KR20230009444A - 디스페린 이중 벡터에 의한 유전자 요법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 인간 디스페린 단백질(human dysferlin protein)의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 기재된다. 또한, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 세포, 및 조성물이 추가로 기재된다. 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 세포, 및 조성물은 디스페린병증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

디스페린 이중 벡터에 의한 유전자 요법
본원은 2020년 5월 13일자로 출원된 미국 가출원 제63/024,338호의 35 U.S.C.§119(e) 하에서 우선권을 주장하며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본원은 본 개시의 별도의 부분으로서, 그 전체가 참조로 포함되고 파일명: 106887_8070_SL.txt; 크기: 129,123 바이트; 생성일: 2021년 5월 11일과 같이 식별되는 컴퓨터 판독가능한 형태의 서열 목록을 포함한다.
본 개시내용은 디스페린 결핍, 예를 들어 사지 근이영양증(limb girdle muscular dystrophy) 유형 2B, 미요시 근병증(miyoshi myopathy), 및 원위 전방 구획 근병증(distal anterior compartment myopathy)을 갖는 대상체를 치료하기 위한, 인간 디스페린(dysferlin) 유전자 및 플라스미드의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터, 세포, 및 조성물, 및 상기 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
디스페르리노병증(dysferlinopathies)은 사지 근이영양증 유형 2B(limb girdle muscular dystrophy type 2B, LGMD2B), 미요시 근병증, 및 원위 전방 구획 근병증(집합적으로 디스페르리노병증으로 알려짐)을 포함한 상염색체 열성 장애이다. 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B)는 1/100,000-1/200,000의 발생률의 전세계적인 보고와 함께 미국에서 가장 흔한 LGMD 중의 하나를 나타낸다. 미요시 근병증(Miyoshi Myopathy)은 디스페리노병증(dysferlinopathy)의 더 한정된 원위 하부 말단 형태이다. 사실상, 질병 스펙트럼을 고려할 때, LGMD2B는 종종 비복근의 위축으로 원위에서 시작되고, 그 후 근위 근육에 영향을 미치도록 경시적으로 확산된다. 디스페린의 손실은 만성 근섬유 손실, 염증, 지방 대체 및 섬유증을 동반하는 점진적인 형태의 이영양증을 초래하고, 이들은 모두 근육 약화를 악화시킨다.
디스페린 유전자는 크며, 지금까지 확인된 55개의 엑손(exons)은 적어도 150 kb의 게놈 DNA에 걸쳐 있다. 이들 엑손은 대략 6.5 kb의 cDNA 및 2,088개 아미노산의 단백질을 예측한다. 디스페린은 C-말단 소수성 막관통 도메인 및 다수의 C2 도메인을 갖는 보다 긴 세포질 배향 친수성 영역으로 구성된 237 kDa의 단백질이다. 성장하는 신체의 연구는 디스페린의 손실이 골격근에서 Ca2 +-의존성 막 복구를 손상시킨다는 것을 보여주었다[문헌 「Song 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 98: 4084-4088, 2001」; 「Schnepp 등, J. Virol. 77:3495-3504, 2003」 참조]. 또한, 디스페린은 아넥신 A1 및 A2, AHNAK, 및 카베올린-3을 포함하는 막 복구에 관여하는 다른 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다. 이러한 시스템의 중요성은 골격근이 기계적으로 활동적이고 손상되기 쉬운 것을 고려할 때 강조되며; 따라서, 강건한 막 재밀봉 메커니즘이 존재해야 한다. 디스페린의 부재 또는 돌연변이는 손상된 막 복구 및 근섬유 괴사로 시작하여 근섬유 손실 및 진행성 사지 약화를 초래하는 일련의 사건으로 이어진다. 근섬유 재생 능력의 손실은 디스페린 결핍의 기여 결과로서 생각된다. 디스페린은 또한 소포 트래피킹(vesicle trafficking) 및 엔도시토시스(endocytosis), T관(T tubule) 형성 등과 관련되어 있다.
디스페린 유전자의 돌연변이는 사지 근육 이영양증 유형 2B(LGMD2B), 미요시 근병증 및 원위 전방 구획 근병증(집합적으로 디스페르리노병증으로 알려짐)을 포함하는 대립유전자 상염색체 열성 장애를 유발한다[예를 들어 문헌 「Grose 등, PloS one 7:e39233,2012」; 「Bansal 등, Nature 423, 168-172,2003, Moore」; 「Moore, SA, 등, J Neuropathol Exp. Neurol 65: 995-1003, 2006」; 「Rosales 등, Muscle Nerv 42:14-21, 2010」; 「Sondergaard 등, Anns of Clin Trans Neurol 2:256-270, 2015」; 「Evesson 등, J Biol Chem 285: 28529-28539, 2010」; 및 「Klinge 등, Soc Exp Biol 21: 1768-1776, 2007」 등을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨]. 디스페린 결핍증의 덜 흔한 표현형은 경추 증후군을 나타낸다[문헌 「Klinge 등, Muscle Nerve 41: 166-173, 2010」을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함됨]. 전형적으로, 환자는 그의 20대 초기에 서서히 진행성 쇠약 및 높은 혈청 크레아틴 키나제(creatine kinase; CK)를 나타낸다. 환자의 대략 1/3은 발병 15년 이내에 휠체어-의존성으로 된다. 임상적으로 심장은 보호되고 인지 기능은 영향을 받지 않는다. 근육 약화의 비교적 제한된 분포를 갖는 표현형 변이체는 이러한 장애에 대한 삶의 질에 크게 영향을 미칠 수 있는 잠재적 부위 유전자 대체 요법에 대한 단계를 설정한다[문헌 「Grose 등, PLoS One 7:e39233, 2012」, 「Barton 등, Muscle Nerve 42:22-29, 2010」 참조]. 단일 뉴클레오티드 변화는 전형적인 DYSF 유전자 돌연변이이며, 이는 또한 면역거부반응으로부터 전이유전자 생성물을 보호하는 역할을 하는 유전자 전달에서의 성공을 선호한다[문헌 「Rodine-Klapac 등, Mol Ther 18: 109-117, 2010」, 「Mendell 등, N Eng J Med 363: 1429-1437, 2010」, 「Mendell 등, Ann Neurol 66:290-297, 2009」을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함됨).
디스페르리노병증에 대한 치유 또는 치료법은 존재하지 않는다. 전체적으로, 유전자 대체 또는 대용 유전자 대체를 평가한 전임상 연구는 다수의 전략이 막 복구를 회복시키는 데 일부 효능을 나타낸다는 것을 보여주었다. 디스페린 유전자는 6.5 kb에서 이의 회합된 cDNA와 함께 150 kb의 게놈 DNA를 포괄하는 55개의 엑손을 포함한다. 그러나, 유전자 대체를 위해, AAV의 패키징 한계는 4.7 kb이며, 이는 6.5 kb에서 디스페린의 cDNA 서열 미만이다. 따라서, 필요로 하는 대상체에게 기능성 전체-길이 디스페린 단백질을 전달할 수 있는 새로운 메커니즘을 필요로 하는 LGMD2B에 대한 치료법이 요구된다.
인간 디스페린(human dysferlin, hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은: (a) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이(full length)에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (c) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (d) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (e) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (f) 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성된다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 역전된 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR), 프로모터(promoter), 인트론(intron), 선택 마커(selection marker), 또는 복제기점(origin of replication; ORI)으로부터 선택된 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 ITR을 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3 또는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터를 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 트로포닌 I(TNNI2) 프로모터, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 절단된 MCK(tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 혼성 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 빠른-트위치(twitch, 연축) 트로포닌 c 유전자 요소, 느린-트위치 심장 트로포닌 c 유전자 요소(slow-twitch cardiac troponin c gene element), 느린-트위치 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자(hypoxia-inducible nuclear factor)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 MHCK7 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 재조합 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 프로모터는 재조합 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 근육-특이적 프로모터는 재조합 미오신 중쇄-크레아틴 키나제 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 5' 공여체 부위, 분지점, 및/또는 3' 스플라이스 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 인간 β-글로빈 유전자로부터의 5' 공여체 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 분지점을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 3' 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 선택 마커를 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자(kanamycin resistance gene)이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열이 본원에 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은: (a) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (c) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (d) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (e) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (f) 상기 (d)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성된다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 역전된 말단 반복부(ITR), 선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(untranslated region; UTR), 또는 폴리아데닐화(polyadenylation; 폴리A) 신호를 포함하는 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 ITR을 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR이다. 일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 2개의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 폴리A 신호를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 인공 폴리A 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 선택 마커를 포함하는 추가의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 또는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 1 단편을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
본원에서는 추가로, 이중 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 벡터 시스템이 개시되며, 상기 벡터 시스템은:
(a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단 단편을 암호화하는 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨;
을 포함한다.
본원에서 추가로, 본원에 개시된 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 벡터가 개시된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 인간 디스페린 단백질의 N-말단 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAVrh10, AAVrh20, 또는 AAVrh74이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAVrh74이다.
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 개시된다.
본원에서는 추가로, 조성물이 개시되며, 상기 조성물은:
(a) 제 1 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 rAAV 벡터는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단 단편을 암호화하는 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 제 2 rAAV 벡터, 여기서 상기 제 2 rAAV 벡터는 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨;
를 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 rAAV 벡터의 몰비는 약 100:1-100, 약 10:1-1:10, 약 2:1-1:2, 또는 약 1:1이다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터가 개시되며, 상기 AAV 벡터는:
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR);
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다(flanked)(또는 '옆에 배치된다').
일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR이다. 일부 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 프로모터, 인트론, 선택 마커, 또는 복제기점(ORI)을 포함하는 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 프로모터를 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 미오신 중쇄 복합체-E 박스 근육 크레아틴 키나제 융합 인핸서/프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 재조합 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 프로모터는 재조합 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 근육-특이적 프로모터는 MHCK7 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 인트론을 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 5' 공여체 부위(donor site), 분지점, 및/또는 3' 스플라이스 부위(splice site)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 인간 β-글로빈 유전자로부터의 5' 공여체 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 분지점을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 3' 스플라이스 수용체 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 선택 마커를 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 서열번호 6 또는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 개시되며, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는:
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR);
(b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(UTR), 또는 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 폴리A 신호를 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 인공 폴리A 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 선택 마커를 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 서열번호 8 또는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
본원에서는, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 개시되며, 상기 이중 AAV 벡터 시스템은:
(I) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는,
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR)를 포함하는 제 1 AAV 벡터;
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;을 포함하는 제 1 AAV 벡터임; 및
(c) 제 2 ITR;
를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 ITR 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹됨; 및
(II) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는,
(a) 제 3 역전된 말단 반복부(ITR)를 포함하는 제 2 AAV 벡터;
(b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드임;를 포함하는 제 2 AAV 벡터임; 및
(c) 제 4 ITR;
를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 제 3 ITR 및 제 4 ITR에 의해 플랭킹됨;
을 포함한다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 패키징 시스템이 개시되며, 상기 시스템은: (a) 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드; (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및 (c) rep-cap 플라스미드;를 포함한다. 일부 경우에, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 pHELP 플라스미드를 포함한다.
본원에서는 추가로, (a) 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드; 및 (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 포함하는 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 pHELP 플라스미드를 포함한다.
본원에서는 추가로, 세포를 AAV 패키징 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법이 개시되며, 상기 AAV 패키징 시스템은, (a) 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드; (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및 (c) rep-cap 플라스미드;를 포함한다. 일부 경우에, 세포는 숙주 세포, 임의로 포유동물 숙주 세포, 추가로 임의로 HEK293이다.
본원에서는 추가로, 패키징 세포주를 AAV 패키징 시스템으로 형질도입(transducing)하는 것을 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법이 개시되며, 상기 AAV 패키징 시스템은: (a) 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 발현 카세트를 포함하는 플라스미드; 및 (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(adenovirus helper plasmid);를 포함하되, 여기서 상기 패키징 세포주는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 발현한다. 일부 경우에, AAV rep 유전자는 Rep78이다. 일부 경우에, AAV cap 유전자는 Rh74 cap 유전자이다.
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 세포가 개시된다.
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 재조합 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 발현 카세트를 포함하는 세포가 개시된다. 일부 경우에, 플라스미드는 서열번호 18 또는 19와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에, 플라스미드는 서열번호 18 또는 19의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증의 치료 방법이 개시되며, 상기 방법은, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게,
(a) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유효량의 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은, (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유효량의 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열은, (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨;
을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게,
(a) 유효량의 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 유효량의 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드;로 구성됨;
을 투여하는 것을 포함하는, 디스페리노병증의 치료 방법이 개시된다.
일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 벡터는 동시에 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 본원에서는 디스페리노증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 임의의 AAV 이중 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 디스페리노증을 치료하는 방법이 개시된다.
일부 구현예에서, AAV 이중 벡터 시스템은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 본원에서는 디스페리노증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 임의의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 디스페리노증을 치료하는 방법이 개시된다.
일부 구현예에서, 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도가 개시되어 있고, 여기서 상기 조성물은,
(a) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨;
을 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 동시에 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도가 개시되어 있고, 여기서 상기 조성물은,
(a) 유효량의 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 유효량의 제 2 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드;로 구성됨;
을 포함한다.
일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 벡터는 동시에 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도가 개시되며, 여기서 상기 조성물은 본원에 개시된 임의의 AAV 이중 벡터 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 임의의 개시된 조성물의 용도가 개시된다.
일부 구현예에서, 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터의 유효량은 정량화 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 하여 약 1×106 내지 1×1016 vg/kg, 약 1×108 내지 1×1015 vg/kg, 또는 약 1×1010 내지 1×1014 vg/kg이다.
일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터의 유효량은 정량화 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 하여 약 1×106 내지 1×1016 vg/kg, 약 1×108 내지 1×1015 vg/kg, 또는 약 1×1010 내지 1×1014 vg/kg이다.
일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 투여된다.
일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 투여된다.
일부 구현예에서, AAV 이중 벡터 시스템의 유효량은 약 1×1010 내지 1×1013 벡터 게놈(vg), 약 1×1011 내지 1×1013 vg, 1×1012 내지 1×1013 vg이다.
