JP2023534026A - 多部分遺伝子送達のための組み換えアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Abstract

遺伝子療法を改善するための組み換えＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルスベクター、及びカプシドタンパク質、並びに多部分（例えば、二部分）送達系におけるそれらの製造及び使用のための方法が本明細書に提供される。本ベクターは導入遺伝子の分割部を提供し、細胞中でそれらの組み換えを方向付けて、完全な導入遺伝子を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月１４日に出願された米国仮出願第６３／０５１，７２１号、及び２０２１年４月２６日に出願された米国仮出願第６３／１７９，６１２号の利益を主張するものであり、これらの全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

参照による配列表の組み込み
本明細書に添えて電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＡＢＥＯ＿００７＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日：２０２１年７月１２日、ファイルサイズ：約７２１キロバイト）。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子療法のための送達ベクターとして有望である。しかしながら、それらの治療有効性は、ある特定のサイズを超える遺伝子の送達に関する制限によって損なわれる。例えば、スタルガルト病は、若年性黄斑変性を引き起こす遺伝性網膜疾患である。常染色体劣性スタルガルト病は、ＡＢＣＡ４遺伝子の変異によって引き起こされる。ヒトＡＢＣＡ４遺伝子のＯＲＦは、長さが約６．８ｋｂであり、これはＡＡＶベクターの典型である約４．７ｋｂのパッケージング能力を超過する。したがって、大きな遺伝子を提供するためのＡＡＶウイルスベクターアプローチが緊急に必要とされている。

本開示は、概して、遺伝子療法の分野に関し、具体的には、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子（ＡＡＶウイルスベクターとしても知られる）、疾患又は障害を処置又は予防するために導入遺伝子を多部分（例えば、二部分）アプローチで送達するためのその使用に関する。

一態様では、本開示は、ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）導入遺伝子の５’部分、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
（ｅ）組み換え部位、
（ｆ）リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）ポリＡ部位、及び
（ｈ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
リコンビナーゼの発現が、プロモーターに作動可能に連結する、ＡＡＶベクターゲノム、を提供する。

実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。実施形態では、リコンビナーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。実施形態では、組み換え部位は、ＬｏｘＰ７１配列を含む。実施形態では、本ＡＡＶベクターゲノムは、組み換え部位とリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、導入遺伝子の５’部分、内部切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内にある。実施形態では、内部切断ポリペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される自己切断ペプチドである。実施形態では、本ＡＡＶベクターゲノムは、組み換え部位とリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み、ＩＲＥＳは、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する。

実施形態では、導入遺伝子はポリペプチドをコードする。実施形態では、ポリペプチドはＡＢＣＡ４タンパク質である。

実施形態では、プロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、又はα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである。実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、ヒト光受容体間結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ）、ヒト赤色／緑色オプシンプロモーター（ｐＲ２．１）、ヒト青色オプシンプロモーター（ＨＢ）、マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、マウス短波長オプシンプロモーター（ｍＢＰ）、又はヒトロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター（βＰＤＥ）である。

一態様では、本開示は、ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、ＡＡＶベクターゲノム、を提供する。

一態様では、本開示は、本開示のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶベクターを提供する。一態様では、本開示は、本開示のＡＡＶベクターゲノムを含むポリヌクレオチドを提供する。

一態様では、本開示は、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び（ｉｉ）本開示のＡＡＶベクターゲノム、を含む、ＡＡＶウイルス粒子を提供する。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１～３、６７、７１、１９６、２０５、及び２０６から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９９％、又は１００％同一である。

一態様では、本開示は、本開示のＡＡＶベクターゲノム又は本開示のＡＡＶウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、本医薬組成物は、
（ｉ）本開示のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子と、
（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子であって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子と、を含み、
第１のＡＡＶウイルス粒子のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位、及び第２のＡＡＶウイルス粒子の第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位により、逆行組み換えが防止される。

一態様では、本開示は、遺伝子欠損によって引き起こされる疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、
（１）対象に、第１のＡＡＶウイルス粒子であって、
（ｉ）第１のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
（ｉｉ）本開示のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第１のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、
（２）対象に、第２のＡＡＶウイルス粒子であって、
（ｉ）第２のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、並びに
（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、を含む、方法を提供する。
実施形態では、第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、第１のＡＡＶウイルス粒子のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位及び第２のＡＡＶウイルス粒子の第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位を介した、第１のＡＡＶベクターゲノム及び第２のＡＡＶベクターゲノムの組み換えが生じる。実施形態では、第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、ポリペプチドの発現が生じる。実施形態では、第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子は、同時投与又は順次投与される。実施形態では、第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子は、同時投与される。実施形態では、ウイルス粒子は網膜下注射により投与される。実施形態では、遺伝子欠損は、ＡＢＣＡ４遺伝子欠損である。実施形態では、ＡＢＣＡ４遺伝子欠損により、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の低下、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の除去、変異ＡＢＣＡ４タンパク質の発現、及びＡＢＣＡ４タンパク質の機能の低下からなる群から選択される１つ以上の状態がもたらされる。

一態様では、本開示は、細胞内でポリペプチドを発現させる方法であって、
（１）本開示のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子を用いて前記細胞を形質導入することであって、導入遺伝子がポリペプチドをコードする、形質導入することと、
（２）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子を用いて細胞を形質導入することであって、第２のＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、形質導入することと、を含む、方法を提供する。

実施形態では、リコンビナーゼの安定した発現は、形質導入細胞において検出されない。実施形態では、ポリペプチドはＡＢＣＡ４タンパク質である。

一態様では、本開示は、形質導入細胞であって、
（ｉ）遺伝子の欠損ゲノムコピーと、
（ｉｉ）第１の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）導入遺伝子の５’部分、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
（ｅ）組み換え部位、
（ｆ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｇ）導入遺伝子の３’部分、
（ｈ）ポリＡ部位、及び
（ｉ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
導入遺伝子が、４．６～７．７ｋｂの長さを有する、第１の組み換え核酸と、
（ｉｉｉ）第２の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ逆位末端反復、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、第２の組み換え核酸がプロモーターを欠く、第２の組み換え核酸と、を含む、形質導入細胞、を提供する。

実施形態では、リコンビナーゼの安定した発現は、形質導入細胞において検出されない。実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。実施形態では、導入遺伝子はＡＢＣＡ４遺伝子をコードする。実施形態では、細胞はエクスビボ細胞である。

多部分遺伝子送達のための例示的なＡＡＶベクターゲノムを示す。図１Ａは、二部分遺伝子送達のための例示的なＡＡＶベクターゲノムを示す。「ＩＴＲ」は「逆位末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」を意味する。「ＳＤ」は「スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）」を意味する。「ＲＳ」は「組み換え部位（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」を意味する。「ＩＣ」は「内部切断ポリペプチド（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を意味する。「Ｒｅｃ」は「リコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）」を意味する。「ＮＬＳ」は「核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を意味する。「ｐＡ」は「ポリＡ部位（ｐｏｌｙ－Ａ ｓｉｔｅ）」を意味する。「ＳＡ」は「スプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ）」を意味する。図１Ｂは、三分した導入遺伝子の多部分遺伝子送達のための例示的なＡＡＶベクターゲノムを示す。「ＩＴＲ」は「逆位末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」を意味する。「ＳＤ」は「スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）」を意味する。「ＲＳ」は「組み換え部位（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」を意味する。「ＩＣ」は「内部切断ポリペプチド（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を意味する。「Ｒｅｃ」は「リコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）」を意味する。「ＮＬＳ」は「核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を意味する。「ｐＡ」は「ポリＡ部位（ｐｏｌｙ－Ａ ｓｉｔｅ）」を意味する。「ＳＡ」は「スプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ）」を意味する。 同上。 組織培養研究で使用するＡＢＣＡ４構築物を示す。 Ｌｅｃ２細胞にトランスフェクトされた部分的ＡＢＣＡ４構築物の組み換えによって媒介される全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現のためのＣｒｅリコンビナーゼの必要性を示す。 様々なＡＢＣＡ４構築物でトランスフェクトしたＬｅｃ２細胞における組み換え全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現レベルを示す。 部分的ＡＢＣＡ４構築物の組み換え後の、Ｌｅｃ２細胞における自己切断されたＣｒｅリコンビナーゼの安定な発現の欠如を示す。 様々なＡＢＣＡ４構築物でトランスフェクトしたＬｅｃ２細胞における全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。 指示されたＡＡＶ９ウイルス粒子で形質導入した細胞における全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの経時的な発現レベルを示す。 ＡＢＣＡ４遺伝子のＡＡＶベクターゲノムの二部分送達の代表的な図を示す。図７Ａは、ヒトＲＫプロモーター、ＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子、及び他のゲノム要素を含む、第１のＡＡＶベクターゲノム（５’ＡＢＣＡ４＋Ｃｒｅ）の構築を示す。図７Ｂは、ＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分及び他のゲノム要素を含む、第２のＡＡＶベクターゲノム（３’ＡＢＣＡ４）の構築を示す。 同上。

本開示による実施形態を、以降でより完全に説明する。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、また本明細書に記載する実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であるように提供され、また本発明の範囲を当業者に完全に伝達することになる。本明細書の記述で使用される用語は、特定の実施形態の記述の目的のみのものであり、限定することを意図しない。

別途定義がない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術的用語及び科学的用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義される用語などの用語は、本出願及び関連技術の文脈においてその意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、また本明細書に明示的に定義されない限り、理想化された意味又は過度に形式的な意味で解釈されるべきでないことが更に理解されるであろう。

文脈で別途示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図される。更に、本開示はまた、実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略することができることも企図する。例証するために、本明細書が、複合体が構成成分Ａ、Ｂ、及びＣを含むと記載する場合、Ａ、Ｂ、若しくはＣ、又はそれらの組み合わせのいずれかを省略し、かつ単独で又は任意の組み合わせで放棄することができることが具体的に意図される。

別途明示的な指示がない限り、指定された一部の実施形態、特徴、及び用語は全て、列挙された実施形態、特徴、又は用語、並びにその生物学的同等物の両方を含むことを意図する。

参照による組み込み
本明細書に引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、及び特許出願は、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、及び特許出願に言及することは、世界中の任意の国で、有効な先行技術を構成する、又は共通の一般知識の一部を形成するという承認又は任意の形態の示唆として解釈するべきではない。

定義
本技術の実践は、別途指示がない限り、当技術分野の技術範囲内の、有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組み換えＤＮＡの従来の技法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、及びＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。

本発明の記述及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途指示を明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」（及び文法的変形）という移行句は、列挙された材料又はステップ、及び列挙された実施形態の基本的な特徴及び新規の特徴に実質的に影響を与えないものを包含するものとして解釈されるべきである。それ故に、本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」という用語は、「含む」と同等のものとして解釈されるべきではない。「からなる」は、微量元素より多い他の成分を排除すること、及び本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。

範囲を含む全ての数字表示（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量など）は、１．０又は０．１の増分で、適宜に、又は代替的に、＋／－１５％、１０％、５％、２％の変動だけ、（＋）又は（－）に変化する近似である。必ずしも明示的に記載されるわけではないが、全ての数字表示は、用語「約」が先行することが理解されるべきである。また、必ずしも明示的には記載されないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的であり、またそのようなものと同等のものが当技術分野で既知であることも、理解されるべきである。量又は濃度及びこれに類するものなどの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された量の１０％の変動を包含することを意味する。

本明細書に開示される任意の構成要素、範囲、用量形態などの選択を説明するために使用されるとき、「許容可能な」、「有効な」、又は「十分な」という用語は、該構成要素、範囲、用量形態などが、開示される目的に好適であることを意図する。

また、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせだけでなく、代替物（「又は」）で解釈される場合、組み合わせの欠如を指し、かつ包含する。

具体的に列挙されない限り、「宿主細胞」という用語は、例えば、真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む真核宿主細胞を含む。真核宿主細胞の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、及びヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞及び２９３Ｔ細胞が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、他の材料から実質的に遊離している分子若しくは生物学的物質又は細胞物質を指す。

本明細書で使用される場合、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために同じ意味で使用される。それ故に、この用語は、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基若しくは他の天然塩基、化学的若しくは生化学的に修飾された塩基、非天然塩基、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなるポリマーを含むが、これらに限定されない。

「遺伝子」は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードする能力を有する少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」、又は代替的に、「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写されかつ翻訳されたときに生成されるアミノ酸配列（例えば、ペプチド又はポリペプチド）を指す。

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステップのプロセス及び／又は転写ｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。

「転写制御下」は、当技術分野でよく理解されている用語であり、かつポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、又は転写を促進する要素に作動可能に連結していることに依存することを示す。「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドが細胞内で機能することを可能にする様態で配設されることを意図する。例えば、プロモーターは、下流配列に作動可能に連結されてもよい。

ポリヌクレオチドに適用される場合、「コードする」という用語は、その天然状態で、又は当業者に周知の方法によって操作されたときに、ポリペプチド及び／又はその断片に対するｍＲＮＡを産生するために転写することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、こうした核酸の補体であり、またコード化配列は、そこから推測することができる。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子又は導入遺伝子などのコード配列の開始及び転写速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列を意味する。プロモーターは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、又は組織特異的であってもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合し得る遺伝的要素を含有してもよい。非限定的な例示的なプロモーターとしては、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、ヒト光受容体間結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ）、ヒト赤色／緑色オプシンプロモーター（ｐＲ２．１）、ヒト青色オプシンプロモーター（ＨＢ）、マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、マウス短波長オプシンプロモーター（ｍＢＰ）（短波長オプシンプロモーターは、Ｓ－オプシンプロモーター又は青色オプシンプロモーターとも称され得る）、ヒトロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター（βＰＤＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、核内低分子ＲＮＡ（Ｕ１ａ又はＵ１ｂ）、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、又はＥＦＩプロモーターが挙げられる。

本明細書に提供される追加の非限定的な例示的プロモーターとしては、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５ポリヘドリン、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、及びα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加又は減少させるために修飾されてもよいことが当技術分野で知られている。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５－１４５（７ＳＫ、Ｕ６、及びＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを修飾して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を廃止し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激する）を参照されたい。合成由来プロモーターは、ユビキタス又は組織特異的発現に使用されてもよい。更に、ウイルス由来プロモーター（そのうちのいくつかは上述した）は、本明細書に開示される方法、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、及びＡＡＶプロモーターにおいて有用であってもよい。実施形態では、本プロモーターは、転写効率を増加させるためにエンハンサーとともに使用される。エンハンサーの非限定的な例としては、間質レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、又はＣＭＶエンハンサーが挙げられる。

エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節要素である。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を提供する能力を有する配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」であっても「外因性」であってもよく、「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結しているものである。「外因性」又は「異種」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子に並置される。本明細書に提供される方法、組成物、及び構築物における使用のための連結したエンハンサー／プロモーターの非限定的な例としては、ＰＤＥプロモーター＋ＩＲＢＰエンハンサー又はＣＭＶエンハンサー＋Ｕ１ａプロモーターが挙げられる。当技術分野では、エンハンサーは、ある距離から、かつ内因性プロモーター又は異種プロモーターの場所に対するその向きに関係なく作動することができることが理解される。それ故に、プロモーターからある距離で作動するエンハンサーは、それ故にベクター内のその場所、又はプロモーターの場所に対するその向きに関係なく、そのプロモーターに「作動可能に連結される」ことが更に理解される。

「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸、アミノ酸類似体、又はペプチド模倣体の２つ以上のサブユニットの化合物を指すために、同じ意味で、かつその最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結してもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結してもよい。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有する必要があり、またタンパク質又はペプチドの配列を含むか、本質的にそれなるか、又はそれからなることができるアミノ酸の最大数には制限が設けられない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、並びにＤ及びＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／若しくは非天然又は合成のアミノ酸のいずれかを指す。

本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」又は「シグナルポリペプチド」という用語は、通常、新たに合成された分泌性ポリペプチド若しくは膜ポリペプチド又はタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列を意図する。これは、ポリペプチドを、例えば、細胞膜を横切って、細胞膜の中へ、又は核の中へと特定の細胞部位に方向付けるように作用する。実施形態では、シグナルペプチドは、局在化後に除去される。シグナルペプチドの例は、当技術分野で周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号、同第５，９５８，７３６号、及び同第８，７９５，９６５号に記載されるものである。更なる非限定的な例として、シグナルペプチドは、ＩＤＵＡシグナルペプチドとすることができる。

「同等の」又は「生物学的同等の」という用語は、特定の分子、生物学的物質、又は細胞物質を指す場合、同じ意味で使用され、また所望の構造又は機能性を依然として維持する一方で、最小限の相同性を有するものを意図する。同等のポリペプチドの非限定的な例としては、参照ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、又は参照ポリヌクレオチド（例えば、野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％の配列同一性、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが挙げられる。

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較目的で整列されてもよい各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占有される場合、分子は、その位置において同一である。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される合致する位置の数の関数である。「無関係」又は「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性しか共有していない。アライメント及び配列同一性パーセントは、核酸配列又はアミノ酸配列について、本明細書に提供される核酸配列又はアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／において入手可能）へと、かつこれを使用してインポートすることによって、決定されてもよい。例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷパラメータは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質用）重量マトリクスを使用して生成することができる。実施形態では、本明細書で見出される核酸配列を使用して核酸配列アライメントを実施するために使用されるＣｌｕｓｔａｌＷパラメータは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡ用）重みマトリクスを使用して生成される。

本明細書で使用される場合、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸挿入であってもよい。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的置き換え（保存的変異、保存的置換、又は保存的変動とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、又はサイズ）を有する異なるアミノ酸へと変化させる、タンパク質におけるアミノ酸の置き換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変動」は、別の生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の置き換えを指す。保存的変動の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、若しくはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別のものに対する置換、又は、一方の荷電残基若しくは極性残基の他方による置換、例えば、リジンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、アスパラギンのグルタミンによる置換が挙げられる。保存的置換の他の実例としては、アラニンのセリンへの変更、アスパラギンからグルタミン又はヒスチジンへの変更、アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩への変更、システインからセリンへの変更、グリシンからプロリンへの変更、ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミンへの変更、リジンからアルギニン、グルタミン、又はグルタミン酸塩への変更、フェニルアラニンからチロシン、セリンからトレオニンへの変更、トレオニンからセリンへの変更、トリプトファンからチロシンへの変更、チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンへの変更、及びこれに類するものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、インタクトなレプリコンを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる核酸を指し、これによりベクターは細胞内に定置されたときに、例えば、トランスフェクション、感染、又は形質転換のプロセスによって、複製されてもよい。一旦細胞の内側に入ると、ベクターは染色体外（エピソーム）要素として複製される場合、又は宿主細胞染色体の中へと組み込まれる場合があることが当技術分野で理解される。ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、修飾バキュロウイルス、パポバウイルス、ＡＡＶウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどに由来する核酸が含まれ得る。Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクター及びＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子療法及び免疫療法で使用するために開発されている。例えば、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４－４３９、及びＹｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３－８２７を参照されたい。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターとしては、ネイキッドＤＮＡ；カチオン性脂質と複合体を形成したＤＮＡ、単独のＤＮＡ、又はカチオン性ポリマーと組み合わせたＤＮＡ；アニオン性リポソーム及びカチオン性リポソーム；一部の事例ではリポソーム内に含有される、異種ポリリシン、長さが定義されたオリゴペプチド、及びポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを用いて凝縮されたＤＮＡを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる、ＤＮＡ－タンパク質複合体及び粒子；並びにウイルス及びポリリシン－ＤＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれらからなる三重複合体の使用が挙げられる。

一般的な組み換え技法に関して、プロモーターと、ポリヌクレオチドを中へと作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含有するベクターは、当技術分野で周知である。こうしたベクターは、インビトロ又はインビボでＲＮＡを転写する能力を有し、またＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）及びＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。発現及び／又はインビトロ転写を最適化するために、転写レベル又は翻訳レベルのいずれかにおいて、発現を妨げる、又は減少させる場合がある、過剰な、可能性のある不適切な代替的翻訳開始コドン又は他の配列を削除するために、クローニングされた導入遺伝子の５’及び／又は３’非翻訳部分を除去、追加、又は変更する必要がある場合がある。代替的に、コンセンサスリボソーム結合部位を、発現を強化するために、５’の開始コドンにすぐに挿入することができる。

本明細書で使用される場合、「組み換え発現系」又は「組み換えベクター」という用語は、組み換えによって形成された、ある特定の遺伝的物質の発現のための遺伝子構築物又は構築物を指す。

「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞へと運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、天然ポリマー及び合成ポリマーを含むリポソーム、ミセル生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；細菌；バキュロウイルス、アデノウイルス、及びレトロウイルスなどのウイルス；バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、及び真菌ベクター；並びに当技術分野で典型的に使用される他の組み換えビヒクルであり、これらは、様々な真核宿主及び原核宿主における発現のために記述されており、また遺伝子療法だけでなく、単純なタンパク質発現にも使用されてもよい。また、同じく、標的抗体又はその断片を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなるリポソームを、本明細書に開示される方法に使用することができる。細胞又は細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、本明細書に記載されるタンパク質を細胞又は細胞集団に直接導入することは、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法によって行うことができ、代替的に本明細書に開示されるタンパク質の発現を増強及び／又は活性を促進することができる条件を育むことは、他の非限定的な技法である。

本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞又は組織に送達することができる。「遺伝子送達」、「遺伝子導入」、「形質導入」、及びこれに類するものは、本明細書で使用される場合、導入に使用される方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す用語である（時として「導入遺伝子」とも称される）。こうした方法としては、ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、又は様々な他のタンパク質ベース若しくは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）だけでなく、「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を促進する技法（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、及びポリヌクレオチドの導入のために使用される様々な他の技法）などの様々な周知の技法が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に安定的に又は一時的に維持されてもよい。安定的な維持は、典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製の起源を含有するか、又は染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）若しくは核若しくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコンの中へと組み込むことを必要とする。数多くのベクターが、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞への遺伝子の移動を媒介する能力を有することが知られている。

「プラスミド」は、典型的に染色体ＤＮＡから分離し、かつ染色体ＤＮＡから独立して複製する能力を有するＤＮＡ分子である。多くの場合、これは円形状かつ二本鎖である。プラスミドは、微生物集団内の水平遺伝子導入のための機構を提供し、また典型的には、所与の環境的状態下で選択的優位性を提供する。プラスミドは、競合する環境的ニッチにおいて自然発生する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を担持する場合も、代替的に、産生されたタンパク質は、類似の状況下で毒素として作用する場合もある。プラスミドベクターは、染色体外環状ＤＮＡ分子として存在することが多いが、プラスミドベクターは、ランダムな又は標的化された様態のいずれかで宿主染色体内に安定的に統合されるように設計される場合があり、またこうした組み込みは、円形プラスミド又は宿主細胞への導入前に直線化されたプラスミドのいずれかを使用して達成される場合があることが当技術分野で知られている。

遺伝子工学で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドは、こうした使用のために市販されている。複製される遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞に耐性を持たせる遺伝子を含有するプラスミドのコピー、及びいくつかの一般的に使用される制限部位を含有し、この場所でのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする短い領域である、複数のクローニング部位（ＭＣＳ、又はポリリンカー）へと挿入される。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者らは、対象の遺伝子を担持するプラスミドを含有する細菌又は真核細胞を成長させ、これを挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することができる。

本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」という用語は、この名称と関連付けられ、かつＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、共感染ヘルパーウイルスによってある特定の機能が提供される細胞でのみ成長する、一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報及びレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見られる。様々な血清型が、遺伝子的なレベルであっても、構造的及び機能的に非常に密接に関連していることが周知なため、これらのレビューに記載される同じ原理がレビューの公表日以降に特徴付けられる追加的なＡＡＶ血清型にも適用可能であることが、十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明白に呈し、かつ全てが、ＡＡＶ２で発現されるものなどの、３つの関連するカプシドタンパク質を保持する。関連度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを明らかにするヘテロ二本鎖解析、及び「逆位末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における相似の自己アニーリングセグメントの存在によって更に示唆される。類似の感染性パターンも、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることを示唆する。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に好適であることが知られており、全ての既知の血清型が、様々な組織型由来の細胞に感染することができる。少なくとも１１個の連続番号の天然ＡＡＶ血清型が当技術分野で既知である。本明細書に開示される方法で有用な非限定的で例示的な血清型には、これら１１個の血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はバリアント血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質であるＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３を指す。実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ １１０、ＡＡＶ ２０４、ＡＡＶ ２１４、ＡＡＶ ２１４Ａ、ＡＡＶ ２１４ｅ、ＡＡＶ ２１４ｅ８、ＡＡＶ ２１４ｅ９、ＡＡＶ ２１４ｅ１０、ＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５、及びＡＡＶ ２１４ＡＢからなる群から選択されるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、１つ以上の異種核酸（ＨＮＡ）配列と１つ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）とを含むベクターを指す。こうしたＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子産物及びｃａｐ遺伝子産物の機能性を提供する宿主細胞中で複製され、ＩＴＲ及びＩＴＲ間の核酸が感染性ウイルス粒子の中へとパッケージングされることを可能にすることができる。実施形態では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質又はＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、及び／又は感染性ＡＡＶ粒子の中へとパッケージングされる隣接するＩＴＲ内のエンハンサー及び／又はターミネーターを含む。ＩＴＲ及びＩＴＲ間の核酸は、ＡＡＶカスピッドへとカプシド形成されてもよく、このカプシド形成された核酸は、「ＡＡＶベクターゲノム」と称されてもよい。ＡＡＶベクターは、カプシド部分に加えて、例えば、製造目的のためにプラスミドに含まれるが、ＡＡＶ粒子にパッケージングされない、抗生物質耐性遺伝子又は当技術分野で既知の他の要素を含有してもよい。

本明細書で使用される場合、「ウイルスカプシド」又は「カプシド」という用語は、ウイルス粒子のタンパク性シェル又は被覆を指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシドで包み、保護し、輸送し、かつ／又は宿主細胞の中へと放出する機能を果たす。カプシドは、概して、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）からなる。本明細書で使用される場合、「カプシドで包む」という用語は、ウイルスカプシド内に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは、３つのウイルスカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の混合物から構成される。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の混合物は、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）又は１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比率でＴ＝１の正２０面体対称で配設された６０個のモノマーを含有し、これは、各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｏｎｎｔａｇ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｎｅ ２０１０）．「Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ」． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． １０７（２２）：１０２２０－５、及びＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）．「Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ：ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ」． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１－８に記載されているとおりである。

「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター粒子」又は「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、本明細書ではＡＡＶベクターゲノムと称されるＡＡＶベクターに由来するカプシドで包まれたポリヌクレオチドとから構成される、ウイルス粒子を指す。

本明細書で使用される場合、ウイルス又はプラスミドに関して「ヘルパー」という用語は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターゲノムのうちのいずれか１つの複製及びパッケージングのために必要な追加的な構成要素を提供するために使用されるウイルス又はプラスミドを指す。ヘルパーウイルス又はプラスミドによってコードされる構成要素は、ビリオンアセンブリ、カプシド形成、ゲノム複製、及び／又はパッケージングに必要とされる任意の遺伝子を含んでもよい。例えば、ヘルパーウイルス又はプラスミドは、宿主細胞中のウイルスゲノムの複製に必要な酵素又は他の因子をコードしてもよい。ＡＡＶ構築物での使用に好適なヘルパーウイルス及びプラスミドの非限定的な例としては、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、又はヘルペスウイルス（ウイルス）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（又はヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために使用される細胞である。組み換えＡＡＶウイルスベクターの産生は、トランスで提供されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質、並びにＡＡＶ複製を助けるアデノウイルス遺伝子配列も必要とする。いくつかの態様では、パッケージング／ヘルパー細胞は、安定的に細胞のゲノムの中へと組み込まれるプラスミドを含有する。他の態様では、パッケージング細胞は一時的にトランスフェクトされてもよい。典型的に、パッケージング細胞は、哺乳動物細胞又は昆虫細胞などの真核細胞である。

本明細書で使用される場合、レポータータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結して、プロモーターの発現（例えば、組織特異性及び／又は強度）をアッセイする、検出可能なタンパク質である。態様では、レポータータンパク質は、別のポリペプチドに作動可能に連結してもよい。態様では、レポータータンパク質は、ＤＮＡ送達方法のモニタリング、プロモーター及びエンハンサー要素の機能的識別及び特徴付け、翻訳及び転写調節、ｍＲＮＡプロセシング、並びにタンパク質タンパク質相互作用に使用されてもよい。レポータータンパク質の非限定的な例としては、Ｂ－ガラクトシダーゼ；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質；ルシフェラーゼ；グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。

