TW202208407A - 使用質膜修復蛋白(dysferlin)雙載體之基因療法 - Google Patents

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Abstract

本文闡述編碼人類質膜修復蛋白(dysferlin protein)之片段之重組聚核苷酸。另外，進一步闡述包含該等重組聚核苷酸之質體、病毒載體、雙載體系統、細胞及組合物。該等重組聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統、細胞及組合物可用於治療質膜修復蛋白病(dysferlinopathy)。

Description

使用質膜修復蛋白(DYSFERLIN)雙載體之基因療法
本發明提供包含人類質膜修復蛋白(dysferlin)基因之片段之聚核苷酸及包含該等聚核苷酸之質體、病毒載體、細胞及組合物，且提供使用該等聚核苷酸、質體、病毒載體及組合物來治療患有質膜修復蛋白缺陷(例如2B型肢帶型肌肉營養不良症、三好氏肌肉病變(Myoshi Myopathy)及遠端前群肌肉病變)之受試者之方法。
質膜修復蛋白病(dysferlinopathy)係體染色體隱性病症，包括2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)、三好氏肌肉病變及遠端前群肌肉病變且通稱為質膜修復蛋白病。2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)代表美國之最常見LGMD之一且在全世界報導有1/100,000-1/200,000之發生率。三好氏肌肉病變係較有限之下肢遠端質膜修復蛋白病形式。實際上，在考慮疾病範圍時，LGMD2B通常始於遠端腓腸肌萎縮且然後隨時間擴散以影響近端肌肉。質膜修復蛋白損失會引起進展形式之營養不良且伴有慢性肌纖維損失、發炎、脂肪替代及纖維化，其皆導致肌無力惡化。
質膜修復蛋白基因較大，且迄今已鑑別55個跨越基因體DNA之至少150 kb之外顯子。該等外顯子可預測大約6.5 kb之cDNA及2,088個胺基酸之蛋白質。質膜修復蛋白係由C-末端疏水性跨膜結構域及具有多個C2結構域之較長細胞質定向性親水區構成之237 kDa蛋白質。愈來愈多之工作已展示，損失質膜修復蛋白會損害骨骼肌中之Ca2+ 依賴性膜修復(Song等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 4084-4088, 2001；Schnepp等人，J. Virol. 77:3495-3504, 2003)。另外，質膜修復蛋白已展示可與涉及膜修復之其他蛋白質(包括膜聯蛋白A1及A2、AHNAK以及小窩蛋白-3)相互作用。考慮到骨骼肌具有機械活性且易受損傷，此系統之重要性得以突顯；因此，必須存在穩定之膜重密封機制。質膜修復蛋白缺乏或突變會導致膜修復受損及自肌纖維壞死開始直至肌纖維損失及進展性肢體無力之一系列事件。據信，損失肌纖維再生能力係質膜修復蛋白缺陷之促成後果。質膜修復蛋白亦與囊泡輸送及內吞作用、T小管形成及其他過程有關。
質膜修復蛋白基因突變會引起等位基因體染色體隱性病症，包括2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)、三好氏肌肉病變及遠端前群肌肉病變(通稱為質膜修復蛋白病) (例如參見 Grose等人，PloS one 7:e39233,2012；Bansal等人，Nature 423, 168-172,2003；Moore, S.A.等人，J. Neuropathol. Exp. Neurol 65: 995-1003, 2006；Rosales等人，Muscle Nerv 42:14-21, 2010；Sondergaard等人，Anns of Clin. Trans. Neurol. 2:256-270, 2015；Evesson等人，J. Biol. Chem. 285: 28529-28539, 2010；及Klinge等人，Soc. Exp. Biol. 21: 1768-1776, 2007，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中)。質膜修復蛋白缺陷之一種較不常見表型呈現強直性脊柱症候群(Klinge等人，Muscle Nerve 41: 166-173, 2010，其全部內容以引用方式併入本文中)。通常，患者在二十出頭即呈現緩慢進展性虛弱及高血清肌酸激酶(CK)。大約三分之一之患者在發展15年內變得依賴於輪椅。在臨床上，心臟得以倖免且認知功能不受影響。肌無力分佈相對受限之表型變體為潛在之區域基因代替療法奠定了基礎，此可大大影響關於此病症之生活品質(Grose等人，PLoS One 7:e39233, 2012；Barton等人，Muscle Nerve 42: 22-29, 2010)。單核苷酸變化係典型DYSF基因突變，其亦有益於成功地進行基因轉移以保護轉基因產物免於免疫排斥(Rodine-Klapac等人，Mol. Ther. 18: 109-117, 2010；Mendell等人，N. Eng. J. Med. 363: 1429-1437, 2010；Mendell等人，Ann. Neurol. 66:290-297, 2009，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中)。
不能治癒或治療質膜修復蛋白病。總而言之，評價基因代替或代用基因代替之臨床前研究已展示，多種策略在恢復膜修復方面展現一定效能。質膜修復蛋白基因包括55個涵蓋150 kb之基因體DNA與其相關6.5 kb cDNA之外顯子。然而，對於基因代替而言，AAV之包裝限值為4.7kb，此低於質膜修復蛋白之6.5 kb cDNA序列。因此，LGMD2B治療需要能夠將功能性全長質膜修復蛋白遞送至有需要之受試者中之新機制。
本文揭示編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之重組聚核苷酸，其中重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列係由以下各物組成：(a) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(c) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(d)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(e)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中該片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(f)與(e)之核苷酸序列在(e)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含一或多個選自反向末端重複序列(ITR)、啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)之其他核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有ITR之其他核苷酸序列。在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。在一些實施例中，重組聚核苷酸包含兩個ITR。在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 17之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有啟動子之其他核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子係選自人類骨骼肌動蛋白基因元件、心臟肌動蛋白基因元件、結蛋白啟動子、骨骼α肌動蛋白(ASKA)啟動子、肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子、肌細胞特異性增強子結合因子mef結合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、截短MCK (tMCK)啟動子、肌球蛋白重鏈(MHC)啟動子、雜合a肌球蛋白重鏈增強子-/MCK增強子-啟動子(MHCK7)啟動子、C5-12啟動子、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白i基因元件、低氧可誘導核因子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子係MHCK7啟動子。在一些實施例中，啟動子係重組啟動子。在一些實施例中，重組啟動子係重組肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，重組肌肉特異性啟動子係重組肌球蛋白重鏈‐肌酸激酶肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有內含子之其他核苷酸序列。在一些實施例中，內含子包含5’供體位點、分支點及/或3’剪接位點。在一些實施例中，內含子係嵌合內含子。在一些實施例中，內含子包含來自人類β球蛋白基因之5’供體位點。在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之分支點。在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之3′剪接受體位點。在一些實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有選擇標記物之其他核苷酸序列。在一些實施例中，選擇標記物係抗生素抗性基因。在一些實施例中，抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素(kanamycin)抗性基因。在一些實施例中，重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列。在一些實施例中，重組核苷酸並並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
在一些實施例中，重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
本文揭示編碼人類質膜修復蛋白之片段之重組聚核苷酸序列，其中重組聚核苷酸包含第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列係由以下各物組成：(a) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(c) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(d)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(e)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(f)與(e)之聚核苷酸序列在(d)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含一或多個其他核苷酸序列，包含反向末端重複序列(ITR)、選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有ITR之其他核苷酸序列。在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。在一些實施例中，重組核苷酸包含兩個ITR。在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有聚A信號之核苷酸序列。在一些實施例中，聚A信號係人工聚A信號。在一些實施例中，聚A信號包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組聚核苷酸進一步包含含有選擇標記物之其他核苷酸序列。在一些實施例中，選擇標記物係抗生素抗性基因。在一些實施例中，抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。在一些實施例中，重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
在一些實施例中，重組核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第一片段之第一聚核苷酸序列。
在一些實施例中，重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
在一些實施例中，重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
本文進一步揭示一種雙腺相關病毒(AAV)載體系統，其包含：(a)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端片段之第一重組聚核苷酸，其中第一重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中該片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二重組聚核苷酸，其中第二重組聚核苷酸包含第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一重組聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，重組聚核苷酸編碼人類質膜修復蛋白之N-末端片段。在一些實施例中，重組聚核苷酸編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段。在一些實施例中，AAV載體係AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.10、AAVrh.20或AAVrh.74。在一些實施例中，AAV載體係AAVrh.74。
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一AAV載體之組合物。
本文進一步揭示一種組合物，其包含(a)第一重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中第一rAAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端片段之第一重組聚核苷酸，其中第一重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中該片段係其SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二rAAV載體，其中第二rAAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二重組聚核苷酸，其中第二重組聚核苷酸包含第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，第一rAAV載體及第二rAAV載體之莫耳比介於約100:1-1:100、約10:1-1:10、約2:1-1:2之間或為約1:1。
本文進一步揭示一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接。
在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。在一些實施例中，第一及/或第二ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含一或多個其他聚核苷酸序列，包含啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含含有啟動子之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子係肌球蛋白重鏈複合物-E盒肌肉肌酸激酶融合增強子/啟動子。在一些實施例中，啟動子係重組啟動子。在一些實施例中，重組啟動子係重組肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，重組-肌肉特異性啟動子係MHCK7啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含含有內含子之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，內含子包含5’供體位點、分支點及/或3’剪接位點。在一些實施例中，內含子係嵌合內含子。在一些實施例中，內含子包含來自人類β球蛋白基因之5’供體位點。在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之分支點。在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之3’剪接受體位點。在一些實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含含有選擇標記物之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，選擇標記物係抗生素抗性基因。在一些實施例中，抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。在一些實施例中，AAV載體包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 15之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例，AAV載體不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
在一些實施例中，AAV載體不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
本文進一步揭示一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含一或多個聚核苷酸序列，包含選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號。
在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含含有聚A信號之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，聚A信號係人工聚A信號。在一些實施例中，聚A信號包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體進一步包含含有選擇標記物之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，選擇標記物係抗生素抗性基因。在一些實施例中，抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。
在一些實施例中，AAV載體包含SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。
在一些實施例中，AAV載體並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例，AAV載體不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
在一些實施例中，AAV載體不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
本文揭示一種雙腺相關病毒(AAV)載體系統，其包含：(I)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接；及(II)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含(a)第三反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及(c)第四ITR，其中聚核苷酸由第三及第四ITR側接。
本文進一步揭示一種腺相關病毒(AAV)包裝系統，其包含：(a)包含本文所揭示重組聚核苷酸之質體；(b)腺病毒輔助質體；及(c) rep-cap質體。在一些情況下，腺病毒輔助質體包含pHELP質體。
本文進一步揭示一種腺相關病毒包裝系統，其包含：(a)包含本文所揭示重組聚核苷酸之質體；及(b)腺病毒輔助質體。在一些情況下，腺病毒輔助質體包含pHELP質體。
本文進一步揭示產生腺相關病毒(AAV)載體之方法，其包含使細胞與AAV包裝系統接觸，其中AAV包裝系統包含：(a)包含本文所揭示重組聚核苷酸之質體；(b)腺病毒輔助質體；及(c) rep-cap質體。在一些情況下，細胞係宿主細胞、視情況哺乳動物宿主細胞、另外視情況HEK293。
本文進一步揭示產生腺相關病毒(AAV)載體之方法，其包含使用AAV包裝系統轉導包裝細胞系，其中AAV包裝系統包含(a)質體，其包含含有本文所揭示之任一重組聚核苷酸之AAV表現盒；及(b)腺病毒輔助質體，且其中包裝細胞系表現腺相關病毒rep及cap基因。在一些情況下，AAV rep基因係Rep78。在一些情況下，AAV cap基因係Rh74cap 基因。
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一重組聚核苷酸之細胞。
本文進一步揭示包含AAV表現盒之細胞，其中AAV表現盒包含本文所揭示之任一重組聚核苷酸。在一些情況下，質體包含與SEQ ID NO: 18或19至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸。在一些情況下，質體包含SEQ ID NO: 18或19之聚核苷酸。
本文進一步揭示治療質膜修復蛋白病之方法，其包含向有需要之受試者投與：(a)有效量之第一重組聚核苷酸，該第一重組聚核苷酸包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列，其中第一聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)有效量之第二重組聚核苷酸，該第二重組聚核苷酸包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸序列，其中第二聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，第一聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。
在一些實施例中，第一及第二聚核苷酸係同時或依序投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文進一步揭示治療質膜修復蛋白病之方法，其包含向有需要之受試者投與(a)有效量之第一腺相關病毒(AAV)載體，其中第一AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸，其中第一聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)有效量之第二AAV載體，其中第二AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸，其中第二聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸。
在一些實施例中，第一AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二AAV載體係同時投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與有效量之本文所揭示之任一AAV雙載體系統。
在一些實施例中，AAV雙載體系統係經肌內或經靜脈內投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與有效量之本文所揭示之任一組合物。
在一些實施例中，該組合物係經肌內或經靜脈內投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文進一步揭示組合物在製造用於治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑中之用途，其中該組合物包含(a)第一重組聚核苷酸，其包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列，其中第一聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二重組聚核苷酸，其包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸序列，其中第二聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，第一聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二聚核苷酸係同時投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文揭示組合物製造治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑中之用途，其中該組合物包含：(a)有效量之第一腺相關病毒(AAV)載體，其中第一AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列，其中第一聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)有效量之第二腺相關病毒(AAV)載體，其中第二AAV載體包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸，其中第二聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸。
在一些實施例中，第一AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二AAV載體係同時投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文揭示組合物在製造用於治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑中之用途，其中該組合物包含本文所揭示之任一AAV雙載體系統。
在一些實施例中，該組合物係經肌內或經靜脈內投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文揭示所揭示任一組合物在製造用於治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑中之用途。
在一些實施例中，該組合物係經肌內或經靜脈內投與。
在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體，第一AAV載體之有效量介於約1×106 -1×1016 vg/kg、約1×108 -1×1015 vg/kg或約1×1010 -1×1014 vg/kg之間。