일부 구현예에서, AAV 이중 벡터 시스템은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물의 유효량은 약 1×1010 내지 1×1013 벡터 게놈(vg), 약 1×1011 내지 1×1013 vg, 1×1012 내지 1×1013 vg이다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 투여된다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 방법은, 세포를,
인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨;
과 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 방법은, 세포를,
(I) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는,
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(first inverted terminal repeat; ITR);
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해서 플랭킹되고, 상기 제 2 AAV 벡터는 상기 (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR)을 포함함; 및
(II) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는,
(a) 제 3 역전된 말단 반복부(ITR);
(b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 4 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 3 및 제 4 ITR에 의해서 플랭킹됨;
을 포함하는, 이중 AAV 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 근육 세포, 심장 세포, 줄기 세포, 위성 세포, 및/또는 간 세포이다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 방법은, 대상체에게,
인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열로 구성됨;
을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 투여하는 것을 포함한다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 방법은, 대상체에게,
(I) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는,
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(first inverted terminal repeat; ITR);
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해서 플랭킹되고, 상기 제 2 AAV 벡터는 상기 (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR)을 포함함; 및
(II) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는,
(a) 제 3 역전된 말단 반복부(ITR);
(b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 4 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 3 및 제 4 ITR에 의해서 플랭킹됨;
을 포함하는, 이중 AAV 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하는, 대상체의 근이영양증을 치료하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 대상체에서 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에게,
인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 N-말단을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(b) 인간 디스페린 단백질의 C-말단 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열로 구성됨;
을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 대상체에게,
(I) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는,
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(first inverted terminal repeat; ITR);
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해서 플랭킹되고, 상기 제 2 AAV 벡터는 상기 (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR)을 포함함; 및
(II) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는,
(a) 제 3 역전된 말단 반복부(ITR);
(b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 4 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 3 및 제 4 ITR에 의해서 플랭킹됨;
을 포함하는, 이중 AAV 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개(canine), 양(ovine), 말(horse), 돼지(porcine), 뮤린(murine), 래트(rat), 토끼(rabbit), 소(bovine), 또는 고양이(feline)로부터 선택된 포유동물이다.
일부 구현예에서, 대상체는 디스페리노병증(dysferlinopathy)을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
도 1은 디스페리노병증을 치료하기 위한 이중 AAV 벡터 시스템의 개략도를 제공한다. 5' 벡터(예를 들어 5' hDYSF AAV 벡터), pAAV.MHCK7.DYSF5'.PTG(PTG=프로모터/전이유전자)는 근육 특이적 MHCK7 프로모터, 키메라 인트론, 공통(consensus) 코작(Kozak) 서열 및 서열번호 12의 아미노산 1-1113에 상응하는 DYSF cDNA의 5' 부분을 함유한다. 3' 벡터(예를 들어 3' hDYSF AAV 벡터), pAAV.DYSF3'.POLYA는 서열번호 12의 아미노산 794-2080에 상응하는 DYSF cDNA의 3' 부분 및 폴리아데닐화 신호를 보유하는 DYSF 3'UTR을 함유한다.
도 2는 pAAV.MHCK7.DYSF5'.PTG DNA 벡터 플라스미드 맵을 제공한다.
도 3은 pAAV.DYSF3'.POLYA 벡터 DNA 플라스미드 맵을 제공한다.
도 4a 내지 도 4d는 이중 벡터 시스템의 전달 후 디스페린 발현을 나타낸다. 강력한 전체-길이 디스페린 발현(robust full-length dysferlin expression)은 면역 염색(immune staining)(도 4a) 및 웨스턴 블롯(western blot)(도 4c)에 의한 두 벡터의 전달 후에 나타났다. 어느 하나 벡터의 단독 전달은 비정상적인 디스페린 발현을 갖지 않았다(도 4b: 면역 염색, 도 4d: 웨스턴 블롯). 3222는 전체-길이 제어이다.
도 5a 내지 5c는 rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 전달 이후의 디스페린 발현의 시간 경과의 결과를 나타낸다. 도 5a는 좌측 전경골(LTA)으로의 이중 벡터의 전달 후에 보여지는 디스페린 면역표지에 의한 전체-길이 디스페린 발현(상부 패널)을 입증한다. 디스페린 발현은 병리학에서 비정상적인 반응이 없는 치료 후 1, 3, 및 6개월 동안 지속되었다(H&E, 하부 패널). 스케일 바(scale bar), 100 ㎛. 시점당 N=4. 도 5b는 주사된 LTA에서 전체-길이 디스페린의 발현을 입증하는 1, 3, 6 개월 샘플에 대한 웨스턴 블롯을 나타낸다(그룹 당 2개). 도 5c는 다양한 조직에 대한 주사 후 3 및 6개월에 ㎍ 벡터 게놈 당 게놈 DNA의 생체분포 플롯을 도시한다. 주의: LTA를 처리하였다; 로그 축.
도 6은 3 또는 12개월의 종말점(endpoints)에서 rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV로 근육내 주사에 의해 치료된 4 마리의 개별 동물로부터의 표적 근육(LTA) 및 비표적 조직의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 7a 내지 7c는 AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV의 전신 전달(systemic delivery) 후 디스페린 발현을 나타낸다. 도 7a는 6×1012 vg(2.4e13 vg/kg, 정량 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 함) AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV의 전신 전달 후 조직의 디스페린 면역표지를 나타낸다(n=6/용량(dose)). 도시된 근육은 심장, 비복근, 횡격막 및 사두근, 치료된 (AAV.DV) 및 야생형(WT) 조직에 대한 것이다. 도 7b는 전경골(LTA), 비복근(RGAS), 사두근(LQD), 삼두근(RTri) 및 횡격막에서의 중앙화된 핵의 정량화를 도시한다. *p<0.05 샘플과 야생형 사이의 유의한 차이, # 샘플과 야생형 사이의 유의한 차이 없음. 도 7c는 로딩 대조군으로서 포함된 237 kD의 γ-튜불린(tubulin)에서 전체-길이 디스페린 밴드를 입증하는 조직 용해물(H: 심장, G: 비복근, Q: 사두근, D: 횡격막)의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 8은 AAVrh.74.DYSF.DV 전달 후의 용량 의존적 막 재밀봉 활성을 나타낸다.
도 9는 AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV의 전신 전달 후 섬유증 및 염증의 역전을 보여준다. BlaJ 마우스를 정량 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 6×1012 vg(2.4e13 vg/kg)로 처리하였다. AAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV(n=6). 돼지 근육을 제거하고, 섬유증(중간 칼럼) 및 CD8 단핵 세포의 존재에 대해 분석하였다. 유전자 전달 후 두 파라미터 모두에서 유의한 감소가 있었다.
도 10a 내지 도 10b는 rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV의 전신 전달을 입증한다. Dysf-/-마우스에서 기능 결함을 회복시켰다. 도 10a: 설사 근육 스트립을 수확하고 특정 힘을 평가하기 위한 프로토콜에 적용하였다. 처리된 다이어프램은 2e12 vg 총 AAV.DYSF.DV(정량 표준으로서 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 8e13 vg/kg), 또는 6e12 vg 총 AAV.DYSF.DV(정량 표준으로서 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 2.4e13 vg/kg) 용량 둘 다에서 야생형 힘과 상이하지 않은 힘(**P>0.01, ANOVA)의 유의한 개선을 입증하였다. 낮은 용량에서 유의한 개선은 없었다.
도 11a 내지 도 11d는 AAV 캡시드 및 디스페린에 대한 T 세포 반응의 모니터링으로부터의 결과를 보여준다. 말초 혈액 단핵 세포를 단리하고, AAV5 및 AAVrh.74 캡시드(청색 막대) 뿐만 아니라 인간 디스페린(녹색)을 포함하는 펩티드에 노출시켰다. AAV5 캡시드 및 디스페린에 대한 T 세포 반응을 3개월(도 11a) 및 6개월(도 11b)에서 모니터링하였다. AAVrh.74 캡디스 및 디스페린에 대한 T 세포 반응을 3개월(도 11c) 및 6개월 (도 11d)에 모니터링하였다.
도 12a 내지 도 12c는 인간이 아닌 영장류에서 디스페린 발현을 나타낸다. 도 12a는 AAV5.DYSF 또는 AAVrh.74.DYSF.DV의 주사 후 3 및 6개월째에 NHP 조직의 조직학(H&E) 및 디스페린 면역형광(IF) 이미지를 나타낸다. H&E 염색된 절편은 섬유의 면역 침윤 및 괴사의 결여를 나타낸다. 도 12b는 AAV5.DYSF 및 AAVrh.74.DYSF.DV 둘 다에 대한 주사 후 3 및 6개월로부터의 조직의 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다. 중요하게는, 주사된 조직은 샴 대조군과 비교하여 디스페린의 과발현을 입증한다. 양성(+) 대조군은 야생형 마우스 조직이고, 음성(-) 대조군은 129Dysf-/-비주사된 조직이다. 도 12c는 좌측 TA 내로 AAVrh.74.DYSF.DV를 사용한 IM 주사 후 벡터 게놈의 생체분포(biodistribution)를 나타내며, 로그 스케일(logarithmic scale)에 주목한다.
도 13은 벡터 유래된 디스페린 발현을 확인하기 위한 항-FLAG의 사용을 입증한다. N 말단 FLAG 태그를 사용하여 내인성 및 AAV 유래 디스페린을 구별하였다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어(기술적 및 과학적 용어 포함)는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 본원 및 관련 분야의 맥락에서 그의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 본원에 명시적으로 그렇게 정의되지 않는 한 이상적이거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 한다는 것으로 이해될 것이다. 하기에서 명시적으로 정의되지 않지만, 이러한 용어는 그의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다.
본원의 기술에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 기술의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 이용할 것이다.
문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 일부 구현예에서, 본원에 제시된 임의의 특징 또는 특징의 조합이 배제되거나 생략될 수 있는 것으로 고려된다. 예시를 위해, 본원 명세서가 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 언급하는 경우, A, B 또는 C 중의 임의의 것, 또는 그의 조합은 단수로 또는 임의의 조합으로 생략되고 구별될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
명시적으로 달리 지시되지 않는 한, 모든 명시된 구현예, 특징, 및 용어는 인용된 구현예, 특징, 또는 용어 및 그의 생물학적 등가물 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다.
모든 수치 지정, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 적절한 경우 1.0 또는 0.1의 증분에 의해, 또는 대안적으로 +/- 15%, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5%, 또는 대안적으로 2%의 변동에 의해 변하는 근사치이고, 이러한 범위는 포함된다. 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 모든 수치 지정은 용어 "약"에 의해 선행되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급되지는 않지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적이고, 이러한 등가물은 당업계에 공지되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 기술의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 유기 화학, 약리학, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 예를 들어 문헌 「Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989)」; 「Current Protocols In Molecular Biology (F M Ausubel, 등, eds, (1987))」; 「Methods in the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc): PCR 2: A Practical Approach (M J MacPherson, B D Hames and G R Taylor eds (1995)), Harlow and Lane, eds (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R I Freshney, ed (1987)」을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "증가된", "감소된", "높은", "낮은" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 참조 조성물, 폴리펩티드, 단백질 등의 약 90%, 80%, 50%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어 0.1%의 변형을 지칭한다.
본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 설명하기 위해 사용되는 용어 "허용가능한", "유효한", 또는 "충분한"은 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것으로 의도된다.
또한, 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하나 이상의 연관된 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안으로 해석될 때 조합의 결여("또는")를 지칭하고 이를 포괄한다.
명백한 인용 없이 그리고 달리 의도되지 않는 한, 본 개시내용이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관한 것일 때, 이들의 등가물 또는 생물학적 등가물이 본 개시의 범위 내에 속하는 것으로 추론되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "이의 생물학적 등가물"은 참조 단백질, 항체, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭할 때 "이의 등가물"과 동의어인 것으로 의도되고, 원하는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소의 서열 동일성을 갖는 것을 의도한다. 본원에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 언급된 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 또한 이의 등가물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어 등가물은 참조 서열의 길이에 걸쳐 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성, 및 대안적으로, 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 98% 상동성 또는 동일성을 의도하고, 참조 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 실질적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드를 지칭할 때, 이의 등가물은 한 측면에서, 엄격한 조건 하에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 추가 측면에서 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체와 동일하거나 유사한 활성 또는 기능을 갖는 참조 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다.
단백질 또는 폴리펩티드의 등가물 (본원에서 참조로서 지칭됨)은 참조에 대해 적어도 50% (또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%) 동일성을 공유하고, 참조의 기능 및 제조가능성을 유지한다.
본원에서 사용되는 용어 "기능", "활성", 및 "효소 활성"은 상호교환가능하게 사용된다. 디스페린의 손실은 골격근에서 Ca2 +-의존성 막 복구를 손상시키는 것으로 나타났다[문헌 「Song 등, Proc Natl Acad Sci USA 98:4084-4088, 2001」 및 「Schnepp 등, J Virol 77:3495-3504, 2003」 참조]. 또한, 디스페린은 아넥신 A1 및 A2, AHNAK, 및 카베올린-3을 포함한, 막 복구에 관여하는 다른 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다[문헌 「Schnepp 등, J Virol 77:3495-3504, 2003」, 「Duan 등, J Virol 72:8568-8577, 1998」, 「Donsante 등, Gene Ther 8:1343-1346, 2001」, 및 「Monahan 등, Expert Opin Drug Saf 1:79-91, 2002」 참조]. 근섬유 재생 능력의 손실은 디스페린 결핍의 기여 결과로서 생각된다[문헌 「Song 등, Gene Ther 8:1299-1306, 2001」 참조]. 디스페린은 또한 소포 트래피킹 및 엔도시토시스 및 T 세관 형성과 연관되어 있다[문헌 「Eveson 등, The Journal of Biological Chemistry 285:28529-28539, 2010」, 「Klinge 등, FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 21:1768-1776, 2007」, 및 「Klinge 등, Muscle & Nerve 41:166-173, 2010」 참조]. 따라서, 디스페린의 활성의 예는 골격근에서 막 복구, 예를 들어 근섬유 재생 능력의 막 재밀봉, 예방 또는 복구, 소포 트래피킹, 엔도시토시스, 및 횡방향 (T-) 세관 형성을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 막 복구 검정, 소포 트래피킹 검정, 및 튜브 형성 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 시험관내에서 디스페린 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌 「Carmeille 등, Methods Mol Biol 1668:195-207, 2017」, 「Vassilieva and Nusrat, Methods Mol Biol 440:3-14, 2008」, 「Demonbreun 등, Am J Pathol 184(1):248-59, 2014」을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. 디스페린의 활성을 측정하기 위한 추가의 방법은, 예를 들어 문헌 「Grose 등, PLoS One 7:e39233, 2012」 및 「Sondergaard 등, Anns of Clin Trans Neurol 2:256-270, 2015」에서 발견된다.
폴리뉴클레오티드의 등가물(본원에서 참조로서 지칭됨)은 참조에 대해 적어도 50% (또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%)의 동일성을 공유하고, 참조에 의해 암호화된 것과 동일한 폴리펩티드를 암호화하거나, 참조에 의해 암호화된 폴리펩티드의 등가물을 암호화한다.
참조 서열의 아미노산/뉴클레오티드 잔기 또는 연속적인 세그먼트에 등가인 (또는 그에 상응하는) 시험 서열의 위치 또는 연속적인 세그먼트에 도달하기 위해, 서열 정렬(sequence alignment)이 시험 서열과 참조 서열 사이에서 수행된다. 서로에 대해 정렬된 위치 또는 세그먼트는 등가물로서 결정된다.