実施形態では、本明細書の組成物は、医薬的に許容可能な担体を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水などの標準的な医薬担体、水、及び油／水又は水／油エマルションなどのエマルション、並びに様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤及び保存剤も含むことができる。担体、安定剤、及びアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。

診断又は処置の「対象」は、細胞、又は哺乳動物若しくはヒトなどの動物である。対象は、特定の種に限定されず、また診断又は処置の対象となる非ヒト動物、及び感染又は動物モデルの対象となる非ヒト動物を含み、サル、ネズミ、ラット、イヌ、又はウサギ種だけでなく、他の家畜、スポーツ動物、又はペットが挙げられるがこれらに限定されない。実施形態では、対象はヒトである。

「組織」という用語は、本明細書では、生きている若しくは死亡した生命体の組織、あるいは生きている若しくは死亡した生命体に由来するか、又はそれらを模倣するよう設計された任意の組織を指すために使用される。組織は、健康であっても、疾患を有しても、遺伝子変異を有してもよい。生物学的組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続され得る細胞の集まり）、又は生命体の身体の器官若しくは一部若しくは領域を作り上げている組織の群を含んでもよい。組織は、均質な細胞物質を含んでも、本質的に均質な細胞物質からなっても、均質な細胞物質からなってもよく、例えば、肺組織、骨格組織、及び／又は筋組織を含むことができる胸郭を含む身体の領域に見られるような複合構造であってもよい。例示的な組織としては、眼、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、及び腸に由来するものが挙げられ、その任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、対象における疾患を「処置すること」又は疾患の「処置」は、（１）疾患にかかりやすいか、又は疾患の症状をまだ示さない対象において、症状又は疾患が発生することを防止すること、（２）疾患を阻害するか、又はその発症を停止させること、あるいは（３）疾患又は疾患の症状の改善又は退縮を引き起こすことを指す。当技術分野で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む、有益又は望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的に対して、有益な又は所望の結果には、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、１つ以上の症状の軽減又は改善、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化しない）、状態（疾患を含む）の遅延又は低速化、状態（疾患を含む）の進行、改善、又は緩和、状態及び寛解（部分寛解であるか完全寛解であるかに関わらず）の１つ以上を含み得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図する。治療的又は予防的用途の文脈では、有効量は、問題となっている状態のタイプ及び重症度、並びに一般的な健康、年齢、性別、体重、及び医薬組成物に対する耐性などの個々の対象の特徴に依存し得る。遺伝子療法の文脈では、実施形態では、有効量は、対象において欠損している遺伝子の部分的な機能又は全機能の獲得をもたらすのに十分な量である。他の実施形態では、有効量のＡＡＶウイルス粒子は、対象の遺伝子の発現をもたらすのに十分な量である。当業者は、これらの因子及び他の因子に応じて適切な量を決定することができる。

実施形態では、有効量は、問題となる用途のサイズ及び性質に依存することになる。また、標的対象の性質及び感受性、並びに使用の方法にも依存することになる。当業者は、これらの考慮事項及び他の考慮事項に基づいて、有効量を決定することができるであろう。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回以上の投与を含んでも、本質的にそれからなっても、それからなってもよい。

本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」という用語は、動物又はヒトなどの対象への物質の送達を意味することを意図する。投与は、処置の過程全体をとおして、１回の用量で、連続的に又は断続的に実施することができる。最も有効な手段及び投与量の投与を決定する方法は、当業者に既知であり、また治療に使用される組成物、治療の目的だけでなく、処置される対象の年齢、健康、又は性別によって変化することになる。単回投与又は複数回投与は、処置担当医によって、又はペット及び他の動物の場合に、処置獣医師によって選択される用量レベル及びパターンで実施することができる。

ＡＡＶの構造及び機能
ＡＡＶは複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムの長さは約４．７ｋｂであり、２つの１４５－ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６１５２で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６２６０で提供され、ＡＡＶ－８の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００６２６１で提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号で提供される。米国特許第９，４３４，９２８号はまた、カプシドタンパク質の配列及び自己相補的ゲノムも提供する。一態様では、ゲノムは自己相補的ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体統合を指示するシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ場所について、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名される）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）の差次的スプライシングとカップリングした２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、及びｒｅｐ ４０）の産生が生じる。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。

ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、ＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的なスプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生を担う。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質の各々が翻訳される単一ｍＲＮＡが転写された後、２つの異なる様式でスプライシングすることができ、すなわち、より長い又はより短いイントロンのいずれかを切除することができ、結果として、ｍＲＮＡの２つのプール（２．３ｋｂ及び２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプール）が形成される。より長いイントロンが好ましい場合が多く、それ故に２．３ｋｂ長のｍＲＮＡを主要なスプライスバリアントと呼ぶことができる。この形態は、最初のＡＵＧコドンを欠いており、そこからＶＰ１タンパク質の合成が開始され、結果としてＶＰ１タンパク質合成の全体的なレベルが低減される。主要なスプライスバリアント内に残る最初のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかしながら、同じオープンリーディングフレーム内のそのコドンの上流には、最適なコザック（翻訳開始）コンテキストに囲まれたＡＣＧ配列（コードするトレオニン）がある。これは、ＶＰ２タンパク質の低レベルの合成に寄与するが、これは実際には、追加的なＮ末端残基を有するＶＰ３タンパク質であり、これは、各々参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｃｅｒｒａ ＳＰ ｅｔ ａｌ．，（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８５）．「Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ」．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２ （２３）：７９１９－２３、Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８８），「Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ：ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６７（１）：１７６－８４、Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎｕａｒｙ １９９４），「Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６８（１）：１７０－６、及びＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８８），「Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２（９）：３３５６－６３に記載されているとおりである。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）でレビューされている。非限定的かつ例示的なカプシドタンパク質としては、本開示の表１～３に従い、ＡＡＶ １１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２０４カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４Ａカプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４ｅカプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４ｅ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４ｅ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４ｅ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５カプシドタンパク質、ＡＡＶ ２１４ＡＢカプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、及びＡＡＶ２カプシドタンパク質が挙げられる。追加的な非限定的かつ例示的なカプシドタンパク質としては、特にＡＡＶカプシドタンパク質配列について参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０８１８１１に開示されているものが挙げられる。

各ＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、及びＶＰ３部分を含有する。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分内にも見られるＶＰ１タンパク質内に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質とは、同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質及びＶＰ２タンパク質と共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。

ＶＰ３タンパク質は更に、個別の可変表面領域Ｉ－ＩＸ（ＶＲ－Ｉ－ＩＸ）に分けることができる。可変表面領域（ＶＲ）の各々は、特有の感染表現型（例えば、他のＡＡＶ血清型と比較して、抗原性の低下、形質導入の改善、及び／又は組織特異的な指向性）を特定の血清型に、単独で、又は他のＶＲの各々の特異的なアミノ酸配列との組み合わせでのいずれかで与えることができる特定のアミノ酸配列を含むか、又は含有することができ、これは、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＭａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９」Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ． ８６（１２）：６９４７－６９５８，Ｊｕｎｅ ２０１２に記載されているとおりである。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な特有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症状かつ無症候性である。更に、ＡＡＶは数多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで数多くの異なる組織を標的化する可能性を許容する。更に、ＡＡＶはゆっくりと分裂する細胞及び分裂しない細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として細胞の生涯にわたって本質的に持続することができる。更に、ＡＡＶの複製及びゲノムのカプシド形成を指示するシグナルは、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、ゲノムの内部のおよそ４．３ｋｂの一部又は全部（複製及び構造的カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、ＡＡＶベクターゲノムを生成するために外来ＤＮＡで置き換えられてもよい。ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の重要な特徴は、ＡＡＶが極めて安定で力強いウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（５６℃～６５℃に数時間の間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存をより危険が少ないものにする。ＡＡＶには、凍結乾燥さえも行うことができる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重複感染に耐性がない。

複数の研究により、筋肉における長期（＞１．５年）の組み換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ Ｓｃ． ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）、及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。更に、筋肉は高度に血管新生されているため、組み換えＡＡＶ形質導入は、筋肉内注射後の全身循環に導入遺伝子産物が現れる結果をもたらし、これは、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるとおりである。更に、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体のグリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を保有ことを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療薬の安定した発現の能力を有することを示した。本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質又はその部分（例えば、ＡＢＣＡ４）をコードする核酸分子と、核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲとを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、及びＡＡＶ ｒｈ７４を含むがこれらに限定されない、組み換えウイルスを誘導することができるいずれのＡＡＶ血清型に由来してもよい。シュードタイプのｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ２００１／０８３６９２号に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有する例示的なｒＡＡＶも企図されている。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。当技術分野では、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。

ＡＡＶベクター粒子、カプシドタンパク質、及びＡＡＶベクター
本明細書では、疾患の治療に有用な核酸及びタンパク質を含む、様々な治療ペイロードの送達において使用を見出すＡＡＶベクター粒子、ＡＡＶベクター、及びカプシドタンパク質が提供される。本明細書に開示される方法及び組成物は、単一ＡＡＶベクターゲノムの典型である約４．７ｋｂのパッケージング能力よりも大きい導入遺伝子を対象に送達するために使用され得る。より大きな導入遺伝子の送達は、２つ以上のＡＡＶベクター粒子内に導入遺伝子の部分を送達し、それらの部分を細胞中で組み換えて、完成した導入遺伝子を提供することにより達成されてもよい（例えば、図１Ａ及び図１Ｂに例解されるとおり）。本明細書に記載される新規の好ましいアプローチでは、導入遺伝子の部分は、Ｃｒｅ－ｌｏｘ媒介性組み換えにより接合される。有利なことに、ＡＡＶベクターゲノムの設計により、導入遺伝子の５’部分が組み換え後の導入遺伝子の３’部分の上流に位置することが確実となる。組み換え部位はまた、組み換え事象の方向性を指示してもよい（例えば、逆組み換えを低減又は除去するため）。更なる利点において、組み換え事象はまた、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質に作動可能に連結したプロモーターを除去して、Ｃｒｅリコンビナーゼを含むプロモーター不含ベクターゲノムを生じさせ、それによって宿主細胞中のＣｒｅリコンビナーゼの更なる望ましくない発現を防止してもよい。

ＡＡＶカプシドタンパク質
本開示は、大型遺伝子の多部分（例えば、二部分）送達のためのＡＡＶ粒子及びＡＡＶベクターゲノムを提供する。実施形態では、２つのＡＡＶ粒子を二部分送達に使用し、第１のＡＡＶ粒子は遺伝子の５’部分を含み、第２のＡＡＶ粒子は遺伝子の３’部分を含む。第１及び第２のＡＡＶ粒子は、同じカプシドタンパク質を有しても、異なるカプシドタンパク質を有してもよい。

カプシドタンパク質は、表１に列挙されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ、又は表１に列挙されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つと比較して、変異した、欠失した、又は追加された最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を有する配列を含む。任意選択で、最大２０個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、又は最大４０個のアミノ酸が、これらの配列と比較して変異していても、欠失していても、追加されていてもよい。カプシドタンパク質は、表１に列挙される核酸配列のうちのいずれか１つ、又は表１に列挙される核酸配列のうちのいずれか１つに対して、最大５個、最大１０個、最大３０個、若しくは最大６０個のヌクレオチド変化を有する配列によってコードされる。

実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１～３、３０～３４、４９、６３、６７、７１、８４、若しくは１９６のアミノ酸配列、又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の配列番号１～３、３０～３４、４９、６３、６７、７１、８４、若しくは１９６とは異なるアミノ酸を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。また、これらのＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。ＶＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５、１８～２３、４７、６６、７０、８２、９８、及び１９７の配列、又は配列番号１５、１８～２３、４７、６６、７０、８２、９８、及び１９７の配列に対して最大５個、最大１０個、若しくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。

実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ－１１０カプシドタンパク質（配列番号１）、ＡＡＶ２０４カプシドタンパク質（配列番号２）、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質（配列番号３）、又はＡＡＶ ＩＴＢ１０２＿４５カプシドタンパク質（配列番号４９）である。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２１４カプシドタンパク質のバリアントである。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２１４Ａ（配列番号３０）、ＡＡＶ－２１４－ＡＢ（配列番号８４）、ＡＡＶ２１４ｅ（配列番号３１）、ＡＡＶ２１４ｅ８（配列番号３２）、ＡＡＶ２１４ｅ９（配列番号３３）、又はＡＡＶ２１４ｅ１０（配列番号３４）である。実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号７１）である。

例示的なＶＰ２タンパク質及びＶＰ３タンパク質の配列を、表２及び表３に提供する。ＶＰ２配列及びＶＰ３配列を所与として、ＶＰ１部分は、完全なＶＰ１タンパク質配列とのアライメントによって決定されてもよい。

ＩＴＢ１０２＿４５に対する例示的な核酸は、配列番号４７である。他のカプシドＶＰ２部分に対する例示的な核酸は、ＶＰ１カプシドタンパク質核酸の対応する部分に由来してもよい。

ＡＡＶ２１４、ＡＡＶ２１４ｅ、ＡＡＶ２１４ｅ８、ＡＡＶ２１４ｅ９、ＡＡＶ２１４ｅ１０のＶＰ３タンパク質は、同じアミノ酸（配列番号４１）及び核酸（配列番号２４）配列を有する。

実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ２タンパク質は、配列番号３５～４０、５０、若しくは８５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の配列番号３５～４０、５０、若しくは８５とは異なるアミノ酸を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。また、これらのＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、ＶＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４７の配列、又は配列番号４７に対して最大５個、最大１０個、若しくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。

実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ３タンパク質は、配列番号１７、４１～４６、５１、若しくは８６のアミノ酸配列、又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の配列番号１７、４１～４６、５１、若しくは８６とは異なるアミノ酸を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。また、これらのＶＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６、２４～２９、４８、及び８３の配列、又は配列番号１６、２４～２９、４８、及び８３に対して最大５個、最大１０個、若しくは最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。

実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はキメラタンパク質である。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３部分は、本明細書に開示される異なるＡＡＶカプシドタンパク質からのＶＰ１、ＶＰ２、又はＶＰ３部分で置き換えられてもよい。

実施形態では、アミノ酸１２９位のロイシン残基、アミノ酸５８６位のアスパラギン残基、及びアミノ酸７２３位のグルタミン酸残基を含むＡＡＶカプシドタンパク質が本明細書に提供され、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸位置に対して番号付けされる。一部の事例では、タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。他の事例では、これらのアミノ酸は、他のカプシドタンパク質へと導入されてもよい。