在一些實施例中，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體，第二AAV載體之有效量介於約1×106 -1×1016 vg/kg、約1×108 -1×1015 vg/kg或約1×1010 -1×1014 vg/kg之間。
在一些實施例中，投與第一AAV載體至少1、2、3、4或5次。
在一些實施例中，投與第二AAV載體至少1、2、3、4或5次。
在一些實施例中，AAV雙載體系統之有效量介於約1×1010 -1×1013 載體基因體(vg)、約1×1011 -1×1013 vg、1×1012 -1×1013 vg之間。
在一些實施例中，投與AAV雙載體系統至少1、2、3、4或5次。
在一些實施例中，組合物之有效量介於約1×1010 -1×1013 載體基因體(vg)、約1×1011 -1×1013 vg、1×1012 -1×1013 vg之間。
在一些實施例中，投與組合物至少1、2、3、4或5次。
本文揭示編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸，其中重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列。
本文揭示製備編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸之方法，其中重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列，其中該方法包含使細胞與以下各物接觸：包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列之重組聚核苷酸，其中第一聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二重組聚核苷酸，其包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸序列，其中第二聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
本文揭示製備編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸之方法，其中重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列，其中該方法包含使細胞與雙AAV載體系統接觸，該雙AAV載體系統包含：(I)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接；及(II)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含(a)第三反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及(c)第四ITR，其中聚核苷酸由第三及第四ITR側接。
在一些實施例中，細胞係真核細胞。在一些實施例中，細胞係肌細胞、心臟細胞、幹細胞、衛星細胞及/或肝細胞。
本文揭示製備編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸之方法，其中重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列，其中該方法包含向受試者投與以下各物：包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列之重組聚核苷酸，其中第一聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二重組聚核苷酸，其包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸序列，其中第二聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
本文揭示製備編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸之方法，其中重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列，其中該方法包含向受試者投與雙AAV載體系統，該雙AAV載體系統包含：(I)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接；及(II)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含(a)第三反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及(c)第四ITR，其中聚核苷酸由第三及第四ITR側接。
本文揭示治療受試者之肌肉營養不良症之方法，其包含在受試者表現編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸，其中重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，該方法包含向受試者投與以下各物：包含編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之N-末端之第一聚核苷酸序列之重組聚核苷酸，其中第一聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(b)第二重組聚核苷酸，其包含編碼人類質膜修復蛋白之C-末端片段之第二聚核苷酸序列，其中第二聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，該方法包含向受試者投與雙AAV載體系統，該雙AAV載體系統包含：(I)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接；及(II)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含(a)第三反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及(c)第四ITR，其中聚核苷酸由第三及第四ITR側接。
在一些實施例中，受試者係選自人類、非人類靈長類動物、犬類、羊類、馬、豬類、鼠類、大鼠、兔、牛類或貓類之哺乳動物。
在一些實施例中，受試者患有質膜修復蛋白病。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
相關申請案之交叉參考
本申請案在35 U.S.C. § 119(e)下主張2020年5月13日提出申請之美國臨時申請案第63/024,338號之優先權，該申請案之內容以引用方式併入本申請案中。
定義
除非另外定義，否則本文使用之所有術語(包括技術及科學術語)皆具有與熟習此項技術者通常所理解相同之含義。應進一步理解，應將術語(例如常用字典中所定義之彼等術語)詮釋為具有與其在本申請案及相關技術之內容脈絡中之含義一致之含義，而不應以理想化或過分形式化意義來詮釋，除非本文中明確如此定義。儘管未明確定義於下文，但該等術語應根據其常用含義來詮釋。
本文之說明中所使用之術語僅用於闡述特定實施例之目的而並非意欲限制本發明。本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。
除非另外指示，否則本發明技術之實踐將採用業內所熟知之組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學及重組DNA之習用技術。
除非上下文另外指示，否則本文所闡述之各個本發明特徵可明確地意欲以任何組合來使用。此外，本發明亦考慮，在一些實施例中，可排除或省略本文所陳述特徵之任何特徵或組合。舉例而言，若說明書陳述複合物包含組分A、B及C，則可明確地意欲單一地或以任何組合省略及棄除A、B或C中之任一者或其組合。
除非另外明確指示，否則所有指定之實施例、特徵及術語皆意欲包括所引述實施例、特徵或術語及其生物等效形式。
所有指定數值(例如pH、溫度、時間、濃度及分子量，包括範圍)皆係視需要(+)或(-)變化1.0或0.1增量或替代地變化+/- 15%或替代地變化10%或替代地變化5%或替代地變化2%之近似值，且包括該等範圍。應理解但並不總是明確陳述，所有指定數值之前皆具有術語「約」。亦應理解但並不總是明確陳述，本文所闡述之試劑僅係實例性且該等試劑之等效物為業內所已知。
除非另外指示，否則本發明技術之實踐將採用業內所熟知之有機化學、藥理學、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學及重組DNA之習用技術。例如參見Sambrook, Fritsch及Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版(1989)；Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel等人編輯(1987))；Methods in Enzymology系列(Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames及G.R. Taylor編輯(1995))；Harlow及Lane編輯(1988) Antibodies, a Laboratory Manual；及Animal Cell Culture (R.I. Freshney編輯(1987))。
如本文中所使用，術語「增加」、「降低」、「高」、「低」或其任何語法變化形式係指參考組合物、多肽、蛋白質等變化約90%、80%、50%、20%、10%、5%、1%、0.5%或甚至0.1%。
在用於闡述本文所揭示之任何組分、範圍、劑型等之選擇時，術語「可接受」、「有效」或「充分」欲指該組分、範圍、劑型等適用於所揭示目的。
另外，如本文中所使用，「及/或」係指且涵蓋所列示相關項目中之一或多者之任何及所有可能組合，且在以替代意義(「或」)詮釋時係指並無組合。
未經明確敘述即可推斷且除非另外期望，否則在本發明陳述多肽、蛋白質、聚核苷酸或抗體時，該物質之等效物或生物等效物意欲屬本發明範圍內。如本文中所使用，在提及參考蛋白質、抗體、多肽或核酸時，術語「其生物等效物」意欲與「其等效物」同義，且欲指具有最小序列一致性而仍維持期望結構或功能性者。除非特定地引述於本文中，否則本文所提及之任何聚核苷酸、多肽或蛋白質亦考慮包括其等效物。舉例而言，等效物意欲與參考序列之長度具有至少約70%同源性或一致性或至少80%同源性或一致性及替代地或至少約85%或替代地至少約90%或替代地至少約95%或替代地98%百分比同源性或一致性，且與參考蛋白質、多肽或核酸展現實質上等效之生物活性。或者，在提及聚核苷酸時，其等效物在一態樣中係在嚴格條件下雜交至參考聚核苷酸或其補體之聚核苷酸，且在另一態樣中與參考聚核苷酸或其補體具有相同或類似活性或功能。
蛋白質或多肽(在本文中稱為參考)之等效物與參考共有至少50% (或至少60%或至少70%或至少80或至少90%)之一致性且保留參考之功能及可製造性。
如本文中所使用，術語「功能」、「活性」及「酶促活性」可互換使用。已展示，損失質膜修復蛋白會損害骨骼肌中之Ca2+依賴性膜修復(Song等人，Proc. Natl. Acad. Sci .USA 98: 4084-4088, 2001；及Schnepp等人，J. Virol. 77:3495-3504, 2003)。另外，已展示，質膜修復蛋白會與涉及膜修復之其他蛋白質相互作用，該等其他蛋白質包括膜聯蛋白A1及A2、AHNAK及小窩蛋白-3 (Schnepp等人，J. Virol. 77:3495-3504, 2003；Duan等人，J. Virol. 72:8568-8577, 1998；Donsante等人，基因 Ther. 8:1343-1346, 2001；及Monahan等人，Expert Opin. Drug. Saf. 1:79-91, 2002)。據信，損失肌纖維再生能力係質膜修復蛋白缺陷之促成後果(Song等人，Gene Ther. 8:1299-1306, 2001)。質膜修復蛋白亦與囊泡輸送及內吞作用以及T小管形成有關(Eveson等人，The Journal of Biological Chemistry 285:28529-28539, 2010；Klinge等人，FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 21:1768-1776, 2007；及Klinge等人，Muscle & Nerve 41:166-173, 2010)。因此，質膜修復蛋白活性之實例包括(但不限於)骨骼肌中之膜修復(例如膜重密封)、肌纖維再生能力之防止或恢復、囊泡輸送、內吞作用及橫向(T-)小管形成。膜修復分析、囊泡輸送分析及管形成分析為業內所已知且可用於量測活體外質膜修復蛋白活性。例如參見 Carmeille等人，Methods Mol. Biol. 1668:195-207, 2017；Vassilieva及Nusrat,Methods Mol. Biol. 440:3-14, 2008；Demonbreun等人，Am. J. Pathol. 184(1):248-59, 2014，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。量測質膜修復蛋白之活性之其他方法可參見(例如) Grose等人，PLoS One 7:e39233, 2012及Sondergaard等人，Anns of Clin. Trans. Neurol. 2:256-270, 2015。
聚核苷酸(在本文中稱為參考)之等效物與參考共有至少50% (或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%)之一致性，且與由參考編碼者編碼相同多肽或編碼由參考所編碼多肽之等效物。
為獲得測試序列中等效於(或對應於)參考序列之胺基酸/核苷酸殘基或連續區段之位置或連續區段，在測試序列與參考序列之間實施序列比對。彼此比對之位置或區段可確定為等效物。
術語「親和標籤」係指可包括於融合蛋白內以容許使用能夠結合至(亦即具有親和力)之親和標籤之配體檢測融合蛋白及/或自細胞環境純化融合蛋白之多肽。配體可為(但不限於)抗體、樹脂或互補多肽。親和標籤可包含小肽(通常係長度為大約4至16個胺基酸之肽)，或其可包含較大多肽。常用親和標籤尤其包括聚精胺酸、FLAG、V5、聚組胺酸、c-Myc、Strep II、麥芽糖結合蛋白(MBP)、N-利用物質蛋白質A (NusA)、硫氧還蛋白(Trx)及麩胱甘肽S -轉移酶(GST) (例如參見GST 基因 Fusion System Handbook - Sigma-Aldrich)。在一實施例中，親和標籤係聚組胺酸標籤，例如His6 標籤(SEQ ID NO: 21)。在融合蛋白中納入親和標籤可容許藉由親和純化使用能夠緊密及特異性地結合親和標籤之親和介質自細胞環境純化融合蛋白。親和介質可包含(例如)帶金屬樹脂或共價連接至固定相(基質，例如瓊脂糖或金屬珠粒)之配體。舉例而言，可藉由固定金屬離子層析使用帶Ni2+ 或Co2+ 樹脂來回收加聚組胺酸標籤之融合蛋白(亦稱為加His標籤之融合蛋白)，可使用抗FLAG親和凝膠捕獲加FLAG標籤之融合蛋白，且可使用交聯至固體載體(例如瓊脂糖)之麩胱甘肽捕獲加GST標籤之融合蛋白。在一態樣中，親和標籤係純化標籤或標記物。
如本文中所使用，術語「純化(purification、purifying)」或「分離」係指自複雜混合物(例如細胞溶解物或多肽混合物)分離一或多種生物材料(例如聚核苷酸、多肽或病毒載體)之製程。純化、分離或分離未必係完全的，亦即，複雜混合物之一些組分可在純化製程之後與一或多種生物材料(例如聚核苷酸、多肽或病毒載體)一起保留。然而，擬純化產物應相對於純化前之複雜混合物富集一或多種生物材料(例如聚核苷酸、多肽或病毒載體)且大部分最初存在於複雜混合物內之其他組分應藉由純化製程去除。
本文所用之術語「細胞」可係指視情況自受試者或市售來源獲得之原核或真核細胞。在一些情況下，細胞係宿主細胞，例如哺乳動物細胞或哺乳動物宿主細胞。在一些情況下，宿主細胞亦在本文中稱為生產細胞或包裝細胞。在一些情形下，細胞系係包裝細胞系。
「真核細胞」包含除原核生物外之所有生命王國。其可易於經由膜結合核來區分。動物、植物、真菌及原生生物係細胞由內部膜及細胞骨架組織成複雜結構之真核生物或生物體。最具特性之膜結合結構係細胞核。除非特定地引述，否則術語「宿主」包括真核宿主，包括(例如)酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞。真核細胞或宿主之非限制性實例包括猿類、牛類、豬類、鼠類、大鼠、禽類、爬蟲類及人類，例如HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-S細胞、CHO-K1細胞、293T細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、Sf9細胞、幹細胞、衛星細胞及肌細胞。肌細胞之實例包括(但不限於)骨骼肌細胞、心臟肌細胞及平滑肌細胞。
「原核細胞」通常缺乏細胞核或任何其他膜結合細胞器且分成兩個領域：細菌及古細菌。除染色體DNA外，該等細胞亦可在稱為游離基因體之圓環中含有基因資訊。細菌細胞極小，大約為動物線粒體之大小(約1-2 μm直徑及10 μm長)。原核細胞主要具有三種形狀：棒形、球形及螺旋形。細菌細胞藉由二元裂變進行分裂，而非如同真核生物一般進行複雜之複製過程。實例包括(但不限於)桿菌(Bacillus )細菌、大腸桿菌(E. coli )細菌及沙門桿菌(Salmonella )細菌。
如針對核酸序列所應用，術語「編碼」係指，若聚核苷酸在呈其天然狀態時或在藉由熟習此項技術者熟知之方法操縱時可發生轉錄及/或轉譯以產生多肽及/或其片段之mRNA，則其可視為「編碼」該多肽。反義鏈係此一核酸之補體，且可自其推斷編碼序列。
在提及特定分子、生物或細胞材料時，術語「等效物」或「生物等效物」可互換使用且欲指具有最小同源性而仍維持期望結構或功能性(例如具有類似功能或活性)者。應理解且未明確陳述，在提及參考多肽、蛋白質或聚核苷酸之等效物或生物等效物時，等效物或生物等效物與參考多肽、蛋白質或聚核苷酸具有所引述結構關係及等效或實質上等效之生物活性。舉例而言，等效多肽、蛋白質或聚核苷酸之非限制性實例包括在參考多肽、聚核苷酸或蛋白質之長度中與或針對多肽、聚核苷酸或蛋白質序列具有至少60%或替代地至少65%或替代地至少70%或替代地至少75%或替代地80%或替代地至少85%或替代地至少90%或替代地至少95%一致性之多肽、蛋白質或聚核苷酸。或者，等效多肽係由在高嚴格度條件下雜交至編碼該等參考多肽序列之聚核苷酸之聚核苷酸或其補體編碼且具有實質上等效或等效之生物活性者。高嚴格度條件闡述於本文中且以引用方式併入本文中。或者，其等效物係由與參考聚核苷酸(例如野生型聚核苷酸)在參考聚核苷酸之長度中具有至少70%或替代地至少75%或替代地80%或替代地至少85%或替代地至少90%或替代地至少95%一致性或至少97%序列一致性之聚核苷酸或其補體編碼之多肽。該等等效多肽與由參考聚核苷酸編碼之多肽具有相同生物活性。
等效聚核苷酸之非限制性實例包括與參考聚核苷酸具有至少60%或替代地至少65%或替代地至少70%或替代地至少75%或替代地80%或替代地至少85%或替代地至少90%或替代地至少95%或替代地至少97%一致性之聚核苷酸。等效物亦欲指在高嚴格度條件下雜交至參考聚核苷酸之聚核苷酸或其補體。該等等效聚核苷酸與參考聚核苷酸具有相同生物活性。
聚核苷酸或聚核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有某一百分比(例如80%、85%、90%或95%)之「序列一致性」意指，在參考聚核苷酸之長度中比較兩個序列以加以比對時，該百分比之鹼基(或胺基酸)係相同的。可使用業內已知之軟體程序(例如闡述於Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯，1987)之增刊30第7.7.18章節之表7.7.1中者)測定所述比對及同源性或序列一致性百分比)。在某些實施例中，使用預設參數進行比對。一種非限制性實例性比對程式係BLAST，其使用預設參數。特定而言，實例性程式包括BLASTN及BLASTP，其使用下列預設參數：基因代碼=標準；篩選=無；鏈=兩條；截止值= 60；預期= 10；矩陣= BLOSUM62；說明=50個序列；分類依據=高分數；資料庫=非冗餘，基因庫+ EMBL + DDBJ + PDB +基因庫CDS轉譯+ SwissProtein + SPupdate + PIR。該等程式之細節可參見下列網際網路網址：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。序列一致性及一致性百分比可藉由將其納入clustalW (可獲得於網址：genome.jp/tools/clustalw/處，最後訪問於2017年1月13日)或Clustal Omega (可獲得於ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/處)中來測得。
「同源性」或「一致性」或「類似性」係指兩條肽之間或兩個核酸分子之間的序列類似性。同源性可藉由比較各序列中之位置來測定，該等序列可出於比較目的進行比對。在比較序列中之位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，分子在該位置處同源。序列間之同源性程度隨序列所共有之匹配或同源位置之數量而變化。「無關」或「非同源」序列與本發明之一個序列共有小於40%之一致性或替代地小於25%之一致性。
如本文中所使用，術語「至少90%一致」係指兩個比較序列(聚核苷酸或多肽)之約90%至約100%之一致性。其亦包括至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、約91%至約100%、約92%至約100%、約93%至約100%、約94%至約100%、約95%至約100%、約96%至約100%、約97%至約100%、約98%至約100%或約99%至約100%之一致性。
如本文中所使用，在闡述聚核苷酸、蛋白質及/或肽之功能、活性或功能活性時，術語「保留」、「類似」及「相同」可互換使用且提及參考蛋白質、聚核苷酸及/或肽之活性之至少約20% (包括(但不限於)：至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或約100%)之功能活性。
「雜交」係指其中一或多個聚核苷酸反應形成複合物之反應，該複合物係經由核苷酸殘基之鹼基之間的氫鍵來穩定。氫鍵可藉由沃森-克裡克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)、霍格斯坦結合(Hoogstein binding)或以任何其他序列特異性方式來發生。複合物可包含兩條形成雙螺旋結構之鏈、三條或更多條形成多鏈複合物之鏈、單一自雜交鏈或其任何組合。雜交反應可構成更廣泛過程中之一個步驟，例如PCR反應之起始或核酶對聚核苷酸之酶促裂解。
嚴格雜交條件之實例包括：約25℃至約37℃之培育溫度；約6×SSC至約10×SSC之雜交緩衝液濃度；約0%至約25%之甲醯胺濃度；及約4×SSC至約8×SSC之洗滌溶液。中等雜交條件之實例包括：約40℃至約50℃之培育溫度；約9×SSC至約2×SSC之緩衝液濃度；約30%至約50%之甲醯胺濃度；及約5×SSC至約2×SSC之洗滌溶液。高嚴格度條件之實例包括：約55℃至約68℃之培育溫度；約1×SSC至約0.1×SSC之緩衝液濃度；約55%至約75%之甲醯胺濃度；及約1×SSC、0.1×SSC或去離子水之洗滌溶液。一般而言，雜交培育時間為5分鐘至24小時，使用1、2或更多個洗滌步驟，且洗滌培育時間為約1、2或15分鐘。SSC為0.15 M NaCl及15 mM檸檬酸鹽緩衝液。應理解，可採用使用其他緩衝系統之SSC等效物。在一態樣中，等效聚核苷酸係在嚴格條件下雜交至參考聚核苷酸或其補體者。在另一態樣中，等效多肽係由在嚴格條件下雜交至參考聚核苷酸或其補體之聚核苷酸編碼之多肽。
如本文中所使用，「表現」係指將聚核苷酸轉錄成mRNA之過程及/或將經轉錄mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。若聚核苷酸係源自基因體DNA，則表現可包括在真核細胞中剪接mRNA。
如本文中所使用，術語「功能」可用於修飾任何分子、生物或細胞材料以意欲使其達成特定、指定效應。
如本文中所使用，術語「核酸序列」及「聚核苷酸」可互換使用且係指任何長度之聚合形式之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)。因此，此術語包括(但不限於)單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因體DNA、互補DNA (cDNA)、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、化學或生物化學修飾之非天然或衍生化核苷酸鹼基的聚合物。在某些實施例中，聚核苷酸包含及/或編碼信使RNA (mRNA)、短髮夾RNA及/或小髮夾RNA。在一實施例中，聚核苷酸係或編碼mRNA。在某些實施例中，聚核苷酸係雙鏈(ds) DNA，例如經改造ds DNA或自單鏈RNA合成之ds cDNA。
術語「蛋白質」、「肽」及「多肽」可互換使用且在最廣泛意義上係指兩種或更多個胺基酸、胺基酸類似物或肽模擬物亞單元之化合物。亞單元可由肽鍵連接。在另一態樣中，亞單元可由其他鍵(例如酯、醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸且並不限制可構成蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量。如本文中所使用，術語「胺基酸」係指天然及/或非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸以及D與L光學異構體、胺基酸類似物及肽模擬物。
如本文中所使用，連續胺基酸序列係指具有至少兩個胺基酸之序列。然而，應注意，第一部分及第二部分之連續胺基酸序列並不將胺基酸序列限於具有直接偶聯之第一部分與第二部分。第一部分亦可經由第三部分(例如連接體)連接至第二部分，由此形成一個連續胺基酸序列。
如本文中所使用，術語「偶聯(conjugate、conjugated、conjugating及conjugation)」係指在分子之間且尤其在兩個胺基酸序列及/或兩個多肽之間形成鍵。偶聯可為直接(亦即鍵)或間接(亦即經由另一分子)的。偶聯可為共價或非共價的。
如本文中所使用，連續胺基酸序列可包含兩個或更多個彼此直接或間接(例如經由連接體)偶聯之多肽。
如本文中所使用，術語「重組表現系統」係指用於表現某些藉由重組形成之基因物質之一或多個基因構築體。
「基因遞送媒劑」定義為可將所插入聚核苷酸攜載至宿主細胞中之任何分子。基因遞送媒劑之實例係脂質體、微胞生物相容性聚合物(包括天然聚合物及合成聚合物)；脂蛋白；脂質奈米顆粒；多肽；多醣；脂多醣；人工病毒包膜；金屬顆粒；及細菌或病毒，例如狂犬病病毒、蟲媒病毒、慢病毒、桿狀病毒、腺病毒及逆轉錄病毒、噬菌體、黏粒、質體、真菌載體及此項技術中通常所用之已闡述用於表現於各種真核及原核宿主中且可用於基因療法以及簡單蛋白質表現之其他重組媒劑。