용어 "친화도 태그"는 친화성 태그에 결합할 수 있는, 즉 친화성 태그에 대해 친화성을 갖는 리간드를 사용하여 융합 단백질의 검출 및/또는 세포 환경으로부터 융합 단백질의 정제를 허용하기 위해 융합 단백질 내에 포함될 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 리간드는 항체, 수지, 또는 상보성 폴리펩티드일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 친화성 태그는 작은 펩티드, 통상적으로 대략 4 내지 16개의 아미노산 길이의 펩티드를 포함할 수 있거나, 더 큰 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 통상적으로 사용되는 친화성 태그는 특히 폴리아르기닌, FLAG, V5, 폴리히스티딘, c-Myc, Strep II, 말토스 결합 단백질(MBP), N-유틸화 물질 단백질 A(NusA), 티오레독신(Trx), 및 글루타티온 S-전이효소(GST)를 포함한다[예를 들어 문헌 「GST Gene Fusion System Handbook - Sigma-Aldrich」 참조]. 한 구현예에서, 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그, 예를 들어 His6 태그(서열번호 21)이다. 융합 단백질 내에 친화성 태그의 포함은 친화성 태그에 단단하고 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 매질을 사용하여 융합 단백질이 친화성 정제에 의해 세포 환경으로부터 정제되도록 한다. 친화성 매질은 예를 들어 금속-충전된 수지 또는 아가로스 또는 금속 비드와 같은 고정상 (매트릭스)에 공유 연결된 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어 폴리히스티딘 태그부착된 융합 단백질(또한 His 태그부착된 융합 단백질로서 지칭됨)은 Ni2 + 또는 Co2 + 로딩된 수지를 사용하여 고정된 금속 이온 크로마토그래피에 의해 회수될 수 있고, 항-FLAG 친화성 겔은 FLAG 태그부착된 융합 단백질을 포획하기 위해 사용될 수 있고, 아가로스와 같은 고체 지지체에 가교된 글루타티온은 GST 태그부착된 융합 단백질을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 한 측면에서, 친화성 태그는 정제 태그 또는 마커이다.
본원에서 사용되는 용어 "정제", "정제하는" 또는 "분리하는"은 복합 혼합물, 예를 들어 세포 용해물 또는 폴리펩티드의 혼합물로부터 1종 이상의 생체물질(예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 바이러스 벡터)을 단리하는 공정을 지칭한다. 정제, 분리 또는 단리는 완료될 필요는 없으며, 즉 복합 혼합물의 일부 성분은 정제 공정 후에 1종 이상의 생체물질(예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 바이러스 벡터)과 함께 남아있을 수 있다. 그러나, 정제의 생성물은 정제 전에 복합 혼합물에 비해 1종 이상의 생체물질 (예를 들어 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 바이러스 벡터)에 대해 농축되어야 하며, 복합 혼합물 내에 초기에 존재하는 다른 성분의 유의한 부분은 정제 공정에 의해 제거되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포"는 임의로 대상체 또는 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 수득된 원핵 또는 진핵 세포를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포 또는 포유동물 숙주 세포이다. 일부 경우에, 숙주 세포는 또한 본원에서 생산 세포 또는 패키징 세포로서 지칭된다. 일부 경우에, 세포주는 패키징 세포주이다.
"유핵 세포"는 모네라(monera)를 제외한 모든 생명체를 포함한다. 이들은 막-결합된 핵을 통해 쉽게 구별될 수 있다. 동물, 식물, 진균 및 원생생물은 세포가 내부 막 및 세포골격에 의해 복합 구조로 조직화되는 진핵생물 또는 유기체이다. 가장 특징적인 막-결합된 구조는 핵이다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "숙주"는 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 숙주를 포함한다. 진핵 세포 또는 숙주의 비제한적 예는 유인원, 소, 돼지, 뮤린, 래트, 조류, 파충류 및 인간, 예를 들어 HEK293 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, 293T 세포, HeLa 세포, 바비 햄스터 신장(BHK) 세포, Sf9 세포, 줄기 세포, 위성 세포 및 근육 세포를 포함한다. 근육 세포의 예는 골격근 세포, 심근 세포 및 평활근 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로 핵 또는 임의의 다른 막-결합된 소기관이 결여되고 2개의 도메인, 박테리아 및 고세균으로 분할되는 "유핵 세포". 염색체 DNA에 더하여, 이들 세포는 또한 에피솜으로 불리는 원형 루프에 유전 정보를 함유할 수 있다. 박테리아 세포는 매우 작고, 대략 동물 미토콘드리아의 크기 (약 1 내지 2 ㎛의 직경 및 10 ㎛의 길이)이다. 유핵 세포는 3개의 주요 형상: 막대 형상, 구형 및 나선형을 특징으로 한다. 진핵생물과 같은 정교한 복제 과정을 거치는 대신에, 박테리아 세포는 이원 핵분열에 의해 분열된다. 예로는 바실러스 박테리아(Bacillus　bacteria), 대장균 박테리아(E. coli 　bacterium) 및 살모넬라 박테리아(Salmonella　bacterium)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
핵산 서열에 적용되는 바와 같은 용어 "암호화(encode)"는, 천연 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 조작되는 경우에 폴리펩티드를 "암호화"하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 생성할 수 있다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보체이며, 암호화 서열은 그로부터 추론될 수 있다.
용어 "동등한" 또는 "생물학적 등가물"은 특정 분자, 생물학적 또는 세포 물질을 지칭하는 경우에 상호교환가능하게 사용되며, 원하는 구조 또는 기능성(예를 들어 유사한 기능 또는 활성을 가짐)을 여전히 유지하면서 최소의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 참조 폴리펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 등가물 또는 생물학적 등가물을 지칭하는 경우에 등가물 또는 생물학적 등가물이 참조 폴리펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 및 등가물 또는 실질적으로 등가인 생물학적 활성에 대해 언급된 구조적 관계를 갖는다는 것이 명백히 언급되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 등가 폴리펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 참조 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 길이에 걸쳐 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 서열에 대해 또는 그와 적어도 60%, 또는 대안적으로 적어도 65%, 또는 대안적으로 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 대안적으로, 등가 폴리펩티드는 이러한 참조 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 높은 엄격도의 조건 하에 혼성화되고 실질적으로 등가이거나 등가인 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체에 의해 암호화되는 것이다. 높은 엄격도의 조건이 본원에 기재되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 그의 등가물은 참조 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 야생형 폴리뉴클레오티드에 대해 참조 폴리뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다. 이러한 등가 폴리펩티드는 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 갖는다.
등가 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 또는 대안적으로 적어도 65%, 또는 대안적으로 적어도 70%, 또는 대안적으로 적어도 75%, 또는 대안적으로 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 97% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 등가물은 또한 참조 폴리뉴클레오티드에 대해 높은 엄격도의 조건 하에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 의도한다. 이러한 등가 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드와 동일한 생물학적 활성을 갖는다.
또 다른 서열에 대한 "서열 동일성"의 특정 백분율(예를 들어 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 정렬될 때, 참조 폴리뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 2개의 서열을 비교할 때 염기 (또는 아미노산)의 백분율이 동일하다는 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1」에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 비제한적인 예시적인 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 예시적인 프로그램은 하기 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP를 포함한다: 유전자 코드=표준; 필터=none; 가닥=nboth; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명= 50개의 서열; 분류=높은 점수; 데이터베이스=비-중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR. 이들 프로그램의 세부사항은 하기 인터넷 주소: ncbimnihgov/cgi-bin/BLAST에서 찾을 수 있다. 서열 동일성 및 퍼센트 동일성은 이들을 clustalW(웹 주소:genomejp/tools/clustalw/, 2017년 1월 13일에 마지막으로 액세스됨) 또는 Clustal Omega(ebiacuk/Tools/msa/clustalo/에서 입수가능함) 내로 혼입시킴으로써 결정될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이의 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 서열에 의해 공유되는 매칭 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. "비관련" 또는 "비-상동성" 서열은 본 개시의 서열 중의 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본원에서 사용되는 용어 "적어도 90% 동일한"은 약 90% 내지 약 100%의 2개의 비교된 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드)의 동일성을 지칭한다. 이는 또한 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 약 91% 내지 약 100%, 약 92% 내지 약 100%, 약 93% 내지 약 100%, 약 94% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 96% 내지 약 100%, 약 97% 내지 약 100%, 약 98% 내지 약 100%, 또는 약 99% 내지 약 100%의 동일성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "함유한다", "유사하다" 및 "유사한"은 폴리뉴클레오티드, 단백질 및/또는 펩티드의 기능, 활성 또는 기능적 활성을 설명하면서 상호교환적으로 사용되며, 참조 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드의 활성의 적어도 약 20%(적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 약 100%를 포함하나 이에 제한되지 않음)의 기능적 활성에 관한 것이다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 Watson-Crick 염기 짝짓기(base pairing), Hoogstein 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조(duplex structure)를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임(ribozyme)에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은 보다 광범위한 공정에서의 단계를 구성할 수 있다.
엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions)의 예는 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6×SSC 내지 약 10×SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4×SSC 내지 약 8×SSC의 세척 용액을 포함한다. 적당한 혼성화 조건(moderate hybridization conditions)의 예는 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9×SSC 내지 약 2×SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5×SSC 내지 약 2×SSC의 세척 용액을 포함한다. 매우 엄격한 혼성화 조건(high stringency conditions)의 예는 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1×SSC 내지 약 0.1×SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1×SSC, 0.1×SSC의 세척 용액, 또는 탈이온수를 포함한다. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 1회, 2회 또는 그 초과의 세척 단계로 5분 내지 24시간이고, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충액이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 등가물이 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 한 측면에서, 동등한 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건 하에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체에 혼성화하는 것이다. 또 다른 측면에서, 동등한 폴리펩티드는 엄격한 조건 하에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성"은 임의의 분자, 생물학적, 또는 세포성 물질을 특정의 특정 효과를 달성하는 것을 의도하도록 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다. 따라서 상기 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, 상보성 DNA(cDNA), DNA-RNA 혼성, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 메신저 RNA(mRNA), 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA, 및/또는 작은 헤어핀(small hairpin) RNA를 포함하고/하거나 암호화한다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이거나 이를 암호화한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥(ds) DNA, 예를 들어 단일-가닥 RNA로부터 합성된 조작된 ds DNA 또는 ds cDNA이다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 그의 가장 넓은 의미에서 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체(peptidomimetics)의 2개 이상의 서브유닛의 화합물을 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 측면에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 어떠한 제한도 두지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용되는 연속 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산을 갖는 서열을 지칭한다. 그러나, 제 1 부분 및 제 2 부분의 연속 아미노산 서열은 제 1 부분이 제 2 부분에 직접적으로 접합된 것을 갖도록 아미노산 서열을 제한하지 않는다는 것에 주목한다. 제 1 부분이 제 3 부분, 예를 들어 연결(link)을 통해 제 2 부분에 연결되어, 이에 따라 1개의 연속 아미노산 서열을 형성하는 것이 또한 가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "접합체", "접합된", "접합하는", 및 "접합"은 분자 사이의, 특히 2개의 아미노산 서열 및/또는 2개의 폴리펩티드 사이의 결합의 형성을 지칭한다. 접합은 직접적(즉, 결합) 또는 간접적(즉, 추가의 분자를 통해)일 수 있다. 접합은 공유적 또는 비-공유적일 수 있다.
본원에 사용되는 연속 아미노산 서열은 서로 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어 링커(linker)를 통해) 접합된 2개 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 발현 시스템"은 재조합에 의해 형성된 특정 유전 물질의 발현을 위한 유전자 구조체(genetic construct)(들)를 지칭한다.
"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 분자로서 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포솜, 천연 중합체 및 합성 중합체를 비롯한 생체적합성 중합체인 미셀; 지질단백질; 지질 나노입자; 폴리펩티드; 다당류; 리포폴리사카라이드; 인공 바이러스 외피; 금속 입자; 및 박테리아, 또는 바이러스, 예를 들어 광견병 바이러스, 플라비바이러스, 렌티바이러스, 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현에 대해 기재된 당업계에서 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클이며, 유전자 요법 뿐만 아니라 단순 단백질 발현에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 본원에 사용되는 "유전자 전달(gene delivery)", "유전자 전이(gene transfer)", "mRNA-기반 전달", "형질도입(transducing)" 등은 도입에 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포 내로의 외인성 폴리뉴클레오티드 (때때로 "전이유전자"로 지칭됨)의 도입을 지칭하는 용어이다. 이러한 방법은 다양하게 널리 공지된 기술, 예를 들어 벡터-매개 유전자 전달 (예를 들어 바이러스 감염/형질주입(transfection), 또는 예를 들어 프로타민 복합체, 지질 나노입자, 중합체 나노입자, 지질-중합체 혼성 나노입자, 및 무기 나노입자, 또는 그의 조합을 비롯한 다양한 다른 단백질-기반 또는 지질-기반 유전자 전달 복합체에 의한 것) 뿐만 아니라 "네이키드(naked)" 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 하는 기술 (예를 들어 전기천공, "유전자 총" 전달 및 폴리뉴클레오티드의 도입에 사용되는 다양한 다른 기술)을 포함한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않을 수 있거나 또는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고; 예를 들어 변형된 mRNA는 ARCA 캡핑; 100-250 아데노신 잔기(서열번호 22)의 테일(tail)을 부가하기 위한 효소적 폴리아데닐화; 및 시티딘 중의 하나 또는 둘 다의 5-메틸시티딘 및/또는 우리딘의 슈도우리딘(pseudouridine)으로의 치환을 포함할 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정한 유지는 전형적으로 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포와 상용성인 복제기점을 함유하거나 또는 숙주 세포의 레플리콘, 예를 들어 염색체외 레플리콘(extrachromosomal replicon) (예를 들어 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체 내로 통합되는 것을 필요로 한다. 다수의 벡터는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같이 포유동물 세포로의 유전자의 전달을 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
"플라스미드"는 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자이다. 많은 경우에, 이는 원형 및 이중-가닥이다. 플라스미드는 미생물의 집단 내에서의 수평 유전자 전달을 위한 메카니즘을 제공하고, 전형적으로 주어진 환경 상태 하에 선택적 이점을 제공한다. 플라스미드는 경쟁적 환경 니치(competitive environmental niche)에서 자연 발생 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자를 운반할 수 있거나, 또는 대안적으로 생성된 단백질은 유사한 환경 하에 독소로서 작용할 수 있다.
유전자 조작에 사용되는 "플라스미드"는 "플라스미드 벡터"로 지칭된다. 많은 플라스미드가 이러한 용도를 위해 상업적으로 이용가능하다. 복제될 유전자는 특정 항생제 및 다중 클로닝 부위(MCS, 또는 폴리링커)에 내성인 세포를 만드는 유전자를 함유하는 플라스미드의 카피 내로 삽입되며, 이는 이러한 위치에서 DNA 단편의 용이한 삽입을 가능하게 하는 몇몇 통상적으로 사용되는 제한 부위를 함유하는 짧은 영역이다. 플라스미드의 또 다른 주요 용도는 다량의 단백질을 만드는 것이다. 이러한 경우에, 연구자들은 관심 유전자를 보유하는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 성장시킨다. 박테리아가 그의 항생제 내성을 부여하는 단백질을 생산하는 것과 마찬가지로, 삽입된 유전자로부터 다량의 단백질을 생산하도록 유도될 수도 있다.
