JP2023522883A - 神経学的障害を処置するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、神経学的障害、たとえば巨大軸索ニューロパチー等を含むがそれらに限らない、対象における疾患および／または障害を処置するための方法および組成物を提供する。本明細書に記載される方法は、遺伝子療法（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）を、対象の迷走神経（たとえば、左迷走神経）中への注射を介して、対象に直接投与することを含む。【選択図】図４

Description

関連出願への相互参照

本出願は、２０２０年４月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０１０，１７９号の優先権を主張し、その内容は、あらゆる目的のため参照により全体として本明細書に組み込まれる。
政府支援

本発明は、国立衛生研究所により授与された助成ＮＳ０８７１７５の下、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

配列表の参照による組み込み
本出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年４月１４日に作成され、「ＴＡＹＳ－０１０＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と命名され、大きさ約２８．２ＫＢである。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子療法は、神経学的障害およびその付随する自律神経機能不全の処置を含む、異なる多種多様な疾患の処置において益々一般化している。しかし、最近の研究は、ある特定のＡＡＶ血清型に対する中和抗体がヒト集団においてきわめて一般的であることを明らかにした。実際、いくつかの研究は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９に対する中和抗体の保有率は、それぞれ７０％、７０％、４０％、４６％、３８％、および４７％ほどと高いことを示した。中和抗体陽性の個人において、ＡＡＶに基づく遺伝子療法は実行性がないと考えられる。最終的に、これまでに第１のＡＡＶに基づく遺伝子療法の投与を受けたことがあり、そしてａ）第１のＡＡＶに基づく遺伝子療法の追加投与；またはｂ）異なるＡＡＶに基づく遺伝子療法を必要とする対象に関して、中和抗体の存在は特に問題である。したがって、対象における中和抗体の存在に付随する問題を克服するＡＡＶに基づく遺伝子療法を投与するための組成物および方法に対する必要性が当技術分野において存在する。さらに、ＡＡＶのような遺伝子療法ベクターに対して血清陽性である対象を含む、対象の自律神経系に対する遺伝子療法ベクターの送達と関連する組成物および方法に対する必要性が当技術分野において存在する。

巨大軸索ニューロパチーは、年齢３～４歳の幼児学令前期において開始する稀で壊滅的な神経学的障害であり、一般的に感覚性運動失調が現れる。末梢神経系（ＰＮＳ）において、疾患は感覚および運動神経を進行性に影響を及ぼす。病理は自律神経系（ＡＮＳ）全体を通じて明らかであり、また患者は、構音障害、嚥下障害、ＧＩ運動に関する問題、および呼吸困難の形態の腸管機能不全および自律神経機能不全を頻繁に呈する。患者は、車椅子依存となり、上肢の使用は限定され、そして１０代後半末期までにその下肢をほとんどまたはまったく使えなくなるのが典型的である。さらに、１０代において、気管切開術（またはその他の人工呼吸手段）、ならびに栄養管が必要になることが多い。巨大軸索ニューロパチーを有する患者から得られたＭＲＩ結果は、大脳および小脳内白質異常、疾患後期において最終的に脳幹および脊髄の重度萎縮を示すことが多いように、巨大軸索ニューロパチーは中枢神経系にも影響を及ぼす。２０代になるまでに死が訪れるのが典型的である。巨大軸索ニューロパチーは、第１６染色体に位置するＧＡＮ遺伝子内の、ギガキソニン（ＧＡＮ）タンパク質をコードする１６ｑ２４．１における異常により惹起される常染色体劣性の遺伝障害である。異常なＧＡＮタンパク質は、ニューロフィラメントと呼ばれるタンパク質の短い糸の沈着を伴う、神経細胞部分（軸索と呼ばれる）の腫脹を惹起し、巨大軸索の外観をもたらす。巨大軸索は、末梢神経系の変性および機能異常を惹起する。巨大軸索ニューロパチーに対して現在処置法は存在しない。したがって、巨大軸索ニューロパチーの処置と関連する組成物および方法に対する必要性が当技術分野において存在する。

本開示は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づく遺伝子療法を含む、ただしこれに限定されない遺伝子療法の分野と一般的に関連する。より具体的には、本開示は、ｒＡＡＶに基づく遺伝子療法をこれまでに投与されたことがあり、および／または１つもしくは複数のＡＡＶ血清型に対する中和抗体について血清陽性である対象に対するｒＡＡＶウイルスベクターの投与と一般的に関連する。本開示は、対象の少なくとも１つの迷走神経への注射を介して、少なくとも１つのｒＡＡＶウイルスベクターを対象に対して投与するための組成物および方法を提供する。本開示は、ギガキソニン（ＧＡＮ）ポリペプチドをコードするトランスジーン配列を含むｒＡＡＶウイルスベクター、その製造法、およびトランスジーンを送達して疾患または障害（ＧＡＮ遺伝子の喪失、機能不全、および／または欠損に付随する疾患を含む）を処置または防止するためのその使用も提供する。

本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の迷走神経に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。

一部の態様では、迷走神経は、対象の左迷走神経であり得る。

一部の態様では、疾患および／または障害は、神経学的疾患および／または障害であり得る。

一部の態様では、神経学的疾患および／または障害は、少なくとも１つの自律神経機能不全により特徴付けられ、および迷走神経への注射を介する少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの投与は、少なくとも１つの自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する。一部の態様では、少なくとも１つの症状は、構音障害、嚥下障害、消化管運動の不適切な制御、血圧の不適切な制御、呼吸困難、起立性低血圧症、発汗異常、尿道の不適切な制御、性機能障害、およびこれらの任意の組合せから選択され得る。

一部の態様では、疾患および／または障害は、脊髄性筋萎縮症、フリードリッヒの運動失調、ＣＬＮ３バッテン病、ＣＬＮ６バッテン病、ＣＬＮ７バッテン病、てんかん性脳症、リー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、ラフォラ病、ＳＬＣ１３Ａ５てんかん性脳症、グリコシル化の先天性疾患、タイプＩｑ、Ｋａｈｒｉｚｉ症候群、アンジェルマン症候群、レット症候群、痙性対麻痺、小児期の交代性片麻痺、およびツェルベーガースペクトラム障害から選択され得る。一部の態様では、疾患および／または障害は巨大軸索ニューロパチーであり得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターは、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、（ｉｉ）５’から３’の方向に：ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列；ｂ）プロモーター配列；ｃ）ギガキソニン（ＧＡＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子；ｄ）ポリＡ配列；およびｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むｒＡＡＶベクターとを含み得る。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み得る。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列は、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であり得、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列を含む。

一部の態様では、プロモーター配列は配列番号８で表される核酸配列を含み得る。

一部の態様では、ポリＡ配列は配列番号９で表される核酸配列を含み得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列；ｂ）配列番号８で表される核酸配列を含むプロモーター配列；ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＧＡＮポリペプチドをコードする前記核酸配列が配列番号３で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；ｄ）配列番号９で表される核酸配列を含むポリＡ配列；およびｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは配列番号１０で表される核酸配列を含み得る。

一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質であり得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターは、ウイルス粒子約３．５×１０^１３個～約３．５×１０^１４個の量で投与され得る。

一部の態様では、対象は、少なくとも１つの治療有効量の初回ｒＡＡＶウイルスベクターをこれまでに投与された可能性がある。一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で対象に投与された可能性がある。一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、対象に髄腔内投与された可能性がある。

一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターと同じであり得る。

一部の態様では、対象はｒＡＡＶウイルスベクターに対する中和抗体を有し得る。

本開示は、対象における巨大軸索ニューロパチーを処置する方法であって、ａ）第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記対象に髄腔内投与するステップと、ｂ）少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の左迷走神経中に注射することにより、投与するステップとを含み、前記ｒＡＡＶウイルスベクターが、（ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、（ｉｉ）配列番号１０で表される核酸配列を含むｒＡＡＶベクターとを含む、方法を提供する。一部の態様では、第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターおよび少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、連続的に投与可能である。一部の態様では、第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターおよび少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、同時に投与可能である。

上記の任意の態様、または本明細書に記載した他の任意の態様は、他の任意の態様と組み合わせることができる。

他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術における当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、単数形は文脈によって他が明確に指示されない限り、複数形を含み、たとえば用語「１つの」および「その」は単数または複数であると理解され、用語「または」は包括的であると理解される。例として、「１つの要素」は１つまたは複数の要素を意味する。明細書全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記述した要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を意味するが、他の任意の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を排除しないことが理解されよう。「約」は、記述した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。文脈から他が明確でない限り、本明細書で提供する全ての数値は、用語「約」によって修飾される。

本明細書に記載した方法および材料と同様または等価の方法および材料は、本開示の実施または試験に用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で述べる全ての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照により全体として組み込まれる。本明細書で引用する参考文献は、特許を請求する発明の先行技術であると認めてはいない。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は説明のためのみであり、限定的であることを意図していない。本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

上記のおよびさらなる特徴は、添付した図面と併せて取り上げた場合に、以下の詳細な説明からより明確に理解される。

ＧＦＰレポータータンパク質を使用して、ラットの左迷走神経中に注射した後の、ＡＡＶ９／ベクタートランスジーン発現を示す画像を示す図である。矢印＝迷走神経；アステリクス＝迷走神経の背側運動核；星型＝疑核。 ＡＡＶ９／ＧＡＮの髄腔内注射により事前免疫化されたラットにおいて、左迷走神経を介してＡＡＶ９／ＧＦＰウイルスベクターを投与した後のＧＦＰ発現を示す一連の画像を示す図である。左側パネル：左節上神経節の神経細胞体。右側パネル：左頚部迷走神経線維。 非免疫化ラット（左側パネル）、またはＡＡＶ９に対して事前免疫化されたラット（右側パネル）において、ＡＡＶ９／ＧＦＰを左迷走神経に注射した後の、ラット脳内におけるＧＦＰ発現を示す一連の画像を示す図である。迷走神経の背側運動核を「ＤＭＮ Ｘ」で示し、そして孤束核を「Ｓｏｌ Ｎ ｌａｔ」で示す。 ピロカルピンが負荷され、そして本開示の組成物および方法を使用して処置された野生型および突然変異ＧＡＮノックインマウスにおける自律神経機能に付随する生理学的応答を示す一連のグラフを示す図である。グラフデータを箱ひげ図として表し、エラーバーは最大値および最低値を表し、また箱で囲まれた線はメジアンを表す。

本開示は、とりわけ、対象における疾患を処置するための組成物および方法を提供し、方法は、少なくとも１つの治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルスベクターを、対象の迷走神経中への注射を介して、前記対象に投与するステップを含む。

本開示は、とりわけ、単離されたポリヌクレオチド、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、およびギガキソニン（ＧＡＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子を含むｒＡＡＶウイルスベクターも提供する。本開示は、これらの単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを製造する方法、ならびにＧＡＮ遺伝子の喪失、誤機能不全、および／または欠損に付随する疾患を含む、巨大軸索ニューロパチーを含む、ただしこれに限定されない疾患または障害を処置または防止するためにトランスジーンを送達するためのその使用も提供する。