実施形態では、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、及びＶＰ３部分を含むＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質が本明細書に提供され、ＶＰ１部分は、アミノ酸１２９にロイシン（Ｌ）残基を含み、ＶＰ２部分は、アミノ酸１５７にトレオニン（Ｔ）残基又はアスパラギン（Ｎ）残基を、アミノ酸１６２にリジン（Ｋ）残基又はセリン（Ｓ）残基を含み、ＶＰ３部分は、アミノ酸２２３にアスパラギン（Ｎ）残基を、アミノ酸２２４にアラニン（Ａ）残基を、アミノ酸２７２にヒスチジン（Ｈ）残基を、アミノ酸４１０にトレオニン（Ｔ）残基を、アミノ酸７２４にヒスチジン（Ｈ）残基を、アミノ酸７３４にプロリン（Ｐ）残基を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対して番号付けされる（すなわち、ＶＰ１カプシドサブユニット番号付け）。

実施形態では、ＶＰ１部分は、アミノ酸２４位にアスパラギン酸（Ｄ）残基又はアラニン（Ａ）残基を更に含み、ＡＡＶカプシドタンパク質におけるアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対して番号付けされる。実施形態では、ＶＰ２部分は、（ｉ）アミノ酸１４８のプロリン（Ｐ）残基（ｉｉ）アミノ酸１５２に挿入されたアルギニン（Ｒ）残基、（ｉｉｉ）アミノ酸１６８のアルギニン（Ｒ）残基、（ｉｖ）アミノ酸１８９のイソロイシン（Ｉ）残基、及び（ｖ）アミノ酸２００のセリン（Ｓ）残基、のうちの１つ以上を更に含み、ＡＡＶカプシドタンパク質内のアミノ酸位置は、配列番号３のアミノ酸配列内のアミノ酸位置に対して番号付けされる。

実施形態では、開示されたＶＰ３部分カプシドタンパク質における１つ以上の可変領域Ｉ～ＩＸは、除去され、代替的な領域と置き換えられてもよい。好適な代替は、以下の表４に特定される。これらに対する場所、及び追加的な代替の同一性は、配列番号４１とのアライメントによって特定され得る。実施形態では、１つ以上のＶＲは、１、２、又は３個のアミノ酸の挿入を有してもよい。実施形態では、１つ以上のＶＲは、１、２、又は３個のアミノ酸の欠失を有してもよい。

本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶカプシドタンパク質のうちのいずれか１つをコードする核酸を提供する。本開示はまた、本明細書に開示される核酸のうちのいずれか１つを含むベクターも提供する。ＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型であっても、ＡＡＶ８血清型であっても、ＡＡＶ９血清型であってもよい。

ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、対象における核酸の発現の制御に関与する要素を含むＡＡＶベクター粒子の中へとカプシド形成される核酸だけでなく、カプシド形成を促進するためにＩＴＲも供給する。実施形態では、ＡＡＶベクターは、本開示のＡＡＶベクターゲノムを含む。実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、少なくとも１つの異種核酸（ＨＮＡ）配列又はその一部を含み、これは、対象の細胞で発現され、ＨＮＡ配列の残りの部分と組み換えられると、疾患又は障害を処置する導入遺伝子をコードする。このため、ＨＮＡ配列は、導入遺伝子、又はその一部を含む。実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＩＴＲ配列と、少なくとも１つの導入遺伝子又はその部分とを含む。実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＩＴＲ配列と、１つの導入遺伝子の部分とを含む。実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質又は治療用ＲＮＡをコードする。

本開示は、サイズ制限を超える遺伝子によりコードされる導入遺伝子を発現させる方法を提供する。サイズ制限は、異種核酸配列を担持するウイルス粒子のパッケージング能力によって決定され、ＡＡＶウイルスベクターの大部分について、カプシド形成されたベクターゲノムのサイズ制限は典型的には約４．７ｋｂである。本開示は、ＡＡＶウイルス粒子を使用して、宿主細胞に送達し、最大約８ｋｂ、最大約７．９ｋｂ、最大約７．８ｋｂ、最大約７．７ｋｂ、最大約７．６ｋｂ、最大約７．５ｋｂ、又は最大約７．４ｋｂである導入遺伝子を発現させるためのアプローチを提供する。二部分遺伝子送達アプローチに好適な導入遺伝子の長さは、約４．０ｋｂ～約８．０ｋｂ、例えば、約４．１ｋｂ～約７．９ｋｂ、約４．２ｋｂ～約７．８ｋｂ、約４．３ｋｂ～約７．７ｋｂ、約４．４ｋｂ～約７．７ｋｂ、約４．５ｋｂ～約７．７ｋｂ、又は約４．６ｋｂ～約７．７ｋｂである。実施形態では、本開示は、宿主細胞に送達し、最大約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１１ｋｂ、約１２ｋｂ、約１３ｋｂ、約１４ｋｂ、約１５ｋｂ、約１６ｋｂ、約１７ｋｂ、約１８ｋｂ、約１９ｋｂ、約２０ｋｂ、又はその間の任意の値である導入遺伝子を発現させるための多部分遺伝子送達アプローチを提供する。

ＡＡＶ系のサイズ制限を超える導入遺伝子を送達するための以前のアプローチには、宿主細胞自体の細胞機構によって媒介される相同組み換えを使用することが含まれる。しかしながら、相同組み換えの効率は、異なる生物及び細胞型間で大きく異なり、内因性相同組み換えプロセスはエラーを起こしやすい。

本明細書に記載される新規の方法は、導入遺伝子の異なる部分をコードするＡＡＶベクターゲノム間の効率的かつ正確な組み換えを媒介するために外因性リコンビナーゼを用いるものであり、これにより、内因性相同組み換えと関連付けられる問題を克服する。実施形態では、外因性リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。Ｃｒｅリコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する。これは、Ｌｏｘ部位と呼ばれる２つの認識部位間の組み換えを触媒する。Ｌｏｘ部位は、典型的には、８ｂｐのコアスペーサー領域と、２つの１３ｂｐの隣接配列（認識領域）とからなる３４ｂｐのポリヌクレオチド配列である。非対称コア配列は、Ｌｏｘ部位への配向を定義する。本明細書に開示されるＣｒｅ組み換えアプローチを使用することで、細胞環境に関係なく、また追加の補因子の非存在下で、非常に効率的な組み換えが得られた。酵母フリッパーゼ（Ｆｌｐ）などの他の外因性リコンビナーゼを使用してもよい。

本開示の多部分ウイルス送達系は、外因性リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を使用して、ウイルスベクター内部の宿主細胞に送達されるＡＡＶベクターゲノム内の特定の組み換え部位を介して、目的の導入遺伝子の異なる部分の組み換えお飛び統合を媒介する。実施形態では、目的の導入遺伝子の３つ以上の部分が、多部分ウイルス送達系を使用して送達され、同じ戦略を使用して宿主細胞中に完全な導入遺伝子を形成し得る。

宿主細胞に送達し、単一のＡＡＶベクターゲノムのサイズ制限を超える導入遺伝子を発現させるための例示的なアプローチを図１Ａに示す。導入遺伝子は、導入遺伝子の５’部分と導入遺伝子の３’部分との２つの部分に分割される。導入遺伝子の５’部分は、第１のＡＡＶベクターゲノムに組み込まれ、導入遺伝子の３’部分は、第２のＡＡＶベクターゲノムに組み込まれる。第１のＡＡＶベクターゲノムはまた、リコンビナーゼ（Ｒｅｃ）例えばＣｒｅリコンビナーゼをコードするＨＮＡ配列を含む。細胞内で発現されると、リコンビナーゼは、第１及び第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位（ＲＳ）をとおして第１のＡＡＶベクターゲノムと第２のＡＡＶベクターゲノムとの間の組み換えを媒介し、これにより、図１Ａに示される２つの組み換え核酸の形成が生じる。第１の組み換え核酸は、導入遺伝子の５’部分と３’部分との両方を含み、これは、転写されると、スプライシングドナー（ＳＤ）部位及びスプライシングアクセプター（ＳＡ）部位の存在に起因してＲＮＡスプライシング中に一緒に接合し、これにより、全長導入遺伝子の発現を生じさせることができる。第２の組み換え核酸は、プロモーター領域を含まないため、第２の組み換え核酸からのリコンビナーゼの発現は抑制される。

第１のＡＡＶベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ａ．５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、
ｂ．プロモーター、
ｃ．導入遺伝子の５’部分、
ｄ．スプライスドナー（ＳＤ）部位、
ｅ．組み換え部位（ＲＳ）、
ｆ．任意選択で、内部切断（ＩＣ）ポリペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列、
ｇ．任意選択で核局在化配列（ＮＬＳ）を有する、リコンビナーゼをコードする核酸配列、
ｈ．ポリＡ部位（ｐＡ）、及び
ｉ．３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む。

典型的には、導入遺伝子の５’部分とリコンビナーゼ核酸との間に終止コドンはなく、これはつまり、導入遺伝子の５’部分とリコンビナーゼをコードする遺伝子とを含むＨＮＡ領域（任意選択で核局在化配列を有する）が、連続ＯＲＦを形成する（すなわち、リーディングフレームの中にある）ということである。

第２のＡＡＶベクターゲノムは、５’から３’の方向に、
ａ．５’ＡＡＶ逆位末端反復、
ｂ．組み換え部位、
ｃ．スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
ｄ．導入遺伝子ＯＲＦの３’部分、
ｅ．ポリＡ部位、
ｆ．及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含んでもよい。

第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムの要素は、全長導入遺伝子の産生を促進する。第１のＡＡＶベクターゲノムと第２のＡＡＶベクターゲノムとの両方が同じ細胞に存在する場合、リコンビナーゼは、第１のＡＡＶベクターゲノム中のプロモーターの制御下で発現される。リコンビナーゼは、ＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位及び第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位を介して第１のＡＡＶベクターゲノム及び第２のＡＡＶベクターゲノムの組み換えを媒介し、これにより、２つの組み換え核酸の形成が生じる。第１の組み換え核酸は、スプライスドナー部位及びアクセプター部位によって分離した、導入遺伝子の５’部分と３’部分との両方を含む。転写及びＲＮＡの成熟後、フルサイズのｍＲＮＡが第１の組み換え核酸から産生される。第２の組み換え核酸は、リコンビナーゼを含む残留核酸部分を含む。とりわけ、リコンビナーゼは、プロモーターが核酸に存在しないことを理由に、もはやプロモーターに作動可能に連結していないため、第２の組み換え核酸からの発現がほとんど又は全くない。図１Ａを参照されたい。

導入遺伝子の３つ以上の部分を、多部分ウイルス送達系を使用して宿主細胞に送達し、組み換えを行って、完全な導入遺伝子の発現を可能にすることができる。導入遺伝子の３つの部分を送達するための例示的なアプローチが図１Ｂに示され、同じ戦略を使用して、３つ超の部分を使用して導入遺伝子を送達することができる。簡潔に述べると、図１Ｂでは、導入遺伝子の第１の部分は第１のＡＡＶベクターゲノムに組み込まれ、導入遺伝子の第２の部分は第２のＡＡＶベクターゲノムに組み込まれ、導入遺伝子の第３の部分は第３のＡＡＶベクターゲノムに組み込まれる。次に、ＡＡＶベクターゲノムをカプシドで包み、ＡＡＶベクター粒子を産生し、これを宿主細胞に送達し、ＡＡＶベクターゲノムを導入する。図１Ａの設計に類似して、図１Ｂの第１のＡＡＶベクターゲノムは、プロモーター、第１のスプライスドナー（ＳＤ１）部位、組み換え部位ＲＳ１、任意選択で内部切断（ＩＣ）ポリペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列、任意選択で核局在化配列（ＮＬＳ）を有する、リコンビナーゼ（Ｒｅｃ）をコードする核酸配列、及びポリＡ部位（ｐＡ）を含む。第２のＡＡＶベクターゲノムはまた、組み換え部位ＲＳ１’、第１のスプライスアクセプター（ＳＡ１）部位、第２のスプライスドナー（ＳＤ２）部位、及び組み換え部位ＲＳ２を含む。第３のＡＡＶベクターゲノムは、組み換え部位ＲＳ２’、第２のスプライスアクセプター（ＳＡ２）部位、及びポリＡ部位を含む。

３つのＡＡＶベクターゲノムが同じ宿主細胞内に送達されると、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）の発現は、ＲＳ１部位とＲＳ１’部位との間の組み換え、及びＲＳ２部位とＲＳ２’部位との間の組み換えを媒介する。実施形態では、ＲＳ１部位及びＲＳ１’部位は、ＲＳ２部位及びＲＳ２’部位に直交する（すなわち、ＲＳ１／ＲＳ１’とＲＳ２／ＲＳ２’との間の組み換えは最小限であるか又はまったくない）。非限定的な例として、リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである場合、ＲＳ１及びＲＳ１’はＬｏｘＰ部位であることができ、ＲＳ２及びＲＳ２’はＬｏｘＮ部位であることができる。組み換え後、導入遺伝子の３つ全ての部分を含むＨＮＡが形成され、その前駆体ｍＲＮＡ転写産物は、ＳＤ１／ＳＡ１スプライシング対及びＳＤ２／ＳＡ２スプライシング対によって媒介されるＲＮＡスプライシングを受けて、組み換え部位のいずれも有しない統合された導入遺伝子を含む成熟ｍＲＮＡ転写産物を形成することができる。実施形態では、ＳＤ１／ＳＡ１スプライシング対及びＳＤ２／ＳＡ２スプライシング対は、互いに直交しており（すなわち、ＳＤ１／ＳＡ２対又はＳＤ２／ＳＡ１対の間にスプライシングが生じない）、それにより、導入遺伝子の全ての部分が成熟ｍＲＮＡ転写産物内のそれらの正しい位置に保持されることを確実にする。

実施形態では、リコンビナーゼは、内部切断ポリペプチドを介してタンパク質のＮ末端部分から切断される。リコンビナーゼの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動されてもよい。

第１の組み換え核酸は、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子の５’部分、スプライスドナー（ＳＤ）部位、組み換えプロセスによって形成される組み換え部位（ＲＳ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、導入遺伝子の３’部分、ポリＡ部位（ｐＡ）、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含んでもよい。プロモーターは、導入遺伝子を含むＨＮＡ配列の効率的な転写を駆動し、導入遺伝子の５’部分と３’部分とが、スプライスドナー部位及びアクセプター部位を介したＲＮＡ転写産物のスプライシング後に一緒に接合し、これにより、全長導入遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の形成が生じる。