"효모 인공 염색체(yeast artificial chromosome)" 또는 "YAC"는 큰 DNA 단편(100 kb 초과 및 3000 kb 이하)을 클로닝하기 위해 사용되는 벡터를 지칭한다. 이는 인공적으로 구축된 염색체이며, 효모 세포에서 복제 및 보존을 위해 필요한 텔로머(telomeric), 센트로메릭(centromeric), 및 복제 기원 서열을 함유한다. 초기 원형 플라스미드를 사용하는 빌딩은 제한 효소를 사용함으로써 선형화되고, 이어서 DNA 리가제(ligase)는 응집성 말단의 사용에 의해 선형 분자 내에 관심 서열 또는 유전자를 부가할 수 있다. 효모 발현 벡터, 예를 들어 YACs, YIps(효모 통합 플라스미드), 및 YEps(효모 에피솜 플라스미드)는 효모가 그 자체로 진핵 세포이기 때문에 번역후 변형을 갖는 진핵 단백질 생성물을 얻을 수 있으므로 매우 유용하지만, YAC는 BAC보다 더 불안정한 것으로 밝혀져서, 키메라 효과를 생성한다.
본원에서 사용되는 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 입자의 단백질성 쉘 또는 코트를 지칭한다. 캡시드는 바이러스 게놈을 숙주 세포 내로 캡시드화, 보호, 수송, 및 방출하는 기능을 한다. 캡시드는 일반적으로 단백질의 올리고머 구조 서브유닛("캡시드 단백질")으로 구성된다. 본원에서 사용되는 용어 "캡시드화된"은 바이러스 캡시드 내에 봉입된 것을 의미한다.
본원에서 바이러스 또는 플라스미드와 관련하여 사용되는 용어 "헬퍼(helper)"는 바이러스 입자 또는 재조합 바이러스 입자, 예를 들어 본원에 개시된 변형된 AAV의 복제 및 패키징을 위해 필요한 추가의 성분을 제공하기 위해 사용되는 바이러스 또는 플라스미드를 지칭한다. 헬퍼 바이러스에 의해 암호화되는 성분은 비리온 어셈블리(virion assembly), 캡시드화, 게놈 복제, 및/또는 패키징을 위해 요구되는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어 헬퍼 바이러스는 바이러스 게놈의 복제를 위해 필요한 효소를 암호화할 수 있다. AAV 구조체와 함께 사용하기에 적합한 헬퍼 바이러스 및 플라스미드의 비제한적 예는 pHELP(플라스미드), 아데노바이러스(바이러스), 또는 헤르페스바이러스(바이러스)를 포함한다.
본원에 사용되는 생물학적 샘플, 또는 샘플은 대상체, 세포주 또는 배양된 세포 또는 조직으로부터 수득될 수 있다. 예시적인 샘플은 세포 샘플, 조직 샘플, 액체 샘플, 예를 들어 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플(안액(ocular fluids)(수성 및 유리액(vitreous humor)), 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액(cerebrospinal fluid; CSF), 객담(sputum), 타액, 골수, 활액, 수성 액, 양수, 뇌척수, 모유, 기관지 폐포 세척액(broncheoalveolar lavage fluid), 정액, 전립선 유체, 소의 유체(cowper's fluid) 또는 쿠퍼액(pre-ejaculatory fluid), 여성 사정액, 땀, 눈물, 낭종 유체, 흉막 및 복막 유체, 심막 유체, 복수, 림프, 라임, 킬(chyle), 담즙, 간질액, 월경, 고름, 피지, 구토, 질 분비물/홍조, 활액, 점막 분비물, 대변 물, 췌장 주스, 부비동 공동으로부터의 세척액, 기관지폐 흡인물, 블라스토실 공동 유체, 또는 제대혈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "검출가능한 마커"는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 적어도 1종의 마커를 지칭한다. 이러한 마커의 비-포괄적 목록은 예를 들어 비색측정, 형광, 발광, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스6 포스페이트 탈수소효소, 발색단, 예를 들어 형광, 발광 염료, 전자 현미경에 의해 또는 그의 전기적 특성, 예를 들어 전도도, 전류측정, 전압전류측정, 임피던스에 의해 검출가능한 신호를 생성하는 효소를 포함하며, 예를 들어 그의 분자가 그의 물리적 및/또는 화학적 특성에서 검출가능한 변형을 유도하기에 충분한 크기를 갖는 검출가능한 기는 광학 방법, 예를 들어 회절, 표면 플라즈몬 공명, 표면 변동, 접촉각 변화 또는 물리적 방법, 예를 들어 원자력 분광법, 터널 효과, 또는 방사성 분자, 예를 들어 32P, 35S, 89Zr 또는 125I에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "정제 마커"는 정제 또는 확인에 유용한 적어도 1종의 마커를 지칭한다. 이러한 마커의 비-포괄적 목록은 His, lacZ, GST, 말토스-결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, 체리, 티오레독신, 폴리(NANP), V5, Snap, HA, 키틴-결합 단백질, Softag 1, Softag 3, Strep, 또는 S-단백질을 포함한다. 적합한 직접 또는 간접 형광 마커는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, 체리, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 디곡시제닌(Digoxigenin), 타마(Tamra), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민(rhodamine), 알렉사 플루오르(Alexa fluors), FITC, TRITC 또는 임의의 다른 형광 염료 또는 합텐(hapten)을 포함한다.
본원에 사용된 에피토프 태그는 항체에 의해 인식되는 항원으로서 작용하는 생물학적 구조 또는 서열, 예를 들어 단백질 또는 탄수화물이다. 특정 구현예에서, 에피토프 태그는 정제 마커 및/또는 친화성 태그와 상호교환가능하게 사용된다.
"조성물"은 2종 이상의 화합물의 조합물, 예를 들어 활성 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 벡터 또는 항체 및 또 다른 화합물 또는 조성물, 불활성(예를 들어 검출가능한 표지) 또는 활성(예를 들어 유전자 전달 비히클)의 조합물을 의미하는 것으로 의도된다.
"약학 조성물"은 활성 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와 담체, 불활성 또는 활성, 예를 들어 고체 지지체의 조합물을 포함하는 것으로 의도되며, 이는 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도에 적합하게 만든다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 표준 약학적 담체 중의 임의의 것, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예를 들어 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포괄한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예는 문헌 「Martin (1975) Remington's Pharm Sci, 15th Ed (Mack Publ Co, Easton)」을 참조한다.
"대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유동물은 비-인간 영장류, 뮤린, 래트, 토끼, 원숭이, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 말, 및 영장류, 특히 인간을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 치료에 유용한 것 이외에도, 본 발명은 또한 포유동물, 설치류 등을 비롯한 반려 포유동물, 외래 동물 및 가축의 수의학적 치료에 유용하다. 한 구현예에서, 포유동물은 말, 개 및 고양이를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 인간은 18세 연령 미만의 청소년 또는 유아이다.
질환의 "치료함" 또는 "치료"는, (1) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 증상을 경험하거나 나타내지 않는 환자에서 질환을 예방하는 것, 즉 질환의 임상적 증상이 발생하지 않도록 하는 것; (2) 질환을 억제하는 것, 즉 질환 또는 그의 임상적 증상의 발생을 저지 또는 감소시키는 것; 또는 (3) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환 또는 그의 임상적 증상의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 용어 "치료"는 예방(prevention) 또는 예방(prophylaxis)을 배제한다.
용어 "치료"와 관련하여 용어 "앓는(suffering)"은 질환에 걸렸거나 걸리기 쉬운 것으로 진단된 환자 또는 개체를 지칭한다.
"유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량(dosage)으로 투여될 수 있다. 이러한 전달은 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 치료제의 생체이용률, 투여 경로 등을 비롯한 다수의 변수에 따라 달라진다. 그러나, 임의의 특정 대상체에 대한 본 발명의 치료제의 특정 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 장애의 중증도 및 투여 형태를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다는 것으로 이해되어야 한다. 치료 투여량은 일반적으로 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다. 한 측면에서, 유효량은 치료 유효량이다. 전형적으로, 시험관내 및/또는 생체내 시험으로부터의 용량-효과 관계는 초기에 환자 투여를 위한 적절한 투여량에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있다. 일반적으로, 시험관내에서 효과적인 것으로 밝혀진 농도와 상응하는 혈청 수준을 달성하기에 효과적인 화합물의 양을 투여하고자 할 것이다. 이들 파라미터의 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술 내에 속한다. 이들 고려사항, 뿐만 아니라 효과적인 제제 및 투여 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 표준 교재에 기재되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 이러한 정의와 일치하게, 용어 "치료 유효량"은 RNA 바이러스 복제를 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 억제하기에 충분한 양이다.
용어 투여는 비제한적으로 경구, 비경구(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의한 투여를 포함할 것이고, 단독으로 또는 함께, 각각의 투여 경로에 적절한 통상적인 무-독성(non-toxic) 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트(adjuvants), 부형제, 및 비히클을 함유하는 적합한 투여량 단위 제제(dosage unit formulations)로 제제화될 수 있다. 본 발명은 투여 경로, 제제 또는 투여 스케줄에 의해 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 표준 약어이다. 아데노-연관 바이러스는 특정 기능이 보조인자 바이러스를 공동-감염시킴으로써 제공되는 세포에서만 성장하는 단일-가닥 DNA 파보바이러스이다. 현재, 특성화된 AAV의 13종의 혈청형이 존재한다. AAV의 일반적 정보 및 검토는 예를 들어 문헌 「Carter, Handbook of Parvoviruses 1:169-228, 1989」 및 「Berns, Virology 1743-1764, 1999」에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 이들 동일한 원리는 다양한 혈청형이 구조적으로 및 기능적으로도 유전자 수준에서 매우 밀접하게 관련되어 있다는 것이 널리 공지되어 있기 때문에 추가의 AAV 혈청형에 적용가능할 것으로 완전히 예상된다. 예를 들어 문헌 「Blacklowe, Parvoviruses and Human Disease 165-174, 1988, J R Pattison, ed」; 및 「Rose, Comprehensive Virology 3:1-61, 1974」을 참조한다. 예를 들어 모든 AAV 혈청형은 명백하게 상동성 rep 유전자에 의해 매개되는 매우 유사한 복제 특성을 나타내며; 모두 AAV2에서 발현되는 것과 같은 3개의 관련된 캡시드 단백질을 갖는다. 관련성의 정도는 게놈의 길이를 따라 혈청형 사이의 광범위한 교차-혼성화를 나타내는 헤테로듀플렉스 분석; 및 "역전된 말단 반복 서열"(ITR)에 상응하는 말단에서 유사한 자기-어닐링 세그먼트의 존재에 의해 추가로 제안된다. 유사한 감염성 패턴은 또한 각각의 혈청형에서 복제 기능이 유사한 조절 제어 하에 있음을 시사한다.
본원에 사용되는 용어 "AAV 발현 카세트"는 AAV 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(또는 전이유전자)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 AAV 발현 카세트는 rep 및 cap 유전자 생성물을 암호화하고 발현하는 벡터로 형질주입된(transfected) 숙주 세포에 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자(예를 들어 AAV 벡터) 내로 패키징될 수 있다.
"AAV 비리온" 또는 "AAV 벡터" 또는 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 벡터 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드 AAV 발현 카세트로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포에 전달될 전이유전자와 같은 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우에, 이는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 간단히 "AAV 벡터"로 지칭된다. 따라서, AAV 벡터 입자의 생산은 반드시 AAV 발현 카세트의 생산을 포함하며, 이는 이러한 플라스미드가 AAV 벡터 입자 내에 함유되기 때문이다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 복제-결함 파보바이러스이며, 이의 단일-가닥 DNA 게놈은 145 뉴클레오티드 역전된 말단 반복부(ITR)를 포함하여 약 4.7 kb 길이이다. AAV의 다중 혈청형이 존재한다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 예를 들어 AAV 혈청형 2 (AAV2) 게놈의 뉴클레오티드 서열은 문헌 「Ruffing 등, J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994)」에 의해 보정된 바와 같이 문헌 「Srivastava 등, J Virol, 45:555-564 (1983)」에 제시되어 있다. 다른 예로서, AAV-1의 완전한 게놈은 진뱅크(GenBank) 수탁번호 NC_002077에 제공되고; AAV-3의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁번호 NC_1829에 제공되며; AAV-4의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁번호 NC_001829에 제공되고; AAV-5의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁번호 AF085716에 제공되며; AAV-6의 완전한 게놈은 진뱅크 수탁번호 NC_001862에 제공되고; AAV-7 및 AAV-8 게놈의 적어도 일부는 각각 진뱅크 수탁번호 AX753246 및 AX753249에 제공되며(또한 AAV-8에 관한 미국특허 제7,282,199호 및 제7,790,449호 참조); AAV-9 게놈은 문헌 「Gao 등, J Virol, 78:6381-6388 (2004)」에 제공되고; AAV-10 게놈은 문헌 「Mol Ther, 13(1):67-76 (2006)」에 제공되며; AAV-11 게놈은 문헌 「Virology, 330(2):375-383 (2004)」에 제공된다. AAVrh74 혈청형의 클로닝은 문헌 「Rodino-Klapac, 등, Journal of translational medicine 5, 45 (2007)」에 기재되어 있다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스-작용 서열이 ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터(그의 상대적인 지도 위치에 대해 p5, p19, 및 p40로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 구동한다. 단일 AAV 인트론의 차별적 스플라이싱(예를 들어 AAV2 뉴클레오티드 2107 및 2227에서)과 커플링된 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52, 및 rep 40)의 생산을 초래한다. Rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈을 복제하는 것을 담당하는 다중 효소 특성을 보유한다. 캡 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이는 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 암호화한다. 대안적 스플라이싱 및 비-컨센서스 번역 개시 부위는 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성을 담당한다. 단일 컨센서스 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 지도 위치 95에 위치한다. AAV의 생활 주기 및 유전학은 문헌 「Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)」에서 검토된다.
본 개시의 재조합 AAV 게놈은 본 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자 측면에 위치하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. rAAV 게놈 내의 AAV DNA는 AAV 혈청형 AAVrh74, AAVrh10, AAVrh20, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13을 포함하나 이에 제한되지 않는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 슈도타입(pseudotyped) rAAV의 생산은 예를 들어 국제공개공보 제WO 2001/83692호에 개시되어 있다. 다른 유형의 rAAV 변이체, 예를 들어 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV가 또한 고려된다. 예를 들어 문헌 「Marsic 등, Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)」을 참조한다. 상기 배경기술에서 언급한 바와 같이, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 골격근 특이적 발현을 촉진하기 위해, AAV1, AAV6, AAV8 또는 AAVrh74가 사용된다.