可使用基因遞送媒劑將本文所揭示之聚核苷酸遞送至細胞或組織中。本文所用之「基因遞送」、「基因轉移」、「基於mRNA之遞送」、「轉導」及諸如此類係涉及將外源性聚核苷酸(有時稱為「轉基因」)引入宿主細胞中(不論用於引入之方法如何)之術語。該等方法包括各種熟知技術，例如載體調介之基因轉移(例如藉由病毒感染/轉染或各種其他基於蛋白質或基於脂質之基因遞送複合物，包括(例如)魚精蛋白(protamine)複合物、脂質奈米顆粒、聚合奈米顆粒、脂質-聚合物雜合奈米顆粒及無機奈米顆粒或其組合)以及有利於遞送「裸」聚核苷酸之技術(例如電穿孔、「基因槍」遞送及用於引入聚核苷酸之各種其他技術)。所引入聚核苷酸可未修飾或可包含一或多種修飾；舉例而言，經修飾mRNA可包含ARCA封端、酶促多聚腺苷酸化(用以添加具有100-250個腺苷殘基之尾部(SEQ ID NO: 22))且使用5-甲基胞苷取代一或兩個胞苷及/或使用假尿苷取代尿苷。所引入聚核苷酸可穩定或暫時維持於宿主細胞中。穩定維持通常需要所引入聚核苷酸含有與宿主細胞相容之複製起點或整合至宿主細胞複製子(例如染色體外複製子(例如質體))或核或粒線體染色體中。已知許多載體能夠調介基因至哺乳動物細胞之轉移，如業內所已知及本文所闡述。
「質體」係與染色體DNA分離之染色體外DNA分子，其能夠獨立於染色體DNA進行複製。在許多情形下，其係圓形及雙鏈。質體提供了在微生物群體內進行水平基因轉移之機構且通常在既定環境狀態下提供選擇性優點。質體可攜載抵抗競爭性環境生態區位中之天然抗生素之基因，或替代地所產生蛋白質可在類似情況下用作毒素。
基因改造中所用之「質體」稱為「質體載體」。可購得許多質體以用於該等應用。將擬複製基因插入含有使得細胞抵抗特定抗生素之基因及多選殖位點(MCS或聚連接體)之質體之拷貝中，該多選殖位點係含有若干容許在此位置處容易插入DNA片段之常用限制位點之較短區域。質體之另一主要用途係製備大量蛋白質。在此情形下，研究者培植含有具有所關注基因之質體之細菌。正如細菌會產生蛋白質以賦予其抗生素抗性，其亦可經誘導以自所插入基因產生大量蛋白質。
「酵母人工染色體」或「YAC」係指用於選殖大DNA片段(大於100 kb且最高3000 kb)之載體。其係人工構築之染色體且含有酵母細胞中之複製及保存所需之端粒、著絲粒及複製起點序列。因使用初始圓形質體所構建，藉由使用限制酶來使其線性化，且然後DNA連接酶可藉由使用黏性端在線性分子內添加所關注序列或基因。酵母表現載體(例如YAC、YIp (酵母整合質體)及YEp (酵母游離質體))極其有用，此乃因可獲得具有轉譯後修飾之真核蛋白質產物(因酵母自身係真核細胞)，然而，已發現YAC之穩定性小於BAC，從而產生嵌合效應。
如本文中所使用，術語「病毒衣殼」或「衣殼」係指病毒顆粒之蛋白質性殼體或外殼。衣殼用於衣殼化、保護、傳輸病毒基因體且釋放至宿主細胞中。衣殼通常包含蛋白質之寡聚結構亞單元(「衣殼蛋白」)。如本文中所使用，術語「衣殼化」意指包封於病毒衣殼內。
如本文中所使用，提及病毒或質體之術語「輔助」係指用於提供複製及包裝病毒顆粒或重組病毒顆粒(例如本文所揭示之經修飾AAV)所需之其他組分之病毒或質體。由輔助病毒編碼之組分可包括病毒體組裝、衣殼化、基因體複製及/或包裝所需之任何基因。舉例而言，輔助病毒可編碼病毒基因體複製所需之酶。適用於AAV構築體之輔助病毒及質體之非限制性實例包括pHELP (質體)、腺病毒(病毒)或疱疹病毒(病毒)。
如本文中所使用，生物試樣或試樣可自受試者、細胞系或經培養細胞或組織獲得。實例性試樣包括(但不限於)細胞試樣、組織試樣、液體試樣(例如血液)及生物來源之其他液體試樣(包括(但不限於)、眼部流體(眼房水及玻璃體液)、周邊血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊髓液(CSF)、痰液、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或預射精液、女性射液、汗液、淚液、囊腫液、胸膜液及腹膜液、心包液、腹水、淋巴液、食糜、乳糜、膽液、間質液、經血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物/潮紅、滑液、黏膜分泌物、糞便水、胰液、竇腔灌洗液、支氣管肺抽吸物、囊胚腔液或臍帶血)。
如本文中所使用，術語「可檢測標記物」係指至少一種能夠直接或間接產生可檢測信號之標記物。此標記物之非窮舉性清單包括產生可檢測信號(例如藉由比色法、螢光、發光)之酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖6磷酸去氫酶)、發色團(例如螢光、發光染料、具有藉由電子顯微術或藉由其電性質(例如電導率、電流分析、伏安分析、阻抗)檢測之電子密度之基團、可檢測基團(例如分子大小足以誘導可檢測到之改良物理及/或化學性質，此等檢測可藉由光學方法(例如繞射、表面電漿共振、表面變化、接觸角變化)或物理方法(例如原子力光譜術、隧道效應)來達成))或放射性分子(例如32 P、35 S、89 Zr或125 I)。
如本文中所使用，術語「純化標記物」係指至少一種可用於純化或鑑別之標記物。此標記物之非窮舉性清單包括His、lacZ、GST、麥芽糖結合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、cherry、硫氧還蛋白、聚(NANP)、V5、Snap、HA、幾丁質結合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S-蛋白。適宜之直接或間接螢光標記物包含FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、cherry、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛(Digoxigenin)、Tamra、德克薩斯紅(Texas Red)、羅丹明(rhodamine)、Alexa fluors、FITC、TRITC或任何其他螢光染料或半抗原。
如本文中所使用，表位標籤係用作由抗體識別之抗原之生物結構或序列，例如蛋白質或碳水化合物。在某些實施例中，表位標籤可與純化標記物及/或親和標籤互換使用。
「組合物」欲指兩種或更多種化合物之組合，例如活性多肽、聚核苷酸、病毒載體或抗體與另一惰性(例如可檢測標記)或活性(例如基因遞送媒劑)化合物或組合物之組合。
「醫藥組合物」意欲包括活性多肽、聚核苷酸或抗體與使組合物適用於活體外、活體內或離體診斷或治療應用之惰性或活性載劑(例如固體載體)之組合。
如本文中所使用，術語「醫藥上可接受之載劑」涵蓋任一標準醫藥載劑，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水及乳液(例如油/水或水/油乳液)以及各種類型之潤濕劑。該等組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci.，第15版(Mack Publ. Co., Easton)。
「受試者」、「個體」或「患者」可在本文中互換使用，且係指脊椎動物、較佳地哺乳動物、更佳地人類。哺乳動物包括(但不限於)非人類靈長類動物、鼠類、大鼠、兔、猿類、牛類、羊類、豬類、犬類、貓類、農場動物、運動動物、寵物、馬及靈長類動物、尤其人類。除用於人類治療外，本發明亦可用於伴侶哺乳動物、境外動物及家養動物(包括哺乳動物、齧齒類動物及諸如此類)之獸醫治療。在一實施例中，哺乳動物包括馬、狗及貓。在本發明之另一實施例中，人類係年齡在18歲以下之青少年或嬰兒。
疾病之「治療(treating或treatment)」包括：(1)預防疾病，亦即使疾病之臨床症狀不會發生於可易感疾病但尚未經歷或顯示疾病症狀之患者中；(2)抑制疾病，亦即阻止或減少疾病或其臨床症狀之發生；或(3)減輕疾病，亦即使疾病或其臨床症狀消退。在一態樣中，術語「治療」不包括預防或防治。
關於術語「治療」之術語「患有」係指患者或個體已經診斷患有疾病或易感疾病。
「有效量」係足以實現有益或期望結果之量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量來投與。該遞送取決於諸多變量，包括擬使用個別劑量單元之時間段、治療劑之生物可用性、投與途徑等。然而，應理解，本發明治療劑在任何特定受試者中之具體劑量值取決於各種因素，包括所採用具體化合物之活性、受試者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、排泄速率、藥物組合及所治療特定病症之嚴重程度以及投與形式。通常可逐步增加治療劑量以最佳化安全性及效能。在一態樣中，有效量係治療有效量。通常，來自活體外及/或活體內測試之劑量-效應關係首先可用於指導用於患者投與之適當劑量。一般而言，化合物之期望投與量可有效達成與所發現活體外有效濃度相稱之血清含量。該等參數之測定在業內已眾所周知。該等考慮以及有效調配物及投與程序在業內已眾所周知且闡述於標準教科書中。與此定義一致，如本文中所使用，術語「治療有效量」係足以離體、在活體外或在活體內抑制RNA病毒複製之量。
術語投與應包括(但不限於)經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)來投與或局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)，且可單獨或一起調配成含有適用於每一投與途徑之醫藥上可接受之習用無毒載劑、佐劑、賦形劑及媒劑之適宜劑量單元調配物。本發明並不受限於投與途徑、調配物或投藥時間表。
如本文中所使用，術語「AAV」係腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒係單鏈DNA細小病毒，其僅生長於由共感染性輔助病毒提供某些功能之細胞中。當前已表徵13種AAV血清型。AAV之一般資訊及綜述可參見(例如) Carter,Handbook of Parvoviruses 1:169-228, 1989及Berns,Virology 1743-1764, 1999。然而，完全可預計，該等相同原理亦適用於其他AAV血清型，此乃因眾所周知，各種血清型在結構及功能上皆極為密切相關，即使在基因層面下。(例如參見Blacklowe,Parvoviruses and Human Disease 165-174, 1988, J. R. Pattison編輯；及Rose,Comprehensive Virology 3:1-61, 1974)。舉例而言，所有AAV血清型皆明顯展現藉由同源rep基因調介之極類似之複製性質；且皆具有三種相關衣殼蛋白(例如表現於AAV2中者)。藉由以下各物來進一步證實相關程度：異源雙鏈體分析，其揭示各血清型之間沿基因體長度發生廣泛交叉雜交；及在末端存在對應於「反向末端重複序列」 (ITR)之類似自複性區段。類似感染性模式亦表明，每一血清型中之複製功能處於類似調控控制下。
本文所用之「AAV表現盒」係指包含一或多個側接有AAV末端重複序列(ITR)之所關注聚核苷酸(或轉基因)之核苷酸序列。在存在於經編碼且表現rep及cap基因產物之載體轉染之宿主細胞中時，該AAV表現盒可複製且包裝成感染性病毒顆粒(例如AAV載體)中。
「AAV病毒體」或「AAV載體」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」係指由至少一種AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV表現盒構成之病毒顆粒。若該顆粒包含異源性聚核苷酸(亦即除野生型AAV基因體外之聚核苷酸，例如擬遞送至哺乳動物細胞中之轉基因)，則其通常稱為「AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒之產生需要包括AAV表現盒之產生，此乃因此一質體含於AAV載體顆粒內。
腺相關病毒(AAV)係複製缺陷型細小病毒，其單鏈DNA基因體約長4.7 kb且包括145核苷酸反向末端重複序列(ITR)。存在多個AAV血清型。AAV血清型之基因體之核苷酸序列係已知的。舉例而言，AAV血清型2 (AAV2)基因體之核苷酸序列呈現於Srivastava等人，J Virol, 45 : 555-564 (1983)中，且校正於Ruffing等人，J Gen Virol, 75 : 3385-3392 (1994)中。作為其他實例，AAV-1之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_002077中；AAV-3之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_1829中；AAV-4之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_001829中；AAV-5基因體提供於基因庫登錄號AF085716中；AAV-6之完整基因體提供於基因庫登錄號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因體之至少一部分分別提供於基因庫登錄號AX753246及AX753249中(關於AAV-8，亦參見美國專利第7,282,199號及第7,790,449號)；AAV-9基因體提供於Gao等人，J. Virol., 78 : 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因體提供於Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)中；且AAV-11基因體提供於Virology, 330(2): 375-383 (2004)中。AAVrh.74血清型之選殖闡述於Rodino-Klapac.等人，Journal of translational medicine 5 , 45 (2007)中。引導病毒DNA複製(rep)、衣殼化/包裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列含於ITR內。三個AAV啟動子(根據其相對圖位置命名為p5、p19及p40)驅動表現兩個編碼rep及cap基因之AAV內部開放閱讀框。聯合單一AAV內含子之差異性剪接(例如在AAV2核苷酸2107及2227處)，兩個rep啟動子(p5及p19)使得自rep基因產生4種rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。Rep蛋白擁有多種最終負責複製病毒基因體之酶促性質。cap基因係自p40啟動子表現且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。選擇式剪接及非一致轉譯起始位點負責三種相關衣殼蛋白之產生。單一共有多聚腺苷酸化位點位於AAV基因體之圖位置95處。AAV之生命週期及基因學綜述於Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology, 158 : 97-129 (1992)中。
本發明之重組AAV基因體包含本發明之核酸分子及一或多個側接於核酸分子之AAV ITR。rAAV基因體中之AAV DNA可來自可衍生重組病毒之任何AAV血清型，包括(但不限於) AAV血清型AAVrh.74、AAVrh.10、AAVrh.20、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假型rAAV之產生揭示於(例如) WO 01/83692中。亦考慮其他類型之rAAV變體，例如具有衣殼突變之rAAV。例如參見Marsic等人，Molecular Therapy , 22(11): 1900-1909 (2014)。如上文之背景章節中所述，各種AAV血清型之基因體之核苷酸序列已為業內所已知。在一些實施例中，為促進骨骼肌特異性表現，使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。
除非上下文明確指示其他含義，否則說明書及申請專利範圍中所用之單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，術語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
如本文中所使用，術語「包含(comprising或comprises)」意指組合物及方法包括所列舉要素，但不排除其他要素。在使用「基本上由……組成」來定義組合物及方法時，其應意指出於所陳述目的排除對組合有任何本質意義之其他要素。因此，基本上由如本文所定義要素組成之組合物將不自分離及純化方法以及醫藥上可接受之載劑(例如磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑及諸如此類)排除痕量污染物。「由……組成」應意指排除其他成分及用於投與本發明組合物之實質性方法步驟或用以產生組合物或達成預期結果之製程步驟之超過痕量的要素。由該等過渡術語中之每一者所定義之實施例皆在本發明範圍內。
本文關於核酸(例如DNA或RNA)所用之術語「經分離」係指分離分別存在於天然大分子來源中之分子與其他DNA或RNA。術語「經分離核酸」意欲包括並非天然作為片段之核酸片段。術語「經分離」在本文中亦用於係指與其他細胞蛋白分離之多肽、蛋白質及/或宿主細胞且意欲涵蓋經純化多肽及重組多肽。在其他實施例中，術語「經分離」意指與在自然界中通常與細胞、組織、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段相關聯之組分、細胞及其他組分分離。舉例而言，經分離細胞係與具有不同表型或基因型之組織或細胞分離之細胞。如熟習此項技術者所明瞭，未必「分離」非天然聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段以區分其與其天然對應體。
本文關於多肽或聚核苷酸(例如DNA或RNA)所用之術語「重組」係指藉由實驗室重組方法(例如分子選殖)所形成之分子。分子選殖技術為業內所已知且可包括(但不限於)聚核苷酸PCR擴增、聚核苷酸酶促消解、將聚核苷酸連接至表現盒(例如哺乳動物表現盒)、使用聚核苷酸轉變、轉染或轉導細胞及表現聚核苷酸以產生多肽。例如參見 Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2012。術語「重組聚核苷酸」意欲包括編碼蛋白質之聚核苷酸之片段。舉例而言，重組聚核苷酸可包括編碼人類質膜修復蛋白之聚核苷酸之片段。可藉由PCR擴增編碼蛋白質之聚核苷酸之片段來產生重組聚核苷酸。可藉由表現一或多種重組聚核苷酸來產生重組多肽。
本文揭示編碼人類質膜修復蛋白(hDSYSF)之片段之聚核苷酸。本文進一步揭示包含編碼人類質膜修復蛋白(hDSYSF)之片段之聚核苷酸之質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物。本文亦揭示製備及使用該等聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物之方法。
本文揭示編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之重組聚核苷酸，其中重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列係由以下各物組成：(a) SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(c) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(d)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(e)編碼hDYSF蛋白之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(f)與(e)之核苷酸序列在(e)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。
本文進一步揭示編碼人類質膜修復蛋白之片段之重組聚核苷酸序列，其中重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列係由以下各物組成：(a) SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列；(b)與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(c) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(d)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；(e)編碼hDYSF蛋白之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(f)與(e)之聚核苷酸序列在(e)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中聚核苷酸係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸由第一及第二ITR側接。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)表現盒。在一些實施例中，AAV表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之5’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。
在一些實施例中，AAV表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之3’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，AAV載體包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之5’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。
在一些實施例中，AAV載體包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之3’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。
本文進一步揭示雙腺相關病毒(AAV)載體系統。在一些實施例中，雙AAV載體系統包含：(a)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(b)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸。
本文進一步揭示雙腺相關病毒(AAV)載體系統。在一些實施例中，雙AAV載體系統包含以下各物、由其組成或基本上由其組成：(a)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成；及(b)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸。
在一些實施例中，AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸。
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體(例如病毒或病毒顆粒)、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含一或多個包含反向末端重複序列(ITR)、啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含一或多個包含反向末端重複序列(ITR)、選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號之其他核苷酸序列。
本文進一步揭示治療質膜修復蛋白病之方法。在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物中之任一者。
本文進一步揭示本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物中之任一者之用途，其用以製造用於治療質膜修復蛋白病之藥劑。
同源重組及hDYSF片段
AAV調介之基因療法呈現用於多種疾病之期望治療策略；然而，其受阻於AAV病毒體之限制性4.7 kb包裝限制。尤其關注當前並無治癒或有效療法之疾病，例如質膜修復蛋白病。本文揭示藉由同源重組兩個部分基因體來製備或產生全長質膜修復蛋白基因之方法。在一實例中，兩個部分包裝之基因體在圖1中展示為pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG及pAAV.DYSF3’.POLYA。在將兩個基因體(不論經由病毒遞送(藉由包裝至AAV載體中)或非病毒方法(例如LNP))遞送至細胞(例如肌細胞)中後，其生成包含全長質膜修復蛋白編碼區之轉錄物，從而表現功能性質膜修復蛋白。兩個聚核苷酸之間之重疊區域可促進同源重組以產生含有全長質膜修復蛋白基因之轉錄物。藉由將全長質膜修復蛋白基因分離成兩個部分包裝之基因體，此方法成功地繞過AAV包裝限制且產生功能性、全長質膜修復蛋白基因。在一實施例中，轉錄物係包含與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列之表現盒。在一實施例中，轉錄物係包含SEQ ID NO: 20之序列之表現盒。
在一些實施例中，本文揭示編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸，其中重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些情況下，重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列。在一些情況下，本文揭示製備重組多肽之方法。在一些情形下，該方法包含使細胞與編碼hDYSF蛋白之5’片段之重組聚核苷酸及編碼hDYSF蛋白之3’片段之第二重組聚核苷酸接觸。在一些情形下，該方法包含使細胞與本文所闡述之雙AAV載體系統接觸。在一些情形下，細胞係真核細胞、視情況肌細胞、心臟細胞及/或肝細胞。在一些情形下，該方法包含向受試者投與編碼hDYSF蛋白之5’片段之重組聚核苷酸及編碼hDYSF蛋白之3’片段之第二重組聚核苷酸。在一些情形下，該方法包含向受試者投與本文所闡述之雙AAV載體系統。在一些情形下，該方法包含藉由表現包含SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列之重組聚核苷酸來治療受試者的肌肉營養不良症。在一些情形下，受試者患有質膜修復蛋白病、視情況LGMD2B或三好氏肌肉病變。
本文亦揭示兩種可藉由如上文所闡述之同源重組產生全長質膜修復蛋白基因之重組聚核苷酸，其各自編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段。在一些實施例中，重組聚核苷酸編碼hDYSF蛋白之5’片段。在一些實施例中，編碼hDYSF蛋白之5’片段之重組聚核苷酸稱為5’ hDYSF聚核苷酸。在一些實施例中，重組聚核苷酸編碼hDYSF蛋白之3’片段。在一些實施例中，編碼hDYSF蛋白之3’片段之重組聚核苷酸稱為3’ hDSYF聚核苷酸。
5’ hDYSF聚核苷酸