ｋｅｌｃｈ様タンパク質１６としても知られているギガキソニン（ＧＡＮ）は、ＧＡＮ遺伝子によりコードされる、ヒト内のタンパク質である。ＧＡＮは、タンパク質の細胞骨格ＢＴＢ／ｋｅｌｃｈ（Ｂｒｏａｄ－Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｔｒａｍｔｒａｃｋ、およびＢｒｉｃ ａ ｂｒａｃ）ファミリーのメンバーである。ＧＡＮは、中間フィラメント（ＩＦ）タンパク質のユビキチン化および分解を促進するＥ３リガーゼアダプタータンパク質である。ＧＡＮ遺伝子内の突然変異は、巨大軸索ニューロパチーを惹起することが示されている。

本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に付随し、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、細胞中で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その中である種の機能が共感染するヘルパーウイルスによって提供される。ＡＡＶに関する一般的な情報および総説は、たとえばＣａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，１６９～２２８頁およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３～１７６４頁，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。種々の血清型が、遺伝子レベルであっても、構造的および機能的両方に極めて密接に関連していることがよく知られているので、これらの総説に記載された同じ原理が総説の発行日以後に特徴解析されたさらなるＡＡＶの血清型に適用可能であることが、完全に期待される（たとえばＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編，１６５～１７４頁、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１頁（１９７４）を参照）。たとえば、全てのＡＡＶ血清型は同種ｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めて類似した複製特性を明らかに呈し、全てが、ＡＡＶ２で発現されるもののような３つの関連するカプシドタンパク質を有している。ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交叉ハイブリダイゼーションおよび「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニール性セグメントの存在を明らかにするヘテロデュプレックス解析によって、関連性の程度がさらに示唆されている。類似した感染性パターンも、各血清型における複製機能が同様の規制制御の下にあることを示唆している。このウイルスの多数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型が種々の組織型の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１個のＡＡＶ血清型が当技術で知られている。本明細書で開示した方法において有用な非限定的な例示的血清型には、１１個の血清型、たとえばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、たとえばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。

例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、全ての血清型（たとえばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、およびＡＡＶｒｈ．１０）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（たとえばＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（Ｋｅｒｕｎら．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０に詳細に記載）およびＡＡＶ－ＮＰ５９（Ｐａｕｌｋら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；２６（１）：２８９～３０３頁に詳細に記載）が含まれる。

ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損性のパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さで、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。たとえば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５～５６４頁（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１～６３８８頁（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７～７６頁（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５～３８３頁（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補性ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは自己相補性ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体の一体化を指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲの中に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置によってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）差別的スプライシングと一体になった２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する多種の酵素特性を有している。

ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、この３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与している。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれがそれから翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後で、このｍＲＮＡは２つの異なる様式でスプライシングされ得る。長いイントロンまたは短いイントロンが切除され、ｍＲＮＡの２つのプール、即ち２．３ｋｂと２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプールの形成がもたらされる。長いイントロンが好ましいことが多く、したがって２．３ｋｂの長さのｍＲＮＡは主要なスプライスバリアントと称され得る。この形態はＶＰ１タンパク質の合成がそれから始まる第１のＡＵＧコドンを欠き、ＶＰ１タンパク質合成の全体のレベルの低下をもたらす。主要なスプライスバリアントに残る第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム中のそのコドンの上流には、最適のＫｏｚａｋ（翻訳開始）コンテクストによって囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコードする）が存在する。これはＶＰ２タンパク質の合成の低いレベルに寄与する。ＶＰ２タンパク質は実際上、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＢｅｃｅｒｒａ ＳＰら，（１９８５年１２月）．“Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ： ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２（２３）：７９１９～２３頁；Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐら，（１９８８年１１月）．“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ （ＡＡＶ） ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ： ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６～８４頁；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓら，（１９９４年１月）．“Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０～６頁；およびＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（１９８８年９月）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２（９）：３３５６～６３頁に記載されているように、ＶＰ１と同じく、ＶＰ３タンパク質にＮ末端残基が付加されたものである。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置している。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝的特徴は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７～１２９頁（１９９２）に概説されている。

それぞれのＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含む。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見出される、ＶＰ１タンパク質の中に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質に共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。

ＶＰ３タンパク質は、不連続の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）にさらに分割することができる。可変表面領域（ＶＲ）のそれぞれは、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＭａｔｔａら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７～６９５８頁，２０１２年６月に記載されているように、単独でまたは他のＶＲのそれぞれの特定のアミノ酸配列との組合せで、特有の感染表現型（たとえば低下した抗原性、改善された形質導入および／または他のＡＡＶ血清型と比較した組織特異的向性）を特定の血清型に付与することができる特定のアミノ酸配列を含み得る。

ＡＡＶは、たとえば遺伝子療法において外来のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてこれを魅力的なものにする固有の特徴を有している。培養における細胞のＡＡＶ感染は細胞変性を起こさず、ヒトおよびその他の動物の天然の感染は症状がなく無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染してｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とすることを可能にする。さらに、ＡＡＶは分裂している細胞および分裂していない細胞にゆっくりと形質導入し、実質的にこれらの細胞の生涯にわたって転写活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として持続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムはクローニングされたＤＮＡとしてプラスミド中に挿入され、それにより組み換えゲノムの構築が実行可能になる。さらに、ＡＡＶの複製とゲノムのカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲの中に含まれているので、ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部または全部（複製および構造のカプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）を外来のＤＮＡで置き換えて、ＡＡＶベクターを生成することができる。ｒｅｐおよびｃａｐのタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、これが極めて安定で元気なウイルスであることである。これはアデノウイルスを不活化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の問題を重要でなくしている。ＡＡＶは凍結乾燥することさえできる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に抵抗しない。

多くの研究が筋肉における長期（１．５年超）の組み換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９～６６９頁（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２～１４０８７頁（１９９６）；およびＸｉａｏら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８～８１０８頁（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９～６２３頁（２０００）およびＣｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７～２２２頁（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管新生しているので、Ｈｅｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４～５８０９頁（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１～１３９２６頁（１９９７）に記載されているように、組み換えＡＡＶ形質導入によって、筋肉内注射の後の全身循環におけるトランスジーン産生物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９～８７７５頁（２００２）は、骨格筋筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌のために必要な細胞性因子を有していることを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療剤を安定的に発現することができることを示した。本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質をコードする核酸分子（たとえばＫＣＴＤ７）および核酸分子の側にある１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれからなる。偽型ｒＡＡＶの産生は、たとえばＷＯ２００１０８３６９２に開示されている。その他の型のｒＡＡＶバリアント、たとえばカプシド変異を有するｒＡＡＶも意図されている。たとえばＭａｒｓｉｃら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００～１９０９頁（２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術で既知である。

トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド
本開示は、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。

一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列またはその少なくとも１つの断片を含み得る。一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＧＡＮポリペプチドの生物学的等価物をコードする核酸配列を含み得る。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドは、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列は、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であってよい。ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはその間の任意のパーセンテージ）を超えず同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。本明細書で使用する場合、「ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列」は、配列番号７で表されるような、ヒトゲノムにおけるＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を指す。配列番号３～６は、ＧＡＮポリペプチドをコードする固有のコドン最適化された核酸配列である。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号３～６で表される配列等は、ドナースプライス部位を含まない可能性がある。一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、または約６個、または約７個、または約８個、または約９個、または約１０個を超えないドナースプライス部位を含んでよい。一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、少なくとも１個、または少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個少ないドナースプライス部位を含む。理論に縛られることは望まないが、曖昧なスプライシングが防止されるので、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去によって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＡＮポリペプチドの発現を予想外かつ予測外に増加させることができる。さらに、曖昧なスプライシングは様々な対象の間で変動することがあり、ドナースプライス部位を含むＧＡＮポリペプチドの発現レベルは様々な対象の間で予測外に変動することがあることを意味している。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号３～６で表される配列等は、ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列のＧＣ含量と異なるＧＣ含量を有し得る。一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含量は、ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。理論に縛られることは望まないが、核酸配列全体にわたってＧＣ含量をより均一に分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は転写物の長さにわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を呈する。核酸配列の転写および／または翻訳はポリメラーゼおよび／またはリボソームの停滞をあまり伴わずに起こるので、融解温度の均一性は、予期しないことに、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現の増大をもたらす。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号３～６で表される配列等は、ＧＡＮポリペプチドをコードする野生型またはコドン最適化されていない核酸配列に対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大したヒト対象における発現を呈する。

一部の態様では、ＧＡＮポリペプチドは、タンパク質タグをさらに含み得る。理論に縛られることは望まないが、タンパク質タグを含ませることによって、外因性ＧＡＮポリペプチドの検出および／または可視化が可能になる。当業者には認識されるように、タンパク質タグの非限定的な例には、Ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＳＢＰタグ、または当技術で既知の任意の他のタンパク質タグが含まれる。

ＡＡＶベクター
一部の態様では、本明細書に記載した少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、元のままのレプリコンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸であって、それによりベクターが、細胞内に入れられた場合に、たとえばトランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスによって複製される、核酸を指す。いったん細胞内に入れば、ベクターは染色体外（エピソーマル）エレメントとして複製され、または宿主細胞の染色体内に統合され得ることが当技術で理解されている。ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポバウイルス、またはその他に改変された天然産生のウイルスから誘導される核酸が含まれ得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、裸のＤＮＡ；単独もしくはカチオン性ポリマーと組み合わせたカチオン性脂質とのＤＮＡの複合体；アニオン性およびカチオン性のリポソーム；異種ポリリジン、定義された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーと縮合し、ある場合にはリポソームに含まれるＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ－タンパク質複合体及び粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン－ＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる三重複合体の使用が含まれる。

一般的な組み換え手法に関しては、プロモーターとその中にポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術で周知である。そのようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するため、クローニングされたトランスジーンの５’および／または３’の翻訳されない部分を除去、付加、または変化させて、余分で潜在的で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳のレベルにおいて発現に干渉しまたはこれを低減させ得る他の配列を排除することが必要であろう。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’のすぐ傍に挿入することができる。

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、１つまたは複数のトランスジーン核酸分子および１つまたは複数のＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、宿主細胞中に存在する場合に、たとえば宿主細胞のトランスフェクションによってｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物の機能を提供する感染性ウイルス粒子の中に、複製しパッケージすることができる。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子の中にパッケージされた側面ＩＴＲの中のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含む。カプシド封入された核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと称し得る。ｒＡＡＶベクターを含むプラスミドは、製造目的のためのエレメント、たとえば抗生剤耐性遺伝子、複製起点の配列、その他を含んでもよいが、これらはカプシド封入されず、したがってＡＡＶ粒子の一部を形成しない。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆転ターミナル（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＲｅｐＣａｐ配列を含み得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのトランスジーン核酸分子を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、同じ核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、異なる核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸配列は、互いに隣接し得る。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのプロモーター配列を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のプロモーター配列および少なくとも第２のプロモーター配列を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、同じ配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、異なる配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、互いに隣接し得る。ｒＡＡＶベクターが第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子も含む一部の態様では、第１のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置してよく、少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子と少なくとも第２のトランスジーン核酸分子との間に位置してよく、それにより少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の下流（３’）かつ少なくとも第２のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置する。