본원 명세서 및 청구범위에 사용되는 단수 형태 "하나(a, an)" 및 "상기(the)"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는한 복수의 것을 지칭한다. 예를 들어 용어 "세포"는 그의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는" 또는 "구비한다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우에 "본질적으로 구성된"은 언급된 목적을 위한 조합에 대한 임의의 본질적인 중요성의 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성되는 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량 오염물 및 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 포스페이트 완충 염수, 보존제 등을 배제하지 않는다. "단리하는"은 조성물을 생산하거나 의도된 결과를 달성하기 위해 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량보다 많은 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 이들 전이 용어에 의해 정의된 구현예는 본 발명의 범주 내에 있다.
핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단리된"은 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 각각 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된 핵산"은 단편으로서 자연 발생하지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 단백질로부터 단리되고 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드를 둘 다 포괄하는 폴리펩티드, 단백질 및/또는 숙주 세포를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 다른 구현예에서, 용어 "단리된"은 구성성분, 세포 및 달리 자연에서 통상적으로 연관된 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)으로부터 분리된 것을 의미한다. 예를 들어 단리된 세포는 비유사 표현형(dissimilar phenotype) 또는 유전자형(genotype)의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)은 그의 자연 발생 대응물과 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "재조합"은 재조합의 실험실 방법, 예를 들어 분자 클로닝에 의해 형성된 분자를 지칭한다. 분자 클로닝 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 폴리뉴클레오티드의 PCR 증폭, 폴리뉴클레오티드의 효소적 소화, 발현 카세트(예를 들어 포유동물 발현 카세트) 내로의 폴리뉴클레오티드의 결찰(ligation), 폴리뉴클레오티드를 사용한 세포의 형질전환(transformation), 형질주입(transfection) 또는 형질도입(transduction), 및 폴리펩티드를 생산하기 위한 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 문헌 「Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2012」을 참조한다. 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어 재조합 폴리뉴클레오티드는 인간 디스페린 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함할 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 단백질-암호화 폴리뉴클레오티드의 단편의 PCR 증폭에 의해 생산될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 1종 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산될 수 있다.
인간 디스페린(hDSYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 인간 디스페린(hDSYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물이 본원에 추가로 개시된다. 이러한 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물의 제조 및 사용 방법이 또한 본원에 개시된다.
본원에서는 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 개시되고, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은, (a) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (c) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (d) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (e) hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (f) 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성된다.
추가로 본원에서는 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열이 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은, (a) 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열번호 2, 8, 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8, 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (c) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (d) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열; (e) hDYSF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (f) 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성된다.
추가로 본원에서는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 개시된다. 일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR); (b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성된다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는,
(a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR);
(b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는, (i) 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및
(c) 제 2 ITR;
을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 ITR 및 상기 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 ITR 중의 임의의 ITR을 포함함; (b) 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR은 본원에 개시된 ITR 중의 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (c)의 제 1 ITR 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 ITR 중의 임의의 ITR을 포함함; (b) 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR은 본원에 개시된 ITR 중의 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 (a) 및 (c)의 제 1 ITR 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함; (b) 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (c)의 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함; (b) 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (c)의 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다.
본원에서는 추가로, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 개시된다. 일부 구현예에서, 이중 AAV 벡터 시스템은, (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함함; 및 (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함함;을 포함한다.
본원에서는 추가로, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 개시된다. 일부 구현예에서, 이중 AAV 벡터 시스템은, (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF AAV 벡터를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성됨; 및 (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF AAV 벡터를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성됨;을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성된다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터(예를 들어 바이러스 또는 바이러스 입자), 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은, 역전된 말단 반복부(ITR), 프로모터, 인트론, 선택 마커, 또는 복제기점(ORI)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은, 역전된 말단 반복부(ITR), 선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(UTR), 또는 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하는 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증을 치료하는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증을 치료하는 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물 중의 임의의 것을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서는 추가로, 디스페리노병증의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물 중의 임의의 것의 용도가 개시된다.
상동 재조합 및 hDYSF 단편
AAV-매개 유전자 요법은 다수의 질환에 대한 바람직한 치료 전략을 제시하지만, 이는 AAV 비리온의 제한적인 4.7 kb 패키징 한계에 의해 방해받는다. 현재 치유되지 않거나 효과적인 요법, 예를 들어 디스페리노병증을 갖지 않는 질환이 특히 관심의 대상이다. 2개의 부분적 게놈의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 전체 길이의 디스페린 유전자를 제조 또는 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 한 예에서, 2개의 부분적으로 패키징된 게놈은 pAAV.MHCK7.DYSF5'.PTG 및 pAAV.DYSF3'.POLYA로서 도 1에 제시된다. 2개의 게놈이 AAV 벡터 내로 패키징됨으로써 바이러스 전달을 통해든지 또는 비-바이러스 방법 (예를 들어 LNP)을 통해든지 간에, 세포 (예를 들어 근세포)에 전달되면, 이들은 전체-길이 디스페린 암호화 영역을 포함하는 전사체(transcript)를 생성하여, 기능적 디스페린 단백질의 발현을 유도한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 중첩 영역은 전체-길이 디스페린 유전자를 함유하는 전사체를 유도하는 상동 재조합을 용이하게 한다. 전체-길이 디스페린 유전자를 2개의 부분적으로 패키징된 게놈으로 분리함으로써, 상기 방법은 AAV 패키징 제한을 성공적으로 우회하고 기능적 전체-길이 디스페린 유전자를 생산한다. 한 구현예에서, 전사체는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 발현 카세트이다. 한 구현예에서, 전사체는 서열번호 20의 서열을 포함하는 발현 카세트이다.
일부 구현예에서, 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시되며, 여기서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 상기 방법은 세포를 hDYSF 단백질의 5' 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 hDYSF 단백질의 3' 단편을 암호화하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 세포를 본원에 기재된 이중 AAV 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 진핵 세포, 임의로 근육 세포, 심장 세포, 및/또는 간 세포이다. 일부 경우에, 상기 방법은 hDYSF 단백질의 5' 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 hDYSF 단백질의 3' 단편을 암호화하는 제 2 재조합 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 이중 AAV 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 서열번호 20 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 대상체의 근이영양증을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상체는 임의로 LGMD2B 또는 미요시 근병증으로부터 선택된 디스페리노병증을 갖는다.
또한, 위에서 기술한 바와 같은 상동 재조합에 의해 전체-길이 디스페린 유전자의 생산을 유도할 수 있는, 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 각각 암호화하는 2개의 재조합 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 5' 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, hDYSF 단백질의 5' 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드로 지칭된다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 3' 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, hDYSF 단백질의 3' 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 3' hDSYF 폴리뉴클레오티드로 지칭된다.
5' hDYSF 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3330-3365, 3330-3360, 3330-3355, 3335-3365, 3335-3350, 3340-3365, 3340-3360, 또는 3340-3355개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드(consecutive nucleotides)를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지는 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3330-3365, 3330-3360, 3330-3355, 3335-3365, 3335-3350, 3340-3365, 3340-3360, 또는 3340-3355개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3330-3365, 3330-3360, 3330-3355, 3335-3365, 3335-3350, 3340-3365, 3340-3360, 또는 3340-3355개 사이의 연속 뉴클레오티드 미스매치(mismatches)를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드 미스매치를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 15개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 10개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 5개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 100-4000, 100-3900, 100-3800, 100-3750, 100-3716, 150-4000, 150-3900, 150-3800, 150-3750, 150-3716, 200-4000, 200-3900, 200-3800, 200-3750, 200-3716, 250-4000, 250-3900, 250-3800, 250-3750, 250-3716, 300-4000, 300-3900, 300-3800, 300-3750, 300-3716, 350-4000, 350-3900, 350-3800, 350-3750, 350-3716, 370-4000, 370-3900, 370-3800, 370-3750, 370-3716, 377-4000, 377-3900, 377-3800, 377-3750, 또는 377-3716개 사이의 영역에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 377-3716 사이의 영역에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3330-3365, 3330-3360, 3330-3355, 3335-3365, 3335-3350, 3340-3365, 3340-3360, 또는 3340-3355개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 여기서 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 여기서 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 상기 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 상기 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 상기 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 상기 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 5개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 2개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 1개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500을 포함하는 영역을 포함하고, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 3400-3716, 3400-3700, 3400-3650, 3400-3600, 3400-3550, 3400-3500, 3390-3716, 3390-3700, 3390-3650, 3390-3600, 3390-3550, 3390-3500, 3380-3716, 3380-3700, 3380-3650, 3380-3500, 3371-3716, 3371-3700, 3371-3650, 3371-3600, 3371-3550, 또는 3371-3500를 포함하는 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열변호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3330-3365, 3330-3360, 3330-3355, 3335-3365, 3335-3350, 3340-3365, 3340-3360, 또는 3340-3355개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 1-100, 1-200, 1-300, 1-350, 1-375, 1-376, 100-200, 100-300, 100-350, 100-375, 100-376, 200-300, 200-350, 200-375, 또는 200-376을 포함하는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 1-376의 뉴클레오티드 위치를 포함하는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3360, 3359, 3358, 3357, 3356, 3355, 3354, 3353, 3352, 3351, 3350, 3349, 3348, 3347, 3346, 3345, 3344, 3343, 3342, 3341, 또는 3340개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 1-100, 1-200, 1-300, 1-350, 1-375, 100-200, 100-300, 100-350, 100-375, 200-300, 200-350, 200-375로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 1-376으로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 야생형 hDSYF 단백질의 N-말단 영역을 포함하는 hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 야생형 hDSYF 단백질의 N-말단 영역을 포함하는 hDYSF 단백질의 단편은 N-말단 hDYSF 단백질로서 지칭된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 1-1113, 200-1113, 400-1113, 500-1113, 600-1113, 650-113, 650-1100, 700-1100, 700-1113, 700-1050, 700-1000, 800-1113, 800-1100, 800-1050, 900-1113, 900-1100, 1000-1113, 또는 1000-1100개를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 1-1113, 200-1113, 400-1113, 500-1113, 600-1113, 650-113, 650-1100, 700-1100, 700-1113, 700-1050, 700-1000, 800-1113, 800-1100, 800-1050, 900-1113, 900-1100, 1000-1113, 또는 1000-1100개를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 아미노산 잔기 999-1113, 999-1100, 1000-1113, 또는 1000-1100개를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 적어도 1000개의 아미노산 길이이고, 여기서 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 999-1113, 999-1100, 1000-1113, 또는 1000-1100개를 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 적어도 1000개의 아미노산 길이이고, 여기서 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 999-1113, 999-1100, 1000-1113, 또는 1000-1100개를 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 N-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 97% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
3' hDYSF 폴리뉴클레오티드
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 3500-4100, 3500-4000, 3500-3900, 3500-3880, 3500-3870, 3600-4100, 3600-4000, 3600-3900, 3600-3880, 3600-3870, 3700-4100, 3700-4000, 3700-3900, 3700-3880, 3700-3870, 3800-4100, 3800-4000, 또는 3800-3900개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 4100, 4000, 3900, 3880, 또는 3870개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 3500-4100, 3500-4000, 3500-3900, 3500-3880, 3500-3870, 3600-4100, 3600-4000, 3600-3900, 3600-3880, 3600-3870, 3700-4100, 3700-4000, 3700-3900, 3700-3880, 3700-3870, 3800-4100, 3800-4000, 또는 3800-3900개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 4100, 4000, 3900, 3880, 또는 3870개의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85%이다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%이다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 95%이다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 3500-4100, 3500-4000, 3500-3900, 3500-3880, 3500-3870, 3600-4100, 3600-4000, 3600-3900, 3600-3880, 3600-3870, 3700-4100, 3700-4000, 3700-3900, 3700-3880, 3700-3870, 3800-4100, 3800-4000, 또는 3800-3900개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역의 4100, 4000, 3900, 3880, 또는 3870개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에서 15개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에서 10개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에서 5개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에서 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2600-6850, 2600-6800, 2600-6780, 2600-6750, 2600-6725, 2600-6700, 2700-6850, 2700-6800, 2700-6780, 2700-6750, 2700-6725, 2700-6700, 2700-6680, 2700-6650, 2700-6625, 2700-6620, 2700-6619, 2750-6850, 2750-6800, 2750-6780, 2750-6750, 2750-6725, 2750-6700, 2750-6680, 2750-6650, 2750-6625, 2750-6620, 2750-6619, 2754-6850, 2754-6800, 2754-6780, 2754-6750, 2754-6725, 2754-6700, 2754-6680, 2754-6650, 2754-6625, 2754-6620, 또는 2754-6619개 사이의 영역에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 2754-6619 사이의 영역에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 3500-4100, 3500-4000, 3500-3900, 3500-3880, 3500-3870, 3600-4100, 3600-4000, 3600-3900, 3600-3880, 3600-3870, 3700-4100, 3700-4000, 3700-3900, 3700-3880, 3700-3870, 3800-4100, 3800-4000, 또는 3800-3900개 사이의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 5' hDSYF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 6620-6914, 6620-6900, 6620-6800, 6620-6700, 6700-6914, 6700-6800, 6800-6914, 또는 6800-6900로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 6620-6914로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 4100, 4000, 3900, 3880, 또는 3870개 또는 그 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 3' hDSYF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 6620-6914, 6620-6900, 6620-6800, 6620-6700, 6700-6914, 6700-6800, 6800-6914, 또는 6800-6900으로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 뉴클레오티드 위치 6620-6914로 구성되는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 야생형 hDSYF 단백질의 C-말단 영역을 포함하는 hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 야생형 hDSYF 단백질의 C-말단 영역을 포함하는 hDYSF 단백질의 단편은 C-말단 hDYSF 단백질로 지칭된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 750-2080, 750-2000, 750-1900, 775-2080, 775-2000, 775-1900, 794-2080, 794-2000, 또는 794-1900개를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 750-2080, 750-2000, 750-1900, 775-2080, 775-2000, 775-1900, 794-2080, 794-2000, 또는 794-1900개를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 길이가 1400, 1350, 1325, 1300, 1290, 또는 1287개 또는 그 미만의 아미노산을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되고, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 750-2080, 750-2000, 750-1900, 775-2080, 775-2000, 775-1900, 794-2080, 794-2000, 또는 794-1900개를 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 길이가 1400, 1350, 1325, 1300, 1290, 또는 1287개 또는 그 미만의 아미노산이고, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 750-2080, 750-2000, 750-1900, 775-2080, 775-2000, 775-1900, 794-2080, 794-2000, 또는 794-1900개를 포함하는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 길이가 1400, 1350, 1325, 1300, 1290, 또는 1287개 또는 그 미만의 아미노산을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 여기서 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 12의 아미노산 잔기 678-793, 678-750, 678-725, 또는 678-700개를 포함하는 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 C-말단 hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 97% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되되, 상기 C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 5' hDSYF 폴리뉴클레오티드 및 3' hDSYF 폴리뉴클레오티드의 서열은 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 950, 960, 또는 963개의 뉴클레오티드의 중첩(overlap)을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 hDSYF 단백질 및 C-말단 hDSYF 단백질의 서열은 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300 또는 320개 아미노산의 중첩을 포함한다.
