核苷酸尺寸，并且不同于GOI1。具有GOI1和GOI2的rAAV用AAV5衣壳被假型化。具有GOI3的rAAV用AAV9衣壳被假型化。
所有下游柱和TFF操作都在环境温度被执行。如果需要延长保持时间，则将中间库保持在冷却的温度。
含有带有GOI1、GOI2或GO3的AAV衣壳的无细胞培养液(“收获库材料”)被用作起始材料。
如图13所示，收获库材料的处理10包括：从收获库材料中纯化100衣壳，以及经由AEX 200、TFF 300、ZUC 400、TFF 500来处理衣壳，并且制备最终衣壳制剂600。含有用AAV5衣壳假型化的GOI1的rAAV的收获库材料的处理11包括：从收获库材料中纯化110衣壳，以及经由AEX 210、TFF 310、ZUC 410、TFF 510来处理衣壳，并且制备最终衣壳制剂610。含有用AAV5衣壳假型化的GOI2的rAAV的收获库材料的处理12包括：从收获库材料中纯化120衣壳，以及经由AEX 220、TFF 320、ZUC 420、TFF 520来处理衣壳，并且制备最终衣壳制剂620。含有用AAV9衣壳假型化的GOI3的rAAV的收获库材料的处理13包括：从收获库材料中纯化130衣壳，以及经由AEX 230、TFF 330、ZUC 430、TFF 530来处理衣壳，并且制备最终衣壳制剂620。
在图13的步骤100、101、102、103中，rAAV从收获库材料中被纯化，以用于后续的AEX和ZUC处理。例如，纯化步骤110、120包括：使用AVB免疫色谱来处理GOI1和GO2的收获库材料，以用于AAV5衣壳的亲和纯化。在另一个实例中，纯化步骤130包括：使用柱免疫色谱来处理GOI3的收获库材料，以用于AAV9衣壳的亲和纯化。经亲和柱纯化的AAV衣壳被用于AEX和ZUC处理。
如图14以及图13的步骤200所示，使用AEX柱(聚合的强或弱阴离子交换柱(AEX柱))，使具有重型、部分、轻型和空AAV衣壳的混合物的分离的衣壳经受阴离子交换色谱(AEX)。AEX步骤200包括以下步骤：平衡柱201，用收获库材料上样柱202，洗涤柱以去除杂质203，以及从AEX柱洗脱和分离AAV衣壳204。在针对GOI1的实例中，AEX步骤210包括以下步骤：平衡柱211，用收获库材料上样柱212，洗涤柱以去除杂质213，以及从AEX柱洗脱和分离AAV衣壳214。在针对GOI2的实例中，AEX步骤220包括以下步骤：平衡柱221，用收获库材料上样柱222，洗涤柱以去除杂质223，以及从AEX柱洗脱和分离AAV衣壳224。在针对GOI3的实例中，AEX步骤230包括以下步骤：平衡柱231，用收获库材料上样柱232，洗涤柱以去除杂质233，以及从AEX柱洗脱和分离AAV衣壳234。
分析了以下衣壳在不同pH的zeta电位：针对GOI1、GOI2和GOI3的重型衣壳；在AEX洗脱204、214、224、234后提取的轻型衣壳；以及来自步骤400、410、420、430的经ZUC处理的衣壳。如图18所示，对于GOI2，发现存在可以使用AEX被去除的轻型衣壳群，因为这些轻型衣壳的净负电荷低于重型衣壳。该轻型衣壳群也无法通过一般的260nm/280nm吸光度测量被检测到，并且需要更精确的测量(即尺寸排阻色谱)来进行检测。
用于AEX分离的缓冲液和溶液在本领域中是已知的。此类缓冲液的实例包括：电导率为≤1mS/cm或1mS/cm至7mS/cm并且pH范围为从7到10的AEX平衡缓冲液，电导率范围为从4mS/cm到7mS/cm并且pH范围为从7到9的AEX洗涤缓冲液，电导率范围为从5mS/cm到10mS/cm并且pH范围为从7到9的AEX洗脱缓冲液，电导率范围为从53.2mS/cm到70.1mS/cm的AEX剥离缓冲液，以及pH范围为从6到9的AEX洗脱库调整缓冲液。
以下参数用于AEX柱：负载容量范围为从0.1x 10e16 vg/L到10x 10e16 vg/L；具有强阴离子交换树脂的柱，并且床高范围为从7cm到15cm；以及流速范围为从50cm/hr到160cm/hr。
在AEX处理之前和之后，用0.22微米(μm)过滤器过滤分离的衣壳。
在AEX分离步骤之前，利用调整缓冲液将分离的衣壳的pH调整至范围为从7到9的pH，并且电导率≤3mS/cm。
用一定体积的AEX平衡缓冲液来制备AEX柱。检查柱后pH和电导率，以确保pH范围为从7到10并且电导率为≤1mS/cm或1mS/cm至7mS/cm。
施加上样库，并且用AEX平衡缓冲液和AEX洗涤缓冲液来洗涤柱。人工观察柱，以确定洗脱的AEX洗涤缓冲液的吸光度何时达到A260＝A280。如果未观察到A260＝A280交叉，则将附加的AEX洗涤缓冲液加入到AEX柱。