先行するｒＡＡＶベクターのいずれも、少なくとも１つのエンハンサーをさらに含み得る。少なくとも１つのエンハンサーは、ｒＡＡＶベクターのいずれの場所に位置してもよい。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ上流（５’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ下流（３’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、エンハンサー、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、トランスジーン核酸分子のすぐ下流に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、エンハンサー、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。

ＡＡＶ ＩＴＲ配列
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術で既知の任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列であってよい。

即ち、一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

プロモーター配列およびエンハンサー
本明細書で使用される用語「プロモーター」および「プロモーター配列」は、遺伝子またはトランスジーン等のコーディング配列の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列を意味する。プロモーターは、たとえば構造的、誘起的、抑制的、または組織特異的であってよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の制御性のタンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。非限定的な例示的プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーととともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、シナプシンプロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭＥＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーターのヒトバリアント、ミニマルＭＥＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦ１プロモーターが含まれる。

本明細書で提供されるさらなる非限定的な例示的プロモーターには、それだけに限らないが、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）が含まれる。ｍＲＮＡ転写の効率を増大または低減させるために、そのようなプロモーターのヌクレオチド配列を改変し得ることは、当技術で既知である。たとえばＧａｏら．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５～１４５頁を参照されたい（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を無効にし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するために、７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを改変する）。遍在性または組織特異的な発現のために、合成由来のプロモーターを用いてもよい。さらに、そのいくつかを上で言及したウイルス由来プロモーター、たとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶのプロモーターは、本明細書に記載した方法において有用であり得る。一部の態様では、転写効率を増大させるために、プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーとともに用いられる。エンハンサーの非限定的な例には、間質性レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーが含まれる。

一部の態様では、プロモーター配列は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター配列（任意選択でＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター配列、ＪｅＴプロモーター配列、強いβ－アクチンプロモーター配列、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、シナプシンプロモーター、Ｈ１プロモーター配列、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター配列、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター配列、ＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター配列、小型の遍在性プロモーター配列（ＪｅｔＩプロモーター配列としても知られている）、ＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＶＭＤ２プロモーター配列、ｍＲｈｏプロモーター配列、ＥＦＩプロモーター配列、ＥＦｌａプロモーター配列、Ｕｂｃプロモーター配列、ヒトβ－アクチンプロモーター配列、ＣＡＧプロモーター配列、ＴＲＥプロモーター配列、Ａｃ５プロモーター配列、ポリヘドリンプロモーター配列、ＣａＭＫＩＩａプロモーター配列、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＴＥＦ１プロモーター配列、ＧＤＳプロモーター配列、ＡＤＨ１プロモーター配列、Ｕｂｉプロモーター配列、ＭｅＰ４２６プロモーター、またはα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

エンハンサーは、標的配列の発現を増大させる制御エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を含んでいる。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子に天然に連結されたエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（即ち分子生物学的手法）または合成手法の手段によって遺伝子に並置され、それによりその遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示される、エンハンサー／プロモーターである。本明細書で提供される方法、組成物、および構築物における使用のための連結されたエンハンサー／プロモーターの非限定的な例には、ＰＤＥプロモータープラスＩＲＢＰエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサープラスＵ１ａプロモーターが含まれる。エンハンサーは遠方から、また内因性または異種のプロモーターの位置に対するそれらの配向とは関係なく、作動し得ることが当技術で理解されている。即ち、プロモーターから離れて作動するエンハンサーは、したがってベクター中のその位置またはプロモーターの位置に対するその配向とは関係なく、そのプロモーターに「作動可能に連結」されていることがさらに理解される。

本開示を通して使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、遺伝子が空間的に連結されたプロモーターの制御下にある遺伝子（即ちトランスジーン）の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターとそのプロモーターがそれから誘導された遺伝子内でプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってよい。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能の損失なしに適応させることができる。

一部の態様では、プロモーター配列は、ＪｅＴプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＪｅＴプロモーター配列は、配列番号８で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

トランスジーン核酸分子
トランスジーン核酸分子は、上の見出し「トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド」の下に記載したトランスジーン核酸分子のいずれかを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。

一部の態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するトランスジーン核酸分子は、同じｒＡＡＶベクター中にも存在するプロモーター配列の転写制御の下にあり得る。

ポリＡ配列
一部の態様では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列の非限定的な例には、それだけに限らないが、ＭＥＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列が含まれる。

即ち、ポリＡ配列は、ＭｅＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

一部の態様では、ポリＡ配列は、配列番号９で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、配列番号１０で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、配列番号１１で表される配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。

細菌プラスミド
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＡＡＶベクターの増殖を可能にするために細菌プラスミドの中に含ませてよい。即ち、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細菌プラスミドを提供する。細菌プラスミドはさらに、複製の起点の配列を含み得る。細菌プラスミドはさらに、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。細菌プラスミドは、耐性遺伝子プロモーターをさらに含み得る。細菌プラスミドは、原核生物プロモーターをさらに含み得る。一部の態様では、本開示の細菌プラスミドは、配列番号１０または配列番号１１で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。

複製の起点の配列
一部の態様では、複製の起点の配列は、当技術で既知の任意の複製の起点の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。複製の起点の配列は、細菌の複製の起点の配列であってよく、それにより前記細菌の複製の起点の配列を含むｒＡＡＶベクターが当技術で標準的な方法を用いることによって細菌内で産生され、増殖し、維持されることが可能になる。

抗生剤耐性遺伝子
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。

一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、当技術で既知の任意の抗生剤耐性遺伝子を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。当技術で既知の抗生剤耐性遺伝子の例には、それだけに限らないが、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれる。

ＡＡＶウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、たとえばＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。たとえばＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７頁を参照されたい。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ｒＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。即ち、ｒＡＡＶウイルスベクターの産生には必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれ、したがってベクターはｒＡＡＶベクターの中に含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド封入し、保護し、輸送し、また宿主細胞中に放出するように機能する。カプシドは一般に、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー性構造サブユニットからなっている。本明細書で使用される場合、用語「カプシド封入」は、ウイルスカプシド中に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは３つのウイルスカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物からなっている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物は、そのそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｎｎｔａｇ Ｆら，（２０１０年６月）“Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１０７（２２）：１０２２０～５頁、およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００年１２月）．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ： ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１～８頁に記載されているように、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１の２０面体対称に配置された６０個のモノマーを含む。

本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれか、またはその相補体；およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。

本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれか；およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。

ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術で既知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であってよい。

代替のｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶウイルスベクターの実施形態
１．５’から３’の方向に、
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）プロモーター配列、
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子、
ｄ）ポリＡ配列、および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含むｒＡＡＶベクター。
２．ＧＡＮポリペプチドが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＡＡＶベクター。
３．ＫＣＴＤ７ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
４．ＫＣＴＤ７ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
５．ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
６．ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号３で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
７．ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８．ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９．ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１０．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列、またはこれらの任意の組合せを含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１１．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１３．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１４．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１５．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１６．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１７．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１８．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１９．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２０．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２１．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２２．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２３．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２４．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列がＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

２５．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列、またはこれらの任意の組合せを含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２６．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２７．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２８．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２９．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３０．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列がＡＡＶ６ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３１．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３２．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３３．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３４．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３５．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３６．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３７．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３８．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３９．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４０．プロモーター配列がＪｅＴプロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４１．ＪｅＴプロモーター配列が、配列番号８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４２．ポリＡ配列が、配列番号１１で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４３．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列、
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドが配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列。
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４４．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４５．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４６．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４７．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４８．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４９．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号４で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。

５０．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号５で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
５１．５’から３’の方向に
ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列
ｂ）配列番号８の核酸配列を含むプロモーター配列；
ｃ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号６で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ）配列番号９の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
５２．配列番号１０の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
５３．配列番号１１の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
５４．
ａ）先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、またはその相補体；および
ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
５５．
ａ）先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター；および
ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
５６．ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態５０または５１に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
５７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
５８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ２カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
５９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ３カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ４カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ５カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ６カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ７カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ８カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６５．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６６．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１０カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１１カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１２カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
６９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１３カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
７２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態５２に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。

組成物および医薬組成物
本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は医薬組成物であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。

医薬組成物は、本明細書に記載したように、薬理学の技術において既知のまたは開発された任意の方法によって製剤化することができ、その方法には、それだけに限らないが、活性成分（たとえばウイルス粒子または組み換えベクター）を賦形剤および／または添加物および／またはその他の補助的成分と接触させ、産生物を用量単位に分割または包装することが含まれる。本開示のウイルス粒子は、望ましい特徴、たとえば増大した安定性、増大した細胞トランスフェクション、持続したまたは遅延した放出、生体分布もしくは向性、コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの調節されたまたは増進された翻訳、およびコードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを有して製剤化され得る。

したがって、医薬組成物は、食塩水、脂質類、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（たとえば対象への移植のための）、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せをさらに含んでよい。一部の態様では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。一部の態様では、ナノ粒子は自己アセンブルした核酸ナノ粒子である。

本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製され、包装され、および／または販売され得る。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量に等しくおよび／またはそのような投薬量の都合の良い割合、たとえばそのような投薬量の半分または３分の１等である。本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤および／または添加物を、それぞれともにウイルスベクターの安定性を増大し、ウイルスベクターによる細胞のトランスフェクションまたは形質導入を増大し、ウイルスベクターによってコードされたタンパク質の発現を増大し、および／またはウイルスベクターによってコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更させる量で含み得る。一部の態様では、医薬組成物は、賦形剤および／または添加物を含む。賦形剤および／または添加物の非限定的な例には、溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁の助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、またはそれらの組合せが含まれる。

一部の態様では、医薬組成物は凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結中の物質に対する損傷を低減または排除することができる薬剤を指す。凍結保護剤の非限定的な例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、および／またはマンニトールが含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体のいずれか、たとえばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルジョン、たとえば水中油もしくは油中水エマルジョン、ならびに種々の種類の湿潤剤を包含する。組成物は安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。

一部の態様では、本開示の医薬組成物は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｄ－ソルビトール、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。

一部の態様では、医薬組成物はＰＢＳを含んでよく、ＰＢＳは約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約３００ｍＭ～約４００ｍＭの濃度で存在する。一部の態様では、塩化ナトリウムが約３５０ｍＭの濃度で存在してよい。

一部の態様では、医薬組成物はＤ－ソルビトールを含んでよく、Ｄ－ソルビトールは約１％～約１０％、または約２．５％～約７．５％の濃度で存在する。一部の態様では、Ｄ－ソルビトールは約５％の濃度で存在してよい。

即ち、本開示は、５％の濃度でＤ－ソルビトールを含む３５０ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液中に本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。

本開示の組成物を使用する方法
本開示は、開示した組成物または医薬組成物を用いる、たとえば細胞、組織、器官、動物、または対象に治療有効量の組成物または医薬組成物を投与する、または接触させる、当技術で既知のまたは本明細書に記載した細胞、組織、器官、動物、または対象における疾患または障害の処置のための開示した組成物または医薬組成物の使用を提供する。一態様では、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。