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的全長上至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的全長上至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的全長上至少85%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的全長上至少90%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的全長上至少95%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDYSF聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域的3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDYSF聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含15個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含10個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含5個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含1個核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸100-4000、100-3900、100-3800、100-3750、100-3716、150-4000、150-3900、150-3800、150-3750、150-3716、200-4000、200-3900、200-3800、200-3750、200-3716、250-4000、250-3900、250-3800、250-3750、250-3716、300-4000、300-3900、300-3800、300-3750、300-3716、350-4000、350-3900、350-3800、350-3750、350-3716、370-4000、370-3900、370-3800、370-3750、370-3716、377-4000、377-3900、377-3800、377-3750或377-3716之間之區域中包含至少1個核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸377-3716之間之區域中包含至少1個核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸包含含有SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸包含含有SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列在該區域之全長上至少85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列在該區域之全長上至少90%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列在該區域之全長上至少95%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列在該區域之全長上至少99%一致的核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸相對於包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列包含10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸相對於包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列包含5個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸相對於包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列包含2個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸相對於包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域之核苷酸序列包含1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸包含含有SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500的區域，其中5’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在包含SEQ ID NO: 11之核苷酸位置3400-3716、3400-3700、3400-3650、3400-3600、3400-3550、3400-3500、3390-3716、3390-3700、3390-3650、3390-3600、3390-3550、3390-3500、3380-3716、3380-3700、3380-3650、3380-3500、3371-3716、3371-3700、3371-3650、3371-3600、3371-3550或3371-3500之區域的全長上至少90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3330-3365、3330-3360、3330-3355、3335-3365、3335-3350、3340-3365、3340-3360或3340-3355個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置1-100、1-200、1-300、1-350、1-375、1-376、100-200、100-300、100-350、100-375、100-376、200-300、200-350、200-375或200-376組成之區域。在一些實施例中，5’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置1-376組成之區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3360、3359、3358、3357、3356、3355、3354、3353、3352、3351、3350、3349、3348、3347、3346、3345、3344、3343、3342、3341或3340個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置1-100、1-200、1-300、1-350、1-375、100-200、100-300、100-350、100-375、200-300、200-350、200-375組成之區域。在一些實施例中，5’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置1-376組成之區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 1之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1之全長上至少90%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1之全長上至少92%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1之全長上至少95%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 13之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13之全長上至少90%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13之全長上至少92%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13之全長上至少95%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含編碼包含野生型hDSYF蛋白之N-末端區域之hDYSF蛋白片段之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，包含野生型hDSYF蛋白之N-末端區域之hDYSF蛋白片段稱為N-末端hDYSF蛋白。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基1-1113、200-1113、400-1113、500-1113、600-1113、650-113、650-1100、700-1100、700-1113、700-1050、700-1000、800-1113、800-1100、800-1050、900-1113、900-1100、1000-1113或1000-1100、由其組成或基本上由其組成之區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基1-1113、200-1113、400-1113、500-1113、600-1113、650-113、650-1100、700-1100、700-1113、700-1050、700-1000、800-1113、800-1100、800-1050、900-1113、900-1100、1000-1113或1000-1100、由其組成或基本上由其組成之區域。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含含有胺基酸殘基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100、由其組成或基本上由其組成之區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白之長度為至少1000個胺基酸，且其中N-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100的區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白之長度為至少1000個胺基酸，且其中N-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12胺基酸殘基999-1113、999-1100、1000-1113或1000-1100之的區域。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少90%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少92%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少95%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼N-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少97%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中N-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列在SEQ ID NO: 9之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列在SEQ ID NO: 9之全長上至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列在SEQ ID NO: 9之全長上至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列在SEQ ID NO: 9之全長上至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，N-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列在SEQ ID NO: 9之全長上至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 6之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 6之全長上至少85%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 6之全長上至少90%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 15之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 15之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 15之全長上至少85%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 15之全長上至少90%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
3’ hDYSF聚核苷酸
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的4100、4000、3900、3880個或3870個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中3’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的全長上至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的4100、4000、3900、3880或3870個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中3’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的全長上至少80%、82%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的全長上至少85%一致。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的全長上至少90%一致。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸與SEQ ID NO: 11之核苷酸序列在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的全長上至少95%一致。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中3’ hDYSF聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域的4100、4000、3900、3880或3870個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中3’ hDYSF聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含15個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含10個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含5個或更少核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含1個核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2600-6850、2600-6800、2600-6780、2600-6750、2600-6725、2600-6700、2700-6850、2700-6800、2700-6780、2700-6750、2700-6725、2700-6700、2700-6680、2700-6650、2700-6625、2700-6620、2700-6619、2750-6850、2750-6800、2750-6780、2750-6750、2750-6725、2750-6700、2750-6680、2750-6650、2750-6625、2750-6620、2750-6619、2754-6850、2754-6800、2754-6780、2754-6750、2754-6725、2754-6700、2754-6680、2754-6650、2754-6625、2754-6620或2754-6619之間之區域中包含至少1個核苷酸失配。在一些實施例中，5’聚核苷酸在SEQ ID NO: 11之核苷酸2754-6619之間之區域中包含至少1個核苷酸失配。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之3500-4100、3500-4000、3500-3900、3500-3880、3500-3870、3600-4100、3600-4000、3600-3900、3600-3880、3600-3870、3700-4100、3700-4000、3700-3900、3700-3880、3700-3870、3800-4100、3800-4000或3800-3900個連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中5’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置6620-6914、6620-6900、6620-6800、6620-6700、6700-6914、6700-6800、6800-6914或6800-6900組成之區域。在一些實施例中，3’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置6620-6914組成之區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之4100、4000、3900、3880或3870個或更少連續核苷酸、由其組成或基本上由其組成，其中3’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置6620-6914、6620-6900、6620-6800、6620-6700、6700-6914、6700-6800、6800-6914或6800-6900組成之區域。在一些實施例中，3’ hDSYF聚核苷酸不包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸位置6620-6914組成之區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 2之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2之全長上至少90%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2之全長上至少92%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2之全長上至少95%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 14之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 14之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 14之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14之全長上至少90%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 14之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14之全長上至少92%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 14之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14之全長上至少95%一致之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含編碼包含野生型hDSYF蛋白之C-末端區域之hDYSF蛋白片段之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，包含野生型hDSYF蛋白之C-末端區域之hDYSF蛋白片段稱為C-末端hDYSF蛋白。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900、由其組成或基本上由其組成之區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900、由其組成或基本上由其組成之區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含1400、1350、1325、1300、1290或1287個或更少胺基酸之長度、由其組成或基本上由其組成，且其中C-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900的區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白之長度為1400、1350、1325、1300、1290或1287個或更少胺基酸，且其中C-末端hDYSF蛋白包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基750-2080、750-2000、750-1900、775-2080、775-2000、775-1900、794-2080、794-2000或794-1900的區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含1400、1350、1325、1300、1290或1287個或更少胺基酸之長度、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白不包含含有SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基678-793、678-750、678-725或678-700的區域。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少90%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少92%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少95%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列在編碼C-末端hDYSF蛋白之核苷酸序列之全長上至少97%一致的核苷酸序列、由其組成或基本上由其組成，其中C-末端hDYSF蛋白包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，C-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列在SEQ ID NO: 10之全長上至少80%、82%、85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，C-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列在SEQ ID NO: 10之全長上至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，C-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列在SEQ ID NO: 10之全長上至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，C-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列在SEQ ID NO: 10之全長上至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，C-末端hDYSF蛋白包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列在SEQ ID NO: 10之全長上至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 8之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 8之全長上至少85%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 8之全長上至少90%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 16之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 16之全長上至少85%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 16之全長上至少90%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
在一些實施例中，5’ hDSYF聚核苷酸及3’ hDYSF聚核苷酸之序列包含至少500、600、700、800、900、950、960或963個核苷酸之重疊。在一些實施例中，N-末端hDSYF蛋白及C-末端hDSYF蛋白之序列包含至少50、100、150、200、250、300或320個胺基酸之重疊。
反向末端重複
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含含有一或多個反向末端重複(ITRS)、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含兩個、三個、四個、五個或六個或更多個包含兩個、三個、四個、五個或六個或更多個ITR、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，兩個或更多個ITR相同。在一些實施例中，兩個或更多個ITR不同。