通过在AEX柱处加入一定体积的AEX洗脱缓冲液来实现AEX洗脱。
对针对GOI1、GOI2和GOI3的AEX处理200、210、220、230的A260和A280廓线进行可视化和分析。图25A示出了在洗涤、洗脱和剥离步骤期间针对用于GOI2的rAAV制备的AEX处理的A260和A280廓线。
用一定体积的AEX洗脱库调整缓冲液将洗脱库的pH调节为6至9。
一般而言，可以以适用于测量相应的vg和衣壳的任何方式来评估vg和衣壳(cp)效价。例如，定量聚合酶链式反应(qPCR)可以用于测量vg效价，并且酶联免疫吸附测定(ELISA)可以用于测量Cp效价。替代地，SEC(尺寸排阻色谱)-HPLC可以用于测量vg和cp效价。另外，RP(反相)-HPLC测定可以用于评估过程参数对VP比率的潜在影响。
使用标准qPCR系统(诸如Applied Biosystems 7500快速即时PCR系统)，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)，qPCR可以用于vg量化。替代地，微滴式数字PCR(ddPCR)可以用于Vg量化。引子和探针可经设计以靶向AAV的DNA，在其在PCR期间积聚时允许对其定量。ddPCR的实例在Pasi,K.John等人"Multiyear Follow-Up of AAV5-hFVIII-SQ Gene Therapy forHemophilia A."New England Journal ofMedicine 382.1(2020):29-40；Regan,John F.等人"A Rapid Molecular Approach for Chromosomal Phasing."PloS one 10.3(2015):e0118270；以及Furuta-Hanawa,Birei,Teruhide Yamaguchi和Eriko Uchida."Two-Dimensional Droplet Digital PCR as a Tool for Titration and IntegrityEvaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors"Human gene therapymethods30.4(2019):127-136中有所描述。用于vg量化的其他系统包括SEC、SEC-HPLC和尺寸交换色谱多角度光散射，所有这些在WO 2021/062164中都有所描述，其以其整体以引用方式并入本文。
衣壳ELISA(cp-ELISA)测定使用例如AAV5衣壳ELISA方法来测量完整衣壳，并且可以利用市售试剂盒(例如，Progen PRAAV5)。该试剂盒ELISA采用特定于组装的AAV5或其他衣壳上的构象表位的单克隆抗体。衣壳可以被捕捉在结合盘的单克隆抗体上，随后是检测抗体的后续结合。通过加入偶联链霉亲和素过氧化物酶，随后加入比色TMB底物溶液，并且加入硫酸以终止反应，可以生成测定信号。测试样品的效价从靶衣壳标准的四参数校准曲线被内插。用于定量衣壳效价的另一系统为SEC-MALS，其描述于WO 2021/062164中。
可以使用本领域中已知的技术来测量重型和部分AAV衣壳。例如，可以使用特定于衣壳蛋白的抗体使用cp-ELISA来测量衣壳的总数。可以使用qPCR测量存在的载体基因组来测量重型衣壳和部分衣壳。
对来自阴离子交换色谱200、210、220、230后的GOI1、GOI2和GOI3制剂的颗粒分布廓线进行了分析。图19示出了用AEX处理GOI2的rAAV制剂将轻型衣壳和空衣壳浓度降低至9.8％。还对来自阴离子交换色谱200、210、220、230后GOI1、GOI2和GOI3制剂的低温电子显微镜图像进行了分析。如图20所示，来自AEX处理后的GOI2的rAAV制剂的低温电子显微镜图像的衣壳计数为57.7％致密颗粒(即，重型衣壳和部分衣壳)和42.3％“非致密”颗粒(即，轻型衣壳)。因此，AEX不会从rAAV制剂中去除所有的轻型衣壳。
通过将已知浓度的污染性病毒加入到分离的衣壳并经由AEX柱来处理组合物，还对通过AEX处理200、210、220、230去除污染性病毒进行了评定。如表1所示，GOI1的rAAV制剂的AEX处理以至少为2的Log10减少降低了污染性病毒的浓度。
表1-AEX处理后的污染性病毒的Log10减少
病毒 Log10减少
VSV >5.5