역전된 말단 반복부
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포 및 조성물은 하나 이상의 역전된 말단 반복부(ITRS)를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포 및 조성물은 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 ITR을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 ITR은 동일하다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 ITR은 상이하다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 제 1 쌍의 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 제 2 쌍의 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 ITR은 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 ITR은 상이하다. 일부 구현예에서, 제 2 쌍의 ITR 내의 ITR은 동일하다. 일부 구현예에서, 제 2 쌍의 ITR 내의 ITR은 상이하다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 ITR은 제 2 쌍의 ITR 내의 ITR과 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 적어도 1개의 ITR은 제 2 쌍의 ITR 내의 적어도 1개의 ITR과 동일하다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 ITR은 제 2 쌍의 ITR 내의 ITR과 상이하다. 일부 구현예에서, 제 1 쌍의 ITR 내의 적어도 1개의 ITR은 제 2 쌍의 ITR 내의 적어도 1개의 ITR과 상이하다.
일부 구현예에서, ITR은 바이러스 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV 혈청형 AAVrh20, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAVrh10, AAV-11, AAV-12 및 AAV-13 중의 적어도 하나로부터의 ITR로부터 선택된다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV5 ITR이다. AAV1-6에 대한 ITR 서열은 예를 들어 문헌 「Grimm 등, J Virol80(1):426-39, 2006」에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 역전된 말단 반복부(ITR) 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 역전된 말단 반복부(ITR) 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 5개 또는 그 미만의 뉴클레오티드 미스매치를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
프로모터
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은 하나 이상의 프로모터를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 진핵 프로모터이다. 진핵 프로모터의 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파(EF1a) 프로모터, CAG 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 유전자(PGK) 프로모터, 테트라사이클린 반응 요소(TRE) 프로모터, 인간 U6 핵(U6) 프로모터, 및 UAS 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 포유동물 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터(inducible promoter)이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 조직의 예는 근육, 상피, 결합, 및 신경 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조직-특이적 프로모터의 예는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40/bAlb 프로모터, SV40/hAlb 프로모터, SV40/CD43 프로모터, SV40/CD45 프로모터, 및 NSE/RU5' 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 프로모터는 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 미오신 중쇄 복합체-E 박스 근육 크레아틴 키나제 융합 인핸서/프로모터이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 재조합 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 프로모터는 재조합 근육-특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 재조합 근육-특이적 프로모터는 재조합 미오신 중쇄-크레아틴 키나제 근육-특이적 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 트로포닌 I(TNNI2) 프로모터, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 절단된 MCK(tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 혼성 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 빠른-트위치 트로포닌 c 유전자 요소, 느린-트위치 심장 트로포닌 c 유전자 요소, 느린-트위치 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 4의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
인트론
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은 하나 이상의 인트론을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 진핵 인트론(eukaryotic intron)이다. 일부 구현예에서, 인트론은 포유동물 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 합성 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론은 비-암호화 엑손으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론은 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 5'에 있다.
일부 구현예에서, 인트론은 5' 공여체 부위, 분지점, 또는 3' 스플라이스 부위 중의 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 5' 공여체 부위, 분지점, 또는 3' 스플라이스 부위 중의 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 5' 공여체 부위, 분지점, 및 3' 스플라이스 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 인트론은 인간 β-글로빈 유전자로부터의 5' 공여체 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 분지점을 포함한다.
일부 구현예에서, 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 3' 스플라이스 수용체 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 5의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
선택 마커
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은 하나 이상의 선택 마커를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 박테리아 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 항생제 내성 유전자의 예는 β-락타마제, 카나마이신 내성 유전자, Tn5로부터의 네오 유전자, 대장균 게놈으로부터의 돌연변이체 FabI 유전자, 및 URA3 (효모로부터의 오로티딘-5' 포스페이트 데카르복실라제)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자이다. 일부 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자이다.
폴리아데닐화 신호
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 바이러스 패키징 시스템, 세포, 및 조성물은 하나 이상의 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 인공 폴리A 신호이다.
일부 구현예에서, 폴리A 신호는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 신호는 서열번호 7의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
발현 카세트 및 패키징 시스템
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함; (b) 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR는 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (c)의 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 발현 카세트는 5' hDYSF AAV 발현 카세트로 지칭된다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 플라스미드가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR), 여기서 상기 제 1 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함; (b) 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 제 2 ITR, 여기서 상기 제 2 ITR은 본원에 개시된 임의의 ITR을 포함함;을 포함하되, 상기 (b)의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드는 상기 (a) 및 (c)의 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 발현 카세트는 3' hDYSF AAV 발현 카세트로 지칭된다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR); (b) 인간 디스페린(hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열; (iv) 서열번호 13의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및 (c) 제 2 ITR;을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 AAV 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 선택 마커, 또는 복제기점(ORI)을 포함하는 1종 이상의 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 역전된 말단 반복부(ITR) 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 역전된 말단 반복부(ITR) 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 발현 카세트는, (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR); (b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은: (i) 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 2의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (iii) 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열; (ii) 서열번호 14의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열; (v) hDYSF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는 (vi) 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;로 구성됨; 및 (c) 제 2 ITR;을 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 서열번호 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 발현 카세트는 선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(UTR), 또는 폴리아데닐화(폴리A) 신호를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 패키징 시스템이 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 패키징 시스템은 (a) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및 (c) rep-cap 플라스미드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 AAV 복제를 매개한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 E4, E2a, 및 VA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, rep-cap 플라스미드는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78, Rep68, Rep62, 및 Rep40으로부터 선택된 생활 주기 단백질 중 하나 이상을 암호화한다. 일부 구현예에서, cap 유전자는 VP1, VP2, 및 VP3으로부터 선택된 캡시드 단백질 중 하나 이상을 암호화한다. 일부 구현예에서, 5' hDYSF AAV 발현 카세트는 하나 이상의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 동일하다. 일부 구현예에서, AAV ITR의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이하다. 일부 구현예에서, AAV rep 유전자의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 동일하다. 일부 구현예에서, AAV rep 유전자의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 패키징 시스템은 5' hDYSF AAV 패키징 시스템으로서 지칭된다.
일부 구현예에서, AAV 패키징 시스템은 (a) 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및 (c) rep-cap 플라스미드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 AAV 복제를 매개한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 E4, E2a, 및 VA로부터 선택된다. 일부 구현예에서, rep-cap 플라스미드는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rep 유전자는 Rep78, Rep68, Rep62 및 Rep40으로부터 선택된 하나 이상의 생활 주기 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 캡 유전자는 VP1, VP2, 및 VP3으로부터 선택된 캡시드 단백질 중 하나 이상을 암호화한다. 일부 구현예에서, 3' hDYSF AAV 발현 카세트는 하나 이상의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV ITR이다. 일부 구현예에서, AAV ITR의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 동일하다. 일부 구현예에서, AAV ITR의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이하다. 일부 구현예에서, AAV rep 유전자의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 동일하다. 일부 구현예에서, AAV rep 유전자의 혈청형은 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 패키징 시스템은 3' hDYSF AAV 패키징 시스템으로 지칭된다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템은 (a) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; 및 (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드;를 포함한다. 일부 구현예에서,m 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 AAV 복제를 매개한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 E4, E2a, 및 VA로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템은 (a) 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; 및 (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드;를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 AAV 복제를 매개한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스로부터의 하나 이상의 유전자는 E4, E2a, 및 VA로부터 선택된다.
바이러스 벡터
본원에서는 추가로, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어 AAV 바이러스 또는 AAV 입자)가 개시된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 AAV 벡터는 5' hDYSF AAV 벡터로서 지칭된다.
일부 구현예에서, 5' hDYSF AAV 벡터는 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터는 3' hDYSF AAV 벡터로서 지칭된다.
일부 구현예에서, 3' hDYSF AAV 벡터는 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, rh10, rh20, 또는 rh74의 AAV이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 rh74의 AAV이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 혈청형 5의 AAV가 아니다.
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 2개 이상의 AAV 벡터를 포함하는 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 개시된다. 일부 구현예에서, 이중 AAV 벡터 시스템은 (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함함; 및 (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함함;을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 AAV 벡터 시스템은 (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성됨; 및 (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성됨;을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성된다.
조성물
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다. 본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다. 본원에서는 추가로, 본원에 개시된 5' hDYSF 플라스미드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다. 본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 플라스미드를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다. 본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 이중 AAV 벡터 시스템을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다. 본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 AAV 벡터를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성되는 조성물이 개시된다.
본원에서는 추가로, (a) 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터, 여기서 상기 rAAV는 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성됨; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아주반트;를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이로 본질적으로 구성되는 조성물이 개시된다.
본원에서는 추가로, (a) 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터, 여기서 상기 rAAV는 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 본질적으로 이들로 구성됨; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아주반트;를 포함하는 조성물이 개시된다.
본원에서는 추가로, (a) 제 1 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV), 여기서 상기 제 1 rAAV는 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성됨; 및 (b) 제 2 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV), 여기서 상기 제 2 rAAV는 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성됨;을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 조성물이 개시된다.
본원에서는 추가로, (a) 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자, 여기서 상기 제 1 AAV 입자는 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성됨; 및 (b) 제 2 아데노-연관 바이러스(AAV) 입자, 여기서 상기 제 2 AAV 입자는 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성됨;을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 또는 이들로 본질적으로 구성되는 조성물이 개시된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 조성물 중의 임의의 것은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 아주반트 중의 적어도 1종을 더 포함한다. 허용가능한 담체, 희석제 및 아주반트는 수용체에 대해 무독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 완충제 및 계면활성제, 예를 들어 플루로닉(pluronics)을 포함한다. 허용가능한 담체의 예는 포스페이트 완충 염수, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 주사가능한 용도에 적합할 수 있다. 주사가능한 용도에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제의 예는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 그 형태는 멸균이어야 하고, 용이한 시링가능성(syringability)이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예를 들어 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 이중 벡터 시스템을 상기 열거된 바와 같은 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 혼입시킨 후, 필터 멸균시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.
AAV 벡터를 제조하는 방법
아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어 바이러스 또는 바이러스 입자)를 생산하는 방법이 본원에 개시된다. AAV 벡터를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 상기 방법은 예를 들어 국제공개공보 제WO 01/83692호에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. AAV 생산의 일반적 원리는 예를 들어 문헌 「Carter, Current Opinions in Biotechnology 1533-1539, 1992」; 및 「Muzyczka, Curr. Topics in Microbial and Immunol 158:97-129, 1992」에 검토되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다. AAV를 생산하기 위한 다양한 접근법이 문헌 「Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072, 1984」; 「Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466, 1984」; 「Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251, 1985」; 「McLaughlin 등, J. Virol., 62:1963, 1988」; 및 「Lebkowski 등, Mol. Cell. Biol., 7:349, 1988」; 「Samulski 등, J. Virol., 63:3822-3828, 1989」; 미국특허 제5,173,414호; 국제공개공보 제WO 95/13365호; 및 대응하는 미국특허 제5,658,776호; 국제공개공보 제WO 95/13392호; 제WO 96/17947호; 국제출원 제PCT/US98/18600호; 국제공개공보 제WO 97/09441호(국제출원 제PCT/US96/14423호); 제WO 97/21825호(제PCT/US96/20777호); 제WO 97/06243호 (제PCT/FR96/01064호); 제WO 99/11764호; 문헌 「Perrin 등, Vaccine 13:1244-1250, 1995」; 「Paul 등, Human Gene Therapy 4:609-615, 1993」; Clark 등, 「Gene Therapy 3:1124-1132, 1996」; 미국특허 제5,786,211호; 미국특허 제5,871,982호; 및 미국특허 제6,258,595호에 개시되어 있으며. 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법은 본원에 개시된 임의의 AAV 패키징 시스템으로 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 안정적으로 발현하는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포를 배양하여 형질도입된 세포의 집단을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 형질도입된 세포의 집단으로부터 상청액을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상청액을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생성하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플에는 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 상기 방법은 형질도입된 세포의 집단을 용해시켜 세포 용해물을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 용해물을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생성하는 것을 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플은 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 AAV 벡터 샘플의 순도는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수하다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법은 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 패키징 시스템 중의 임의의 시스템으로 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 안정적으로 발현하는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 배양하여 형질도입된 세포의 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 형질도입된 세포의 집단으로부터 상청액을 수집하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상청액을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생산하는 것을 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플은 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 없다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 상기 방법은 형질도입된 세포의 집단을 용해시켜 세포 용해물을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 용해물을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생산하는 것을 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플은 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 AAV 벡터 샘플의 순도는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수하다.
일부 구현예에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법은 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 패키징 시스템 중의 임의의 시스템으로 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 안정적으로 발현하는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 배양하여 형질도입된 세포의 집단을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 형질도입된 세포의 집단으로부터 상청액을 수집하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상청액을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생산하는 것을 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플은 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 없다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 상기 방법은 형질도입된 세포의 집단을 용해시켜 세포 용해물을 생산하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 용해물을 하나 이상의 정제 단계에 적용하여 정제된 AAV 벡터 샘플을 생산하는 것을 추가로 포함하되, 상기 AAV 벡터 샘플은 세포 파편 및 단백질이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 AAV 벡터 샘플의 순도는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순수하다.
세포
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 세포가 개시된다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 진핵 세포의 비제한적 예는 포유동물, 예를 들어 햄스터, 뮤린, 래트, 개, 양 또는 인간 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것을 포함하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 임의의 5' hDYSF AAV 발현 카세트로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 벡터로 감염된다.
본원에서는 추가로, 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 개시된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF AAV 발현 카세트로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 개시된 임의의 3' hDYSF AAV 벡터로 감염된다.
본원에 개시된 임의의 세포는 감염성 rAAV를 생산하는 패키징 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 안정적으로 형질전환된 암 세포, 예를 들어 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC6 세포(동족 293 라인)이다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 저 계대(low passage) 293 세포(아데노바이러스의 E1으로 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유모세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유모세포), 베로 세포(Vero cells)(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(레서스 태아 폐 세포)와 같은, 형질전환된 암 세포가 아닌 세포이다. 원핵 세포의 비제한적인 예는 박테리아 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)) 및 고세균 세포를 포함한다. 본 개시의 세포는 세포 은행, 예를 들어 비-GMP 목적을 위한 수탁 세포 은행(ACB) 또는 GMP 마스터 세포 은행(MCB)을 생산하는 데 사용될 수 있다. 세포의 분취량은, 일 구현예에서, 생산을 위한 생물반응기에서의 배양 전에 원래의 접종물로부터 더 큰 부피로 확장된다.