本開示は、疾患および／または障害を防止または処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するステップを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる方法を提供する。

処置方法は、本明細書に記載される疾患および／または障害の１つまたは複数の症状を緩和することができる。一実施形態では、本明細書に記載した組成物の送達によって、症状が検出可能になる前にＧＡＮ遺伝子の変異を有している対象に投与されれば、検出可能な症状の進行を防止しまたは遅延させることができる。したがって、処置は治療的または予防的であり得る。治療は、確立した症状または表現型の阻害または逆転を指す。治療は、症状または表現型の発症の遅延も意味し得る。予防は、既に明白な症状を呈していない対象における症状の進行を阻止または防止することを意味する。明白な症状を呈していない対象は、月齢１８か月、１２か月、または６か月以前に実施される適切な遺伝子検査によって、ＧＡＮ遺伝子の機能喪失変異を有すると若年期に特定することができる。

本開示の方法、組成物、医薬組成物、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターを用いて処置すべき対象は、本明細書に記載した疾患および／または症状のいずれをも有し得る。

本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）を、前記少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置で使用するための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを提供するが、前記ｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置を目的とする医薬を製造のための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの使用を提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。

一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の左迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置で使用するための少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターも提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の左迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置を目的とする医薬を製造するための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの使用も提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の左迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。

一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の右迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置で使用するための少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の右迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置を目的とする医薬を製造するための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの使用も提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の左迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。

本開示は、対象における自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）を、対象の迷走神経中に投与するステップを含む方法を提供する。

本開示は、対象における自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを対象の迷走神経中に投与するステップを含む方法を提供する。本開示は、対象における自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する方法で使用するための少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶベクターも提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する医薬を製造するための少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの使用も提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。

自律神経機能不全の症状には、構音障害（発声困難）、嚥下障害（嚥下困難）、消化管運動の制御に伴う問題（たとえば、食欲不振、腹部膨満、下痢、便秘を惹起する）、血圧の制御に伴う問題、および呼吸困難、起立性低血圧症（めまいおよび失神をもたらす）、運動不耐性（運動に伴い心拍数を変化させることができない）、発汗異常（発汗過剰および／または発汗不十分）、尿の問題（たとえば、排尿開始困難、失禁、および膀胱の残尿感）、および性的問題（たとえば、射精困難または勃起維持困難、腟乾燥、またはオルガスムを有することが困難）が含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。一部の態様では、自律神経機能不全は、神経学的障害を含む、ただしこれに限定されない特定の疾患および／または障害と関連し得る。

本開示は、遺伝子療法（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）が対象の自律神経系を標的とするようにする方法を提供し、同方法は、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を対象の迷走神経中に注射するステップを含む。

本開示は、ｒＡＡＶウイルスベクターが対象の自律神経系を標的とするようにする方法を提供し、同方法は、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを対象の迷走神経中に注射するステップを含む。本開示は、ｒＡＡＶウイルスベクターが対象の自律神経系を標的とするようにする方法で使用するための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターも提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、ｒＡＡＶウイルスベクターが対象の自律神経系を標的とするようにすることを目的とする医薬を製造するための、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの使用も提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。

本開示は、対象の自律神経系において外因性核酸を発現させる方法を提供し、同方法は、外因性核酸を含む組成物を、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するステップを含む。本開示は、対象の自律神経系において外因性核酸を発現させる方法で使用するための、外因性核酸を含む組成物を提供するが、前記組成物は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象の自律神経系において外因性核酸を発現させる方法のための医薬の製造における、外因性核酸を含む組成物の使用を提供するが、前記組成物は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。

一部の態様では、外因性核酸を含む組成物は、転写制御の下に置かれかつプロモーター配列と作動可能に連結された外因性核酸を含む組成物であり得る。一部の態様では、外因性核酸を含む組成物は、外因性核酸、および／または転写制御の下に置かれかつプロモーター配列と作動可能に連結された外因性核酸を含むｒＡＡＶウイルスベクターであり得る。

本開示は、対象の自律神経系において外因性ポリペプチドを発現させる方法を提供し、同方法は、対象の迷走神経中への注射を介して外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を対象に投与するステップを含む。本開示は、自律神経系において外因性ポリペプチドを発現させる方法で使用するための、外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供するが、前記組成物は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象の自律神経系において外因性ポリペプチドを発現させる方法で使用することを目的とする医薬の製造で使用するための、外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物の使用を提供するが、前記組成物は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。

一部の態様では、外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物は、転写制御の下に置かれかつプロモーター配列と作動可能に連結された外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であり得る。

一部の態様では、外因性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物は、転写制御の下に置かれかつプロモーター配列と作動可能に連結された外因性ポリペプチドをコードする核酸を含むｒＡＡＶウイルスベクターであり得る。

外因性核酸および／またはポリペプチドの発現は、自律神経系の特定領域における外因性核酸および／またはポリペプチドの発現を含み得る。自律神経系の特定領域の非限定的な例として、最後野、背側運動核、自律神経系の感覚ニューロン、自律神経系の運動ニューロン、節上神経節、迷走神経の背側運動核、迷走神経回路、疑核、または当技術分野において公知の自律神経系の任意のその他の部分が含まれる。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、少なくとも１つの量の遺伝子療法をこれまでに投与されたことのある対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を、前記少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を、前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含み、前記対象が初回遺伝子療法をこれまでに投与されたことのある、方法を提供する。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与される遺伝子療法は、初回遺伝子療法とは異なる遺伝子療法であり得る。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与される遺伝子療法は、初回遺伝子療法と同じ遺伝子療法であり得る。一部の態様では、初回遺伝子療法は、迷走神経ではない投与経路を介して投与された可能性がある。一部の態様では、初回遺伝子療法は、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で投与された可能性がある。一部の態様では、初回遺伝子療法は、髄腔内投与された可能性がある。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、少なくとも１つの量の初回ｒＡＡＶウイルスベクターをこれまでに投与されたことのある対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含み、前記対象が初回ｒＡＡＶウイルスベクターをこれまでに投与されたことのある、方法を提供する。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターは、初回ｒＡＡＶウイルスベクターとは異なるｒＡＡＶウイルスベクターであり得る。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターは、初回ｒＡＡＶウイルスベクターと同じであり得る。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターは、第１のＡＡＶカプシドタンパク質を含む可能性があり、また初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、第２のＡＡＶカプシドタンパク質を含む可能性があり、第１のＡＡＶカプシドタンパク質は、第２のＡＡＶカプシドタンパク質とは異なる血清型である。一部の態様では、対象の迷走神経を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターは第１のＡＡＶカプシドタンパク質を含む可能性があり、また初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、第２のＡＡＶカプシドタンパク質を含む可能性があり、第１のＡＡＶカプシドタンパク質は、第２のＡＡＶカプシドタンパク質（たとえば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質）と同じ血清型である。一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、迷走神経ではない投与経路を介して投与された可能性がある。一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で投与された可能性がある。一部の態様では、初回ｒＡＡＶウイルスベクターは、髄腔内投与された可能性がある。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、迷走神経中への注射を介して投与される遺伝子療法に対して血清陽性である対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を、前記少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含み、前記対象が前記遺伝子療法に対して血清陽性である、方法を提供する。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、迷走神経中への注射を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターと同じ血清型であるＡＡＶ粒子に対して血清陽性である対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含み、前記対象が、迷走神経中への注射を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターと同じ血清型であるＡＡＶ粒子に対して血清陽性である、方法を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「血清陽性」とは、対象の血液中に血清学的マーカーが存在することを指す。したがって、非限定的な例では、ＡＡＶ９カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターに対して血清陽性であるといわれる対象は、その血液中にＡＡＶ９カプシドを含むＡＡＶウイルスベクターを有する対象である。別の非限定的な例では、中和抗体に対して血清陽性であるといわれる対象は、その血液中に中和抗体を有する対象である。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、迷走神経中への注射を介して投与される遺伝子療法に対する中和抗体を有する対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を、前記少なくとも１つの治療有効量の遺伝子療法を前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含み、前記対象が前記遺伝子療法に対する中和抗体を有する、方法を提供する。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象は、迷走神経中への注射を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターと同じ血清型を有するＡＡＶ粒子に対する中和抗体を有する対象であり得る。したがって、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを迷走神経中に注射することにより投与するステップを含み、前記対象がｒＡＡＶウイルスベクターと同じ血清型を有するＡＡＶ粒子に対する中和抗体を有する、方法を提供する。非限定的な例では、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを迷走神経中に注射することにより投与するステップを含み、前記ｒＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ９カプシドタンパク質を含み、前記対象がＡＡＶ９カプシドを含むＡＡＶ粒子に対する中和抗体を有する、方法を提供する。

特定の血清型を有する遺伝子療法またはＡＡＶ粒子に対する中和抗体の存在は、当技術分野において標準的な、また当業者にとって公知の方法を使用して決定することができる。

本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、ａ）少なくとも１つの治療有効量の第１の遺伝子療法と、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法とを投与するステップを含み、前記少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法が、前記対象の迷走神経中への注射を介して投与される、方法を提供する。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置で使用するための、少なくとも１つの治療有効量の第１の遺伝子療法および少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法を提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置を目的とする医薬を製造するための、少なくとも１つの治療有効量の第１の遺伝子療法および少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法の使用を提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法は、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経であり得る。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経であり得る。

先行する方法および使用の一部の態様では、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法は同じであり得る。先行する方法および使用の一部の態様では、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法は異なる可能性がある。

先行する方法の一部の態様では、第１の遺伝子療法は、対象の迷走神経中への注射ではない投与経路を介して対象に投与され得る。一部の態様では、第１の遺伝子療法は、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で投与される。したがって、非限定的な例では、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、ａ）前記対象に髄腔内投与される、少なくとも１つの治療有効量の第１の遺伝子療法と、ｂ）前記対象の迷走神経中への注射を介して前記対象に投与される、少なくとも１つの治療有効量の第２の遺伝子療法とを投与するステップを含む方法を提供する。

本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、ａ）少なくとも１つの治療有効量の第１のｒＡＡＶウイルスベクターと、ｂ）少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターとを投与するステップを含み、前記少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターが、前記対象の迷走神経中への注射を介して投与される、方法を提供する。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置で使用するための、少なくとも１つの治療有効量の第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターも提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。本開示は、対象における疾患および／または障害の処置を目的とする医薬の製造における、少なくとも１つの治療有効量の第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターの使用も提供するが、前記少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射を介して対象に投与するためのものである。一部の態様では、迷走神経は左迷走神経であり得る。一部の態様では、迷走神経は右迷走神経であり得る。

先行する方法の一部の態様では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクターは同じであり得る。先行する方法の一部の態様では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクターは異なる可能性がある。

先行する方法の一部の態様では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクターは同じ血清型であり得る。したがって、非限定的な例では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターはＡＡＶ９カプシドタンパク質を含み、および第２のｒＡＡＶウイルスベクターはＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。