X-MuLV >5.7
AcNPV >4.7
SV-40 >4.7
Reo-3 >5.8
PPV >5.9
EMC >2.0
在AEX之后，使收集的洗脱库在图13的步骤300中经受第一切向流过滤(TFF)超滤/渗滤(UF/DF)。将AEX柱洗脱库浓缩并渗滤到TFF缓冲器中，为区带超速离心做准备。如图15所示，TFF UF/DF 300包括以下步骤：提供样品301(例如，洗脱液204)，并且将样品渗滤/超滤302为渗透物/滤液303或可以被返回到样品301的渗余物302。对于GOI1，TFF UF/DF 310包括以下步骤：提供样品311(例如，洗脱液214)，并且将样品渗滤/超滤312为渗透物/滤液313或可以被返回到样品311的渗余物312。对于GOI2，TFF UF/DF 320包括以下步骤：提供样品321(例如，洗脱液224)，并且将样品渗滤/超滤322为渗透物/滤液323或可以被返回到样品321的渗余物322。对于GOI3，TFF UF/DF 330包括以下步骤：提供样品331(例如，洗脱液234)，并且将样品渗滤/超滤332为渗透物/滤液333或可以被返回到样品331的渗余物332。
将范围为从0.1x 10e17 vg/m2到10x 10e17 vg/m2的负载上样到以100kD截留分子量(MWCO)超滤和渗滤的膜上，其中过程通过TMP和横流来控制。
使用0.22uM PVDF过滤器使渗滤的库经受0.2μm过滤，从而生成最终TFF库。
如果需要长的保持时间，则可以任选地在ZUC处理之前将TFF库冷冻在≤60℃。
在TFF UF/DF 300之后并且如图16所示，通过包括以下步骤的ZUC 400来处理TFF库：用组合物302以及用于形成梯度的组分(例如，氯化铯等)来上样区带转子401，离心被上样的转子402，并且收集已鉴定的级分403。对于GOI1，ZUC 410包括以下步骤：用组合物312以及用于形成梯度的组分(例如，氯化铯等)来上样转子411，离心被上样的转子412，并且收集已鉴定的级分413。对于GOI2，ZUC 420包括以下步骤：用组合物322以及用于形成梯度的组分(例如，氯化铯等)来上样区带转子421，离心被上样的转子422，并且收集已鉴定的级分423。对于GOI3，ZUC 430包括以下步骤：用组合物332以及用于形成梯度的组分(例如，氯化铯等)来上样转子431，离心被上样的转子432，并且收集已鉴定的级分433。
rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)制剂通过AEX 200、210、220、230和ZUC 400、410、420、430被处理。含有ZUC轻型衣壳的级分通过AEX被收集和重新处理，其中A260和A280廓线被可视化。如图27A、图27B和图27C所示，对于GOI2的rAAV制剂，还发现轻型衣壳群在AEX期间与重型衣壳一起洗脱。可以使用区带超速离心(ZUC)将该轻型衣壳群与全衣壳进一步分离，因为qPCR示出了这些衣壳没有任何可量化的被包封的DNA(即使这些衣壳的净负电荷与重型衣壳相同)。在图13的步骤400中，通过用TFF-A缓冲液稀释TFF产物库，并用CsCl缓冲液调节到范围为从15％至75％CsCl的最终浓度，使TFF产物经受ZUC。将CsCl浓度(15％至75％CsCl)小于用CsCl调整的产物库的氯化铯的覆盖溶液泵送到离心机转子中，随后是用CsCl调整的产物库，然后是CsCl浓度(15％至75％CsCl)小于用CsCl调整的产物库的氯化铯的缓冲溶液。在旋转期间形成了CsCl梯度，从而分隔出具有不同密度的产物形式。从转子中回收梯度中的级分。ZUC在环境温度被执行。基于在线密度测量或通过对回收的级分的分析来自动地收集产物库。使用以下参数来执行ZUC。
对于GOI1，ZUC转子被上样有效价范围为从0.1x 10e17 vg/上样到10x 10e17 vg/上样的组合物。ZUC参数包含在范围为从10℃到36℃的温度以范围为80000G至125000G的速度离心组合物达14hr至16hr。
对于GOI2，ZUC转子被上样有效价范围为从0.1x 10e16 vg/上样到10x 10e16 vg/上样或从0.5x 10e16 vg/上样到50x 10e16 vg/上样的组合物。ZUC参数包含在范围为从10℃到36℃的温度以范围为从10000rpm到50000rpm的速度离心组合物达15hr至25hr。替代地，ZUC参数中的一者包含以范围为从50000G到100000G的速度离心组合物。