치료 방법
본원에서는 추가로, 디스페리노병증을 치료하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, (a) 유효량의 제 1 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의임; 및 (b) 유효량의 제 2 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것임;을 투여하는 것을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증을 치료하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, (a) 유효량의 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터든 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것임; 및 (b) 유효량의 제 2 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것임;을 투여하는 것을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 벡터는 근육내 또는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 벡터는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 벡터는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증의 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, (a) 유효량의 제 1 AAV 발현 카세트, 여기서 상기 제 1 AAV 발현 카세트는 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것임; 및 (b) 유효량의 제 2 AAV 발현 카세트, 여기서 상기 본원에 개시된 제 2 AAV 발현 카세트는 3' hDSYF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것임;을 투여하는 것을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 제 1 AAV 발현 카세트는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 AAV 발현 카세트는 근육내 또는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 발현 카세트는 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 제 2 AAV 발현 카세트는 근육내 또는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 발현 카세트는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 AAV 발현 카세트는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
일부 구현예에서, 디스페리노병증의 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, (a) 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것; (b) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것; (c) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; 또는 (d) 본원에 개시된 이중 AAV 벡터 시스템 중의 임의의 것;을 포함하는 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본원에서는 추가로, 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 벡터 시스템, 및 조성물의, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 용도가 개시된다. 본원에서는, 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, (a) 본원에 개시된 5' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF 폴리뉴클레오티드 중의 임의의 것; (b) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 벡터 중의 임의의 것; (c) 본원에 개시된 5' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것 및 본원에 개시된 3' hDYSF AAV 발현 카세트 중의 임의의 것; 또는 (e) (d) 본원에 개시된 이중 AAV 벡터 시스템 중의 임의의 것;을 포함하는 조성물의 용도가 개시된다. 일부 구현예에서, 조성물은 경구로, 비경구로(예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내, ICV, 흉골내 주사 또는 주입, 피하 주사, 또는 임플란트), 흡입 스프레이 비강, 질, 직장, 설하, 요도(예를 들어 요도 좌제) 또는 국소 투여 경로(예를 들어 겔, 연고, 크림, 에어로졸 등)에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증이다.
본 발명의 방법에서 투여될 AAV 벡터의 역가(titers)는, 예를 들어 특정 AAV, 투여 방식, 치료 목표, 개체, 및 표적화되는 세포 유형(들)에 의존하고, 관련 기술분야의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. AAV의 역가는 ㎖ 당 적어도 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013 내지 약 1×1014개 또는 그 초과의 DNase 저항성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 또한, 투여량은 바이러스 게놈(vg)의 단위로 표현될 수 있다. 예를 들어 AAV의 투여량은 적어도 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 2×1012, 약 3×1012, 약 4×1012, 약 5×1012, 약 6×1012, 약 7×1012, 약 8×1012, 약 9×1012, 약 1×1013 내지 약 1×1014개의 바이러스 게놈의 범위일 수 있다.
AAV 투여량은 ELISA, 역전사효소 활성의 평가, FACS, 형질도입 검정 노던 블롯팅(예를 들어 반-정량적 노던), 도트 블롯 분석 또는 PCR(예를 들어 qPCR)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중 방법에 의해 결정될 수 있다. AAV 투여량은 정량적 실시간 PCR (qPCR)로 AAV 벡터 게놈을 측정함으로써 결정될 수 있다는 것이 널리 공지되어 있다. 이러한 qPCR 방법은 통상적인 형질도입 검정으로부터의 불일치 또는 임의적 결과를 극복한다. PCR 투여량 결정의 한 구현예에서, 플라스미드 DNA는 보정 표준으로서 사용된다. 플라스미드의 형태는 qPCR 방법으로부터의 투여량 결과에 영향을 줄 수 있다. 한 구현예에서, 원형 또는 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드는 정량화 표준으로서 사용된다.
일부 구현예에서, 투여량은 정량화 표준으로서 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 하여 vg/kg의 단위로 표현될 수 있다. 예를 들어 AAV의 투여량은 정량화 표준으로서 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 하여 약 1×106-1×1016 vg/kg, 약 1×108 내지 1×1015 vg/kg, 또는 약 1×1010 내지 1×1014 vg/kg이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 적어도 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 2×1012, 약 4×1012, 약 6×1012, 약 8×1012, 약 1×1013, 약 2×1013, 약 2.4×1013, 약 3×1013, 약 4×1013, 약 5×1013, 약 6×1013, 약 7×1013, 약 8×1013, 약 9×1013, 약 1×1014, 약 1×1015, 또는 적어도 약 1×1016 vg/kg이다. 한 구현예에서, 투여량은 정량화 표준으로서 수퍼코일 DNA 또는 플라스미드를 기준으로 하여 적어도 2×1012, 4×1012, 6×1012, 8×1012, 1×1013, 2×1013, 2.4×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 또는 8×1013 vg/kg이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 2×1012, 약 3×1012, 약 4×1012, 약 5×1012, 약 6×1012, 약 7×1012, 약 8×1012, 약 9×1012, 약 1×1013 vg을 주사당 1.5 ml의 총 부피로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 2×1012, 약 3×1012, 약 4×1012, 약 5×1012, 약 6×1012, 약 7×1012, 약 8×1012, 약 9×1012, 약 1×1013, 약 2×1013, 약 5×1013, 약 7×1013, 약 1×1014 vg의 총 1일 용량을 투여하는 것을 포함한다. 캡시드화된 벡터 게놈 역가를 결정하는 한 예시적인 방법은 정량적 PCR, 예를 들어 문헌 「Pozsgai 등, Mol. Ther. 25(4): 855-869, 2017」에 기재된 방법을 사용하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 매일 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 주(week) 당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 1개월 당 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일마다 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일의 기간 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20주의 기간 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 대상체에게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개월의 기간 동안 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 전신 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어 전신 투여는 전체 신체가 영향을 받도록 순환계 내로의 투여이다. 전신 투여는 장관 투여, 예를 들어 위장관을 통한 흡수 및 주사, 주입 또는 이식을 통한 비경구 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 하나 이상의 조직에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직은 근육, 상피, 결합 및 신경 조직으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조직은 근육 조직이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 대상체의 발에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 대상체의 신근 브레비스 (EDB) 근육에 투여하는 것을 포함한다.
또한 조합 요법이 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 바와 같은 조합은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 다를 포함한다. 본 발명의 방법과 표준 의학적 치료(예를 들어 코르티코스테로이드)의 조합이 신규 요법과의 조합과 같이 구체적으로 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 대상체에게 투여하기 전에 또는 그 후에 대상체에서 디스페린 유전자에서의 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것은 디스페린 유전자에서의 돌연변이의 존재의 검출 시에 대상체에게 투여된다. 예시적인 디스페린 돌연변이는 c1392dupA, c3035GA (pW1012X), c2858dupT, c2779del G, c5594delG, c4201dupA, c1795_1799dupTACT, c3832CT (pQ1278X), c757CT (pR253W), c855+1delG, c3126GA (pW1042X), c1663CT (pR555W), c610CT (pR204X), c3112CT (pR1038X), c1368CG (pC456W), c5713CT (pR1905X), c3826CG (pI1276V), c3843+1GA, c4167+1GC, c2643+1GA, c797TC (pI266P), c4876delG, c3477CA (pY1159X), c3137GA (pR1046H), c509CA (pA170E), c3967CT (pQ1323X), 3191_3196dupGAGGCG, c3992GT (pR1331L), c3516_3517delTT, c247delG, c1180+11CT, c896GA (pG299E), c5078GA (pR1693Q), c5979dupA, c3348+1_3348+4delGTAT, c5314_5318delAGCCC, 및 c565CG (pL189V)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 디스페린 유전자는 c1392dupA, c3035GA (pW1012X), c2858dupT, c2779delG, c5594delG, c4201dupA, c1795_1799dupTACT, c3832CT (pQ1278X), c757CT (pR253W), c855+1delG, c3126GA (pW1042X), c1663CT (pR555W), c610CT (pR204X), c3112CT (pR1038X), c1368CG (pC456W), c5713CT (pR1905X), c3826CG (pI1276V), c3843+1GA, c4167+1GC, c2643+1GA, c797TC (pI266P), c4876delG, c3477CA (pY1159X), c3137GA (pR1046H), c509CA (pA170E), c3967CT (pQ1323X), 3191_3196dupGAGGCG, c3992GT (pR1331L), c3516_3517delTT, c247delG, c1180+11CT, c896GA (pG299E), c5078GA (pR1693Q), c5979dupA, c3348+1_3348+4delGTAT, c5314_5318delAGCCC, 및 c565CG (pL189V)를 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 투여하기 전에 또는 그 후에 대상체에서 디스페린 단백질의 수준을 검출하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물 중의 임의의 것을 투여한 후에 대상체에서 디스페린 단백질의 수준을 검출하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 디스페린의 수준을 검출하는 것은 디스페린 유전자의 발현을 검출하는 것을 포함한다. 디스페린 유전자의 발현을 검출하는 것은 디스페린 DNA 또는 RNA 수준을 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 디스페린 단백질의 수준을 검출하는 것은 디스페린 단백질의 수준을 정량화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스페린 단백질의 수준은 대상체로부터의 샘플에서 검출된다. 일부 구현예에서, 샘플은 체액 샘플이다. 체액 샘플의 예는 혈액, 소변, 땀, 타액, 대변, 및 활액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플은 혈장 또는 혈청 샘플이다. 일부 경우에, 상기 방법은 예를 들어 Athena Diagnostics (CPT: 81408(1))로부터의 디스페린 DNA 서열분석 시험을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 대상체에게 투여되는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템 또는 조성물 중의 임의의 것의 용량 또는 투여 빈도를 변형시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 투여량 또는 투여 빈도의 변경은 디스페린 단백질 수준의 검출에 기초한다. 일부 구현예에서, 용량 또는 투여 빈도는 대상체에서 디스페린 단백질 수준이 더 이른 시점(예를 들면, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물의 투여 전, 또는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물의 초기 투여량의 투여 후, 그러나 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터, 이중 벡터 시스템, 또는 조성물의 후속 용량의 투여 전)으로부터 대상체에서 디스페린 단백질 수준과 비교하여 증가할 때 감소된다.
키트
또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 세포 및 시스템 중의 임의의 하나 이상, 또는 조성물, 및 사용 설명서를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 또 추가로 이들로 구성되는 키트가 제공된다. 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 세포 및 시스템 중의 임의의 하나 이상, 또는 조성물은 검출가능하게 표지되거나 정제 또는 검출가능한 마커를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 상기 키트는, a) 제 1 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오티드임, 제 2 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 재조합 폴리뉴클레오티드임; 또는 b) 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 본원에 기재된 AAV 벡터임, 제 2 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 본원에 기재된 AAV 벡터임; 또는 c) 본원에 기재된 AAV 이중 벡터 시스템; 또는 d) 본원에 기재된 조성물; 또는 e) 본원에 기재된 세포(예를 들어 숙주 세포, 임의로 포유동물 세포); 및 임의로 사용 지침서;를 포함한다.
실시예
실시예 1: 이중 AAV 벡터 시스템의 생성
본 실시예는 본원에 개시된 이중 AAV 벡터 시스템을 생산하기 위한 예시적인 방법을 제공한다. 본 실시예에서는, 이중 AAV 벡터, rAAVrh74.MHCK7.DYSF.DV가 생산된다. rAAVrh.74.MHCK7.DYSF.DV 근육 특이적 MHCK7 프로모터의 제어 하에 이중 벡터 (DV)로부터 인간 디스페린을 발현하는 비-복제 재조합 AAV 혈청형 rh74 (AAVrh74)이다. 이중 벡터는 디스페린 cDNA 서열의 5' 부분 또는 3' 부분을 함유하고, 이들 부분은 ~1 kb 만큼 중첩되어 재조합을 촉진하고 전체 길이 인간 디스페린 유전자를 생성한다. 인간 디스페린 cDNA의 일부를 함유하는 발현 카세트는 AAV2 역 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된다(도 1).
rAAVrh.74.MHCK7.DYSFDV를 구축하기 위해, 인간 디스페린 cDNA를 AAV의 패키징 용량(4.7kb)에 부착된 2개의 구조체로 분할하였다. 5' 벡터(예를 들어 5' hDYSF AAV 벡터), pAAV.MHCK7.DYSF5'.PTG(PTG=프로모터/전이유전자)는 근육 특이적 MHCK7 프로모터, 키메라 인트론, 공통 코작 서열 및 디스페린 아미노산 서열의 아미노산 1-1113에 상응하는 DYSF cDNA의 5' 부분을 함유한다. 3' 벡터(예를 들어 3' hDYSF AAV 벡터), pAAV.DYSF3'.POLYA는, 폴리아데닐화 신호를 보유하는(harboring) DYSF 3'UTR 및 디스페린 아미노산 서열의 아미노산 794-2080에 상응하는 DYSF cDNA의 3' 부분을 함유한다. 5' hDYSF AAV 벡터 및 3' hDYSF AAV 벡터의 발현 카세트의 서열은 각각 서열번호 6 및 8로서 개시된다.
이전 연구는 MHCK7 프로모터(그 전문이 참조로 포함되는 문헌 「Salva 등, Mol Ther 15, 320-329 (2007)」) 및 AAVrh.74를 사용하여 심장 발현을 입증하여 골격, 횡격막, 및 심근 발현을 달성하였다(그 전문이 참조로 포함되는 문헌 「Sondergaard 등, Annals of clinical and Transl Neurology 2, 256-270 (2015)」). 5' hDYSF AAV 벡터 및 3' hDSYF AAV 벡터를 별개의 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화하였다. AAVrh.74 혈청형의 분자 클론을 레서스 마카크 림프절로부터 클로닝하고, 이는 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 「Rodino-Klapac 등, Journal of Translational medicine 5, 45 (2007)」에서 논의된다.
5' hDYSF AAV 벡터( AAV 벡터 플라스미드 pAAV . MHCK7.DYSF5 '. PTG )
제 1 재조합 단일-가닥 AAV 벡터를 AAV 벡터 DNA 플라스미드 pAAV.MHCK7.DYSF5'.PTG를 사용하여 생성되었다. 인간 디스페린 부분 cDNA 서열(인간 cDNA, Genbank 수탁번호 NM_003494.3)의 5' 부분을 구동하는 MHCK7 발현 카세트를 벡터 백본(vector backbone) pAAV-CMV(클론테크(Clontech))에 삽입함으로써 플라스미드를 구축하였다(플라스미드 맵에 대해 도 2 및 특이적 서열 정보에 대해 표 1 참조). 키메라 인트론이 존재하고, 인간 β-글로빈 유전자의 제 1 인트론으로부터의 5' 공여체 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 몸체(body)와 리더(leader) 사이에 있는 인트론으로부터의 분지점 및 3' 스플라이스 수용체 부위로 구성되었다. 이 벡터에 포함된 유일한 바이러스 서열은 rAAV 벡터 게놈의 바이러스 DNA 복제 및 패키징 둘 다에 필요한 AAV2의 역전된 말단 반복체이다. 2개의 ITR 사이의 서열은 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화된 DNA의 부분이다.