先行する方法の一部の態様では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象の迷走神経中への注射ではない投与経路を介して対象に投与される。一部の態様では、第１のｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で投与される。したがって、非限定的な例では、本開示は、対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、ａ）前記対象に髄腔内投与される、少なくとも１つの治療有効量の第１のｒＡＡＶウイルスベクターと、ｂ）前記対象の迷走神経中への注射を介して前記対象に投与される、少なくとも１つの治療有効量の第２のｒＡＡＶウイルスベクターとを投与するステップを含む方法を提供する。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象には、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法（たとえば、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクター）が投与され、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法は、時間的に近接した状態で投与可能である。

本明細書で使用される場合、用語「時間的に近接した状態」とは、一方の治療組成物（たとえば、第１の遺伝子療法）の投与が、別の治療組成物（たとえば、第２の遺伝子療法）の投与の前または後のある期間内に、一方の治療剤の治療効果が他方の治療剤の治療効果と重複するように起こることを指す。一部の実施形態では、一方の治療剤の治療効果は他方の治療剤の治療効果と完全に重複する。一部の実施形態では、「時間的に近接した状態」とは、一方の治療剤の投与が、別の治療剤の投与の前または後のある期間内に、一方の治療剤と他方の治療剤の間で相乗的効果が存在するように起こることを意味する。「時間的に近接した状態」は、治療剤が投与される対象の年齢、性別、体重、遺伝的背景、医学的状態、疾患履歴、および処置履歴、処置または良化の対象とされる疾患または状態；達成されるべき治療転帰；治療剤の投薬量、投与頻度、および投与期間；治療剤の薬物動態および薬力学；ならびに治療剤が投与される経路（複数可）を含む、ただしこれらに限定されない種々の因子によって変動し得る。一部の実施形態では、「時間的に近接した状態」とは、１５分以内、３０分以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日内、６日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、または８週間以内を意味する。一部の実施形態では、「時間的に近接した状態」とは、１ヶ月以内、２ヶ月以内、３ヶ月以内、４ヶ月以内、５ヶ月以内、６ヶ月以内、７ヶ月以内、８ヶ月以内、９ヶ月以内、１０ヶ月以内、１１ヶ月、または１２ヶ月以内を意味する。一部の実施形態では、「時間的に近接した状態」とは、１年以内、２年以内、３年以内、４年以内、５年以内、６年以内、７年以内、８年以内、９年以内、または１０年以内を意味する。一部の実施形態では、１つの治療剤の多回の投与は、別の治療剤の単一の投与と時間的に近接した状態で起こり得る。一部の実施形態では、時間的に近接した状態は、処置サイクル期間中または投与レジメン内で変化し得る。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象には、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法（たとえば、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクター）が投与され、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法は、同時に投与され得る。

本開示の方法および使用の一部の態様では、対象には、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法（たとえば、第１のｒＡＡＶウイルスベクターおよび第２のｒＡＡＶウイルスベクター）が投与され、第１の遺伝子療法および第２の遺伝子療法は、連続的に投与され得る。

本開示の方法および使用の一部の態様では、遺伝子療法は、脊髄性筋萎縮症、フリードリッヒの運動失調、ＣＬＮ３バッテン病、ＣＬＮ６バッテン病、ＣＬＮ７バッテン病、てんかん性脳症、リー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、ラフォラ病、ＳＬＣ１３Ａ５てんかん性脳症、グリコシル化の先天性疾患、タイプＩｑ、Ｋａｈｒｉｚｉ症候群、アンジェルマン症候群、レット症候群、痙性対麻痺、小児期の交代性片麻痺、およびツェルベーガースペクトラム障害のうちの少なくとも１つ以上を処置するために、当業者に公知の標準法に従って設計される遺伝子療法であり得る。非限定的な例では、当業者には認識されるように、遺伝子療法は、治療用タンパク質をコードする核酸を送達するように設計された遺伝子療法であり得るが、その場合、治療用タンパク質が発現すると、その結果、疾患及び／又は障害の処置が実現する。別の非限定的な例では、当業者には認識されるように、遺伝子療法は、内因性の核酸および／またはタンパク質の発現および／または活性を上方制御または下方制御する制御性核酸（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ等）を送達するように設計された遺伝子療法であり得る。

遺伝子療法の非限定的な例として、ウイルスに基づく遺伝子療法（たとえば、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター等）、非ウイルス性遺伝子療法（たとえば、直鎖状オリゴヌクレオチド、環状プラスミド、ヒト人工染色体）、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子療法、アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく遺伝子療法、ナノ粒子媒介式の遺伝子療法、または当技術分野において公知の任意のその他の遺伝子療法が含まれる。遺伝子療法は、ウイルスベクター（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）、プラスミド、バクテリオファージ、細菌染色体、人工染色体、トランスポゾン、または任意のこれらの組合せを含み得る。

遺伝子療法は遺伝子発現カセットを含み得る。発現カセットは環状または直鎖状核酸分子であり得る。いくつかのケースでは、発現カセットは、ベクター（たとえば、発現ベクター）の状態で細胞（たとえば、標的細胞もしくは細胞型および／または非標的細胞型を含む、複数の異なる細胞または細胞型）に送達される。遺伝子発現カセットは、遺伝子、たとえばコドン最適化された遺伝子等の発現を推進するように設計され得る。遺伝子の例を表１に示す。発現カセットは、研究用として、またたとえば表１に示す遺伝障害に対する遺伝子置換戦略を試験するために使用され得る。発現カセットは、このような遺伝子欠陥に起因する障害、疾患、または状態を処置するためにも使用され得る。

遺伝子発現カセットは、カセットが導入された細胞内で機能的遺伝子を発現することができる。発現カセットは、たとえば高、中、または低の強度で発現させるためのプロモーターを含み得る。発現カセットは、多くのまたは全ての組織において発現させるための遍在性プロモーターを含み得る。任意の組織特異的プロモーターが、本明細書で提供される発現カセット内に含まれ得る。本明細書で提供される発現カセットに含まれる遺伝子は、最適な遺伝子発現を容易にするためにコドン最適化され得る。したがって、遺伝子の配列は非自然発生的であり得る。

一部の実施形態では、神経学的障害に付随する遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットが本明細書で提供される（たとえば、表１を参照）。遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、（Ｉ）たとえば表１で表されるポリヌクレオチド、または（ＩＩ）表１に示す遺伝子に対して少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、少なくとも９９．９％の同一性、およびその間の任意の数値もしくは範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、本明細書で提供される発現カセットに含まれる遺伝子は、ヒト遺伝子である。本明細書で提供される発現カセットに含まれる遺伝子は、コドン最適化され得る。

本明細書で提供される発現カセットは、遺伝子の発現を推進するプロモーターをさらに含み得る。たとえば遍在的、構成的、誘起的、および組織特異的プロモーターを含む、任意のプロモーターが使用され得る。ヒト、類人猿、サル、マウス、ラット、ニワトリ等を含む、任意の種に由来するプロモーターが使用され得る。一実施形態では、遺伝子の発現を推進するプロモーターは、高強度の遍在性プロモーターである。一実施形態では、遺伝子の発現を推進するプロモーターは、ニューロン特異的発現を提供し得るプロモーターである。

遺伝子発現に影響を及ぼすことができる追加の制御エレメントおよびその他のエレメント、たとえばＫｏｚａｋコンセンサス配列、ポリ（Ａ）シグナル、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）等が、本明細書で提供される発現カセット内に含まれ得る。

ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、それぞれ約１４５塩基の対称的な配列である。ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムの５’および３’末端に位置する。ＩＴＲは効率的なＡＡＶゲノム増殖にとって重要である。ＩＴＲ配列は、たとえば、ＡＡＶベクター内で、異種ポリヌクレオチド、即ちＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチドに隣接することができる。

変異したＩＴＲが、本明細書で提供される発現カセット内に含まれ得る。５’ＩＴＲおよび／または３’ＩＴＲは変異し得る。一実施形態では、５’ＩＴＲが変異している。一実施形態では、３’ＩＴＲが変異している。一実施形態では、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが変異している。ＩＴＲは、自己相補性となるように変異し得る。一実施形態では、３’ＩＴＲが自己相補性となるように変異している。

本開示の方法および使用の一部の態様では、迷走神経は左迷走神経である。本開示の方法および使用の一部の態様では、迷走神経は右迷走神経である。

本開示の方法および使用の一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターは、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶウイルスベクターを含む、ただしこれに限定されない、本明細書に記載されるｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかであり得る。

一部の態様では、疾患および／または障害は、ＧＡＮ遺伝子が関与する遺伝障害であり得る。ＧＡＮ遺伝子が関与する遺伝障害は、ＧＡＮの喪失、機能不全、および／または欠損であり得る。

一部の態様では、疾患はＧＡＮタンパク質が関与する障害であり得る。ＧＡＮタンパク質が関与する遺伝障害は、ＧＡＮの喪失、機能不全、および／または欠損であり得る。

疾患および／または障害は、巨大軸索ニューロパチーであり得る。

一部の態様では、疾患および／または障害は、対象のゲノム内に存在するＧＡＮ遺伝子の少なくとも１つのコピーの機能喪失によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。一部の態様では、疾患および／または障害は、対象のゲノム内に存在するＧＡＮ遺伝子の少なくとも１つのコピーの機能低下によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。一部の態様では、疾患および／または障害は、対象のゲノム内に存在するＧＡＮ遺伝子の少なくとも１つのコピーに含まれる少なくとも１つの突然変異における、少なくとも１つの突然変異によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。

本明細書で提供される方法に含まれる対象は、ＧＡＮ遺伝子および／またはＧＡＮタンパク質が欠損している可能性がある。本明細書で使用される場合、「ＧＡＮ遺伝子の欠損」とは、対象が、ＧＡＮ遺伝子内に１つまたは複数の突然変異を有し得るかまたは機能的なＧＡＮ遺伝子を欠いていることを意味する。本明細書で使用される場合、「ＧＡＮタンパク質の欠損」とは、対象が、ＧＡＮタンパク質内に１つまたは複数の突然変異を有し得るかまたは機能的なＧＡＮタンパク質を欠いていることを意味する。

ＧＡＮ遺伝子またはＧＡＮタンパク質内の突然変異は、当技術分野において公知である任意の種類の突然変異であり得る。変異の非限定的な例には、体細胞変異、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、ナンセンス変異、挿入、欠失、重複、フレームシフト変異、反復拡張、短い挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）、長いＩＮＤＥＬ、選択的スプライシング、選択的スプライシングの産物、改変された翻訳の開始、改変された翻訳の開始の産物、プロテオーム切断、プロテオーム切断の産物が含まれる。

一部の態様では、疾患および／または障害は、疾患および／または障害を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＧＡＮ遺伝子の発現減少によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。一部の態様では、発現の低下は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であってよい。

一部の態様では、疾患および／または障害は、疾患および／または障害を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＧＡＮタンパク質量の減少によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。一部の態様では、ＧＡＮタンパク質量の減少は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であり得る。

一部の態様では、疾患および／または障害は、疾患および／または障害を有しない対照の対象と比較した、対象におけるＧＡＮタンパク質の活性減少によって特徴付けられる疾患および／または障害であり得る。一部の態様では、ＧＡＮタンパク質の活性減少は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であり得る。