确定和分析了相对于经由ZUC 400、410、420、430处理的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)的不同收集级分403、413、423、433的密度的Vg浓度。图21示出了增加vg的浓度直至级分22，其中级分18至29被鉴定为具有用于GOI2的rAAV制剂的重型衣壳和部分衣壳的增加的浓度。注意到级分18至29的密度范围为从大于1.30g/mL到≤1.45g/mL。还分析了来自经由ZUC 400、410、420、430处理的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)的不同收集级分403、413、423、433的颗粒分布廓线。图22示出了用ZUC处理rAAV制剂将轻型衣壳浓度降低至1.1％。
通过蛋白印迹、碱性琼脂糖凝胶和低温电子显微镜分析了ZUC 400、410、420、430后的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)。图23A和图23B示出了，相比GOI2的rAAV制剂的较低密度级分10至16，高密度级分18至24具有显著更大浓度的具有更大基因组尺寸的衣壳(即，重型衣壳和部分衣壳)。如图24所示，来自后ZUC处理的GOI2的rAAV制剂的低温电子显微镜图像的衣壳计数为85.7％致密颗粒(即，重型衣壳和部分衣壳)和14.3％“非致密”颗粒(即，轻型衣壳)。因此，仅ZUC不会从rAAV制剂中去除所有轻型衣壳。
通过qPCR、ddPCR、SEC、SEC-HPLC或SEC-MALS确定了经由ZUC 400、410、420、430处理的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)的不同收集级分403、413、423、433的Vg浓度。通过cp-ELISA或SEC-MALS确定了经由ZUC 400、410、420、430处理的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)的不同收集级分403、413、423、433的衣壳效价。对于GOI2的rAAV制剂，图25B示出了如通过cp-ELISA确定的每个级分的衣壳效价，以及如通过qPCR确定的每个级分的vg效价。如图25B所示，与其他级分相比，级分15至26具有更高的衣壳和vg效价。通过cp-ELISA确定了使用或不使用AEX 200、210、220、230处理的rAAV(即，GOI1、GOI2和GOI3)的衣壳效价。图26还示出了AEX实质上减少了轻型衣壳和空衣壳，使得ZUC处理不会因轻型衣壳和空衣壳而过载。
表2示出了具有不同效价负载的ZUC处理后的GOI2的rAAV制剂的属性。
表2
表3示出了具有不同效价负载的ZUC处理后的GOI2的另一种rAAV制剂的属性。
表3
还针对GOI1、GOI2和GOI3评定了对通过ZUC处理减少污染性病毒的分析。对于杆状病毒，ZUC处理减少了≥2(例如，2.09和2.46)的Log10浓度。
在图13的步骤500中，将ZUC洗脱库浓缩并渗滤到稳定化TFF-B缓冲器中。如图17所示，TFF UF/DF 500包括以下步骤：提供样品501(例如，收集的级分403)，并且将样品渗滤/超滤502成渗透物/滤液503或可以被返回到样品501的渗余物502。对于GOI1，TFF UF/DF310包括以下步骤：提供样品511(例如，收集的级分413)，并且将样品渗滤/超滤512成渗透物/滤液513或可以被返回到样品511的渗余物512。对于GOI2，TFF UF/DF 520包括以下步骤：提供样品521(例如，收集的级分423)，并且将样品渗滤/超滤522成渗透物/滤液523或可以被返回到样品521的渗余物522。对于GOI3，TFF UF/DF 530包括以下步骤：提供样品531(例如，收集的级分433)，并且将样品渗滤/超滤532成渗透物/滤液533或可以被返回到样品531的渗余物532。将范围为从0.1x10e17 vg/m2到10x 10e17 vg/m2的负载上样到以100kD截留分子量(MWCO)超滤和渗滤的膜上，其中过程通过TMP和横流来控制。
在图13的步骤600中，将组合的TFF产物库材料稀释到制剂缓冲液中至预定浓度，并通过0.2μm过滤器过滤。
GOI2的rAAV制剂的组合的AEX(图25A)和ZUC(图25B)处理获得了约1.0Cp/Vg比率的重型衣壳和部分衣壳的基本纯的制剂。