第２の組み換え核酸は、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、組み換えプロセスによって形成される組み換え部位（ＲＳ）、任意選択で、内部切断（ＩＣ）ポリペプチド又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードするＨＮＡ配列、任意選択で核局在化配列（ＮＬＳ）を有する、リコンビナーゼをコードする核酸配列、ポリＡ部位（ｐＡ）、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含んでもよい。実施形態では、第２の組み換え核酸内に位置するリコンビナーゼをコードする遺伝子は、プロモーターの欠如に起因して、効率的に転写されることができない。結果として、実施形態では、第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムの両方を用いて形質導入された細胞において、リコンビナーゼの安定した発現がほとんど又は全く検出されない。

リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼであってもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼは、配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでも、本質的にそれからなっても、それからなってもよく、あるいは配列番号１６４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。任意選択で、Ｃｒｅリコンビナーゼは、配列番号１６４とは異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大１０個のアミノ酸を有してもよい。

Ｃｒｅリコンビナーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）に融合していてもよい。ＮＬＳの場所は、ＣｒｅリコンビナーゼのＮ末端であっても、Ｃ末端であっても、中央であってもよい。ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６５）のアミノ酸配列、又は配列番号１６５との最大１、２、若しくは３個のアミノ酸の変異を有してもよい。ＮＬＳを有するＣｒｅリコンビナーゼは、配列番号１６６のアミノ酸配列を含んでも、本質的にそれからなっても、それからなってもよく、あるいは配列番号１６６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。ＮＬＳを有するＣｒｅリコンビナーゼは、配列番号１６７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される組み換え部位は、１つ以上のＬｏｘＰ（クロスオーバーＰ１の遺伝子座）配列を含んでもよい。ＬｏｘＰ配列の例を以下の表５に列挙する。代表的なＬｏｘＰ配列は、長さが３４ｂｐであり、１３ｂｐの認識領域の２つのセットの間に非対称な８ｂｐのスペーサー領域を含む。実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、ＡＴＧＴＡＴＧＣのヌクレオチド配列を有するスペーサー領域を含む。組み換え部位の対合（一方は第１のＡＡＶベクターゲノム内にあり、他方は第２のＡＡＶベクターゲノム内にある）は、一方向性組み換えを促進し、かつ／又は逆行組み換えを防止してもよい。

Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される組み換え部位は、標準配列（ＡＴＧＴＡＴＧＣ）とは異なるスペーサー領域配列を含む１つ以上のバリアントＬｏｘ部位を含んでも、本質的にそれからなっても、それからなってもよい。実施形態では、バリアントＬｏｘ部位は、ＬｏｘＰ部位に直交する（すなわち、バリアントＬｏｘ部位とＬｏｘＰ部位との間の交差組み換えは存在しない）。実施形態では、Ｌｏｘ部位は、ＧＴＡＴＡＣＣＴのスペーサー領域配列を含むｌｏｘＮ部位である。実施形態では、Ｌｏｘ部位は、ＡＡＧＴＡＴＣＣのスペーサー領域配列を含むｌｏｘ２２７２部位である。実施形態では、Ｌｏｘ部位は、ＡＴＧＴＡＴＡＣのスペーサー領域配列を含むｌｏｘ５１１部位である。実施形態では、異なるスペーサー領域配列を含む２つ以上のＬｏｘ部位が使用され、これらのＬｏｘ部位は互いに直交する。実施形態では、Ｌｏｘ部位は、同じスペーサー領域配列を含むＬｏｘ部位との組み換えを受けるが、交差適合性はない。直交Ｌｏｘ部位に関する更なる考察は、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｖｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００７ Ｎｏｖ １，４５０（７１６６）：５６－６２、及びＭｉｓｓｉｒｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００６ Ａｐｒ ４，７：７３に見られる。例示的なバリアントＬｏｘ部位配列を以下の表５に提供する。

第１のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位は、Ｌｏｘ ７１配列、例えば配列番号１７８を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、それからなってもよく、第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位は、Ｌｏｘ６６配列、例えば配列番号１７９を含んでも、本質的にそれからなっても、それからなってもよい。

第１のＡＡＶベクターゲノムは、内部切断ポリペプチドをコードして、残りのポリペプチドからのリコンビナーゼの切断を促進してもよい。内部切断ポリペプチドをコードする核酸は、リコンビナーゼをコードする核酸部分の５’末端の約１～１０００ｂｐ上流、例えば、リコンビナーゼをコードする核酸部分の５’末端の約１～５００ｂｐ、約１～３００ｂｐ、約１～２００ｂｐ、約１～１５０ｂｐ、約１～１００ｂｐ、約１～５０ｂｐ、約１～３０ｂｐ、約１～２０ｂｐ、又は約１～１０ｂｐ上流に位置してもよい。

内部切断ポリペプチドは、２Ａ自己切断ペプチドであってもよい。２Ａ自己切断ペプチドの好適な例を以下の表６に列挙する。好適な例としては、配列番号１８５の配列を有する核酸によってコードされる、配列番号１８４のアミノ酸配列を有する内部切断ペプチドが挙げられる。内部切断ペプチドのＣ末端残基は、ＮＬＳを有するＣｒｅリコンビナーゼのＮ末端残基と重複してもよい。

実施形態では、第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムの両方を用いて形質導入された細胞において、リコンビナーゼの安定した発現がほとんど又は全く検出されない。実施形態では、リコンビナーゼの発現は、両方のＡＡＶベクターゲノムによる形質導入の約１時間後、約３時間後、約６時間後、約１２時間後、約２４時間後、約４８時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約１週間後、約２週間後、約３週間後、又は約１か月後に、細胞におけるウエスタンブロットによって検出することができない。実施形態では、リコンビナーゼの発現は、両方のＡＡＶベクターゲノムによる形質導入の約４８時間後、細胞におけるウエスタンブロットによって検出することができない。リコンビナーゼのウエスタンブロット分析は、当業者であれば、市販の抗体を使用して実施することができる。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現レベルは、ウサギ抗Ｃｒｅ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１５０３６）を、実施例３に記載のプロトコルに従い１：１０，０００希釈で使用して、ウエスタンブロットによって分析することができる。

実施形態では、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの安定した発現現は、第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムの両方によって形質導入した細胞において、ほとんど又は全く検出されない。実施形態では、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの発現は、両方のＡＡＶベクターゲノムによる形質導入の約１時間後、約３時間後、約６時間後、約１２時間後、約２４時間後、約４８時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約１週間後、約２週間後、約３週間後、又は約１か月後に、細胞における定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検出することができない。実施形態では、リコンビナーゼをコードするｍＲＮＡの発現は、両方のＡＡＶベクターゲノムによる形質導入の約１週間後、細胞におけるｑＰＣＲによって検出することができない。

第１のＡＡＶベクターゲノムは、下流リコンビナーゼの発現を促進するために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。

スプライスドナー（ＳＤ）部位及びスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を使用して、ｍＲＮＡ転写産物の一部を除去することができる。スプライスドナー（ＳＤ）部位は、ＡＡＶベクターゲノム中の導入遺伝子の５’部分の下流に位置してもよい。例えば、スプライスドナー（ＳＤ）部位は、導入遺伝子の５’部分の約１～５００ｂｐ、約１～３００ｂｐ、約１～２００ｂｐ、約１～１５０ｂｐ、約１～１００ｂｐ、約１～５０ｂｐ、約１～３０ｂｐ、約１～２０ｂｐ、又は約１～１０ｂｐ下流に位置してもよい。

スプライスアクセプター（ＳＡ）部位は、ＡＡＶベクターゲノム中の導入遺伝子の３’部分の上流に位置してもよい。例えば、導入遺伝子の３’部分の約１～５００ｂｐ、約１～３００ｂｐ、約１～２００ｂｐ、約１～１５０ｂｐ、約１～１００ｂｐ、約１～５０ｂｐ、約１～３０ｂｐ、約１～２０ｂｐ、又は約１～１０ｂｐ上流。

スプライスドナー（ＳＤ）部位及びスプライスアクセプター（ＳＡ）部位は、それぞれ、異なるＡＡＶベクターゲノム内に位置してもよく、その結果、第１のＡＡＶベクターゲノムと第２のＡＡＶベクターゲノムとの間の組み換え後、導入遺伝子の５’部分及び導入遺伝子の３’部分を含むｍＲＮＡ転写産物を処理して、連続した全長導入遺伝子を含む成熟ｍＲＮＡ転写産物を形成することができる。図１Ａを参照されたい。

スプライスドナー（ＳＤ）部位は、配列番号１８６のヌクレオチド配列、又は配列番号１８６に対して最大１個、最大３、最大５、若しくは最大１０個のヌクレオチド変化を有する配列を含んでも、本質的にそれらからなっても、それらからなってもよい。スプライスアクセプター（ＳＡ）部位は、配列番号１８７のヌクレオチド配列、又は配列番号１８７に対して最大１個、最大３、最大５、若しくは最大１０個のヌクレオチド変化を有する配列を含んでも、本質的にそれらからなっても、それらからなってもよい。

宿主細胞における導入遺伝子発現の制御は、プロモーター配列を含むＡＡＶベクターゲノム及びポリＡ部位内に含有される調節要素によって調節されてもよい。ＡＡＶベクターはまた、シグナルペプチドもコードしてもよい。実施形態では、ＡＡＶベクターは、５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を有する。５’ＩＴＲはプロモーターの上流に位置し、これはまた導入遺伝子の上流である。実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、同じ配列を有する。実施形態では、それらは異なる配列を有する。実施形態では、本開示のＡＡＶベクターゲノムは、５’から３’の方向に、第１の（５’）ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリＡ部位、及び第２の（３’）ＩＴＲを含んでもよい。

ＨＮＡ（例えば、導入遺伝子又はその部分を含むＨＮＡ）は、構成的プロモーターに作動可能に連結する。構成的プロモーターは、当技術分野で既知である及び／又は本明細書に提供される任意の構成的プロモーターであることができる。実施形態では、構成的プロモーターは、ラウス肉腫（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、ｍＭｅＰ４１８プロモーター、ｍＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、又はＥＦ１プロモーターを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。こうしたプロモーターのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の効率を増加又は減少させるために修飾されてもよいことが当技術分野で知られている。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５－１４５（７ＳＫ、Ｕ６、及びＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを修飾して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を廃止し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激する）を参照されたい。実施形態では、ＨＮＡ配列は、組織特異的対照プロモーター、又は誘導性プロモーターに作動可能に連結する。実施形態では、組織特異的対照プロモーターは、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、皮膚特異的プロモーター、筋特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、又は眼特異的プロモーターである。実施形態では、組織特異的対照プロモーターは、眼特異的プロモーターを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。実施形態では、組織特異的対照プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、ヒト光受容体間結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ）、ヒト赤色／緑色オプシンプロモーター（ｐＲ２．１）、ヒト青色オプシンプロモーター（ＨＢ）、マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、マウス短波オプシンプロモーター（ｍＢＰ）（短波オプシンプロモーターはＳ－オプシンプロモーター又は青色オプシンプロモーターとも称され得る）、ヒトロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター（βＰＤＥ）、ＶＭＤ２プロモーター、又はｍＲｈｏプロモーターを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。

本明細書で使用されるプロモーターは、配列番号９６（マウスＵ１プロモーター）又は配列番号９７（Ｈ１プロモーター）の配列を有するポリヌクレオチドを含んでも、本質的にそれらからなっても、それらからなってもよい。プロモーターは、Ｕ１ａ又はＵ１ｂプロモーターであっても、ＥＦ１プロモーターであっても、ＣＢＡ（ニワトリベータアクチン）であってもよい。プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター（配列番号１８８）であってもよい。プロモーターは、表７に列挙される核酸配列のうちのいずれか１つ、又は表７に列挙される核酸配列のうちのいずれか１つに対して、最大５個、最大１０個、又は最大３０個のヌクレオチド変化を有する配列を含んでも、本質的にそれらからなっても、それらからなってもよい。

実施形態では、ＨＮＡ配列は、追加の調節要素に作動可能に連結する。追加の調節要素は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）であり得る。実施形態では、ＡＡＶベクターは、ベクター産生目的のために細菌宿主におけるベクターの成長及び培養に好適な調節構成成分を含んでもよい。例えば、ベクターは、抗生物質耐性及び細菌内のプラスミドの維持のための遺伝子、並びに細菌中のタンパク質発現を制御するための関連調節要素を含んでもよい。

実施形態では、ＨＮＡ配列は、ポリアデニル化（ポリＡ）部位に作動可能に連結する。ポリ－Ａ部位は、ＭｅＣＰ２ポリＡ部位、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ部位、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ部位、ＳＶ４０ポリＡ部位、ＳＰＡ４９ポリＡ部位（配列番号１８９）、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ部位、ｓＮＲＰポリＡ部位、又はＴＫ６５ポリＡ部位を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。例示的なＳＰＡ４９ポリＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（Ｆｅｂ．２２，２００５）１０２：２９５２－２９５７に記載されている。

異種核酸（ＨＮＡ）
本明細書に開示されるＡＡＶウイルスベクターは、１つ以上の異種核酸（ＨＮＡ）を標的組織に感染させ、送達する。第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムのＨＮＡ配列は、細胞内で組み換えられて、新しいＨＮＡ配列を形成する。ＨＮＡ配列は転写され、任意選択で、標的組織の細胞内で翻訳される。態様では、新しい組み換えＨＮＡ配列は、タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。