在一些實施例中，重組聚核苷酸側接有兩個或更多個ITR。在一些實施例中，5’ hDYSF聚核苷酸側接有第一對ITR。在一些實施例中，3’ hDYSF聚核苷酸側接有第二對ITR。在一些實施例中，第一對ITR中之ITR相同。在一些實施例中，第一對ITR中之ITR不同。在一些實施例中，第二對ITR中之ITR相同。在一些實施例中，第二對ITR中之ITR不同。在一些實施例中，第一對ITR中之ITR與第二對ITR中之ITR相同。在一些實施例中，第一對ITR中之至少一個ITR與第二對ITR中之至少一個ITR相同。在一些實施例中，第一對ITR中之ITR與第二對ITR中之ITR不同。在一些實施例中，第一對ITR中之至少一個ITR與第二對ITR中之至少一個ITR不同。
在一些實施例中，ITR係病毒ITR。在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR係選自來自AAV血清型AAVrh.20、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、 AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAVrh.10、AAV-11、AAV-12及AAV-13中之至少一者之ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV2 ITR。在一些實施例中，AAV ITR係AAV5 ITR。AAV1-6之ITR序列可參見(例如) Grimm等人，J. Virol.80(1):426-39, 2006，該文獻之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，重組聚核苷酸不包含除反向末端重複序列(ITR)外之AAV序列。
在一些實施例中， 重組聚核苷酸不包含除反向末端重複序列(ITR)外之病毒序列。
在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列在SEQ ID NO: 3之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列在SEQ ID NO: 3之全長上至少90%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含與SEQ ID NO: 3之核苷酸序列在SEQ ID NO: 3之全長上至少95%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含相對於SEQ ID NO: 3之核苷酸序列包含10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個或更少核苷酸失配之核苷酸序列。在一些實施例中，ITR包含相對於SEQ ID NO: 3之核苷酸序列包含5個或更少核苷酸失配之核苷酸序列。
啟動子
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含含有一或多個啟動子、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子係真核啟動子。真核啟動子之實例包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)啟動子、延長因子1 α (EF1a)啟動子、CAG啟動子、磷酸甘油酸激酶基因(PGK)啟動子、四環素(tetracycline)反應元件(TRE)啟動子、人類U6核(U6)啟動子及UAS啟動子。在一些實施例中，啟動子係哺乳動物啟動子。在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係誘導型啟動子。
在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。組織之實例包括(但不限於)肌肉、上皮、結締及神經組織。組織特異性啟動子之實例包括(但不限於) B29啟動子、CD14啟動子、CD43啟動子、CD45啟動子、CD68啟動子、結蛋白啟動子、彈性蛋白酶-1啟動子、內皮醣蛋白啟動子、纖連蛋白啟動子、Flt-1啟動子、GFAP啟動子、ICAM-2啟動子、INF-β啟動子、Mb啟動子、NphsI啟動子、OG-2啟動子、SP-B啟動子、SYN1啟動子、WASP啟動子、SV40/bAlb啟動子、SV40/hAlb啟動子、SV40/CD43啟動子、SV40/CD45啟動子及NSE/RU5’啟動子。
在一些實施例中，啟動子係肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子係肌球蛋白重鏈複合物-E盒肌肉肌酸激酶融合增強子/啟動子。
在一些實施例中，啟動子係重組啟動子。在一些實施例中，重組啟動子係重組肌肉特異性啟動子。在一些實施例中，重組肌肉特異性啟動子係重組肌球蛋白重鏈‐肌酸激酶肌肉特異性啟動子。在另一實施例中，肌肉特異性啟動子包含人類骨骼肌動蛋白基因元件、心臟肌動蛋白基因元件、結蛋白啟動子、骨骼α肌動蛋白(ASKA)啟動子、肌鈣蛋白I (TNNI2)啟動子、肌細胞特異性增強子結合因子mef結合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、截短MCK (tMCK)啟動子、肌球蛋白重鏈(MHC)啟動子、雜合a肌球蛋白重鏈增強子-/MCK增強子-啟動子(MHCK7)啟動子、C5-12啟動子、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白i基因元件、低氧可誘導核因子。
在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 4之核苷酸序列在SEQ ID NO: 4之全長上至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。
內含子
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含含有一或多個內含子、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，內含子係真核內含子。在一些實施例中，內含子係哺乳動物內含子。在一些實施例中，內含子係合成內含子。在一些實施例中，內含子係嵌合內含子。在一些實施例中，內含子係來自非編碼性外顯子。在一些實施例中，內含子位於5’ hDYSF聚核苷酸之上游或5’端。
在一些實施例中，內含子包含5’供體位點、分支點或3’剪接位點中之至少一者。在一些實施例中，內含子包含5’供體位點、分支點或3’剪接位點中之兩者或更多者。在一些實施例中，內含子包含5’供體位點、分支點及3’剪接位點。
在一些實施例中，內含子包含人類β 球蛋白基因之5’供體位點。
在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之分支點。
在一些實施例中，內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之3’剪接受體位點。
在一些實施例中，內含子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在一些實施例中，內含子包含與SEQ ID NO: 5之核苷酸序列在SEQ ID NO: 5之全長上至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。
選擇標記物
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含含有一或多種選擇標記物、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，選擇標記物係細菌可選標記物。在一些實施例中，選擇標記物係抗生素抗性基因。抗生素抗性基因之實例包括(但不限於) β-內醯胺酶、卡那黴素抗性基因、來自Tn5之neo基因、來自大腸桿菌基因體之突變FabI基因及URA3 (來自酵母之血苷-5’磷酸去羧酶)。在一些實施例中，抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因。在一些實施例中，抗生素抗性基因係卡那黴素抗性基因。
多聚腺苷酸化信號
在一些實施例中，聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統、病毒包裝系統、細胞及組合物進一步包含含有一或多種多聚腺苷酸化(聚A)信號、由其組成或基本上由其組成之核苷酸序列。在一些實施例中，聚A信號係人工聚A信號。
在一些實施例中，聚A信號包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。在一些實施例中，聚A信號包含與SEQ ID NO: 7之核苷酸序列在SEQ ID NO: 7之全長上至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。
表現盒及包裝系統
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)表現盒。在一些實施例中，AAV表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之5’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸之AAV表現盒稱為5’ hDYSF AAV表現盒。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)質體。在一些實施例中，AAV表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)，其中第一ITR包含本文所揭示之任一ITR；(b)本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸；及(c)第二ITR，其中第二ITR包含本文所揭示之任一ITR，其中(b)之3’ hYDSYF聚核苷酸由(a)及(c)之第一及第二ITR側接。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸之AAV表現盒稱為3’ hDYSF AAV表現盒。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸序列，其中聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i)SEQ ID NO: 1之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(iii)SEQ ID NO: 13之核苷酸序列；(iv)與SEQ ID NO: 13之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸序列由第一及第二ITR側接。在一些實施例中，本文所揭示之任一AAV表現盒進一步包含一或多個包含啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)之其他聚核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含與SEQ ID NO: 6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 6之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含SEQ ID NO: 15之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含與SEQ ID NO: 15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 15之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒並不進一步包含編碼hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒不包含除反向末端重複序列(ITR)外之AAV序列。在一些實施例中，AAV表現盒不包含除反向末端重複序列(ITR)外之病毒序列。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)表現盒包含：(a)第一反向末端重複序列(ITR)；(b)編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中聚核苷酸序列係由以下各物組成：(i) SEQ ID NO: 2之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO: 14之核苷酸序列；(ii)與SEQ ID NO: 14之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列；(v)編碼hDYSF蛋白之聚核苷酸序列，其中hDYSF蛋白係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或(vi)與(v)之聚核苷酸序列在(v)之核苷酸序列之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列；及(c)第二ITR，其中聚核苷酸序列由第一及第二ITR側接。在一些實施例中，AAV表現盒包含SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含與SEQ ID NO: 8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 8之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV表現盒包含與SEQ ID NO: 16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 16之全長上至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸列。在一些實施例中，AAV表現盒進一步包含一或多個包含選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號之聚核苷酸序列。
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)包裝系統。在一些實施例中，AAV包裝系統包含：(a)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒；(b)腺病毒輔助質體；及(c) rep-cap質體。在一些實施例中，腺病毒輔助質體包含一或多種來自腺病毒之基因。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因調介AAV複製。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因係選自E4、E2a及VA。在一些實施例中，rep-cap質體包含一或多種編碼腺相關病毒rep及cap基因之聚核苷酸。在一些實施例中，rep基因編碼一或多種選自Rep78、Rep68、Rep62及Rep40之生命週期蛋白。在一些實施例中，cap基因編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之衣殼蛋白。在一些實施例中，5’ hDYSF AAV表現盒包含一或多個ITR。在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型相同。在一些實施例中，AAV ITR之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型不同。在一些實施例中，AAV rep基因之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型相同。在一些實施例中，AAV rep基因之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型不同。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒之AAV包裝系統稱為5’ hDYSF AAV包裝系統。
在一些實施例中，AAV包裝系統包含：(a)本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒；(b)腺病毒輔助質體；及(c) rep-cap質體。在一些實施例中，腺病毒輔助質體包含一或多種來自腺病毒之基因。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因調介AAV複製。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因係選自E4、E2a及VA。在一些實施例中，rep-cap質體包含一或多種編碼腺相關病毒rep及cap基因之聚核苷酸。在一些實施例中，rep基因編碼一或多種選自Rep78、Rep68、Rep62及Rep40之生命週期蛋白。在一些實施例中，cap基因編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之衣殼蛋白。在一些實施例中，3’ hDYSF AAV表現盒包含一或多個ITR。在一些實施例中，ITR係AAV ITR。在一些實施例中，AAV ITR之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型相同。在一些實施例中，AAV ITR之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型不同。在一些實施例中，AAV rep基因之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型相同。在一些實施例中，AAV rep基因之血清型與AAV衣殼蛋白之血清型不同。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒之AAV包裝系統稱為3’ hDYSF AAV包裝系統。
在一些實施例中，腺相關病毒包裝系統包含：(a)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒；及(b)腺病毒輔助質體。在一些實施例中，腺病毒輔助質體包含一或多種來自腺病毒之基因。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因調介AAV複製。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因係選自E4、E2a及VA。
在一些實施例中，腺相關病毒包裝系統包含：(a)本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒；及(b)腺病毒輔助質體。在一些實施例中，腺病毒輔助質體包含一或多種來自腺病毒之基因。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因調介AAV複製。在一些實施例中，一或多種來自腺病毒之基因係選自E4、E2a及VA。
病毒載體
本文進一步揭示腺相關病毒(AAV)載體(例如AAV病毒或AAV顆粒)。在一些實施例中，AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸之AAV載體稱為5’ hDYSF AAV載體。
在一些實施例中，5’ hDYSF AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒。
在一些實施例中，AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸之AAV載體稱為3’ hDYSF AAV載體。
在一些實施例中，3’ hDYSF AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒。
在一些實施例中，AAV載體係血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、rh.10、rh.20或rh.74之AAV。在一些實施例中，AAV載體係血清型rh.74之AAV。在一些實施例中，AAV載體並非血清型5之AAV。
本文進一步揭示包含兩個或更多個本文所揭示之AAV載體之雙腺相關病毒(AAV)載體系統。在一些實施例中，雙AAV載體系統包含：(a)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(b)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸。
在一些實施例中，雙AAV載體系統包含以下各物、由其組成或基本上由其組成：(a)第一AAV載體，其中第一AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成；及(b)第二AAV載體，其中第二AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成。
組合物
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成之組合物。本文進一步揭示包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成之組合物。本文進一步揭示包含本文所揭示之任一5’ hDYSF質體、由其組成或基本上由其組成之組合物。本文進一步揭示包含本文所揭示之任一3’ hDYSF質體、由其組成或基本上由其組成之組合物。本文進一步揭示包含本文所揭示之任一雙AAV載體系統、由其組成或基本上由其組成之組合物。本文進一步揭示包含本文所揭示之任一AAV載體、由其組成或基本上由其組成之組合物。
本文進一步揭示包含以下各物、由其組成或基本上由其組成之組合物：(a)重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中rAAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成；及(b)醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。
本文進一步揭示包含以下各物、由其組成或基本上由其組成之組合物：(a)重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中rAAV包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成；及(b)醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。
本文進一步揭示包含以下各物、由其組成或基本上由其組成之組合物：(a)第一重組腺相關病毒(rAAV)，其中第一rAAV包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成；及(b)第二重組腺相關病毒(rAAV)，其中第二rAAV包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸、由其組成或基本上由其組成。
本文進一步揭示包含以下各物、由其組成或基本上由其組成之組合物：(a)第一腺相關病毒(AAV)顆粒，其中第一AAV顆粒包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成；及(b)第二腺相關病毒(AAV)顆粒，其中第二AAV顆粒包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體、由其組成或基本上由其組成。
在一些實施例中，本文所揭示之任一組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑中之至少一者。可接受之載劑、稀釋劑及佐劑對接受者無毒並較佳地在所採用之劑量及濃度下係惰性的，且包括緩衝劑及表面活性劑(例如普羅尼克類(pluronics))。可接受載劑之實例包括(但不限於)磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑及諸如此類。
醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑可適用於可注射應用。適用於可注射應用之醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之實例包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情形下，該形式必須無菌且其流動程度必須使其具有易注射性。其在製造及儲存條件下必須穩定，且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及植物油。可(例如)藉由使用塗層(例如卵磷脂)、藉由維持所需粒徑(在分散液情形下)及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑或抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來防止微生物作用。在許多情形下，較佳地應包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可藉由使用延緩吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來延長可注射組合物之吸收。
藉由以下方式來製備無菌可注射溶液：將所需量之本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體或雙載體系統與上文所列舉之各種其他成分(視需要)一起納入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。通常，藉由將經滅菌活性成分納入含有基本分散介質及來自上文所列舉之彼等之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉末來製備無菌可注射溶液之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，此自預先經無菌過濾之溶液產生具有活性成分加上任何其他期望成分之粉末。
產生AAV載體之方法