对于GOI1的rAAV制剂，对通过AEX和ZUC处理的rAAV产物进行分析超速离心分析。经处理的rAAV产物中的衣壳组成为：0％轻型衣壳、3.9％衣壳聚集体、7.68％中间体或部分全衣壳以及88.4％重型衣壳。
实施例3-AAV产生杂质的去除：与Rep蛋白和脱去酰胺基的衣壳相关的rAAV
发现Rep蛋白(特别是Rep78和Rep68)在产生后仍然与rAAV的浓度相关。与Rep78/Rep68相关的这种rAAV为杂质，其可能无法感染细胞，或者被与Rep78/Rep68相关的rAAV感染的细胞可能无法表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。与Rep78/Rep68相关的rAAV可导致每单位剂量衣壳的有效性降低，并可增加免疫应答的风险(由于需要增加被引入到患者中以获得有效量的重型/全/部分全衣壳的外源蛋白)。因此，AEX和ZUC处理降低了与Rep78/Rep68相关的rAAV的浓度。与来自GOI1、GOI2和GOI3制剂的Rep78/Rep68相关的rAAV通过液相色谱-质谱(LC-MS)被量化。该测定准确地测量Rep78/Rep68浓度。在AVB处理、AEX处理和ZUC处理后衣壳被分离。在LC-MS分析之前，衣壳变性以解离病毒蛋白并被消化成肽。来自Rep78/Rep68蛋白的肽在LC上被分离，并且通过三重四极质谱仪来分析来自靶向肽的多个片段的所得信号。
如图28所示，在针对AAV5衣壳的AVB免疫色谱期间，一定浓度的与Rep蛋白相关的rAAV与治疗有效的rAAV一起洗脱。对于GOI1，AEX处理大大降低了与Rep蛋白相关的rAAV的浓度，但与Rep蛋白相关的rAAV中的一些与治疗有效的rAAV一起洗脱。在AEX之后，ZUC处理进一步降低了与Rep蛋白相关的rAAV的浓度。例如，AEX和ZUC处理去除了与Rep蛋白相关的rAAV的浓度，使得含有治疗有效的rAAV的最终组合物基本上不含与Rep蛋白相关的rAAV。
如图29所示，对于GOI1，在洗涤和洗脱步骤后，与Rep蛋白相关的rAAV保持在AEX柱内。与Rep蛋白相关的rAAV只有当柱再生时才离开AEX柱。
如图30所示，对于GOI1，ZUC处理还将治疗有效的rAAV和与Rep蛋白相关的rAAV分离，使得可以从与Rep蛋白相关的rAAV中纯化治疗有效的rAAV。特别地，分离的“库”级分几乎不包含与Rep蛋白相关的rAAV，而“库后”级分包含高得多的浓度的与Rep蛋白相关的rAAV。还注意到与Rep蛋白相关的rAAV为空衣壳或轻型衣壳。
已经表明，衣壳的脱去酰胺基作用降低了由rAAV提供的转基因表达的rAAV感染性(Giles,April R.等人Molecular Therapy 26.12(2018):2848-2862)和Frederick,Amy等人Human Gene Therapy 31.13-14(2020):756-774。因此，具有脱去酰胺基的衣壳的rAAV(或脱去酰胺基的rAAV)为杂质，其可能无法感染细胞，或者被脱去酰胺基的rAAV感染的细胞可能无法表达(例如，通过转录和/或通过转译)目标元件(例如，核苷酸序列、蛋白质等)。脱去酰胺基的rAAV也可导致每单位剂量衣壳的有效性降低，并可增加免疫应答的风险(由于需要增加被引入到患者中以获得有效量的重型/全/部分全衣壳的外源蛋白)。因此，AEX和ZUC处理降低了具有脱去酰胺基的衣壳的rAAV的浓度。VP1蛋白在GOI1、GOI2和GOI3的N末端处的脱去酰胺基水平通过液相色谱-质谱(LC-MS)来进行量化。该测定准确地测量VP1的N末端区处的脱去酰胺基的百分比。在AVB处理、AEX处理和ZUC处理后衣壳被分离。在LC-MS分析之前，衣壳变性以解离病毒蛋白并被消化成肽。带有靶标脱去酰胺基位点的靶标VP1 N-末端肽的未修饰和脱去酰胺基的形式在LC上被分离，并通过三重四极质谱仪分析来自靶向肽的多个片段的所得信号。
如图31所示，对于GOI1，在针对AAV5衣壳的AVB免疫色谱期间，一定浓度的脱去酰胺基的rAAV与治疗有效的rAAV一起洗脱。AEX处理大大降低了脱去酰胺基的rAAV的浓度，但脱去酰胺基的rAAV中的一些与治疗有效的rAAV一起洗脱。在AEX后，ZUC处理进一步降低了脱去酰胺基的rAAV的浓度。例如，AEX和ZUC处理去除了脱去酰胺基的rAAV的浓度，使得含有治疗有效rAAV的最终组合物基本上不含脱去酰胺基的rAAV。
如图32所示，对于GOI1，脱去酰胺基的rAAV在洗涤步骤期间被去除，并且仅当柱再生时才离开AEX柱。还注意到，AEX洗脱液具有大大降低的浓度的脱去酰胺基的rAAV。