タンパク質をコードする導入遺伝子について、全長タンパク質をコードする導入遺伝子は、５’部分と３’部分との２つの部分に分割される。各部分の長さは、全導入遺伝子の長さよりも短い。導入遺伝子の５’部分は、タンパク質のＮ末端部分をコードし、導入遺伝子の３’部分は、タンパク質のＣ末端部分をコードする。導入遺伝子の５’部分及び／又は３’部分が、３の倍数である核酸長を有する必要がない（すなわち、導入遺伝子の分割点は、２つのコドンの間である必要はない）ことは、当業者であれば理解するであろう。その理由は、第１及び第２のＡＡＶベクターゲノムの組み換え後、これら２つの部分は、ｍＲＮＡスプライシングを介して再接合されて全長導入遺伝子を形成することができるからである。そのため、導入遺伝子及びそれがコードする対応するアミノ酸配列の一部分は、完全一致であってもよく、又は分割点で１若しくは２ヌクレオチドの小さなミスマッチを有してもよい。サイズ制限に関しては、第１のＡＡＶベクターゲノム中の導入遺伝子の５’部分は、最大約３．５ｋｂ、約３．４ｋｂ、約３．３ｋｂ、又は約３．２ｋｂのサイズ制限を有してもよい。導入遺伝子の３’部分は、第２のＡＡＶベクターゲノムにおいて、最大約４．６ｋｂ、約４．５ｋｂ、約４．４ｋｂ、又は約４．３ｋｂのサイズ制限を有してもよい。

導入遺伝子によってコードされるタンパク質の代表的な例は、ＡＢＣＡ４（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー４）である。ＡＢＣＡ４タンパク質の変異は、スタルガルト病を引き起こし得る。ヒトでは、野生型ＡＢＣＡ４タンパク質は、ＡＢＣＡ４遺伝子によってコードされ、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ７８３６３（配列番号１９０）に従うアミノ酸配列を有する。ＡＢＣＡ４タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１９１である。

好適なＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１９０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。ＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１９０と同一であってもよく、又は配列番号１９０とは異なる最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のアミノ酸を有してもよい。

ＡＢＣＡ４タンパク質をコードする核酸は、５’部分と３’部分とに分割され、それらは別々のＡＡＶベクターゲノムに入れられる。ＡＢＣＡ４導入遺伝子の５’部分は、配列番号１９２、又は配列番号１９２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であってもよく、ＡＢＣＡ４導入遺伝子の３’部分は、配列番号１９３、又は配列番号１９３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であってもよい。

二部分遺伝子送達方法に好適な導入遺伝子の追加の例としては、ＭＹＯ７Ａ及びＣＥＰ２９０が挙げられる。

ＭＹＯ７Ａは、ミオシンＶＩＩａタンパク質をコードし、ＭＹＯ７Ａの変異は、アッシャー症候群に関与している。ヒトにおいて、ミオシンＶＩＩａタンパク質は、配列番号２０１に従うアミノ酸配列を有する。ＭＹＯ７Ａ遺伝子の例示的な核酸配列は、配列番号２０２である。好適なミオシンＶＩＩａタンパク質は、配列番号２０１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。ミオシンＶＩＩａタンパク質は、配列番号２０１と同一であってもよく、又は配列番号２０１とは異なる最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のアミノ酸を有してもよい。

ＣＥＰ２９０遺伝子は、光受容体の結合繊毛に局在し、毛様体形成及び毛様体輸送の両方に関与する中心体タンパク質をコードし、ＣＥＰ２９０の変異は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）に関与している。ヒトでは、ＣＥＰ２９０タンパク質（２９０ｋＤａの中心体タンパク質としても知られる）は、配列番号２０３に従うアミノ酸配列を有する。ＣＥＰ２９０遺伝子の例示的な核酸配列は、配列番号２０４である。好適なＣＥＰ２９０タンパク質は、配列番号２０３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。ＣＥＰ２９０タンパク質は、配列番号２０３と同一であってもよく、又は配列番号２０３とは異なる最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個のアミノ酸を有してもよい。

ＡＡＶウイルスベクターを産生する方法
ＡＡＶウイルスベクターを産生するために、様々なアプローチを使用することができる。実施形態では、パッケージングは、ヘルパーウイルス又はヘルパープラスミド及び細胞株を使用することによって達成される。ヘルパーウイルス又はヘルパープラスミドは、ウイルスベクター産生を促進する要素及び配列を含有する。別の態様では、ヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株のゲノムの中へと安定して組み込まれ、これによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによる追加的なトランスフェクションを必要としない。

実施形態では、細胞は、パッケージング又はヘルパー細胞株である。実施形態では、態様では、ヘルパー細胞株は、真核細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞又は２９３Ｔ細胞である。実施形態では、ヘルパー細胞は酵母細胞又は昆虫細胞である。

ヘルパープラスミドは、例えば、複製能力のないＡＡＶをパッケージングするために必要とされる全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする、及び高力価で複製能力のないＡＡＶをパッケージングする能力を有するビリオンタンパク質を産生するための、複製能力のないウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を、複製能力のあるＡＡＶの産生を伴わずに含んでもよい。

ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術分野で既知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開 第２００４／０２３５１７４ Ａ１号を参照されたい。その中で記載されるように、ＡＡＶヘルパープラスミドは、非限定的な例として、それらのそれぞれのオリジナルのプロモーターによって又は異種プロモーターによって制御される、Ａｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡを、ヘルパーウイルスＤＮＡ配列として含有してもよい。ＡＡＶヘルパープラスミドは、蛍光タンパク質などのマーカータンパク質の発現用の発現カセットを追加的に含有して、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にしてもよい。

本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶヘルパープラスミドのうちのいずれか１つ、及び本明細書に開示されるＡＡＶベクターのうちのいずれかを用いてパッケージング細胞株をトランスフェクトすることを含む、ＡＡＶ粒子を生成する方法を提供する。実施形態では、ＡＡＶヘルパープラスミド及びＡＡＶベクターは、パッケージング細胞株へと共トランスフェクトされる。実施形態では、細胞株は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、及び／又はＡＡＶ粒子のうちのいずれかを含む細胞を提供する。

医薬組成物
本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、ＡＡＶカプシド、及び／又はＡＡＶ粒子のうちのいずれかを含む医薬組成物を提供する。典型的に、ＡＡＶ粒子は治療のために投与される。

医薬組成物は、本明細書に記載されるように、調合薬開発の技術分野で既知であるか又は開発された任意の方法によって製剤化されてもよく、これには、活性成分（例えば、ウイルス粒子又は組み換えベクター）を賦形剤又は他の副成分と接触させ、産物を用量単位に分割又はパッケージングすることが含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、医薬組成物は、眼注射に好適である。

実施形態では、医薬組成物は、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターで形質導入した細胞（例えば、対象への移植用）、ナノ粒子模倣体、又はこれらの組み合わせを更に含んでもよい。実施形態では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。実施形態では、医薬組成物は、滅菌溶液及び実質的に等張溶液として製剤化される。

本開示による医薬組成物は、単一単位用量として、及び／又は複数の単一単位用量として、バルクで調製、パッケージング、及び／又は販売されてもよい。活性成分の量は、対象に投与されることになる活性成分の投与量、及び／又はこうした用量の好都合な割合（例えば、こうした用量の１／２又は１／３など）と概して等しい。本発明の製剤は、１つ以上の賦形剤を、各々がともに、ウイルスベクターの安定性を増加させ、ウイルスベクターによる細胞トランスフェクション又は形質導入を増加させ、ベクターゲノムでコードされたタンパク質の発現を増加させ、かつ／又はベクターゲノムでコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更する量で、含むことができる。実施形態では、医薬組成物は賦形剤を含む。賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、分散媒体、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散助剤若しくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤若しくは乳化剤、保存剤、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

実施形態では、医薬組成物は凍結防止剤を含む。「凍結防止剤」という用語は、凍結中に物質への損傷を減少又は除去する能力を有する薬剤を指す。凍結防止剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、及び／又はマンニトールが挙げられる。

治療方法
本開示は、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる、遺伝障害を予防又は処置する方法を提供する。

実施形態では、遺伝障害は、眼障害、ＣＮＳ障害、皮膚障害、肺障害、筋障害、肝障害、消化器障害、血液若しくはリンパ障害、炎症性障害、又はがんである。実施形態では、障害はスタルガルト病である。

実施形態では、障害は、低ホスファターゼ症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、劣性ジストロフィー性表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、リソソーム蓄積障害（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及びベッカー型筋ジストロフィーを含む）、若年性バッテン病、乳児バッテン病、常染色体優性障害、筋ジストロフィー、ビエッティの結晶性ジストロフィー、網膜分離症（例えば、変性、遺伝性、牽引性、滲出性）、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ファブリー病、ポンペ病、神経セロイドリポフスチン症１（ＣＬＮ１）、ＣＬＮ３疾患（又は若年性神経セロイドリポフスチン症）、ゴーシェ病、がん、関節炎、筋消耗、心臓病、内膜過形成、レット症候群、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群（ＭＰＳ ＩＨ）、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ又はＭＰＳＩＩＩＡ）、サンフィリッポ症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢ又はＭＰＳＩＩＩＢ）、サンフィリッポ症候群Ｃ、サンフィリッポ症候群Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、脊髄性大脳性運動失調症、ＬＤＬ受容体欠損症、高アンモニア血症、貧血、関節炎、又はアデノシンデアミナーゼ欠損症である。

本明細書に開示される特定の導入遺伝子に加えて、既知の活性酵素、構造タンパク質、又はＲＮＡ配列が、機能的活性を送達するための導入遺伝子として使用されてもよい。

障害は眼疾患であってもよい。眼は免疫特権組織であり、低用量のウイルスは治療的利益を提供し得る。眼疾患は、光受容体及び／又はＲＰＥ細胞に影響を及ぼしてもよい。例えば、眼疾患は、網膜色素変性症（例えば、常染色体劣性（ＳＰＡＴＡ７遺伝子、ＬＲＡＴ遺伝子、ＴＵＬＰ１遺伝子）、常染色体優性（ＡＩＰＬ１遺伝子）、及びＸ連鎖（ＲＰＧＲ遺伝子））、ベストロフィン－１（ＢＥＳＴ－１）遺伝子における変異に関係する眼障害（例えば、卵黄様黄斑ジストロフィー、加齢黄斑変性、常染色体優性硝子体網脈絡膜症、緑内障、白内障）、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ；アリール－炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）遺伝子、錐体－ロッドジストロフィー（ＣＲＤ；ＡＢＣＡ４遺伝子）、シュタルガルト病（ＡＢＣＡ４遺伝子）、先天性脈絡膜欠如（ＣＨＭ遺伝子）、アッシャー症候群（ＭＹＯ７Ａ遺伝子、ＣＤＨ２３遺伝子；ＵＳＨ２Ａ遺伝子；ＣＬＲＮ１遺伝子）、網膜分離症（ＲＳ１遺伝子）、ビエッティの結晶性ジストロフィー（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子）又は色覚異常（ＣＮＧＡ３遺伝子、ＣＮＧＢ３遺伝子、ＧＮＡＴ２遺伝子、ＰＤＥ６Ｃ遺伝子、又はＰＤＥ６Ｈ遺伝子）であってもよい。

本開示の方法及び組成物を使用する処置に好適な障害としては、アッシャー症候群（ＵＳＨ）及びレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）が挙げられる。アッシャー症候群は、網膜色素変性症と関連付けられる聴覚障害、及び場合により前庭機能障害を特徴とする常染色体劣性障害である。アッシャー症候群Ｉ型（ＵＳＨ１）は最も重篤な型であり、重度から深刻な先天性感音性難聴、平衡欠損、及び失明につながる網膜色素変性症の思春期前発症を特徴とする。ＵＳＨ１（ＵＳＨ１Ｂ－ＵＳＨ１Ｇ）の６つの遺伝子座がマッピングされている。ＭＹＯ７Ａ遺伝子の変異は、最も一般的なＵＳＨ１のサブタイプであるＵＳＨ１Ｂの原因であることが分かった。ＭＹＯ７Ａ遺伝子は、ミオシンＶＩＩＡタンパク質をコードする。ヒト網膜では、ミオシンＶＩＩＡは、ＲＰＥメラノソームの遊走、光受容体細胞の外側セグメント先端の食作用、及びこれらの光受容体の繊毛をとおしたオプシン輸送において、活性機能を示す。ＭＹＯ７Ａのコード配列は、サイズが約６．６ｋｂであり、コードされたミオシンＶＩＩＡは、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１３４０２－１（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１３４０２＃Ｑ１３４０２－１）に従うアミノ酸配列を有する。レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、生後１年以内の視力低下、眼振、及び記録不能な網膜電図を特徴とする重度の遺伝性網膜障害の群を指す。ＣＥＰ２９０の変異は、ＬＣＡに最も一般的な要因のうちの１つである。ＣＥＰ２９０遺伝子は、光受容体の結合繊毛に局在し、毛様体形成及び毛様体輸送の両方に関与する中心体タンパク質をコードする。ＣＥＰ２９０は、初期繊毛形成及び毛様体タンパク質輸送において重要な役割を果たしている。ＣＥＰ２９０関連ＬＣＡを有する患者は、中心錐体が豊富な中心窩領域にいくつかの錐体核を保持する。しかしながら、これらの錐体光受容体は、異常な内側及び外側セグメントを有し、ほとんどの患者において重度の視力喪失をもたらす。ＣＥＰ２９０遺伝子のコード配列は、サイズが約７．４ｋｂであり、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｏ１５０７８－１（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ１５０７８＃Ｏ１５０７８－１）に従うタンパク質配列をコードする。

実施形態では、がんは、固形がん、例えば、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、口唇がん、口腔がん、肝臓がん、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、非黒色腫皮膚がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、小細胞肺腫瘍、又は甲状腺である。

対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよい。ヒトは、幼児のヒト、例えば、３歳未満、２歳未満、又は１歳未満であってもよい。

本明細書に開示される処置及び予防の方法は、治療又は予防のための患者を特定し、選択するために、適切な診断技法と組み合わせられてもよい。例えば、本明細書に開示される障害、例えば、スタルガルト病を処置又は予防する方法は、対象の障害に関連する遺伝子変異又は欠失を特定するために遺伝子検査を実施するステップを更に含んでもよい。実施形態では、障害、例えば、スタルガルト病を処置又は予防する方法は、障害に関連する変異を担持している、又は障害を発症するリスクが高い（例えば、遺伝性因子に基づいて）と以前に特定された対象に投与することを含む。

本開示は、宿主細胞中のタンパク質のレベルを増加させる方法を提供し、本方法には、宿主細胞を、本明細書に開示される２つのＡＡＶウイルス粒子と接触させることを含み、第１のＡＡＶウイルス粒子は第１のＡＡＶベクターゲノムを含み、第２のＡＡＶウイルス粒子は第２のＡＡＶベクターゲノムを含む。第１のＡＡＶベクターゲノムと第２のＡＡＶベクターゲノムとのＣｒｅ－ｌｏｘ媒介性組み換えにより、タンパク質をコードするＨＮＡ配列が生じる。実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。実施形態では、宿主細胞は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボである。実施形態では、宿主細胞は対象に由来する。実施形態では、対象は、正常な対象におけるタンパク質のレベル及び／又は機能性と比較して、タンパク質のレベル及び／又は機能性の減少をもたらす障害に罹患する。