本文揭示產生腺相關病毒(AAV)載體(例如病毒或病毒顆粒)之方法。產生AAV載體之方法為業內所已知。舉例而言，該等方法揭示於(例如) WO 01/83692中，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。AAV產生之一般原理綜述於(例如)以下文獻中：Carter,Current Opinions in Biotechnology 1533-1539, 1992；及Muzyczka,Curr. Topics in Microbial. and Immunol . 158:97-129, 1992，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。產生AAV之各種方式闡述於以下文獻中：Ratschin等人，Mol. Cell. Biol . 4:2072, 1984；Hermonat等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6466, 1984；Tratschin等人，Mo1. Cell. Biol . 5:3251, 1985；McLaughlin等人，J. Virol ., 62:1963, 1988；及Lebkowski等人，Mol. Cell. Biol., 7:349, 1988；Samulski等人，J. Virol., 63:3822-3828, 1989；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相應美國專利第5,658.776號；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441 (PCT/US96/14423)；WO 97/08298 (PCT/US96/13872)；WO 97/21825 (PCT/US96/20777)；WO 97/06243 (PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人，Vaccine 13:1244-1250, 1995；Paul等人，Human Gene Therapy 4:609-615, 1993；Clark等人，Gene Therapy 3:1124-1132, 1996；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號，其中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，產生腺相關病毒(AAV)載體之方法包含使用本文所揭示之任一AAV包裝系統轉導細胞。在一些實施例中，細胞係真核細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞係穩定表現腺相關病毒rep及cap基因之重組細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含培養細胞以產生經轉導細胞之群體。在一些實施例中，該方法進一步包含自經轉導細胞之群體收集上清液。在一些實施例中，該方法進一步包含對上清液實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。替代地或另外，該方法進一步包含溶解經轉導細胞之群體以產生細胞溶解物。在一些實施例中，該方法進一步包含對細胞溶解物實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。在一些實施例中，經純化AAV載體試樣之純度為至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純。
在一些實施例中，產生腺相關病毒(AAV)載體之方法包含使用本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV包裝系統轉導細胞。在一些實施例中，細胞係真核細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞係穩定表現腺相關病毒rep及cap基因之重組細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含培養細胞以產生經轉導細胞之群體。在一些實施例中，該方法進一步包含自經轉導細胞之群體收集上清液。在一些實施例中，該方法進一步包含對上清液實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。替代地或另外，該方法進一步包含溶解經轉導細胞之群體以產生細胞溶解物。在一些實施例中，該方法進一步包含對細胞溶解物實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。在一些實施例中，經純化AAV載體試樣之純度為至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純。
在一些實施例中，產生腺相關病毒(AAV)載體之方法包含使用本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV包裝系統轉導細胞。在一些實施例中，細胞係真核細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞係穩定表現腺相關病毒rep及cap基因之重組細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含培養細胞以產生經轉導細胞之群體。在一些實施例中，該方法進一步包含自經轉導細胞之群體收集上清液。在一些實施例中，該方法進一步包含對上清液實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。替代地或另外，該方法進一步包含溶解經轉導細胞之群體以產生細胞溶解物。在一些實施例中，該方法進一步包含對細胞溶解物實施一或多個純化步驟以產生經純化AAV載體試樣，其中AAV載體試樣實質上不含細胞碎屑及蛋白質。在一些實施例中，經純化AAV載體試樣之純度為至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純。
細胞
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸之細胞。細胞可為原核或真核細胞。真核細胞之非限制性實例包括哺乳動物(例如倉鼠、鼠類、大鼠、犬類、羊類或人類)細胞。在一些實施例中，使用包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸之質體轉染細胞。在一些實施例中，使用本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒轉導細胞。在一些實施例中，使用本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體感染細胞。
本文進一步揭示包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸之細胞。在一些實施例中，使用包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸之質體轉染細胞。在一些實施例中，使用本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒轉導細胞。在一些實施例中，使用本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體感染細胞。
本文所揭示之任一細胞可為產生感染性rAAV之包裝細胞。在一些實施例中，包裝細胞係經穩定轉變之癌細胞，例如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞(同族293細胞系)。在另一實施例中，包裝細胞係並非經轉變癌細胞之細胞，例如低傳代293細胞(經腺病毒E1轉變之人類胎兒腎細胞)、MRC-5細胞(人類胎兒纖維母細胞)、WI-38細胞(人類胎兒纖維母細胞)、Vero細胞(猴腎細胞)及FRhL-2細胞(恒河猴胎兒肺細胞)。原核細胞之非限制性實例包含細菌細胞(例如大腸桿菌)及古細菌細胞。可使用本發明細胞來產生細胞庫，例如用於非GMP目的之登錄細胞庫(ACB)或GMP原始細胞庫(MCB)。在一實施例中，將細胞等分試樣自原始接種物擴增至較大體積，然後在生物反應器中培養以供生產。
治療方法
本文進一步揭示治療質膜修復蛋白病之方法。在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與以下各物、由其組成或基本上由其組成：(a)有效量之第一聚核苷酸，其中第一聚核苷酸包含本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸；及(b)有效量之第二聚核苷酸，其中第二聚核苷酸包含本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸。在一些實施例中，第一聚核苷酸係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第一聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二聚核苷酸係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第二聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二聚核苷酸係同時投與。在一些實施例中，第一及第二聚核苷酸係依序投與。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與以下各物、由其組成或基本上由其組成：(a)有效量之第一腺相關病毒(AAV)載體，其中第一AAV載體包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體；及(b)有效量之第二腺相關病毒(AAV)載體，其中第二AAV載體包含本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體。在一些實施例中，第一AAV載體係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第一AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二AAV載體係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第二AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二AAV載體係同時投與。在一些實施例中，第一及第二AAV載體係依序投與。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與以下各物、由其組成或基本上由其組成：(a)有效量之第一AAV表現盒，其中第一AAV表現盒包含本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒；及(b)有效量之第二AAV表現盒，其中第二AAV表現盒包含本文所揭示之任一3’ hDSYF AAV表現盒。在一些實施例中，第一AAV表現盒係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第一AAV表現盒係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第二AAV表現盒係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，第二AAV表現盒係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，第一及第二AAV表現盒係同時投與。在一些實施例中，第一及第二AAV表現盒係依序投與。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
在一些實施例中，治療質膜修復蛋白病之方法包含向有需要之受試者投與有效量之包含以下各物的組合物、由其組成或基本上由其組成：(a)本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸及本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸；(b)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體及本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體；(c)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒及本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒；或(d)本文所揭示之任一雙AAV載體系統。在一些實施例中，該組合物係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，該組合物係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
本文進一步揭示重組聚核苷酸、質體、病毒載體、載體系統及組合物中之任一者之用途，其用以製造用於治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑。 本文揭示包含以下各物之組合物之用途：(a)本文所揭示之任一5’ hDYSF聚核苷酸及本文所揭示之任一3’ hDYSF聚核苷酸；(b)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV載體及本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV載體；(c)本文所揭示之任一5’ hDYSF AAV表現盒及本文所揭示之任一3’ hDYSF AAV表現盒；或(d) (e)本文所揭示之任一雙AAV載體系統，其用以製造用於治療有需要之受試者之質膜修復蛋白病之藥劑。在一些實施例中，該組合物係經口、非經腸(例如肌內、腹膜腔內、靜脈內、ICV、腦池內注射或輸注、皮下注射或植入)、藉由吸入噴霧、經鼻、經陰道、經直腸、經舌下、經尿道(例如尿道栓劑)或藉由局部投與途徑(例如凝膠、軟膏、乳霜、氣溶膠等)來投與。在一些實施例中，該組合物係經肌內或經靜脈內投與。在一些實施例中，質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
擬在本發明方法中投與之AAV載體之效價端視(例如)特定AAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向細胞類型而有所變化，且可藉由業內標準方法來確定。AAV之效價範圍可為至少約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約1×1013 至約1×1014 或更多個DNase抗性顆粒(DRP)/ml。亦可以病毒基因體(vg)之單位來表示劑量。舉例而言，AAV之劑量範圍可為至少約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約2×1012 、約3×1012 、約4×1012 、約5×1012 、約6×1012 、約7×1012 、約8×1012 、約9×1012 、約1×1013 至約1×1014 個病毒基因體。
可藉由多種方法來測定AAV劑量，包括(但不限於) ELISA、評價逆轉錄酶活性、FACS、轉導分析、北方印漬(northern blotting) (例如半定量北方印漬)、斑點印漬分析或PCR (例如qPCR)。眾所周知，可藉由使用定量實時PCR (qPCR)量測AAV載體基因體來測定AAV劑量。該等qPCR方法克服了習用轉導分析之不一致或任意結果。在PCR劑量測定之一實施例中，使用質體DNA作為校準標準。質體形式可影響qPCR方法之劑量結果。在一實施例中，使用圓形或超螺旋DNA或質體作為定量標準。
在一些實施例中，可以基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體之單位vg/kg來表示劑量。舉例而言，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體，AAV劑量為約1×106 -1×1016 vg/kg、約1×108 -1×1015 vg/kg或約1×1010 -1×1014 vg/kg)。在另一實施例中，劑量為約至少1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約2×1012 、約4×1012 、約6×1012 、約8×1012 、約1×1013 、約2×1013 、約2.4×1013 、約3×1013 、約4×1013 、約5×1013 、約6×1013 、約7×1013 、約8×1013 、約9×1013 、約1×1014 、約1×1015 或至少約1×1016 vg/kg。在一實施例中，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體，劑量為至少2×1012 、4×1012 、6×1012 、8×1012 、1×1013 、2×1013 、2.4×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 或8×1013 vg/kg。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含在每一注射之1.5 ml總體積中投與至少約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約2×1012 、約3×1012 、約4×1012 、約5×1012 、約6×1012 、約7×1012 、約8×1012 、約9×1012 、約1×1013 vg。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含投與至少約1×106 、約1×107 、約1×108 、約1×109 、約1×1010 、約1×1011 、約1×1012 、約2×1012 、約3×1012 、約4×1012 、約5×1012 、約6×1012 、約7×1012 、約8×1012 、約9×1012 、約1×1013 、約2×1013 、約5×1013 、約7×1013 、約1×1014 vg之總日劑量。測定衣殼化載體基因體效價之一種實例性方法使用定量PCR，例如闡述於Pozsgai等人，Mol. Ther. 25(4): 855-869, 2017 (其全部內容以引用方式併入本文中)中之方法。
在一些實施例中，每天向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。在一些實施例中，每週向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在一些實施例中，每月向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31次。在一些實施例中，至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者。在一些實施例中，至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14週向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者。在一些實施例中，向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之時段。在一些實施例中，向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20週之時段。在一些實施例中，向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19或20個月之時段
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含全身性投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者。舉例而言，全身性投與係投與循環系統中，從而影響整個身體。全身性投與包括經腸投與(例如經由胃腸道吸收)及經由注射、輸注或植入之非經腸投與。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含經局部投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含將本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者投與至一或多個組織中。在一些實施例中，組織係選自肌肉、上皮、結締及神經組織。在一些實施例中，組織係肌肉組織。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含將本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者投與至受試者之腳部中。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含將本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者投與至受試者之趾短伸肌(EDB)中。
本發明亦考慮組合療法。本文所用之組合包括同時治療及依序治療。特別考慮本發明方法與標準醫學治療(例如皮質類固醇)之組合以及與新穎療法之組合。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者之前或之後檢測受試者中質膜修復蛋白基因突變的存在或不存在。在一些實施例中，在檢測到在質膜修復蛋白基因中存在突變時，向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者。實例性質膜修復蛋白突變包括(但不限於) c.1392dupA、c.3035G＞A (p.W1012X)、c.2858dupT、c.2779del G、c.5594delG、c.4201dupA、c.1795_1799dupTACT、c.3832C＞T (p.Q1278X)、c.757C＞T (p.R253W)、c.855+1delG、c.3126G＞A (p.W1042X)、c.1663C＞T (p.R555W)、c.610C＞T (p.R204X)、c.3112C＞T (p.R1038X)、c.1368C＞G (p.C456W)、c.5713C＞T (p.R1905X)、c.3826C＞G (p.I1276V)、c.3843 +1G＞A、c.4167+1G＞C、c.2643+1G＞A、c.797T＞C (p.I266P)、c4876delG、c.3477C＞A (p.Y1159X)、c.3137G＞A (p.R1046H)、c.509C＞A (p.A170E)、c.3967C＞T (p.Q1323X)、3191_3196dupGAGGCG、c.3992G＞T (p.R1331L)、c.3516_3517delTT、c.247delG、c.1180+11C＞T、c896G＞A (p.G299E)、c.5078G＞A (p.R1693Q)、c.5979dupA、c.3348+1_3348+4delGTAT、c.5314_5318delAGCCC及c565C＞G (p.L189V)。在一些情況下，質膜修復蛋白基因包含一或多種包括(但不限於)以下各物之突變：c.1392dupA、c.3035G＞A (p.W1012X)、c.2858dupT、c.2779del G、c.5594delG、c.4201dupA、c.1795_1799dupTACT、c.3832C＞T (p.Q1278X)、c.757C＞T (p.R253W)、c.855+1delG、c.3126G＞A (p.W1042X)、c.1663C＞T (p.R555W)、c.610C＞T (p.R204X)、c.3112C＞T (p.R1038X)、c.1368C＞G (p.C456W)、c.5713C＞T (p.R1905X)、c.3826C＞G (p.I1276V)、c.3843 +1G＞A、c.4167+1G＞C、c.2643+1G＞A、c.797T＞C (p.I266P)、c4876delG、c.3477C＞A (p.Y1159X)、c.3137G＞A (p.R1046H)、c.509C＞A (p.A170E)、c.3967C＞T (p.Q1323X)、3191_3196dupGAGGCG、c.3992G＞T (p.R1331L)、c.3516_3517delTT、c.247delG、c.1180+11C＞T、c896G＞A (p.G299E)、c.5078G＞A (p.R1693Q)、c.5979dupA、c.3348+1_3348+4delGTAT、c.5314_5318delAGCCC及c565C＞G (p.L189V)。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者之前或之後檢測受試者中的質膜修復蛋白含量。在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在向受試者投與本文所揭示之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者之後檢測受試者中的質膜修復蛋白含量。在一些實施例中，檢測質膜修復蛋白之含量包含檢測質膜修復蛋白基因之表現。檢測質膜修復蛋白基因之表現可包含量化質膜修復蛋白之DNA或RNA含量。替代地或另外，檢測質膜修復蛋白之含量包含量化質膜修復蛋白之含量。在一些實施例中，在受試者試樣中檢測質膜修復蛋白之含量。在一些實施例中，試樣係體液試樣。體液試樣之實例包括(但不限於)血液、尿、汗液、唾液、糞便及滑液。在一些實施例中，血樣係血漿或血清試樣。在一些情況下，該方法進一步包含(例如)來自Athena Diagnostics之質膜修復蛋白DNA定序測試(CPT: 81408(1))。
在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含修改投與受試者之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物中之任一者的劑量或投藥頻率。在一些實施例中，劑量或投藥頻率之修改係基於質膜修復蛋白含量之檢測。在一些實施例中，在受試者中之膜修復蛋白含量大於受試者在較早時間點時(例如在投與聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物之前，或在投與初始劑量之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物之後但在投與後續劑量之聚核苷酸、質體、病毒載體、雙載體系統或組合物之前)之質膜修復蛋白含量時，減小劑量或投藥頻率。
套組
在又一態樣中，提供一種套組，其包含聚核苷酸、多肽、載體、細胞及系統或組合物中之任一者或多者及使用說明書或替代地基本上由其組成或另外由其組成。在一態樣中，聚核苷酸、多肽、載體、細胞及系統或組合物中之任一者或多者可檢測地經標記或進一步包含純化或可檢測標記物。在一些情況下，該套組包含a)第一聚核苷酸，其中第一聚核苷酸係本文所闡述之重組聚核苷酸；及第二聚核苷酸，其中第二聚核苷酸係本文所闡述之重組聚核苷酸；或b)第一腺相關病毒(AAV)載體，其中第一AAV載體係本文所闡述之AAV載體；及第二腺相關病毒(AAV)載體，其中第二AAV載體係本文所闡述之AAV載體；或c)本文所闡述之AAV雙載體系統；或d)本文所闡述之組合物；或e)本文所闡述之細胞(例如宿主細胞、視情況哺乳動物細胞)；及視情況使用說明書。實例
實例1：雙AAV載體系統之生成