如图33所示，对于GOI1，ZUC处理还将治疗有效的rAAV与脱去酰胺基的rAAV分离，使得治疗有效的rAAV可以被纯化为脱去酰胺基的rAAV。特别地，分离的“库”级分含有降低浓度的脱去酰胺基的rAAV，而“库后”级分含有高得多的浓度的脱去酰胺基的rAAV。还注意到，脱去酰胺基的rAAV为空衣壳或轻型衣壳。
尽管上面描述了示例性实施例，但并非旨在这些实施例描述本发明的所有可能形式。相反地，说明书中使用的词语是描述性的而不是限制性的词语，并且应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下作出各种改变。另外，各种实施性实施例的特征可经组合以形成本发明的另外实施例。

Claims (35)

1.一种纯化治疗有效的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含治疗有效的rAAV颗粒和AAV产生杂质的组合物，其中所述AAV产生杂质的第一部分包含具有不同于所述AAV颗粒的净电荷的杂质，并且所述AAV产生杂质的第二部分包含具有不同于所述AAV颗粒的密度的杂质；
通过阴离子交换色谱从所述组合物中去除所述第一部分；以及
通过区带超速离心从所述组合物中去除所述第二部分；
其中，在阴离子交换色谱和区带超速离心后，所述组合物基本上不含AAV产生杂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物至少95％不含AAV产生杂质。
3.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物至少99％不含AAV产生杂质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物99+％不含AAV产生杂质。
5.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物至少95％不含治疗无效的rAAV颗粒。
6.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物至少99％不含治疗无效的rAAV颗粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物99+％不含治疗无效的rAAV颗粒。
8.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物不含任何可检测到的治疗无效的rAAV颗粒。
9.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含与Rep蛋白相关的衣壳。
10.根据权利要求9所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含通过阴离子交换色谱与治疗有效的rAAV颗粒分离的衣壳和Rep蛋白。
11.根据权利要求9所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含通过区带超速离心与治疗有效的rAAV颗粒分离的衣壳和Rep蛋白。
12.根据权利要求9所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含具有附着的Rep蛋白的衣壳。
13.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳带有具有脱去酰胺基的氨基酸的一种或多种VP1、VP2或VP3衣壳蛋白。
14.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳不含载体基因组或包封无法检测到的浓度的核苷酸。
15.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含具有载体基因组的衣壳，所述载体基因组具有一种或多种尺寸，所述一种或多种尺寸不足以使被所述衣壳感染的细胞生成治疗有效的核苷酸序列。