本開示は、導入遺伝子を対象に導入することによって、対象の障害を予防又は処置する方法を提供する。実施形態では、本方法は、有効量の２つのＡＡＶウイルス粒子の同時投与を含み、第１のＡＡＶウイルス粒子は、導入遺伝子の５’部分を含む第１のＡＡＶベクターゲノムを含み、第２のＡＡＶウイルス粒子は、導入遺伝子の３’部分を含む第２のＡＡＶベクターゲノムを含む。例えば、本開示は、対象においてスタルガルト病を処置する方法を提供する。実施形態では、本方法は、２つのＡＡＶウイルス粒子の同時投与を含み、第１のＡＡＶウイルス粒子は、ＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分を含む第１のＡＡＶベクターゲノムを含み、第２のＡＡＶウイルス粒子は、ＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分を含む第２のＡＡＶベクターゲノムを含む。

投与量及び投与
最も有効な手段及び投与量の投与を決定する方法は、当業者に既知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、及び処置される対象によって変化することになる。単回投与又は複数回投与は、処置担当医によって選択される用量レベル及びパターンで行われ得る。これは、投与経路によって影響され得ることに留意されたい。薬剤の好適な投与剤形及び投与の方法は、当技術分野で既知である。こうした好適な投与量の非限定的な例は、１投与当たり１０^９個ほど少ない数から１０^１７個ほど多い数までのベクターゲノムとすることができる。

本明細書に記載される方法の実施形態では、対象に投与されるウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）の数は、約１０^９～約１０^１７個の範囲である。具体的には、いくつかの実施形態では、約１０^１０～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１３、約１０^１１～約１０^１２、約１０^１１～約１０^１４、約５×ｌ０^１１～約５×１０^１２、又は約１０^１２～約１０^１３個のウイルス粒子が対象に投与される。ヒトの眼への投与については、約１×１０^１０ｖｇ／眼の総用量を使用してもよく、マウスの眼に対しては、５×１０^９ｖｇ／眼の総用量を使用してもよい。動物における有効性／安全性をモニターするために、非侵襲的なインビボ撮像技法を使用することができ、撮像技法としては、走査型レーザー眼底検査（ＳＬＯ）、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、多光子顕微鏡、フルオレセイン血管造影が挙げられるが、これらに限定されない。

実施形態では、ウイルス粒子は、対象に、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内、若しくは眼周囲、経口、直腸内、経粘膜的、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、胸膜内、局所的、リンパ管内、嚢内で投与される。こうした導入はまた、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。実施形態では、ウイルス粒子は、非限定的な例として、例えば、肺、眼、又はＣＮＳなど、所望の標的組織に送達される。実施形態では、ウイルス粒子の送達は全身的である。嚢内投与経路は、脳室の脳脊髄液の中へと薬物を直接的に投与することを含む。これは、大槽の中への直接注射によって、又は永久的に置かれる管を介して実施することが可能である。

眼疾患（眼障害）を眼内で処置するために、涙腺（ＬＧ）投与、局所的点眼、角膜への基質内投与、前房内投与（前眼房）、硝子体内投与、網膜下投与、全身投与、又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、当業者に既知の複数の投与様式がある。遺伝的眼障害の８０％は光受容体内で生じる。少量の遺伝子療法の硝子体内送達は、外来患者のクリニックで行うことができる。

一部のＡＡＶ粒子は、脳及び頸椎の指向性を示し、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断し得る。一部のＡＡＶ粒子は、網膜下注射及び硝子体内注射による高い網膜指向性を示す。ＡＡＶ粒子は、例えば、錐体、ロッド、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）などの複数の眼細胞型を標的とする。有利なことに、ＡＡＶ粒子は、天然血清型に対する中和抗体を逃れるため、再投与の可能性を実現し得る。更なる態様では、ＡＡＶ粒子及び組成物は、処置される障害に対する他の既知の処置と組み合わせて投与されてもよい。

ＡＡＶ粒子は、網膜下注射を介して投与されてもよい。網膜下注射の経路は、（１）レンズ、硝子体、及び網膜を通過する、瞳孔を通る経角膜経路、（２）網膜下腔内へと硝子体及び網膜の反対側を通り抜ける、毛様体扁平部又は縁領域に入る経強膜経路、並びに（３）網膜を貫通することなく、脈絡膜及びブルッフ膜を通る経強膜経路、を含む。網膜下注射は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ．２０１７；５８（４）：２１７－２２６に記載されているとおりである。

本開示のＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルス粒子、又は組成物の各々の投与は、処置の過程全体をとおして、１回の用量で、連続的に、又は断続的に、実施することができる。実施形態では、本開示のＡＡＶベクター、ＡＡＶ粒子、又は組成物は、注射、注入、又は移植によって非経口的に投与される。

第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子とは、同時投与されても、順次投与されてもよい。「同時投与」は、第１及び第２のＡＡＶウイルス粒子を一緒に投与する（すなわち、両方のＡＡＶウイルス粒子が同じ組成物中で投与され得る）ことを指す。「順次投与」は、２つのＡＡＶウイルス粒子が、標的細胞上で一緒に作用し、生理学的効果を達成する（すなわち、対象において同じ細胞を形質導入し、導入遺伝子部分を組み換えて、全長導入遺伝子を産生する）ことができるように、ある時間間隔で別々に投与されることを意味する。例えば、１つのウイルス粒子の投与は、他のウイルス粒子の投与に、最大約１０分、最大約２０分、最大約３０分、最大約６０分、最大約２時間、最大約３時間、最大約６時間、最大約１２時間、最大約２４時間、最大約２日、最大約４日、最大約１週間、最大約２週間、又は最大約４週間先行することができる。

第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子とは、特定の比で、又は特定の比の範囲内で投与されてもよい。実施形態では、第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子との比は、約０．１：１、約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約１．１：１、約１．３：１、約１．５：１、約１．７：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、又は約１０：１である。実施形態では、第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子との比は、０．１：１～１０：１、０．２：１～５：１、０．３：１～３：１、０．４：１～２．５：１、０．５：１～２：１、０．７：１～１．５：１、０．８：１～１．２：１、又は０．９：１～１．１：１の範囲内である。実施形態では、第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子との比は、０．１：１未満、０．２：１未満、０．３：１未満、０．４：１未満、０．５：１未満、０．６：１未満、０．７：１未満、０．８：１未満、０．９：１未満、又は１：１未満である。実施形態では、第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子と、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子との比は、約１：１である。実施形態では、この比は、投与過程（例えば、同時投与又は順次投与）中、第１のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子の総数を、第２のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子の総数と比較することによって計算される。

キット
本明細書に記載される薬剤、ベクター、又は組成物は、実施形態では、治療、診断、又は研究用途におけるそれらの使用を容易にするために、医薬又は診断又は研究キットへと組み立てられてもよい。実施形態では、本開示のキットは、本明細書に記載されるように、修飾されたＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶベクター、ＡＡＶベクターゲノム、ＡＡＶ粒子、宿主細胞、単離された組織、組成物、又は医薬組成物のうちのいずれか１つを含む。

キットは、使用説明書を更に含んでもよい。具体的には、こうしたキットは、意図される用途及びこれらの薬剤の適当な使用を説明する説明書とともに、本明細書に記載される１つ以上の薬剤を含んでもよい。例として、実施形態では、キットは、キットの１つ以上の構成要素を混合するため、並びに／又は試料を単離及び混合し、かつ対象に適用するための取り扱い説明を含んでもよい。実施形態では、キット内の薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与方法に好適な医薬製剤及び投与量の状態にある。研究目的のキットは、様々な実験を実施するための適切な濃度又は量の成分を含有してもよい。

キットは、本明細書に記載される方法の使用を容易にするように設計されてもよく、多くの形態を取ることができる。キットの組成物の各々は、該当する場合、液体形態（例えば、溶液）で提供されても、固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供されてもよい。ある特定の事例では、組成物のうちのいくつかは、例えば、キットとともに提供されても、提供されなくてもよい、好適な溶媒又は他の種（例えば、水又は細胞培養培地）の添加によって、構成可能又は別様に処理可能（例えば、活性形態に）であってもよい。

実施形態では、キットは、本明細書に記載される構成要素のうちのいずれか１つ以上を、１つ以上の容器内に含有する。このため、実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬剤を収容する容器を含んでもよい。薬剤は、液体の形態であっても、ゲルの形態であっても、固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は、滅菌して調製され、シリンジ内にパッケージングされ、冷蔵されて出荷されてもよい。代替的に、これらは、保存のためにバイアル又は他の容器に収容されてもよい。第２の容器は、滅菌して調製された他の薬剤を有してもよい。代替的に、キットは、シリンジ、バイアル、管、又は他の容器内に、予め混合され出荷される活性薬剤を含んでもよい。キットは、シリンジ、局所適用装置、又はＩＶ針管及びバッグなどの、薬剤を対象に投与するために必要とされる構成要素のうちの１つ以上又は全てを有してもよい。

本発明は上記の実施形態と併せて記述されているが、前述の記述及び実施例は、本発明の範囲を例証することを意図しており、限定することを意図していないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本発明が関連する当業者に明らかであろう。

更なる番号付き実施形態
本開示の更なる番号付き実施形態を、以下のとおりに提供される。

実施形態１． ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）導入遺伝子の５’部分、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
（ｅ）組み換え部位、
（ｆ）リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）ポリＡ部位、及び
（ｈ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
リコンビナーゼの発現が、プロモーターに作動可能に連結する、ＡＡＶベクターゲノム。

実施形態２． リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、実施形態１に記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態３． リコンビナーゼが、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、実施形態１又は２に記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態４． 組み換え部位が、ＬｏｘＰ７１配列を含む、実施形態２又は３に記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態５． ＡＡＶベクターゲノムが、組み換え部位とリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、導入遺伝子の５’部分、内部切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドが、同じリーディングフレーム内にある、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態６． 内部切断ポリペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される自己切断ペプチドである、実施形態５に記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態７． ＡＡＶベクターゲノムが、組み換え部位とリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み、ＩＲＥＳが、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態８． 導入遺伝子がポリペプチドをコードする、実施形態１～７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態９． ポリペプチドがＡＢＣＡ４タンパク質である、請求項８に記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態１０． プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、又はα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態１１． プロモーターが、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、ヒト光受容体間結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ）、ヒト赤色／緑色オプシンプロモーター（ｐＲ２．１）、ヒト青色オプシンプロモーター（ＨＢ）、マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、マウス短波長オプシンプロモーター（ｍＢＰ）、又はヒトロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター（βＰＤＥ）である、実施形態１～９のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム。

実施形態１２． ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、ＡＡＶベクターゲノム。

実施形態１３． ＡＡＶウイルス粒子であって、
（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
（ｉｉ）実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム、を含む、ＡＡＶウイルス粒子。

実施形態１４． ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１～３、６７、７１、１９６、２０５、及び２０６から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９９％、又は１００％同一である、実施形態１３に記載のＡＡＶウイルス粒子。

実施形態１５． 実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム、又は実施形態１３若しくは１４に記載のＡＡＶウイルス粒子を含む、医薬組成物。

実施形態１６． 医薬組成物であって、
（ｉ）実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子と、
（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子であって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子と、を含み、
第１のＡＡＶウイルス粒子のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位、及び第２のＡＡＶウイルス粒子の第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位により、逆行組み換えが防止される、医薬組成物。

実施形態１７． 遺伝子欠損によって引き起こされる疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、
（１）対象に、第１のＡＡＶウイルス粒子であって、
（ｉ）第１のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
（ｉｉ）実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第１のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、
（２） 対象に、第２のＡＡＶウイルス粒子であって、
（ｉ）第２のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
（ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、を含む、方法。

実施形態１８． 第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、第１のＡＡＶウイルス粒子のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位及び第２のＡＡＶウイルス粒子の第２のＡＡＶベクターゲノム中の組み換え部位を介した、第１のＡＡＶベクターゲノム及び第２のＡＡＶベクターゲノムの組み換えが生じる、実施形態１７に記載の方法。

実施形態１９． 第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、ポリペプチドの発現が生じる、実施形態１７又は１８に記載の方法。

実施形態２０． 第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子が、同時投与又は順次投与される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２１． 第１のＡＡＶウイルス粒子及び第２のＡＡＶウイルス粒子が、同時投与される、実施形態２０に記載の方法。

実施形態２２． ウイルス粒子が、網膜下注射によって投与される、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２３． 遺伝子欠損が、ＡＢＣＡ４遺伝子欠損である、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２４． ＡＢＣＡ４遺伝子欠損により、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の低下、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の除去、変異ＡＢＣＡ４タンパク質の発現、及びＡＢＣＡ４タンパク質の機能の低下からなる群から選択される１つ以上の状態がもたらされる、実施形態２３に記載の方法。

実施形態２５． 細胞中でポリペプチドを発現させる方法であって、
（１）実施形態１～１１のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子を用いて細胞を形質導入することであって、導入遺伝子がポリペプチドをコードする、形質導入することと、
（２）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子を用いて細胞を形質導入することであって、第２のＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）組み換え部位、
（ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｄ）導入遺伝子の３’部分、
（ｅ）ポリＡ部位、及び
（ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、形質導入することと、を含む、方法。

実施形態２６． リコンビナーゼの安定した発現が、形質導入細胞において検出されない、実施形態２５に記載の方法。

実施形態２７． ポリペプチドがＡＢＣＡ４タンパク質である、実施形態２５又は２６に記載の方法。

実施形態２８． 形質導入細胞であって、
（ｉ）遺伝子の欠損ゲノムコピーと、
（ｉｉ）第１の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、
（ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
（ｂ）プロモーター、
（ｃ）導入遺伝子の５’部分、
（ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
（ｅ）組み換え部位、
（ｆ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
（ｇ）導入遺伝子の３’部分、
（ｈ）ポリＡ部位、及び
（ｉ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
導入遺伝子が、４．６～７．７ｋｂの長さを有する、第１の組み換え核酸と、
（ｉｉｉ）第２の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ逆位末端反復、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、第２の組み換え核酸がプロモーターを欠く、第２の組み換え核酸と、を含む、形質導入細胞。