此實例提供產生本文所揭示之雙AAV載體系統之實例性方法。在此實例中，產生雙AAV載體rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV。rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV係血清型為rh74之非複製性、重組AAV (AAVrh74)，其在肌肉特異性MHCK7啟動子之控制下表現來自雙載體(DV)之人類質膜修復蛋白。雙載體含有質膜修復蛋白cDNA序列之5’部分或3’部分，且該等部分重疊約1 kb以有利於重組產生全長人類質膜修復蛋白基因。含有人類質膜修復蛋白cDNA之一部分之表現盒側接有AAV2反向末端重複序列(ITR) (圖1)。
為構築rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV，將人類質膜修復蛋白cDNA分裂成兩個遵循AAV包裝容量之構築體(＜4.7kb)。5’載體(例如5’ hDYSF AAV載體) pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG (PTG=啟動子/轉基因)含有肌肉特異性MHCK7啟動子、嵌合內含子、共有Kozak序列及DYSF cDNA中對應於質膜修復蛋白胺基酸序列之胺基酸1-1113之5’部分。3’載體(例如3’ hDYSF AAV載體) pAAV.DYSF3’.POLYA含有DYSF cDNA中對應於質膜修復蛋白胺基酸序列之胺基酸794-2080之3’部分及具有多聚腺苷酸化信號之DYSF 3’UTR。5’ hDYSF AAV載體及3’ hDYSF AAV載體之表現盒之序列分別揭示為SEQ ID NO: 6及8。
先前研究已驗證了使用MHCK7啟動子之心臟表現(Salva等人，Mol Ther 15 , 320-329 (2007)，其全部內容以引用方式併入本文中)及達成骨骼、橫膈膜及心臟肌肉表現之AAVrh74 (Sondergaard等人，Annals of clinical and Transl Neurology2 , 256-270 (2015)，其全部內容以引用方式併入本文中)。將5’ hDYSF AAV載體及3’ hDSYF AAV載體衣殼化成單獨AAVrh.74病毒體。AAVrh.74血清型之分子純系係選殖自恒河猴淋巴結且論述於Rodino-Klapac等人 ，Journal of Translational medicine 5 , 45 (2007)中，該文獻之全部內容以引用方式併入本文中。
5’ hDYSF AAV載體(AAV載體質體pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG)
使用AAV載體DNA質體pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG產生第一重組單鏈AAV載體。藉由將驅動人類質膜修復蛋白部分cDNA序列(人類cDNA，基因庫登錄號：NM_003494.3)之5’部分之MHCK7表現盒插入載體骨架pAAV-CMV (Clontech)中來構築質體(質體圖可參見圖2且具體序列資訊可參見表1)。存在嵌合內含子且由來自人類β球蛋白基因之第一內含子之5’供體位點與分支點以及3’剪接受體位點(來自前導序列與免疫球蛋白基因重鏈可變區之主體之間之內含子)構成。包括於此載體中之唯一病毒序列係AAV2之反向末端重複，其係病毒DNA複製及rAAV載體基因體包裝所需。兩個ITR之間之序列係衣殼化成AAVrh74病毒體之DNA部分。
表 1. 一種實例性質體 pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG 之分子特徵
類型 起點 終點 名稱 說明
區域 8229 8373 5’ ITR 野生型AAV2反向末端重複
區域 22 813 MHCK7 小鼠肌球蛋白重鏈複合物-E盒肌肉肌酸激酶融合增強子/啟動子
區域 823 970 嵌合內含子 來自人類β球蛋白基因之5′供體位點與分支點以及來自IgG重鏈可變區之3′剪接受體位點
基因 993 4329 hDYSF cDNA 人類質膜修復蛋白cDNA (轉錄物變體8；377-3716) aa1-1113
區域 4440 4584 3’ ITR 野生型AAV2反向末端重複
基因 6370 7230 AmpR β-內醯胺酶基因
區域 7378 8045 ori 質體複製起點
3’ hDYSF AAV載體(AAV載體質體pAAV.DYSF3’.POLY)
使用AAV載體DNA質體pAAV.DYSF3’.POLYA產生第二重組單鏈AAV載體。藉由將人類質膜修復蛋白部分cDNA序列(人類cDNA，基因庫登錄號：NM_003494.3)插入載體骨架pAAV-CMV (Clontech)中來構築質體(質體圖可參見圖3且具體序列資訊可參見表2)。使用內源性質膜修復蛋白3’未轉譯區及聚A信號序列來有效地終止轉錄。包括於此載體中之唯一病毒序列係AAV2之反向末端重複，其係病毒DNA複製及rAAV載體基因體包裝所需。兩個ITR之間之序列係衣殼化成AAVrh74病毒體之DNA部分。
表 2. 一種實例性質體 pAAV.DYSF3’.POLYA 之分子特徵
類型 起點 終點 名稱 說明
區域 1 145 5’ ITR 野生型AAV2反向末端重複
基因 204 3866 hDYSF cDNA 人類質膜修復蛋白cDNA (轉錄物變體8；2754-6619) aa794-2080
區域 4070 4364 hDYSF 3’UTR 人類質膜修復蛋白基因之3’未轉譯區
區域 4378 4427 pA 人工多聚腺苷酸化信號
區域 4481 4625 3’ ITR 野生型AAV2反向末端重複
基因 6411 7271 AmpR β-內醯胺酶基因
區域 7419 8086 ori 質體複製起點
AAV輔助質體(pNLRep2-Caprh74)
自p5E18及pCLR3K構築親代質體pNLrep。(參見 Bansal, D.等人，Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.Nature 423 , 168-172 (2003)，其全部內容以引用方式併入本文中)。p5E18係基於pAAV/Ad。其含有AAV2rep 及cap 基因， 其中自rep 之5’端去除p5啟動子且置於cap 之3’端處，從而在p5與rep 之間存在3 kb間隔序列(具體序列資訊可參見表3)。為生成pCLR3K，藉由PCR擴增人類膠原內含子且然後選殖至pAd/AAV之位置1,052處。為構築pNLrep，使用含有來自pCLR3k之3 kb膠原內含子之BamHI/XbaI片段代替p5E18之BamHI/XbaI片段。使用Swa I/Not I限制位點PCR擴增rh74cap 基因並選殖以代替pNLrep中之AAV2cap 基因，從而產生pNLRep2-Caprh74。藉由DNA質體定序證實AAV rh74衣殼基因之屬性。
表 3. 質體 pNLRep2-Caprh.74 之分子特徵
類型 起點 終點 名稱 說明
基因 84 815 Rep78之5’端 Rep78 ORF之5’端
區域 816 3886 膠原內含子 3 kb人類膠原內含子
基因 3887 5017 Rep78之3’端 Rep78 ORF之3’端
基因 5037 7253 rh74 Cap rh74cap 基因
區域 7428 7507 p5啟動子 AAV2 p5啟動子區
腺病毒輔助質體(pHELP)
質體pHELP係自Applied Viromics (Fremont, CA 94538)獲得且大小為11,635 bp (具體序列資訊可參見表4)。該質體含有腺病毒基因體中對於AAV複製較為重要之區域，亦即E2A 、E4 及VA RNA (腺病毒E1功能係由293細胞提供)。該質體係基於pBluescript骨架且亦含有編碼賦予胺苄青黴素(ampicillin)抗性之TEM-1 ß-內醯胺酶基因之bla 基因(10,182-11,042 bp)、細菌ColE1複製起點(9,315- 10,167 bp)及f1單鏈DNA複製起點(11,172 – 11,627 bp)。存在於此質體中之腺病毒序列僅佔腺病毒基因體之約28% (9,280 / 35,938)，且不含對於複製至關重要之順式元件(例如反向末端重複)。藉由DNA質體定序證實該3種腺病毒基因之屬性。DNA分析揭示了與3個5型腺病毒基因區域(基因庫登錄號：AF369965，其全部內容以引用方式併入本文中)之100%同源性。
表 4. 質體 pHELP 之分子特徵
類型 起點 終點 名稱 說明
區域 1 5336 E2A AAV輔助功能所需之DNA結合蛋白。
區域 5337 8537 E4 AAV輔助功能所需之E4ORF6。
區域 8537 9280 VA RNA 病毒相關RNA係調控病毒轉譯之非編碼性RNA且係AAV輔助功能所需。
基因 11,042 10,182 Ampr 胺苄青黴素抗性基因
實例2：使用雙AAV載體系統製造病毒產物
使用最佳化磷酸鈣共沈澱方法利用3種生產質體((i) AAV載體質體，例如5’ hDYSF AAV載體或3’ hDYSF AAV載體；(ii)腺病毒(Ad)輔助質體；及(iii) AAV輔助質體)轉染HEK 293細胞。轉染細胞包含製備含有AAV載體質體、Ad輔助質體、AAV輔助質體及CaCl2 之DNA/鈣溶液並與等體積之2× HEPES緩衝鹽水混合以獲得最佳沈澱物。然後將沈澱物添加至HEK 293細胞中並培育。然後將沈澱物添加至HEK 293細胞中並培育。在培育後，交換培養基且同時添加核酸酶。
實例3：rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV肌內遞送之效能測定
生成含有MHCK7.DYSF盒之5’及3’部分且具有約1kb之重疊序列之兩種AAV表現盒(參見圖1)。將質體包裝至AAVrh.74載體中。藉由肌內注射至脛骨前肌中使用1×1011 vg每一載體來治療4週齡Dysf-/- 小鼠並在1個月時進行驗屍。在遞送兩種載體後藉由免疫染色(圖4A)及西方印漬(圖4C)可看到穩定之全長質膜修復蛋白表現。單獨遞送任一載體並無異常質膜修復蛋白表現(圖4B：免疫染色，及圖4D：西方印漬)。3222係全長對照。量化表現質膜修復蛋白之肌纖維之數量並展示於表5中。
表 5. 在經肌內遞送 rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 後之質膜修復蛋白表現
測試物品(載體 動物編號 (耳標號) 動物品系 終點(月數) 劑量 表現Dysf之纖維%*
rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 3266 Dysf-/- 1 2×1011 vg 75%
3267 68%
3268 81%
674 63%
675 83%
*每塊肌肉計數4個20×視場(約550‐600根纖維/動物)
開始時程研究以評價在向脛骨前肌經肌內注射後之安全性(表6)。亦評價蛋白質表現及載體生物分佈。在1、3、6、9及12個月終點時，對動物進行全面驗屍並評價肌肉及非靶器官上之質膜修復蛋白表現(圖5A-5C (展示1、3及6個月))、載體生物分佈(表7)及組織病理學。對脛骨肌(TA)進行注射。用於分析每一動物之組織病理學之組織包括：生殖腺、肝、心臟、肺、脾、腎、橫膈膜、左(經治療)及右脛骨前肌。未獲得任何發現。
表 6. rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 長期安全性研究
測試物品(載體 動物編號 (耳標號) 動物品系 終點(月數) 劑量 表現Dysf之纖維%*
rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 832 Dysf-/- 3 2×1011 vg 70%
833 78%
834 79%
835 6 90%
836 91%
815 68%
816 9 70%
817 79%
818 68%
819 12 89%
820 87%
821 89%
*每塊肌肉計數4個20×視場(約550‐600根纖維/動物)
表 7. rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 治療動物在三個月時之載體生物分佈
組織 載體基因體拷貝/µg
動物832 動物833 動物834
LTA (經處理肌肉) 1.12E+05 1.12E+05 2.61E+05
RTA (對側肌肉) 未檢測 1.87E+02 1.02E+02
心臟 4.54E+03 1.96E+03 9.11E+02
肺 2.62E+03 1.00E+04 6.86E+02
肝 2.42E+05 9.19E+04 2.24E+05
腎 6.71E+03 2.76E+03 1.86E+02
脾 4.13E+03 3.43E+03 4.49E+02
生殖腺 2.30E+02 3.32E+02 4.15E+01
在肌內注射後，在經注射脛骨前肌中發現質膜修復蛋白之表現(圖6)。在靜脈內遞送後，在骨骼及心臟肌肉中發現質膜修復蛋白之表現(圖7A)。
治療其他小組之小鼠以測定用於膜修復之最小有效劑量。將三個劑量之AAV載體注射至8週齡129Dysf‐/‐小鼠之FDB中(n=6/組)。對照Dysf‐/‐組接受鹽水且129WT小鼠組用作品系特異性正常對照。如圖8中所展示，AAVrh.74.DYSF.DV治療揭示劑量依賴性膜重密封。平行表現研究展示，高劑量使得表現＞50%之纖維轉導。在正規化至肌肉重量時，此劑量等效於給予脛骨中以供表現及安全性研究者(圖4A-5C)。
表 8. AAVrh.74.MHCK7.Dysf erlin .DV 劑量反應
小鼠品系 治療 總劑量(vg) 12週
129-Dysftm1Kcam/J AAvrh.74.MHCK7.Dysf.DV 6×109 n = 6
129-Dysftm1Kcam/J AAvrh.74.MHCK7.Dysf.DV 2×1010 n = 6
129-Dysftm1Kcam/J AAvrh.74.MHCK7.Dysf.DV 6×1010 n = 6
129-Dysftm1Kcam/J PBS N/A n = 6
129S1/SvImJ正常對照 PBS N/A n = 6
rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV之全身性遞送
實施劑量探索研究以測試全身性遞送雙載體之可行性/有效性。基於此品系中之所確立功能性MRI/MRS結果，在研究中使用BlaJ小鼠(與BL6小鼠回交之AJ質膜修復蛋白缺陷小鼠)。藉由向尾部靜脈注射鹽水、2e12 vg總AAV.DYSF DV (8e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體)或6e12 vg總AAV.DYSF.DV (2.4e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體)來治療3組6週齡小鼠(n=6/組)。終點分析發生於3個月時且包括FDB中之橫膈膜生理學、膜修復分析及用於量化質膜修復蛋白表現及評價組織病理學之全面驗屍。4
在4個月之研究終點時，實施全面驗屍。對橫膈膜實施力量測，測試FDB肌肉之膜修復恢復性，且收穫肌肉及器官以分析表現、載體生物分佈及組織病理學。在高劑量下，質膜修復蛋白表現廣泛存在於所有肌肉中(圖7A及7B)，而在低劑量下則具有低含量可變表現。在20週時，BlaJ具有極溫和之組織學表型。與對照相比，作為再生標記物之中央細胞核顯著增加。經治療小鼠展示，中央成核在高劑量下顯著降低(圖7B)。最受影響之肌肉腰大肌顯示，在以高劑量(6e12 vg)治療後纖維化及發炎有所減少(圖9)。橫膈膜中之力缺陷在高劑量及低劑量下皆得以恢復(圖10A)且在FDB肌肉中之膜修復中存在劑量依賴性反應(圖10B)。
實例4：NHP中之AAV5及Aavrh.74.Mhck7.Dysf.Dv遞送之全長質膜修復蛋白表現之安全性及效能
方法：藉由肌內注射使用AAV.MHCK7.DYSF.FLAG治療4隻NHP。使用AAV5.MHCK7.DYSF治療2隻NHP且使用AAVrh.74.MHCK7.DYSF.FLAG治療2隻動物。為反映臨床試驗設計，在3個月時分析一隻動物且在6個月時分析兩隻動物。對動物實施基線化學及免疫學研究(包括ELISpot分析)以針對AAV5與rh.74衣殼及質膜修復蛋白量測T細胞(圖11A-11D)且量測抗AAV Ab效價(表9)。
將用於刺激PBMC之肽池設計為長15個胺基酸且重疊10個胺基酸以捕獲所有可能之抗原性表位。與肽反應之細胞會釋放干擾素‐γ，經由ELISpot分析將干擾素‐γ量化為斑點。使用50個斑點/1×106 個細胞作為陽性反應臨限值來對每百萬細胞之斑點進行計數。未觀察到持續免疫反應。所有動物在研究終點時皆具有表現(圖16A)。在整個研究中，每兩週一次重複該等研究。在研究終點時，對動物實施全面驗屍，且除基因表現研究外，亦包括生命器官組織之組織病理學及生物分佈研究。
結果：未發現可觀察毒性。申請者使用不區分恒河猴質膜修復蛋白及人類質膜修復蛋白之抗質膜修復蛋白抗體來證實質膜修復蛋白之過度表現(圖12A-12C)。亦進行抗FLAG免疫染色以證實衍生自載體之質膜修復蛋白表現(圖13)。與未注射對照相比，在注射AAV5.DYSF之TA中，肌肉顯示104.9% (3mo)及122.6% (6mo)之質膜修復蛋白過度表現，而注射AAVrh.74.DYSF.DV之TA具有122.0% (3mo)及115.2% (6mo)之過度表現。在NHP中之組織層面上未觀察到毒性且並無發炎或肌纖維壞死。ELISpot免疫學分析並未展示對衣殼或轉基因之任何異常反應(圖11A-11D)。另外，全血計數及化學組展示在任一恒河猴中並無異常值。如所預計，在基因轉移後抗AAV抗體效價有所升高。終點抗AAVrh.74效價低於抗AAV5之彼等。
表 9.NHP 中之肌內注射後之抗 AAV5 及抗 AAVrh.74 抗體。
注射後週數 AAV5.hDYSF AAVrh.74.DYSF.DV
06C011 06C029 07C019 10-158 10-172
0 ＜5 ＜5 ＜5 ＜5 ＜5
2 1,600 6,400 6,400 400 400
4 51,200 51,200 51,200 800 800
6 51,200 102,400 102,400 800 200
8 51,200 204,800 102,400 800 800
10 51,200 102,400 51,200 1,600 1,600
12 51,200 204,800 102,400 1,600 800
14 51,200 204,800 51,200    800
16 51,200 102,400       800
18 51,200 51,200       1,600
20 51,200 25,600       1,600
22 51,200 25,600       1,600
24 51,200 51,200       3,200
等效內容
除非另外陳述，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本技術所屬領域者通常所理解之含義相同的含義。
本文中闡釋性地闡述之本發明技術可適當地在不存在未在本文中具體地揭示之任一或多種要素或一或多種限制之情況下實踐。因此，舉例而言，術語「包含」、「包括」、「含有」等應廣義而不加限制地理解。另外，本文所採用之術語及表達用作說明之術語而無限制性，且在該等術語及表達之使用中並不意欲排除所展示及闡述之特徵或其部分之任何等效形式，但應認識到，在所主張之本發明技術之範圍內可進行各種修改。
因此，應理解，本文所提供之材料、方法及實例代表較佳態樣，係實例性，且並不意欲限制本發明技術之範圍。
本發明技術已經在本文中廣泛地且一般性地予以闡述。在一般揭示內容內之更窄種及亞屬組群中之每一者亦形成本發明技術之一部分。此包括對本發明技術之一般闡述，條件或消極限制係將任何標的物自該類屬中去除，而不管所去除材料是否在本文中具體敘述。
另外，在本發明技術之特徵或態樣係按照馬庫什組(Markush group)闡述時，熟習此項技術者應認識到，本發明技術亦由此按照該馬庫什組之任何個別成員或成員亞組來闡述。
本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式明確併入本文中，其併入程度如同每一者個別地以引用方式併入一般。倘若出現衝突，則以本說明書(包括定義)為準。
其他態樣陳述於下列申請專利範圍內。
圖1 提供用於治療質膜修復蛋白病之雙AAV載體系統之 示意圖。5’載體(例如5’ hDYSF AAV載體) pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG (PTG=啟動子/轉基因)含有肌肉特異性MHCK7啟動子、嵌合內含子、共有Kozak序列及DYSF cDNA中對應於SEQ ID NO: 12之胺基酸1-1113之5’部分。3’載體(例如3’ hDYSF AAV載體) pAAV.DYSF3’.POLYA含有DYSF cDNA中對應於SEQ ID NO: 12之胺基酸794-2080之3’部分及具有多聚腺苷酸化信號之DYSF 3’UTR。
圖2 提供pAAV.MHCK7.DYSF5’.PTG DNA載體質體圖。
圖3 提供pAAV.DYSF3’.POLYA載體DNA質體圖。
圖4A-4D 展示在遞送雙載體系統後之質膜修復蛋白表現。在遞送兩種載體後藉由免疫染色(圖4A )及西方印漬(western blot) (圖4C )可看到穩定之全長質膜修復蛋白表現。單獨遞送任一載體並無異常質膜修復蛋白表現(圖 4B ：免疫染色，圖 4D ：西方印漬)。3222係全長對照。
圖5A-5C 展示在rAAVrh74.MHCK7.DYSF.DV遞送後之質膜修復蛋白表現之時程結果。圖 5A 顯示在將雙載體遞送至左脛骨前肌(LTA)中後可藉由質膜修復蛋白免疫標記看到之全長質膜修復蛋白表現(上圖)。質膜修復蛋白表現持續至處理後1、3及6個月且並無異常病理學反應(H&E，下圖)。比例尺，100 μm。N=4/時間點。圖 5B 展示1、3、6個月試樣之西方印漬，該西方印漬顯示經注射LTA中之全長質膜修復蛋白之表現(2/組)。使用γ‐微管蛋白作為加載對照。圖 5C 展示在注射後3及6個月時各個組織之載體基因體/μg基因體DNA之生物分佈繪圖。注意：處理LTA；對數軸。
圖6 展示藉由經肌內注射rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV進行治療之4隻個別動物之靶肌肉(LTA)及非靶組織在3或12個月終點時之西方印漬分析。
圖7A-7C 展示在全身性遞送AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV後之質膜修復蛋白表現。圖 7A 展示在全身性遞送6 × 1012 vg (2.4e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體) AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV之後組織之質膜修復蛋白免疫標記(n=6/劑量)。所展示肌肉係Dysf‐/‐、經處理(AAV.DV)及野生型(WT)組織之心臟、腓腸肌、橫膈膜及四頭肌。圖 7B 展示脛骨前肌(LTA)、腓腸肌(RGAS)、四頭肌(LQD)、三頭肌(RTri)及橫膈膜中之中央型細胞核之量化。*代表試樣與野生型之間具有p＜0.05之顯著差異，#代表試樣與野生型之間並無顯著差異。圖 7C 展示組織溶解物(H：心臟，G：腓腸肌，Q：四頭肌，D：橫膈膜)之西方印漬，該西方印漬顯示237 kD之全長質膜修復蛋白帶，包括γ‐微管蛋白作為加載對照。
圖8 展示AAVrh.74.DYSF.DV遞送後之劑量依賴性膜重密封活性。
圖9 展示在全身性遞送AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV後纖維化及發炎之逆轉。使用6 × 1012 vg (2.4e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體)治療BlaJ小鼠。AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV (n=6)。取下腰大肌並分析是否存在纖維化(中間柱)及CD8單核細胞。在基因遞送後兩個參數皆顯著減小。
圖10A-10B 顯示，全身性遞送rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV可恢復Dysf‐/‐小鼠中之功能缺陷。圖 10A ： 收穫橫膈膜肌肉條並實施特定力評價方案。在兩個劑量[2e12 vg總AAV.DYSF DV (8e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體)或6e12 vg總AAV.DYSF.DV (2.4e13 vg/kg，基於作為定量標準之超螺旋DNA或質體)]下，經處理橫膈膜皆顯示顯著力改良(**P＞ 0.01, ANOVA)，此與野生型力不同。圖 10B 展示，膜重密封存在劑量依賴性反應。在低劑量下並無顯著改良。
圖11A-11D 展示T細胞對AAV衣殼及質膜修復蛋白之反應之監測結果。分離周邊血單核細胞並暴露於包含AAV5及AAVrh.74衣殼(藍色條)以及人類質膜修復蛋白(綠色)之肽。在3個月(圖 11A )及6個月(圖 11B )時監測T細胞對AAV5衣殼及質膜修復蛋白之反應。在3個月(圖 11C )及6個月(圖 11D )時監測T細胞對AAVrh.74衣殼及質膜修復蛋白之反應。
圖12A-12C 展示非人類靈長類動物中之質膜修復蛋白表現。圖 12A 展示在注射AAV5.DYSF或AAVrh.74.DYSF.DV後3及6個月時NHP組織之組織學(H&E)及質膜修復蛋白免疫螢光(IF)影像。H&E染色切片展示並無免疫浸潤及纖維壞死。IF切片展示，與天然(假)組織相比，質膜修復蛋白過度表現於經注射組織中。圖 12B 展示在注射AAV5.DYSF及AAVrh.74.DYSF.DV後3及6個月時組織之西方印漬影像。重要的是，經注射組織與假對照相比顯示質膜修復蛋白之過度表現。陽性(+)對照係野生型小鼠組織且陰性(‐)對照係129‐Dysf‐/‐未注射組織。圖 12C 展示在將AAVrh.74.DYSF.DV經肌內注射至左TA中後載體基因體之生物分佈，注意對數標度。
圖13 顯示使用抗FLAG來證實載體源質膜修復蛋白表現。使用N‐末端FLAG標籤來區分內源性及AAV源質膜修復蛋白。
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Claims (128)

  1. 一種編碼人類質膜修復蛋白(dysferlin) (hDYSF)之片段之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸包含第一核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列係由以下各物組成： (a)    SEQ ID NO: 1、6或18之核苷酸序列； (b)    與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1、6或18之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； (c)    SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列； (d)    與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； (e)    編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中該片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或 (f)    與(e)之該核苷酸序列在(e)之該核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之重組聚核苷酸，其進一步包含一或多個選自反向末端重複序列(ITR)、啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)之其他核苷酸序列。