本開示の方法および使用の一部の態様では、疾患および／または障害は神経系の障害であり得る。

本開示の方法および使用の一部の態様では、疾患および／または障害は、脊髄性筋萎縮症、フリードリッヒの運動失調、ＣＬＮ３バッテン病、ＣＬＮ６バッテン病、ＣＬＮ７バッテン病、てんかん性脳症、リー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、ラフォラ病、ＳＬＣ１３Ａ５てんかん性脳症、グリコシル化の先天性疾患、タイプＩｑ、Ｋａｈｒｉｚｉ症候群、アンジェルマン症候群、レット症候群、痙性対麻痺、小児期の交代性片麻痺、およびツェルベーガースペクトラム障害のうちの１つまたは複数であり得る。代表的な神経系障害を、障害に付随する代表的な遺伝子およびポリヌクレオチドを含め、下記の表１に示す。これらの代表的な遺伝子およびポリヌクレオチドは、１つまたは複数の神経系障害に付随する治療ポリペプチドをコードする。

一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満、または年齢１歳未満、または年齢１．５歳未満、または年齢２歳未満、または年齢２．５歳未満、または年齢３歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢４歳未満、または年齢４．５歳未満、または年齢５歳未満、または年齢５．５歳未満、または年齢６歳未満、または年齢６．５歳未満、または年齢７歳未満、または年齢７．５歳未満、または年齢８歳未満、または年齢８．５歳未満、または年齢９歳未満、または年齢９．５歳未満、または年齢１０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１１歳未満、年齢１２歳未満、年齢１３歳未満、年齢１４歳未満、年齢１５歳未満、年齢２０歳未満、年齢３０歳未満、年齢４０歳未満、年齢５０歳未満、年齢６０歳未満、年齢７０歳未満、年齢８０歳未満、年齢９０歳未満、年齢１００歳未満、年齢１１０歳未満、または年齢１２０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢４歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１０歳未満であってよい。

本明細書で開示した処置および防止の方法は、治療または防止のための患者を特定および選択するために適切な診断手法と組み合わせてよい。

本開示は、宿主細胞を本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つと接触させることを含む、宿主細胞中のタンパク質のレベルを増加させる方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは、タンパク質をコードするトランスジーン核酸分子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む。一部の態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。一部の態様では、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の態様では、宿主細胞は対象由来である。一部の態様では、対象は正常な対象におけるタンパク質のレベルおよび／または機能と比較して低下したタンパク質のレベルおよび／または機能をもたらす障害に罹患している。

一部の態様では、タンパク質のレベルは、宿主細胞中で約１×１０^－７ｎｇ、約３×１０^－７ｎｇ、約５×１０^－７ｎｇ、約７×１０^－７ｎｇ、約９×１０^－７ｎｇ、約１×１０^－６ｎｇ、約２×１０^－６ｎｇ、約３×１０^－６ｎｇ、約４×１０^－６ｎｇ、約６×１０^－６ｎｇ、約７×１０^－６ｎｇ、約８×１０^－６ｎｇ、約９×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－６ｎｇ、約１２×１０^－６ｎｇ、約１４×１０^－６ｎｇ、約１６×１０^－６ｎｇ、約１８×１０^－６ｎｇ、約２０×１０^－６ｎｇ、約２５×１０^－６ｎｇ、約３０×１０^－６ｎｇ、約３５×１０^－６ｎｇ、約４０×１０^－６ｎｇ、約４５×１０^－６ｎｇ、約５０×１０^－６ｎｇ、約５５×１０^－６ｎｇ、約６０×１０^－６ｎｇ、約６５×１０^－６ｎｇ、約７０×１０^－６ｎｇ、約７５×１０^－６ｎｇ、約８０×１０^－６ｎｇ、約８５×１０^－６ｎｇ、約９０×１０^－６ｎｇ、約９５×１０^－６ｎｇ、約１０×１０^－５ｎｇ、約２０×１０^－５ｎｇ、約３０×１０^－５ｎｇ、約４０×１０^－５ｎｇ、約５０×１０^－５ｎｇ、約６０×１０^－５ｎｇ、約７０×１０^－５ｎｇ、約８０×１０^－５ｎｇ、または約９０×１０^－５ｎｇのレベルに増加している。

本開示は、細胞を有効量の本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのうちいずれか１つと接触させることを含む、対象における細胞に目的の遺伝子を導入する方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは目的の遺伝子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのうちいずれか１つを含む。

本開示の方法の一部の態様では、対象には、本開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶウイルスベクターを投与することに加えて、予防的免疫抑制処置レジメンを施行することもできる。一部の態様では、免疫抑制処置レジメンには、少なくとも１つの免疫抑制治療剤を投与することが含まれる。免疫抑制治療剤の非限定的な例には、それだけに限らないが、シロリムス（ラパマイシン）、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、ＩＶメチルプレドニソロン、プレドニソン、またはそれらの任意の組合せが含まれる。免疫抑制治療剤は、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の日に先立って、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与と同じ日に、またはｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の後の任意の日に、投与してよい。

診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物等の動物、またはヒトである。対象は特定の種に限定されず、限定なしに類人猿、ネズミ、ラット、イヌ、またはウサギ種を含む、診断または処置の対象となる非ヒト動物、および感染または動物のモデルの対象となるもの、ならびにその他の家畜、スポーツ動物、またはペットを含む。一部の態様では、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、対象における疾患の「処置すること」または「処置」は、（１）疾患を阻止しまたはその進行を阻むこと、または（２）疾患もしくは疾患の症状を改善しまたはその退行を惹起することを指す。当技術で理解されているように、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは望ましい結果には、検出可能であってもなくても、１つまたは複数の、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の逓減、状態（疾患を含む）の状況の安定化（即ち、悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅らせること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全面的であっても）が含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「防止すること」または疾患の「防止」は、疾患に罹患しやすい、または疾患の症状がまだ表れていない対象における発生から症状または疾患を防止することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」および／または「治療有効量」とは、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図している。治療または予防の用途に関しては、有効量は、問題の状態の種類および重症度、ならびに個別の対象の特徴、たとえば一般的健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する忍容性に依存することになる。遺伝子治療に関しては、有効量は、対象において欠如している遺伝子の部分的または完全な機能の回復をもたらすために十分な量であってよい。一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターの有効量は、ＧＡＮポリペプチドが産生されるような対象における遺伝子の発現をもたらすために十分な量である。一部の態様では、有効量は、それを必要とする対象におけるガラクトースの代謝を増大させるために必要な量である。当業者であれば、これらのおよびその他の因子に応じて適切な量を決定することができよう。

一部の態様では、有効量は、問題の用途の大きさおよび性質に依存することになる。これは標的の対象および使用する方法の性質および感受性に依存することにもなる。当業者であれば、これらのおよびその他の考慮に基づいて有効量を決定することができよう。有効量は、実施形態に応じた組成物の１つまたは複数の投与を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。

本明細書で使用される場合、用語「投与する」または「投与」は、ヒトまたは動物等の対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象の年齢、健康状態、または性別によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医またはペットおよびその他の動物の場合には処置する獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。

最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。投薬量は投与の経路に影響され得ることが注意される。好適な投薬処方および薬剤を投与する方法は当技術で既知である。そのような好適な投薬量の非限定的な例は、投与あたり１０^９ベクターゲノムの低い量から１０^１７ベクターゲノムの高い量までであってよい。

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約１０^９～約１０^１７の範囲である。一部の態様では、約１０^１０～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１３、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１６、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１５、約５×１０^１１～約５×１０^１２、約１０^１１～約１０^１８、約１０^１３～約１０^１６、または約１０^１２～約１０^１３個のウイルス粒子が対象に投与される。

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、少なくとも約１０^１０、または少なくとも約１０^１１、または少なくとも約１０^１２、または少なくとも約１０^１３、または少なくとも約１０^１４、または少なくとも約１０^１５、または少なくとも約１０^１６、または少なくとも約１０^１７個のウイルス粒子である。

本明細書に記載される方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約３．５×１０^１３個のウイルス粒子である。本明細書に記載される方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約３．５×１０^１４個のウイルス粒子である。本明細書に記載される方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえば、ｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約３．５×１０^１３個～約３．５×１０^１４個のウイルス粒子である。

本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は対象の年齢に依存し得る。非限定的な例では、７歳またはそれ以上の年齢の対象には約１０×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約４歳～約７歳の年齢の対象には約１０×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約３歳～約４歳の年齢の対象には約９×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約２歳～約３歳の年齢の対象には約８．２×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約１歳～約２歳の年齢の対象には約７．３×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳～約１歳の年齢の対象には約４×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳未満の年齢の対象には３×１０^１４個のウイルス粒子を投与してよい。

一部の態様では、組成物、医薬組成物中のウイルス粒子の量、または患者に投与されるウイルス粒子の量は、ウイルスゲノムを含むと予測されるウイルス粒子のパーセンテージに基づいて計算することができる。

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ内、脳槽内で対象に導入してよい。そのような導入は、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、大脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、神経内、またはそれらの任意の組合せであってもよい。一部の態様では、ウイルス粒子は所望の標的組織に、たとえば非限定的な例として、肺、眼、またはＣＮＳに送達される。一部の態様では、ウイルス粒子の送達は全身的である。脳槽内の投与経路には、脳室の脳脊髄液への薬物の直接投与が含まれる。これは、大槽への直接注射または永久的に位置したチューブによって実施し得る。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは髄腔内に投与される。

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象における遺伝子欠損を修復する。一部の態様では、成功裡に処理された細胞、組織、器官、または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修復されていない標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの比は、少なくとも約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、マススペクトル、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける蛍光、次世代シーケンシング、イムノブロット、およびＥＬＩＳＡを含むがそれらに限らない当技術で既知の任意の方法によって決定することができる。

本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物の投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物は、注射、注入、または移植によって非経口的に投与される。

一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、脳および頸椎に増進された向性を示す。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。

製造方法
本開示のｒＡＡＶウイルスベクターを産生するために種々のアプローチを用い得る。一部の態様では、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を用いることによって、パッケージングが達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの産生を容易にするエレメントおよび配列を含んでいる。別の態様では、ヘルパープラスミドはパッケージング細胞株のゲノムの中に安定に組み込まれ、それによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによるさらなるトランスフェクションを必要としない。

一部の態様では、細胞はパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株である。一部の態様では、ヘルパー細胞株は真核細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。一部の態様では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。

一部の態様では、細胞はテトラサイクリンアクチベータータンパク質をコードする核酸、およびテトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターを含む。一部の態様では、テトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターは、構造的プロモーターである。一部の態様では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。

ヘルパープラスミドはたとえば、複製能のあるＡＡＶを産生せず、複製能のないＡＡＶをパッケージングするためおよび複製能のないＡＡＶをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を高いタイターで産生するために必要なトランスオールビリオンタンパク質をコードする複製能のないウイルスゲノムから誘導された少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。

ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術で既知であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２３５１７４Ａ１号を参照されたい。そこで述べられているように、ＡＡＶヘルパープラスミドはヘルパーウイルスとしてＤＮＡ配列、非限定的な例としてそれぞれの元のプロモーターまたは異種プロモーターによって制御されるＡｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含み得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にするために、蛍光タンパク質等のマーカータンパク質の発現のための発現カセットをさらに含んでよい。