実施形態２９． リコンビナーゼの安定した発現が、形質導入細胞において検出されない、実施形態２８に記載の形質導入細胞。

実施形態３０． リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、実施形態２８又は２９に記載の形質導入細胞。

実施形態３１． 導入遺伝子が、ＡＢＣＡ４遺伝子をコードする、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の形質導入細胞。

実施形態３２． 細胞がエクスビボ細胞である、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の形質導入細胞。

実施例１：
二部分設計を用いたプラスミドの構築
二部分ベクター系を使用して、細胞における全長ＡＢＣＡ４遺伝子の発現を試験するために、いくつかのプラスミドを生成した（図２）。

５’から３’に、ＡＡＶ逆位末端反復、Ｕ１ａプロモーター、ＡＢＣＡ４遺伝子ＯＲＦの５’部分、スプライスドナー（ＳＤ）部位、Ｌｏｘ７１部位、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列、核局在化配列（ＮＬＳ）を有するＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列、ポリＡ部位、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復を含む、「５’ＡＢＣＡ４－ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミドを構築した。

「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミドを、３ｘＦＬＡＧタグコード配列を「５’ＡＢＣＡ４－ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミド中のＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分に組み込むことにより生成した。

「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ－Ｃｒｅ」プラスミドを、「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミド中のＣｒｅリコンビナーゼコード配列を除去することにより生成した。

５’から３’に、５’ＡＡＶ逆位末端反復、Ｌｏｘ６６部位、スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、３ｘＦＬＡＧタグコード配列に組み込まれたＡＢＣＡ４遺伝子ＯＲＦの３’部分、ポリＡ部位、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復を含む、「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」プラスミドを構築した。

全長ＡＢＣＡ４遺伝子を含む２つの陽性対照プラスミド構築物も生成した（図２）。一方の陽性対照構築物はイントロン領域を有しておらず、他方の陽性対照は、スプライスドナー（ＳＤ）部位、Ｌｏｘ７１部位、及びスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含むイントロン領域を含み、これは、「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」と「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」プラスミドとの間の組み換えによって生成された構築物を模倣している。両方の陽性対照構築物は、ＡＢＣＡ４遺伝子の５’部分とＡＢＣＡ４遺伝子の３’部分との両方に３ｘＦＬＡＧタグコード配列を含む。

実施例２：
二部分ベクター系を使用した全長タンパク質の発現
実施例１及び図２に記載される示されるプラスミドでトランスフェクトしたＬｅｃ２細胞を使用して細胞試験を行い、ウエスタンブロット法を使用して全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を検査した。全長ＡＢＣＡ４タンパク質（ＦＬＡＧタグを付けた）は、推定分子量が約２６１ｋＤである。図３Ａに示すように、陽性対照以外のプラスミドでトランスフェクトした細胞のなかで、全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現は、「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミドと「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」プラスミドとの両方を細胞に適用した時にのみ観察された。一方で、Ｃｒｅリコンビナーゼなしのデュアルベクター系でトランスフェクトした細胞では、全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現はなかった（すなわち、「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ－Ｃｒｅ」及び「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」対）。同様に、反復実験（図３Ｂ）では、陽性対照以外の示されるプラスミドでトランスフェクトした細胞群のなかで、全長ＡＢＣＡ４の発現を示したのは２つの実験群のみであった。一方の群を「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミド及び「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」プラスミドでトランスフェクトし、他方の群を「５’ＡＢＣＡ４－ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミド及び「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」プラスミドでトランスフェクトした。これらの結果は、デュアルベクター系が、２つのプラスミド間の効率的なＣｒｅ－ｌｏｘ媒介性組み換えを実行することができ、これが今度は全長ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を生じさせることを示している。

実施例３：
組み換え核酸からのＣｒｅリコンビナーゼの検出可能な発現なし
プラスミドを含有する細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現レベルを分析した（図４）。実施例２に記載したようにＬｅｃ２細胞を様々なプラスミド及び対照でトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間で、細胞試料を、４Ｍ尿素を含有する試料緩衝液を使用して処理し、ブロッキング剤として３％乳、一次抗体として１：１０，０００希釈のウサギ抗Ｃｒｅ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１５０３６）、及び二次抗体として１：１０，０００希釈のヤギ抗ウサギＨＲＰ（ａｚｕｒｅ）を使用するウエスタンブロットにより、Ｃｒｅリコンビナーゼの安定した発現を定量した。自己切断Ｃｒｅリコンビナーゼは、分子量が約３７ｋＤである。予想どおり、「５’ＡＢＣＡ４－ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」又は「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」プラスミドのいずれかのトランスフェクションにより、Ｌｅｃ２細胞においてＣｒｅリコンビナーゼの明確な発現が生じた。注目すべきことに、第２のプラスミド「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」と共トランスフェクトした細胞において、自己切断Ｃｒｅリコンビナーゼのウエスタンブロットによる検出可能な発現はなく、このことは、デュアルベクター系が、第１のプラスミドと第２のプラスミドとの間の効率的な組み換えを可能にし、これが今度はプロモーターなしでＣｒｅリコンビナーゼＯＲＦを含有する組み換え型核酸の生成を生じさせるため、Ｃｒｅリコンビナーゼがもはや発現されなくなることを示唆する。

実施例４：
二部分ベクター系のＣｒｅ媒介性組み換えにより、全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現が達成される
様々なプラスミドでトランスフェクトした細胞における全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現レベルを定量した。図５に示すように、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするデュアルベクター系でトランスフェクトされた細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする対応するデュアルベクター系でトランスフェクトした細胞と比較して、約５５倍高い全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現レベルを示した（「５’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ－Ｃｒｅ」及び「３’ＡＢＣＡ４＋ＦＬＡＧ」）。これらの結果は、Ｃｒｅリコンビナーゼが、２つの開始ベクター間の組み換えを、それらが細胞内にトランスフェクトされた直後に効果的に媒介し、全長ｍＲＮＡの発現を駆動することを示す。

実施例５：
デュアルＡＡＶウイルス粒子を介した二部分ベクター系の送達により、全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現が生じる
細胞内で全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡを発現させるために、二部分ベクター系がＡＡＶウイルス粒子によって送達され得るかどうかを試験した。実施例１に記載した発現カセットを使用して、２種類のＡＡＶ９ウイルス粒子を調製した。１種類のＡＡＶ９ウイルス粒子は、「５’ＡＢＡＣＡ４＋ＦＬＡＧ＋Ｃｒｅ」をコードするＡＡＶベクターゲノムを含み、もう１種類のＡＡＶ９ウイルス粒子は、「３’ＡＢＡＣＡ４＋ＦＬＡＧ」をコードするＡＡＶベクターゲノムを含む。図６に示すように、ＡＢＣＡ４陰性細胞を、示されるＡＡＶ９ウイルス粒子で形質導入し、全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの発現レベルを各群において定量した。両種類のＡＡＶ９ウイルス粒子で形質導入した細胞のみが、全長ＡＢＣＡ４ ｍＲＮＡの高い発現レベルを示し、発現レベルは、形質導入後１２０時間以上にわたって増加し続けた。この結果は、ＡＡＶウイルス粒子が、同じ細胞内で二部分ベクター系を効果的に送達し、ｍＲＮＡペイロードが本系によって適当に再構成されるように組み換えられることを示した。

Claims (32)

1. ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
   （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
   （ｂ）プロモーター、
   （ｃ）導入遺伝子の５’部分、
   （ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
   （ｅ）組み換え部位、
   （ｆ）リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、
   （ｇ）ポリＡ部位、及び
   （ｈ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
   前記リコンビナーゼの発現が、前記プロモーターに作動可能に連結する、ＡＡＶベクターゲノム。
2. 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項１に記載のＡＡＶベクターゲノム。
3. 前記リコンビナーゼが、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項１又は２に記載のＡＡＶベクターゲノム。
4. 前記組み換え部位が、ＬｏｘＰ７１配列を含む、請求項２又は３に記載のＡＡＶベクターゲノム。
5. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、前記組み換え部位と前記リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する内部切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記導入遺伝子の前記５’部分、前記内部切断ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド、及び前記リコンビナーゼをコードする前記ポリヌクレオチドが、同じリーディングフレーム内にある、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
6. 前記内部切断ポリペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される自己切断ペプチドである、請求項５に記載のＡＡＶベクターゲノム。
7. 前記ＡＡＶベクターゲノムが、前記組み換え部位と前記リコンビナーゼをコードする前記ポリヌクレオチドとの間に位置する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み、前記ＩＲＥＳが、前記リコンビナーゼをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
8. 前記導入遺伝子がポリペプチドをコードする、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
9. 前記ポリペプチドがＡＢＣＡ４タンパク質である、請求項８に記載のＡＡＶベクターゲノム。
10. 前記プロモーターが、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリベータアクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、ユビキタスニワトリβアクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最小限のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、又はα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
11. 前記プロモーターが、ヒトロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、ヒト光受容体間結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ）、ヒト赤色／緑色オプシンプロモーター（ｐＲ２．１）、ヒト青色オプシンプロモーター（ＨＢ）、マウスオプシンプロモーター（ｍＯＰ）、マウス短波長オプシンプロモーター（ｍＢＰ）、又はヒトロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼβサブユニットプロモーター（βＰＤＥ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム。
12. ＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
    （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
    （ｂ）組み換え部位、
    （ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
    （ｄ）導入遺伝子の３’部分、
    （ｅ）ポリＡ部位、及び
    （ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、ＡＡＶベクターゲノム。
13. ＡＡＶウイルス粒子であって、
    （ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
    （ｉｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム、を含む、ＡＡＶウイルス粒子。
14. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号１～３、６７、７１、１９６、２０５、及び２０６から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９９％、又は１００％同一である、請求項１３に記載のＡＡＶウイルス粒子。
15. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム、又は請求項１３若しくは１４に記載のＡＡＶウイルス粒子を含む、医薬組成物。
16. 医薬組成物であって、
    （ｉ）請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子と、
    （ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子であって、
    （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
    （ｂ）組み換え部位、
    （ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
    （ｄ）前記導入遺伝子の３’部分、
    （ｅ）ポリＡ部位、及び
    （ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子と、を含み、
    前記第１のＡＡＶウイルス粒子の前記ＡＡＶベクターゲノム中の前記組み換え部位、及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子の前記第２のＡＡＶベクターゲノム中の前記組み換え部位により、逆行組み換えが防止される、医薬組成物。
17. 遺伝子欠損によって引き起こされる疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、
    （１）前記対象に、第１のＡＡＶウイルス粒子であって、
    （ｉ）第１のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、及び
    （ｉｉ）請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第１のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、
    （２）前記対象に、第２のＡＡＶウイルス粒子であって、
    （ｉ）第２のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド、並びに
    （ｉｉ）第２のＡＡＶベクターゲノムであって、５’から３’の方向に、
    （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
    （ｂ）組み換え部位、
    （ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
    （ｄ）前記導入遺伝子の３’部分、
    （ｅ）ポリＡ部位、及び
    （ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、第２のＡＡＶベクターゲノム、を含む、第２のＡＡＶウイルス粒子、を投与することと、を含む、方法。
18. 前記第１のＡＡＶウイルス粒子及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、前記第１のＡＡＶウイルス粒子の前記ＡＡＶベクターゲノム中の前記組み換え部位及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子の前記第２のＡＡＶベクターゲノム中の前記組み換え部位を介した、前記第１のＡＡＶベクターゲノム及び前記第２のＡＡＶベクターゲノムの組み換えが生じる、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第１のＡＡＶウイルス粒子及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子の投与により、前記ポリペプチドの発現が生じる、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記第１のＡＡＶウイルス粒子及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子が、同時投与又は順次投与される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記第１のＡＡＶウイルス粒子及び前記第２のＡＡＶウイルス粒子が、同時投与される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ウイルス粒子が、網膜下注射によって投与される、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記遺伝子欠損が、ＡＢＣＡ４遺伝子欠損である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＡＢＣＡ４遺伝子欠損により、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の低下、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現の除去、変異ＡＢＣＡ４タンパク質の発現、及びＡＢＣＡ４タンパク質の機能の低下からなる群から選択される１つ以上の状態がもたらされる、請求項２３に記載の方法。
25. 細胞中でポリペプチドを発現させる方法であって、
    （１）請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターゲノムを含む第１のＡＡＶウイルス粒子を用いて前記細胞を形質導入することであって、前記導入遺伝子が前記ポリペプチドをコードする、形質導入することと、
    （２）第２のＡＡＶベクターゲノムを含む第２のＡＡＶウイルス粒子を用いて前記細胞を形質導入することであって、前記第２のＡＡＶベクターゲノムが、５’から３’の方向に、
    （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
    （ｂ）組み換え部位、
    （ｃ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
    （ｄ）前記導入遺伝子の３’部分、
    （ｅ）ポリＡ部位、及び
    （ｆ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含む、形質導入することと、を含む、方法。
26. 前記リコンビナーゼの安定した発現が、前記形質導入細胞において検出されない、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ポリペプチドがＡＢＣＡ４タンパク質である、請求項２５又は２６に記載の方法。
28. 形質導入細胞であって、
    （ｉ）遺伝子の欠損ゲノムコピーと、
    （ｉｉ）第１の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、
    （ａ）５’ＡＡＶ逆位末端反復、
    （ｂ）プロモーター、
    （ｃ）導入遺伝子の５’部分、
    （ｄ）スプライスドナー（ＳＤ）部位、
    （ｅ）組み換え部位、
    （ｆ）スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、
    （ｇ）前記導入遺伝子の３’部分、
    （ｈ）ポリＡ部位、及び
    （ｉ）３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、
    前記導入遺伝子が、４．６～７．７ｋｂの長さを有する、第１の組み換え核酸と、
    （ｉｉｉ）第２の組み換え核酸であって、５’から３’の方向に、５’ＡＡＶ逆位末端反復、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び３’ＡＡＶ逆位末端反復、を含み、前記第２の組み換え核酸がプロモーターを欠く、第２の組み換え核酸と、を含む、形質導入細胞。
29. 前記リコンビナーゼの安定した発現が、前記形質導入細胞において検出されない、請求項２８に記載の形質導入細胞。
30. 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２８又は２９に記載の形質導入細胞。
31. 前記導入遺伝子が、ＡＢＣＡ４遺伝子をコードする、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の形質導入細胞。
32. 前記細胞がエクスビボ細胞である、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の形質導入細胞。