  3. 如請求項2之重組聚核苷酸，其中該ITR係AAV ITR。
  4. 如請求項3之重組聚核苷酸，其中該AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。
  5. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸包含兩個ITR。
  6. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該ITR包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 17之核苷酸序列。
  7. 如請求項2至4之重組聚核苷酸，其中該啟動子包含肌肉特異性啟動子。
  8. 如請求項7之重組聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子係選自人類骨骼肌動蛋白基因元件、心臟肌動蛋白基因元件、結蛋白(desmin)啟動子、骨骼α肌動蛋白(ASKA)啟動子、肌鈣蛋白I(troponin I) (TNNI2)啟動子、肌細胞特異性增強子結合因子mef結合元件、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、截短MCK (tMCK)啟動子、肌球蛋白重鏈(MHC)啟動子、雜合a肌球蛋白重鏈增強子-/MCK增強子-啟動子(MHCK7)啟動子、C5-12啟動子、鼠類肌酸激酶增強子元件、骨骼快縮肌鈣蛋白c基因元件、慢縮心臟肌鈣蛋白c基因元件、慢縮肌鈣蛋白i基因元件、低氧可誘導核因子。
  9. 如請求項7之重組聚核苷酸，其中該肌肉特異性啟動子包含MHCK7啟動子。
  10. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該啟動子包含重組啟動子。
  11. 如請求項10之重組聚核苷酸，其中該重組啟動子包含重組肌肉特異性啟動子。
  12. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
  13. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含5’供體位點、分支點及/或3’剪接位點。
  14. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含嵌合內含子。
  15. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含來自人類β球蛋白基因之5’供體位點。
  16. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之分支點。
  17. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之3′剪接受體位點。
  18. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該內含子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
  19. 如請求項2至4中任一項之重組聚核苷酸，其中該選擇標記物係抗生素抗性基因。
  20. 如請求項19之重組聚核苷酸，其中該抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素(kanamycin)抗性基因。
  21. 如請求項1之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 18之核苷酸序列。
  22. 如請求項1至4及21中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組核苷酸並不進一步包含編碼該hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
  23. 如請求項1至4及21中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
  24. 如請求項1至4及21中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
  25. 一種編碼人類質膜修復蛋白之片段之重組聚核苷酸序列，其中該重組聚核苷酸包含第二核苷酸序列，其中該第二核苷酸序列係由以下各物組成： (a)    SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列； (b)    與SEQ ID NO: 2、8或19之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2、8或19之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； (c)    SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列； (d)    與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之其各別全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； (e)    編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸序列，其中該hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或 (f)    與(e)之該聚核苷酸序列在(d)之該核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸序列。
  26. 如請求項25之重組聚核苷酸，其進一步包含一或多個包含反向末端重複序列(ITR)、選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號之其他核苷酸。
  27. 如請求項26之重組聚核苷酸，其中該ITR係AAV ITR。
  28. 如請求項27之重組聚核苷酸，其中該AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。
  29. 如請求項25、27或28中任一項之重組核苷酸，其中該重組核苷酸進一步包含兩個ITR。
  30. 如請求項26至28中任一項之重組聚核苷酸，其中該ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
  31. 如請求項26至28中任一項之重組聚核苷酸，其中該聚A信號係人工聚A信號。
  32. 如請求項26至28中任一項之重組聚核苷酸，其中該聚A信號包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。
  33. 如請求項26至28中任一項之重組聚核苷酸，其中該選擇標記物包含抗生素抗性基因。
  34. 如請求項33之重組聚核苷酸，其中該抗生素抗性基因包含β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。
  35. 如請求項25之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸包含SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
  36. 如請求項25至28及35中任一項之組聚核苷酸，其中該重組核苷酸並不進一步包含編碼該hDYSF蛋白之第一片段之第一聚核苷酸序列。
  37. 如請求項25至28及35中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
  38. 如請求項25至28及35中任一項之重組聚核苷酸，其中該重組核苷酸不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
  39. 一種雙腺相關病毒(AAV)載體系統，其包含： (a)    第一AAV載體，其中該第一AAV載體包含如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸；及 (b)    第二AAV載體，其中該第二AAV載體包含如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸。
  40. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸。
  41. 如請求項40之AAV載體，其中該AAV載體係AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.10、AAVrh.20或AAVrh.74。
  42. 如請求項40之AAV載體，其中該AAV載體係AAVrh.74。
  43. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸。
  44. 如請求項43之AAV載體，其中該AAV載體係AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.10、AAVrh.20或AAVrh.74。
  45. 如請求項43之AAV載體，其中該AAV載體係AAVrh.74。
  46. 一種組合物，其包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸或如請求項40至45中任一項之AAV載體。
  47. 一種組合物，其包含： (a)    第一重組腺相關病毒(rAAV)載體，其中該第一rAAV載體包含如請求項40至42中任一項之AAV載體；及 (b)    第二rAAV載體，其中該第二rAAV載體包含如請求項43至45中任一項之AAV載體。
  48. 如請求項47之組合物，其中第一rAAV載體及第二rAAV載體之莫耳比介於約100:1至1:100、約10:1至1:10、約2:1至1:2之間或為約1:1。
  49. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含： (a)    第一反向末端重複序列(ITR)； (b)    編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之片段之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係由以下各物組成： i.  SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列； ii. 與SEQ ID NO: 1或6之核苷酸序列在SEQ ID NO: 1或6之全長上上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； iii. SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列； iv. 與SEQ ID NO: 13或15之核苷酸序列在SEQ ID NO: 13或15之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； v.  編碼hDYSF蛋白之片段之核苷酸序列，其中該hDYSF蛋白之片段係由SEQ ID NO: 9之胺基酸序列組成；或 vi. 與(v)之該核苷酸序列在(v)之該核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列；及 (c)    第二ITR， 其中該聚核苷酸由該等第一及第二ITR側接。
  50. 如請求項49之AAV載體，其進一步包含一或多個選自啟動子、內含子、選擇標記物或複製起點(ORI)之其他聚核苷酸。
  51. 如請求項49或50之AAV載體，其中該ITR係AAV ITR。
  52. 如請求項51之AAV載體，其中該AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。
  53. 如請求項49或50之AAV載體，其中該等第一及/或第二ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
  54. 如請求項50之AAV載體，其中該啟動子係肌肉特異性啟動子。
  55. 如請求項54之AAV載體，其中該肌肉特異性啟動子係肌球蛋白重鏈複合物-E盒肌肉肌酸激酶融合增強子/啟動子。
  56. 如請求項50之AAV載體，其中該啟動子係重組啟動子。
  57. 如請求項56之AAV載體，其中該重組啟動子係重組肌肉特異性啟動子。
  58. 如請求項57之AAV載體，其中該重組-肌肉特異性啟動子係MHCK7啟動子。
  59. 如請求項50之AAV載體，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
  60. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子包含5’供體位點、分支點及/或3’剪接位點。
  61. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子係嵌合內含子。
  62. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子包含來自人類β球蛋白基因之5′供體位點。
  63. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之分支點。
  64. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子包含來自免疫球蛋白G (IgG)重鏈之3’剪接受體位點。
  65. 如請求項50之AAV載體，其中該內含子包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。
  66. 如請求項50之AAV載體，其中該選擇標記物係抗生素抗性基因。
  67. 如請求項66之AAV載體，其中該抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。
  68. 如請求項49或50之AAV載體，其中該AAV載體包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 15之核苷酸序列。
  69. 如請求項49或50之AAV載體，其中該AAV載體並不進一步包含編碼該hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
  70. 如請求項49或50之AAV載體，其中該AAV載體不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
  71. 如請求項49或50之AAV載體，其中該AAV載體不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
  72. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含： (a)    第一反向末端重複序列(ITR)； (b)    編碼人類質膜修復蛋白之片段之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係由以下各物組成： i.  SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列； ii. 與SEQ ID NO: 2或8之核苷酸序列在SEQ ID NO: 2或8之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； iii. SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列； iv. 與SEQ ID NO: 14或16之核苷酸序列在SEQ ID NO: 14或16之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列； v.  編碼hDYSF蛋白之片段之聚核苷酸，其中該hDYSF蛋白之該片段係由SEQ ID NO: 10之胺基酸序列組成；或 vi. 與(v)之該聚核苷酸序列在(v)之該核苷酸序列之全長上至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸；及 (c)    第二ITR， 其中該聚核苷酸由該等第一及第二ITR側接。
  73. 如請求項72之AAV載體，其進一步包含一或多個選自選擇標記物、複製起點(ORI)、未轉譯區(UTR)或多聚腺苷酸化(聚A)信號之聚核苷酸。
  74. 如請求項72或73之AAV載體，其中該ITR係AAV ITR。
  75. 如請求項74之AAV載體，其中該AAV ITR係AAV2 ITR或AAV3 ITR。
  76. 如請求項72或73之AAV載體，其中該ITR包含SEQ ID NO: 3或17之核苷酸序列。
  77. 如請求項73之AAV載體，其中該聚A信號係人工聚A信號。
  78. 如請求項73之AAV載體，其中該聚A信號包含SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。
  79. 如請求項73之AAV載體，其中該選擇標記物係抗生素抗性基因。
  80. 如請求項79之AAV載體，其中該抗生素抗性基因係β-內醯胺酶基因或卡那黴素抗性基因。
  81. 如請求項72或73之AAV載體，其中該AAV載體包含SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 16之核苷酸序列。
  82. 如請求項72或73之AAV載體，其中該AAV載體並不進一步包含編碼該hDYSF蛋白之第二片段之第二聚核苷酸序列。
  83. 如請求項72或73之AAV載體，其中該AAV載體不包含除一或多個ITR外之AAV序列。
  84. 如請求項72或73之AAV載體，其中該AAV載體不包含除一或多個ITR外之病毒序列。
  85. 一種雙腺相關病毒(AAV)載體系統，其包含： (a)    第一AAV載體，其中該第一AAV載體包含如請求項40至42及49至71中任一項之AAV載體；及 (b)    第二AAV載體，其中該第二AAV載體包含如請求項43至45及72至84中任一項之AAV載體。
  86. 如請求項85之雙腺相關病毒(AAV)載體系統，其中該AAV載體係AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAVrh.10、AAVrh.20或AAVrh.74。
  87. 如請求項85之雙腺相關病毒(AAV)載體系統，該AAV載體係AAVrh.74。
  88. 一種腺相關病毒(AAV)包裝系統，其包含： (a)    包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸之質體； (b)    腺病毒輔助質體；及 (c)    rep-cap質體。
  89. 一種腺相關病毒包裝系統，其包含： (a)    包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸之質體；及 (b)    腺病毒輔助質體。
  90. 如請求項88或89之腺相關病毒包裝系統，其中該腺病毒輔助質體包含pHELP質體。
  91. 一種產生腺相關病毒(AAV)載體之方法，其包含使細胞與包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸之質體或如請求項88之AAV包裝系統接觸。
  92. 如請求項91之方法，其中該細胞係宿主細胞，視情況為哺乳動物宿主細胞，另外視情況為HEK293。
  93. 一種產生腺相關病毒(AAV)載體之方法，其包含使用包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸之質體轉導包裝細胞系，其中該包裝細胞系表現腺相關病毒rep及cap基因。
  94. 如請求項93之方法，其中該AAV rep基因係Rep78。
  95. 如請求項93之方法，其中該AAV cap基因係Rh74cap 基因。
  96. 一種細胞，其包含如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸。
  97. 一種細胞，其包含含有如請求項1至38中任一項之重組聚核苷酸之質體。
  98. 如請求項88或89之AAV包裝系統、如請求項91至95中任一項之方法或如請求項96或97之細胞，其中該質體包含與SEQ ID NO: 18或19至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之聚核苷酸。
  99. 如請求項88或89之AAV包裝系統、如請求項91至95中任一項之方法或如請求項96或97之細胞，其中該質體包含SEQ ID NO: 18或19之聚核苷酸。
  100. 一種第一聚核苷酸之用途，其用以製造用於治療質膜修復蛋白病(dysferlinopathy)之藥劑，其中該藥劑進一步包含第二聚核苷酸或與該第二聚核苷酸組合使用，且其中該第一聚核苷酸係如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸；且其中該第二聚核苷酸係如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸。
  101. 如請求項100之用途，其中該等第一聚核苷酸及/或第二聚核苷酸係經肌內或經靜脈內投與。
  102. 如請求項100或101之用途，其中該等第一及第二聚核苷酸係同時或依序投與。
  103. 一種第一腺相關病毒(AAV)載體之用途，其用以製造用於治療質膜修復蛋白病之藥劑，其中該藥劑進一步包含第二AAV載體或與該第二AAV載體組合使用，且其中該第一AAV載體係如請求項40至42及49至71中任一項之AAV載體；且其中該第二AAV載體係如請求項43至45或72至84中任一項之AAV載體。
  104. 如請求項103之用途，其中該等第一AAV載體及/或第二AAV載體係經肌內或經靜脈內投與。
  105. 如請求項103或104之用途，其中該等第一及第二AAV載體係同時或依序投與。
  106. 一種如請求項39及85至87中任一項之AAV雙載體系統之用途，其用以製造用於治療質膜修復蛋白病之藥劑。
  107. 如請求項106之用途，其中該AAV雙載體系統係經肌內或經靜脈內投與。
  108. 一種如請求項46至48中任一項之組合物之用途，其用以製造用於治療質膜修復蛋白病之藥劑。
  109. 如請求項108之用途，其中該組合物係經肌內或經靜脈內投與。
  110. 如請求項100、101、103、104及106至109中任一項之用途，其中該質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變(Miyoshi myopathy)。
  111. 如請求項103、104及106至109中任一項之用途，其中該第一AAV載體之有效量介於約1×106 至1×1016 vg/kg、約1×108 至1×1015 vg/kg或約1×1010 至1×1014 vg/kg之間，其中該劑量係藉由超螺旋PCR定量標準所量測。
  112. 如請求項111之用途，其中該第一AAV載體之有效量為1.2e13 vg/kg，其中該劑量係藉由超螺旋PCR定量標準所量測。
  113. 如請求項103、104及106至109中任一項之用途，其中該第二AAV載體之有效量介於約1×106 至1×1016 vg/kg、約1×108 至1×1015 vg/kg或約1×1010 至1×1014 vg/kg之間，其中該劑量係藉由超螺旋PCR標準所量測。
  114. 如請求項113之用途，其中該第二AAV載體之有效量為1.2e13 vg/kg，其中該劑量係藉由超螺旋PCR定量標準所量測。
  115. 如請求項103、104及106至109中任一項之用途，其中總AAV載體劑量為2.4e13 vg/kg，其中該劑量係藉由超螺旋PCR標準所量測。
  116. 一種編碼人類質膜修復蛋白(hDYSF)之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 20之核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列。
  117. 如請求項116之重組聚核苷酸，其中該重組聚核苷酸序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列。
  118. 一種如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸或如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸之用途，其用以製造用於在受試者中製備如請求項116之重組聚核苷酸之藥劑。
  119. 如請求項39及85至87中任一項之雙AAV載體系統或如請求項47或48之組合物之用途，其用以製造用於在受試者中製備如請求項116之重組聚核苷酸之藥劑。
  120. 如請求項118之用途，其中該用途包含使細胞與如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸及如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸接觸或表現該等重組聚核苷酸。
  121. 如請求項119之用途，其中該用途包含使細胞與如請求項39及85至87中任一項之雙AAV載體系統接觸。
  122. 如請求項120或121之用途，其中該細胞係真核細胞。
  123. 如請求項120或121之用途，其中該細胞係肌細胞、心臟細胞、幹細胞、衛星細胞及/或肝細胞。
  124. 一種如請求項1至24中任一項之重組聚核苷酸及如請求項25至38中任一項之重組聚核苷酸或如請求項47或48之組合物之用途，其用以製造用於治療受試者之肌肉營養不良症之藥劑，其中該藥劑用於在該受試者中表現如請求項116之重組聚核苷酸。
  125. 如請求項39及85至87中任一項之雙AAV載體系統之用途，其用以製造用於治療受試者之肌肉營養不良症之藥劑，其中該藥劑在該受試者中表現如請求項116之重組聚核苷酸。
  126. 如請求項122至125中任一項之用途，其中該受試者係選自人類、非人類靈長類動物、犬類、羊類、馬、豬類、鼠類、大鼠、兔、牛類或貓類之哺乳動物。
  127. 如請求項122至125中任一項之用途，其中該受試者患有質膜修復蛋白病。
  128. 如請求項127之用途，其中質膜修復蛋白病係2B型肢帶型肌肉營養不良症(LGMD2B)或三好氏肌肉病變。
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