本開示は、パッケージング細胞株を本明細書で開示したＡＡＶヘルパープラスミドのいずれか１つおよび本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つでトランスフェクトすることを含む、ｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法を提供する。一部の態様では、ＡＡＶヘルパープラスミドとｒＡＡＶベクターはパッケージング細胞株に共トランスフェクトされる。一部の態様では、細胞株は哺乳動物細胞株、たとえばヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書で開示したｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つを含む細胞を提供する。

本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関連する用語「ヘルパー」は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか１つの複製およびパッケージングのために必要なさらなる成分を提供するために用いられるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分は、ビリオンのアセンブリー、カプシド封入、ゲノムの複製、および／またはパッケージングのために必要な任意の遺伝子を含み得る。たとえば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物とともに用いるために好適なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。一部の態様では、ｐＨＥＬＰプラスミドはｐＨＥＬＰＫプラスミドであってよく、この場合はアンピシリン発現カセットがカナマイシン発現カセットに交換される。

本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために用いられる細胞である。組み換えＡＡＶウイルスベクターの産生には、トランスで提供されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにＡＡＶの複製を助けるアデノウイルス由来の遺伝子配列が必要である。一部の態様では、パッケージング／ヘルパー細胞が、細胞のゲノムの中に安定に組み込まれるプラスミドを含む。他の態様では、パッケージング細胞は過渡的にトランスフェクトされ得る。典型的には、パッケージング細胞は真核細胞、たとえば哺乳動物細胞または昆虫細胞である。

キット
本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物は、治療、診断、または研究の用途におけるその使用を容易にするために、医薬用または診断用または研究用のキットにアセンブルしてよい。一部の態様では、本開示のキットは、本明細書に記載したように、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、医薬組成物、宿主細胞、単離された組織のいずれか１つを含む。

一部の態様では、キットは使用説明書をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載した１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の意図された用途および正しい使用を記載した説明書とともに含んでよい。一部の態様では、キットは、キットの１つもしくは複数の成分を混合し、および／または試料を単離し混合して対象に適用するための説明書を含んでよい。一部の態様では、キット中の薬剤は医薬製剤中にあり、特定の用途および薬剤の投与の方法に適した投薬量である。研究目的用のキットは、種々の実験を行なうために適切な濃度または量で成分を含み得る。

キットは、本明細書に記載した方法の使用を容易にするように設計され、多くの形態を取ることができる。キットの成分のそれぞれは、適用できる場合には、液体形態（たとえば溶液中）または固体形態（たとえば乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の例では、組成物のいくつかは、たとえば、キットとともに提供されてもよく提供されなくてもよい好適な溶媒または他の種（たとえば、水または細胞培養培地）によって再構成または他の方法で処理（たとえば活性形に）することができる。一部の態様では、組成物は保存溶液（たとえば凍結保存溶液）中で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。一部の態様では、保存溶液はある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含む。

一部の態様では、キットは、本明細書に記載した成分のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の容器中に含む。即ち、一部の態様では、キットは、本明細書に記載した薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は無菌的に調製され、シリンジに包装され、冷蔵で出荷され得る。あるいは、保存のために薬剤をバイアルまたはその他の容器中に収容してもよい。第２の容器が無菌的に調製された他の薬剤を有してもよい。あるいは、キットは、事前に混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、またはその他の容器中で出荷された活性薬剤を含んでよい。キットは、対象に薬剤を投与するために必要な部品、たとえばシリンジ、局所適用デバイス、またはＩＶニードルチューブおよびバッグの１つもしくは複数または全てを有してよい。

さらなる定義
文脈によって他が指示されない限り、本明細書に記載した本発明の種々の特徴は任意の組合せで用いることができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の態様で、本明細書で説明した任意の特徴または特徴の組合せを除外または削除してよいことも意図している。説明のため、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書で述べている場合には、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで削除または放棄してよいことが特に意図されている。

他に明示的に示さない限り、全ての特定した態様、実施形態、特徴、および用語は、引用した態様、実施形態、特徴、または用語と、その生物学的等価物の両方を含むことが意図されている。

本技術の実施には、他に指示がない限り、当技術の技能の範囲内にある有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来の手法が採用されることになる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８７））を参照されたい。

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が引用した要素を含むが、他を排除しないことを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、移行句「実質的に～からなる」（および文法的変形）は、引用した材料またはステップ、および引用した実施形態の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料またはステップを包含すると解釈すべきである。即ち、本明細書で使用される用語「実質的に～からなる」は、「含む」と等価であると解釈するべきではない。「からなる」は、他の成分および本明細書で開示した組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量を超える要素を排除することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。本明細書におけるそれぞれの例において、用語「含む」、「実質的に～からなる」、および「からなる」のいずれも、それらの元の意味を保持したままで他の２つの句によって置き換えることができる。本明細書に記載したいずれの単一の用語、単一の要素、単一の句、用語の群、または要素の群は、特許請求の範囲からそれぞれ具体的に除外され得る。

全ての数値指定、たとえば範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは±１５％、１０％、５％、２％の変動で、（＋）または（－）に変動する近似である。常に明示的に述べてはいないが、全ての数値指定には、用語「約」が先行していることを理解されたい。常に明示的に述べてはいないが、本明細書に記載した試薬は単に例示的なものであり、その等価物が当技術で既知であることも理解されたい。量または濃度その他の測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定した量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％でさえもの変動を包含することを意味している。

用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示した任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を記載するために使用される場合には、前記の成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙した項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）で説明される場合には組合せの欠如を指し、包含する。

具体的に引用しない限り、用語「宿主細胞」は、たとえば真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。真核生物宿主細胞の非限定的な例には、類人猿、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、およびヒト、たとえばＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。

本明細書で使用される用語「単離された」は、実質的に他の材料を含まない分子または生物製剤または細胞材料を指す。

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は相互交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態を指す。即ち、この用語には、それだけに限らないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導されたヌクレオチド塩基を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなるポリマーが含まれる。

「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写され翻訳された際に生成するアミノ酸配列（たとえばペプチドまたはポリペプチド）を指す。

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステップのプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合には、発現は真核細胞内におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「転写の制御下」は当技術でよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存していることを示す。「作動可能に連結されている」は、ポリヌクレオチドが細胞中において機能することを可能にする様式で配置されていることを意図している。一態様では、プロモーターは下流配列に作動可能に連結されていてよい。

用語「コードする」は、それがポリヌクレオチドおよび／または核酸配列に適用される場合には、その塩基配列が、ポリペプチドおよび／またはその断片に翻訳されるＲＮＡ転写物（たとえば、ｍＲＮＡ転写物）の塩基配列と同一であるならば、ポリペプチドを「コードしている」と称されるポリヌクレオチドおよび／または核酸配列を指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードする配列はそれから推測することができる。

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は相互交換可能に使用され、その最も広い意味においてアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体の２つ以上のサブユニットの化合物を指す。サブユニットはペプチド結合で連結されていてよい。別の態様では、サブユニットは他の結合、たとえばエステル、エーテル、その他で連結されていてよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸の最大の数には制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然、または合成のアミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、新たに合成された分泌性または膜のポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図している。これはポリペプチドを特定の細胞内位置に、たとえば細胞膜を横切って、細胞膜の中に、または核の中に、指向するように作用する。一部の態様では、シグナルペプチドは局在化の後で除去される。シグナルペプチドの例は当技術で公知である。非限定的な例としては、米国特許第８，８５３，３８１号、第５，９５８，７３６号、および第８，７９５，９６５号に記載されたものがある。一部の態様では、シグナルペプチドはＩＤＵＡシグナルペプチドであってよい。

用語「等価」または「生物学的等価」は、特定の分子、生物学的材料、または細胞材料に言及する場合には、相互交換可能に使用され、最小の相同性を有しながらそれでも所望の構造または機能性を維持している特定の分子、生物学的材料、または細胞材料を意図している。等価のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリペプチド（たとえば野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、または参照ポリヌクレオチド（たとえば野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドが含まれる。

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較の目的でアラインさせたそれぞれの配列において位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、それらの分子はその位置において同一である。配列の間の同一性の程度は、それらの配列によって共有される一致した位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同性」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性を共有している。アラインメントおよび配列同一性パーセントは、前記核酸またはアミノ酸の配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）にインポートし、これを用いることによって、本明細書で提供した核酸またはアミノ酸の配列について決定することができる。たとえば、本明細書で見出したタンパク質配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質について）重みマトリックスを用いて生成した。一部の態様では、本明細書で見出した核酸配列を用いて核酸配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡについて）重みマトリックスを用いて生成される。

本明細書で使用される場合、アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入であってよい。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。保存的置き換え（保存的変異、保存的置換、または保存的変形とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を同様の生化学的特性（たとえば電荷、疎水性、または大きさ）を有する異なるアミノ酸に変更する、タンパク質中のアミノ酸の置き換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変形」は、アミノ酸残基の、別の生物学的に同様の残基による置き換えを指す。保存的変形の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン等の１つの疎水性残基の別の残基への置換、または１つの荷電したもしくは極性の残基の別の残基への置換、たとえばアルギニンのリジンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、グルタミンのアスパラギンへの置換、その他が含まれる。保存的置換のその他の説明的な例には、アラニンからセリン、アスパラギンからグルタミンもしくはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンもしくはグルタミン、リジンからアルギニン、グルタミン、もしくはグルタミン酸、フェニルアラニンからチロシン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンもしくはフェニルアラニン、その他の変更が含まれる。

本明細書で開示したポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子移送」、「形質導入」等は、導入のために用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチド（時には「トランスジーン」と称される）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、種々の周知の手法、たとえばベクター媒介遺伝子移送（たとえばウイルス感染／トランスフェクション、またはその他の種々のタンパク質系もしくは脂質系の遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする手法（たとえばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために用いられる他の種々の手法）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、安定的または過渡的に宿主細胞中に維持され得る。安定的な維持には、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製の起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、たとえば染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）、または核もしくはミトコンドリアの染色体に統合されることが必要である。当技術において既知で本明細書に記載しているように、いくつかのベクターが遺伝子の哺乳動物細胞への移送を媒介することができることが知られている。

「プラスミド」は、典型的には染色体ＤＮＡとは離れていて独立にこれを複製することができるＤＮＡ分子である。多くの例で、これは環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で水平的遺伝子移送のための機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは競争的な環境的地位において天然産生の抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を運搬し、あるいは産生されたタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用し得る。プラスミドベクターは染色体外環状ＤＮＡ分子として存在することが多い一方、プラスミドベクターはランダムにまたは標的とされた様式で宿主染色体中に安定的に統合されるようにも設計され、そのような統合は環状プラスミドまたは宿主細胞への導入の前に線状化されたプラスミドを用いて達成できることが当技術で知られている。

遺伝子操作で用いられる「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような使用のために多くのプラスミドが市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子を含むプラスミドのコピー、およびいくつかの一般に用いられる制限部位を含み、この位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にする短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）の中に挿入される。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作成することである。この場合には、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌または真核細胞が研究者によって増殖され、これらは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が産生されるように誘起することができる。