16.根据权利要求5至8中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含：具有载体基因组的衣壳，所述载体基因组具有一种或多种尺寸，所述一种或多种尺寸减少由被所述衣壳感染的细胞进行的元件的表达；以及治疗有效的rAAV，所述治疗有效的rAAV相对于由在相同条件下被感染但未被所述衣壳感染的细胞进行的所述元件的表达来编码所述元件。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述阴离子交换色谱为聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述树脂用季铵基团改性。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述区带超速离心使用氯化铯梯度。
20.根据权利要求19所述的方法，其中使用氯化铯梯度的所述区带超速离心包括
向洗脱液中加入一定浓度的氯化铯；
在旋转的离心机转子中覆盖第一氯化铯溶液，所述第一氯化铯溶液具有小于所述洗脱液的氯化铯浓度的氯化铯浓度；
加入来自所述阴离子交换离子色谱的洗脱液；
加入第二氯化铯溶液，所述第二氯化铯溶液具有大于所述洗脱液的氯化铯浓度的氯化铯浓度；
离心所述旋转的离心机转子以在所述洗脱液内形成密度梯度；以及
从所述密度梯度收集级分。
21.一种纯化治疗有效的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
提供包含治疗有效的rAAV颗粒和治疗无效的rAAV颗粒的组合物；
通过阴离子交换色谱从所述组合物中去除至少一些所述治疗无效的rAAV颗粒；以及
通过区带超速离心来处理所述组合物；
其中，在阴离子交换色谱和区带超速离心后，所述组合物基本上不含治疗无效的rAAV颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中去除步骤允许通过区带超速离心来对所述组合物进行后续处理。
23.根据权利要求21所述的方法，其中去除步骤允许提供步骤的所述组合物具有通过区带超速离心被处理的更大数量的治疗有效的rAAV颗粒。
24.根据权利要求21所述的方法，其中去除步骤从所述组合物中去除所述治疗无效的rAAV颗粒的至少0.1％。
25.根据权利要求21所述的方法，其中去除步骤从所述组合物中去除所述治疗无效的rAAV颗粒的至少50％。
26.根据权利要求21所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物至少95％不含治疗无效的rAAV颗粒。
27.根据权利要求21所述的方法，其中阴离子交换色谱和区带超速离心后的所述组合物不含任何可检测到的治疗无效的rAAV颗粒。
28.根据权利要求21至27中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含与Rep蛋白相关的衣壳。
29.根据权利要求28所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含通过阴离子交换色谱与治疗有效的rAAV颗粒分离的衣壳和Rep蛋白。
30.根据权利要求28所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含通过区带超速离心与治疗有效的rAAV颗粒分离的衣壳和Rep蛋白。
31.根据权利要求28所述的方法，其中与Rep蛋白衣壳相关的所述衣壳包含具有附着的Rep蛋白的衣壳。
32.根据权利要求21至27中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳带有具有脱去酰胺基的氨基酸的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白。
33.根据权利要求21至27中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳不含载体基因组或包封无法检测到的浓度的核苷酸。
34.根据权利要求21至27中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含具有载体基因组的衣壳，所述载体基因组具有一种或多种尺寸，所述一种或多种尺寸不足以使被所述衣壳感染的细胞生成治疗有效的核苷酸序列。
35.根据权利要求21至27中的一项所述的方法，其中所述治疗无效的rAAV颗粒包含：具有载体基因组的衣壳，所述载体基因组具有一种或多种尺寸，所述一种或多种尺寸减少由被所述衣壳感染的细胞进行的元件的表达；以及治疗有效的rAAV，所述治疗有效的rAAV相对于由在相同条件下被感染但未被所述衣壳感染的细胞进行的所述元件的表达来编码所述元件。
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