遺伝子移送がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランスジーンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるポリヌクレオチドを指す。

用語「組織」は、生きているもしくは死亡した生命体の組織または生きているもしくは死亡した生命体から誘導されもしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書において使用される。組織は健康であっても、疾患を有していても、および／または遺伝的変異を有していてもよい。生物学的組織は、任意の単一の組織（たとえば相互に連結されていてもよい細胞の集合）または生命体の身体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均一な細胞材料を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよく、またはたとえば肺組織、骨格組織、および／または筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域において見出されるようなコンポジット構造であってもよい。例示的な組織には、それだけに限らないが、肝、肺、甲状腺、皮膚、膵、血管、膀胱、腎、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸から誘導された組織が含まれ、それらの任意の組合せが含まれ得る。

実施例１－迷走神経を介する遺伝子療法の投与は、自律神経系において外因性タンパク質の発現をもたらす

下記の非限定的な実施例は、迷走神経を介するｒＡＡＶウイルスベクターの投与は、自律神経系において外因性タンパク質の発現をもたらすことを実証する。

ＧＦＰレポータータンパク質をコードする核酸配列を含むＡＡＶ９ウイルスベクターを、ラットの左迷走神経中に注射した。次にＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡検査を介して評価した。図１に示すように、ＧＦＰ発現が、迷走神経（図１において矢印により示される）、迷走神経の背側運動核（図１においてアステリクスにより示される）、および疑核（図１において星型により示される）を含む、中枢神経系および末梢神経系に連結する迷走神経回路内に観察された。これらの結果は、迷走神経を介する遺伝子療法、たとえばｒＡＡＶウイルスベクター等の投与が、遺伝子療法が対象の自律神経系を効率的に標的とするようにし、これにより外因性のタンパク質および／または核酸の発現を可能にするのに使用され得ることを示す。

実施例２－迷走神経を介する遺伝子療法の投与は、該遺伝子療法に対して事前免疫化された対象においてさえも外因性タンパク質の発現をもたらす。

下記の非限定的な実施例は、迷走神経を介するｒＡＡＶウイルスベクターの投与は、ｒＡＡＶウイルスベクターに対して事前免疫化された（即ち、ｒＡＡＶウイルスベクターに対する中和抗体を有し、および／または同じ血清型を有するＡＡＶ粒子に対して血清陽性である）対象においてさえも、外因性タンパク質の発現をもたらすことを実証する。

第１の実験において、ラットを、ギガキソニン（ＧＡＮ）ポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶ９ウイルスベクターの髄腔内注射により、ＡＡＶ９ウイルスベクターに対して事前免疫化した。引き続いて、ラットには、ＧＦＰレポータータンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶ９ウイルスベクターを、左迷走神経中への注射を介して投与した。次にＧＦＰ発現を解析した。図２に示すように、強いＧＦＰ発現が、左節上神経節の神経細胞体（図２の左側パネル）および左頚部迷走神経線維（図２の右側パネル）を含む末梢神経系において観察された。

第２の実験では、ラットを、未処置（以後「非免疫化ラット」と称する）のままとするか、またはＡＡＶ９ウイルスベクターの髄腔内発現により、ＡＡＶ９ウイルスベクターに対して事前免疫化した（以後「免疫化ラット」と称する）。引き続いて、左迷走神経中への注射を介して、ＧＦＰレポータータンパク質をコードする核酸を含むＡＡＶ９ウイルスベクターをラットに投与した。次にＧＦＰ発現を解析した。図３に示すように、迷走神経の背側運動核（図３において「ＤＭＮ Ｘ」として示される）および孤束核（図３において「Ｓｏｌ Ｎ ｌａｔ」として示される）における発現を含む、強いＧＦＰ発現が、事前免疫化されたラット（右側パネル）においてさえも観察された。

これらの結果は、ＡＡＶ粒子の特定の血清型に対して中和抗体を有し得る（たとえば、ＡＡＶに基づく遺伝子療法がこれまでに投与されたことに起因して）対象において、迷走神経を介して引き続くＡＡＶに基づく遺伝子療法を投与することで、処置の中和を回避し、そして外因性タンパク質の発現を効果的に推進することができることを実証する。

実施例３－迷走神経を介する遺伝子療法の投与は、巨大軸索ニューロパチーのラットモデルにおいて自律神経機能不全を効果的に処置する

下記の非限定的な実施例は、迷走神経中への注射を介するｒＡＡＶウイルスベクターの投与は、巨大軸索ニューロパチー、より具体的には、巨大軸索ニューロパチーに付随する自律神経機能不全を効果的に処置することができることを実証する。

下記の実験において、巨大軸索ニューロパチーのラットモデルを試験した。巨大軸索ニューロパチーのラットモデルは、突然変異ＧＡＮポリペプチドをコードする遺伝子をラットに導入することにより確立した。このラットを、本明細書ではＧＡＮノックイン（ＫＩ）ラットと称する。

月齢４か月のときに、ＧＡＮ ＫＩラットを、ａ）媒体対照を用いて処置し（以後「ＧＡＮ ＫＩ」）；ｂ）ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶ９ウイルスベクター（ＡＡＶ９／ＧＡＮ）を用いて、髄腔内注射を介して処置し（以後「ＧＡＮ ＫＩ ＩＴ」）；またはｃ）髄腔内注射を介しおよび左迷走神経中への注射を介する両経路で投与されるＡＡＶ９／ＧＡＮを用いて処置した（以後「ＧＡＮ ＫＩ ＩＴ＋ＶＮ」）。月齢２０か月の時に、次にラットに１ｍｇ／ｋｇピロカルピンの腹腔内注射を施し、そして自律神経機能に付随する生理学的応答を、ラットに移植された無線テレメトリーデバイスを使用して記録した。この解析の結果を図４に示す。

図４に示すように、ピロカルピン処置が負荷された場合、対照ラットと比較して、ＧＡＮ ＫＩラットは、呼吸（図４の左側パネル）、血圧（図４の中央パネル）、および心拍数（図４の右側パネル）について異常な自律神経応答制御を示した。対照的に、ＡＡＶ９／ＧＡＮをＩＴ経路のみ（ＧＡＮ ＫＩ ＩＴ）で送達したとき、呼吸および血圧が改善した。ＡＡＶ９／ＧＡＮのＩＴ＋ＶＮ複合式の送達（ＧＡＮ ＫＩ ＩＴ＋ＶＮ）では、対照（野生型ラット）と比較して、ＩＴ単独よりも優れた有効性を示し、呼吸、血圧、および心拍数応答が正常化した。１処置群当たり、対照ラット４例を解析し、またＧＡＮ ＫＩラット５例を解析した。

これらの結果は、迷走神経中への注射を介して、ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸を含むｒＡＡＶウイルスベクターを投与することで、迷走神経を介する投与がｒＡＡＶウイルスベクターの髄腔内投与と併用される場合を含め、巨大軸索ニューロパチー、より具体的には、巨大軸索ニューロパチーに付随する自律神経機能不全を効果的に処置することができることを実証する。

Claims (24)

1. 対象における疾患および／または障害を処置する方法であって、少なくとも１つの治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルスベクターを、前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の迷走神経中に注射することにより、前記対象に投与するステップを含む、方法。
2. 前記迷走神経が、前記対象の左迷走神経である、請求項１に記載の方法。
3. 前記疾患および／または障害が、神経学的疾患および／または障害である、請求項１に記載の方法。
4. 前記神経学的疾患および／または障害が、少なくとも１つの自律神経機能不全により特徴付けられ、および前記迷走神経中への注射を介する前記少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターの投与が、前記少なくとも１つの自律神経機能不全の少なくとも１つの症状を緩和する、請求項３に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つの症状が、構音障害、嚥下障害、消化管運動の不適切な制御、血圧の不適切な制御、呼吸困難、起立性低血圧症、発汗異常、尿道の不適切な制御、性機能障害、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記疾患および／または障害が、脊髄性筋萎縮症、フリードリッヒの運動失調、ＣＬＮ３バッテン病、ＣＬＮ６バッテン病、ＣＬＮ７バッテン病、てんかん性脳症、リー症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、巨大軸索ニューロパチー、ラフォラ病、ＳＬＣ１３Ａ５てんかん性脳症、グリコシル化の先天性疾患、タイプＩｑ、Ｋａｈｒｉｚｉ症候群、アンジェルマン症候群、レット症候群、痙性対麻痺、小児期の交代性片麻痺、およびツェルベーガースペクトラム障害から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記疾患および／または障害が、巨大軸索ニューロパチーである、請求項６に記載の方法。
8. 前記ｒＡＡＶウイルスベクターが、
   （ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、
   （ｉｉ）５’から３’の方向に
   ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
   ｂ）プロモーター配列、
   ｃ）ギガキソニン（ＧＡＮ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子、
   ｄ）ポリＡ配列；および
   ｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
   を含むｒＡＡＶベクターとを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＧＡＮポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＧＡＮポリペプチドをコードする核酸配列が、ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であり、前記ＧＡＮポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列が、配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記プロモーター配列が、配列番号８で表される核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記ポリＡ配列が、配列番号９で表される核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
13. 前記プロモーター配列が配列番号８で表される核酸配列を含み、前記ＧＡＮポリペプチドが配列番号３で表される核酸配列を含み；および前記ポリＡ配列が配列番号９で表される核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
14. 前記ｒＡＡＶベクターが、配列番号１０で表される核酸配列を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項８に記載の方法。
16. 前記ｒＡＡＶウイルスベクターが、ウイルス粒子約３．５×１０^１３個～約３．５×１０^１４個の量で投与される、請求項１に記載の方法。
17. 前記対象が、少なくとも１つの治療有効量の初回ｒＡＡＶウイルスベクターをこれまでに投与されたことのある、請求項１に記載の方法。
18. 前記初回ｒＡＡＶウイルスベクターが、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖａｌｌｙ）、胸膜内、局所、リンパ節内、脳槽内、または神経内（ｉｎｔｒａｎｅｒｖｅ）で前記対象に投与された、請求項１７に記載の方法。
19. 前記初回ｒＡＡＶウイルスベクターが、前記対象に髄腔内投与された、請求項１８に記載の方法。
20. 前記初回ｒＡＡＶウイルスベクターが、前記対象の迷走神経中への注射を介して投与されるｒＡＡＶウイルスベクターと同じである、請求項１７に記載の方法。
21. 前記対象が、前記ｒＡＡＶウイルスベクターに対する中和抗体を有する、請求項１に記載の方法。
22. 対象における巨大軸索ニューロパチーを処置する方法であって、
    ａ）第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記対象に髄腔内投与するステップと、
    ｂ）少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを、前記少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターを前記対象の左迷走神経中に注射することにより、投与するステップと
    を含み、
    前記ｒＡＡＶウイルスベクターが、
    （ｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、
    （ｉｉ）配列番号１０で表される核酸配列を含むｒＡＡＶベクターと
    を含む、方法。
23. 前記第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターおよび前記少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターが、連続的に投与される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第１の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターおよび前記少なくとも第２の治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターが、同時に投与される、請求項２２に記載の方法。

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