[표 1]
Figure pct00001
3' hDYSF AAV 벡터( AAV 벡터 플라스미드 pAAV . DYSF3 '. POLY )
제 2 재조합 단일-가닥 AAV 벡터를 AAV 벡터 DNA 플라스미드 pAAV.DYSF3'.POLYA를 사용하여 생산하였다. 인간 디스페린 부분 cDNA 서열(인간 cDNA, Genbank 수탁번호 NM_003494.3)을 벡터 백본 pAAV-CMV (Clontech)에 삽입함으로써 플라스미드를 구축하였다(플라스미드 맵에 대해 도 3 및 특이적 서열 정보에 대해 표 2 참조). 내인성 디스페린 3' 비번역 영역 및 폴리A 신호 서열이 효율적인 전사 종결(transcription termination)을 위해 사용되었다. 이 벡터에 포함된 유일한 바이러스 서열은 rAAV 벡터 게놈의 바이러스 DNA 복제 및 패키징 둘 다에 필요한 AAV2의 역전된 말단 반복체이다. 2개의 ITR 사이의 서열은 AAVrh.74 비리온으로 캡시드화된 DNA의 부분이다.
[표 2]
Figure pct00002
AAV 헬퍼 플라스미드 ( pNLRep2 - Caprh74 )
모 플라스미드(parent plasmid), pNLrep는 p5E18 및 pCLR3K로부터 구축되었다. [문헌 「Bansal, D., 등, Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 423, 168-172 (2003)」을 참조하며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다]. p5E18은 pAAV/Ad를 기반으로 한다. 그것은 AAV2 rep 및 캡 유전자를 함유하며, p5 프로모터가 rep의 5' 말단에서 제거되고 캡의 3' 말단에 배치되며, 이는 p5와 rep 사이에 3 kb 스페이서 서열의 존재를 초래한다(특이적 서열 정보에 대해서는 표 3 참조). pCLR3K를 생성하기 위해, 인간 콜라겐 인트론을 PCR에 의해 증폭시킨 다음, 위치 1.052에서 pAd/AAV로 클로닝하였다. pNLrep를 구축하기 위해, p5E18의 BamHI/XbaI 단편을 pCLR3K로부터의 3 kb 콜라겐 인트론을 함유하는 BamHI/XbaI 단편으로 대체하였다. rh74 캡 유전자를 PCR 증폭시키고, Swa I/Not I 제한 부위를 사용하여 pNLrep에서 AAV2 캡 유전자 대신에 클로닝하여 pNLRep2-Caprh74를 수득하였다. AAV rh74 캡시드 유전자의 동일성은 DNA 플라스미드 서열분석에 의해 확인되었다.
[표 3]
Figure pct00003
아데노바이러스 헬퍼 플라스미드( pHELP )
플라스미드 pHELP는 Applied Viromics(Fremont, CA 94538)로부터 얻었고, 크기는 11,635 bp이다(구체적인 서열 정보에 대해서는 표 4 참조). 플라스미드는 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈의 영역, 즉 E2A, E4 및 VA RNA를 함유한다(아데노바이러스 E1 기능은 293개의 세포에 의해 제공됨). 플라스미드는 pBluescript 백본을 기반으로 하고, 또한 암피실린(ampicillin)(10,182-11,042 bp), 박테리아 ColE1 복제기점(9,315- 10,167 bp) 및 f1 단일-가닥 DNA 복제기점(11,172-11,627 bp)에 내성을 부여하는 TEM-1 β-락타마아제 유전자를 암호화하는 bla 유전자를 함유한다. 이 플라스미드에 존재하는 아데노바이러스 서열은 단지 아데노바이러스 게놈의 약 ~28%(9,280 / 35,938)를 나타내고, 복제에 중요한 시스(cis) 요소, 예를 들어 역전된 말단 반복부를 함유하지 않는다. 이들 3개의 아데노바이러스 유전자의 동일성은 수행된 DNA 플라스미드 서열분석에 의해 확인하였다. DNA 분석은 3개의 아데노바이러스 유형 5 유전자 영역(그 전문이 참조로 포함되는 GenBank 수탁번호 AF369965)과 100% 상동성을 나타내었다.
[표 4]
Figure pct00004
실시예 2: 이중 AAV 벡터 시스템을 이용한 바이러스 생성물의 제조
HEK 293 세포를 최적화된 칼슘 포스페이트 공침전 방법을 사용하여 3개의 생산 플라스미드((i) AAV 벡터 플라스미드, 예를 들어 5' hDYSF AAV 벡터 또는 3' hDYSF AAV 벡터; (ii) 아데노바이러스(Ad) 헬퍼 플라스미드; 및 (iii) AAV 헬퍼 플라스미드)로 형질주입시켰다. 세포를 형질주입시키는 것은 AAV 벡터 플라스미드, Ad 헬퍼 플라스미드, AAV 헬퍼 플라스미드 및 CaCl2를 함유하는 DNA/칼슘 용액을 제조하고, 동일 부피의 2X HEPES 완충 염수와 혼합하여 최적 침전물을 수득하는 것을 포함한다. 이어서, 침전물을 HEK 293 세포에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 이어서, 침전물을 HEK 293 세포에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 배양 후, 배지를 교환하고, 이때 핵산 분해 효소(nuclease)를 첨가하였다.
실시예 3: rAAVrh . 74.MHCK7.DYSF . DV 근육내 전달의 효능 결정
~1kb의 중첩 서열을 갖는 MHCK7.DYSF 카세트의 5' 및 3' 부분을 함유하는 2개의 AAV 발현 카세트를 생성하였다(도 1 참조). 플라스미드를 AAVrh74 벡터 내로 패키징하였다. 4주령의 Dysf-/- 마우스를 전경골근(tibialis anterior muscle) 내로의 근육내 주사에 의해 1×1011 vg의 각각의 벡터로 처리하고 1개월에 부검하였다. 강력한 전체-길이 디스페린 발현은 면역 염색(도 4a) 및 웨스턴 블롯(도 4c)에 의해 두 벡터 모두의 전달 후에 나타났다. 어느 하나의 벡터 단독의 전달은 비정상적인 디스페린 발현을 갖지 않았다(도 4b, 면역 염색, 및 도 4d, 웨스턴 블롯). 3222는 전체-길이 대조군이다. 디스페린을 발현하는 근섬유의 수를 정량화하고 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure pct00005
전경골근에 대한 근육내 주사 후 안전성을 평가하기 위한 시간 경과 연구를 개시하였다(표 6). 단백질 발현 및 벡터 생체분포를 또한 평가하였다. 1, 3, 6, 9, 및 12개월 종말점에서, 동물을 충분히 부검하고, 근육 및 비표적 기관에 대한 디스페린 발현(도 5a 내지 도 5c(1, 3, 및 6개월이 표시됨), 벡터 생체분포(vector biodistribution)(표 7) 및 조직병리학을 분석하였다. 경골근(tibialis muscle; TA)을 주사하였다. 각각의 동물에 대한 조직병리학에 대해 분석된 조직은 다음을 포함하였다: 생식선, 간, 심장, 폐, 비장, 신장, 횡격막, 좌측(처리된) 및 우측 전경골근. 어떠한 발견도 확인되지 않았다.
[표 6]
Figure pct00006
[표 7]
Figure pct00007
근육내 주사 후, 디스페린의 발현이 주사된 경골 전근에서 발견되었다(도 6 참조). 정맥내 전달 후, 디스페린의 발현이 골격근 및 심장 근육에서 발견되었다(도 7a 참조).
마우스의 추가 코호트를 처리하여 막 복구를 위한 최소 유효 용량을 결정하였다. AAV 벡터의 3회 용량을 8주령의 129Dysf-/- 마우스의 FDB에 주사하였다(그룹당 n=6). 대조군 Dysf-/- 그룹은 염수를 투여받았고, 129WT 마우스의 그룹은 균주 특이적 정상 대조군으로서 기능하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, AAVrh.74.DYSF.DV 처리는 용량 의존성 막 재밀봉을 나타냈다. 병행 발현 연구는 높은 용량이 섬유 형질도입의 발현>50%를 초래함을 보여준다. 이 용량은 근육 중량에 대해 정규화될 때 발현 및 안전성 연구를 위해 전경골근에 제공된 것과 동등하다(도 4a 내지 도 5c 참조).
[표 8]
Figure pct00008
rAAVrh . 74.MHCK7.DYSF . DV의 전신 전달
이중 벡터 전달의 전신 전달의 타당성/유효성을 시험하기 위해 용량 발견 연구(dose finding study)를 수행하였다. BlaJ 마우스(BL6 마우스에 역교배된 AJ 디스페린 결핍 마우스)를 이 균주에서 확립된 기능적 MRI/MRS 결과에 기초한 연구를 위해 사용하였다. 3 그룹의 마우스(그룹 당 n=6)를 6주령에서 염수, 2e12 vg 총 AAV.DYSF DV(정량 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드에 기초한 8e13 vg/kg), 또는 6e12 vg 총 AAV.DYSF DV(정량 표준으로서 슈퍼코일 DNA 또는 플라스미드에 기초한 2.4e13 vg/kg)로 꼬리 정맥 주사로 처리하였다. 종말점 분석은 3개월에 이루어졌고, 횡격막 생리학(diaphragm physiology), FDB의 막 복구 분석, 및 디스페린 발현을 정량화하고 조직병리학을 평가하기 위한 완전한 부검(necropsies)을 포함하였다.4
4개월의 연구 종말점에서, 완전한 부검이 수행되었다. 횡격막(diaphragm)은 힘을 측정하고, FDB 근육은 막 복구의 회복을 위해 시험하고, 근육 및 기관을 발현, 벡터 생체분포 및 조직병리학을 위해 수확하였다. 고 용량에서, 디스페린 발현은 모든 근육에서 광범위한 반면(도 7a 및 7b), 저 용량은 낮은 수준의 가변 발현을 가졌다. 20주에서, BlaJ는 조직학적으로 매우 온화한 표현형을 갖는다. 대조군에 비해 재생의 마커로서 중심 핵에서 유의한 증가가 존재한다. 처리된 마우스는 고 용량에서 중심 핵형성에서 유의한 감소를 나타내었다(도 7b). 가장 영향을 많이 받은 근육인 소아(psoa)는 고 용량에서 처리시 섬유증 및 염증이 감소하는 것으로 나타났다(6e12 vg)(도 9). 횡격막의 힘 결손은 고 용량 및 저 용량 둘 다에서 회복되었고(도 10a), FDB 근육의 막 복구에서 용량 반응이 존재하였다(도 10b).
실시예 4: NHP에서 AAV5 및 Aavrh . 74.Mhck7.Dysf . Dv 전달에 의한 전체-길이 디스페린 발현의 안전성 및 효능
방법: 근육내 주사에 의해 AAV.MHCK7.DYSF.FLAG로 4개의 NHP를 처리하였다. 2개의 NHP를 AAV5.MHCK7.DYSF로 처리하고, 2개를 AAVrh.74.MHCK7.DYSF.FLAG로 처리하였다. 본 발명자들의 임상 시험 설계를 반영하여, 한마리의 동물을 3개월에, 두마리는 6개월에 분석하였다. 동물들은 AAV5와 rh.74 캡시드 및 디스페린(도 11a 내지 도 11d)과 항-AAV Ab 역가(표 9)에 대해 T 세포를 측정하기 위한 ELISpot 분석을 포함한 기본 화학 및 면역학 연구를 받았다.
PBMC를 자극하는데 사용되는 펩티드 풀(peptide pools)은 가능한 모든 항원 에피토프를 포획할 수 있도록 10개의 아미노산으로 중첩된 15개의 긴 아미노산으로 설계되었다. 펩티드에 반응하는 세포는 ELISpot 분석을 통해 스폿(spots)으로서 정량화된 인터페론-γ를 방출한다. 백만개의 세포당 스폿은 양성 반응 임계치(positive reaction threshold)로서 50개의 스폿/1×106개의 세포로 계수되었다. 어떠한 지속적인 면역 반응도 관찰되지 않았다. 모든 동물은 연구 종말점에서 발현이 있었다(도 16a). 이들 연구는 전체 연구에 대해 2주마다 반복되었다. 연구 종말점에서 유전자 발현 연구에 더하여 생체 기관 조직에 대한 조직병리학 및 생체분포 연구를 포함하는 동물에 대한 전체 부검이 수행되었다.
결과: 어떠한 관찰가능한 독성도 발견되지 않았다. 본 출원인은 디스페린의 과발현을 입증하기 위해 레서스(rhesus)와 인간 디스페린을 구별하지 않는 항-디스페린 항체를 사용하였다(도 12a 내지 도 12c). 또한 벡터 유래된 디스페린 발현을 확인하기 위해 항-FLAG 면역 염색을 수행하였다(도 13). AAV5.DYSF 주사된 TA의 경우, 근육은 디스페린의 104.9%(3mo) 및 122.6%(6mo) 과발현을 나타낸 반면, AAVrh74.DYSF.DV 주사된 TA는 주사되지 않은 대조군과 비교하여 122.0%(3mo) 및 115.2% 6mo) 과발현을 나타냈다. 염증 또는 근섬유 괴사가 결여된 NHP의 조직 수준에서 어떠한 독성도 관찰되지 않았다. 면역학적 분석은 ELISpot에 의한 캡시드 또는 전이유전자에 대한 어떠한 비정상적인 반응을 나타내지 않았다(도 11a 내지 도 11d). 또한, 충분히 완전한 혈액 계수(complete blood count) 및 화학 패널은 임의의 마카크에서 비정상 값을 나타내지 않았다. 예상한 바와 같이, 항-AAV 항체 역가는 유전자 전달 후에 상승되었다. 종말점 항-AAVrh74 역가는 항-AAV5에 대한 것보다 더 낮았다.
[표 9]
Figure pct00009
등가물
달리 정의되지 않는 한, 본원 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 예시적으로 기술된 본 기술은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서 예를 들어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "함유하는(containing)" 등의 용어는 제한 없이 포괄적으로 읽혀져야 한다. 또한, 본원 명세서에서 사용되는 용어 및 표현들은 설명의 목적으로 사용된 것이지 제한할 목적으로 사용된 것이 아니며, 도시 및 설명된 특징들 또는 그 일부의 균등물들을 배제하는 이러한 용어들 및 표현들의 사용의 의도는 없으며, 청구된 본 기술의 범위 내에서 다양한 수정들이 가능하다는 것이 인식된다.
따라서, 본원에 제공된 재료, 방법 및 실시예는 바람직한 구현예를 대표하고, 예시적인 것이며, 본 기술의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본 기술은 광범위하게 그리고 포괄적으로 본원 명세서에서 설명되었다. 일반 개시물 내에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 하위-범용 그룹은 또한 본 기술의 일부를 형성한다. 이는 절제된 물질이 본원에서 구체적으로 언급되는지 여부에 관계없이, 속으로부터 임의의 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 기술의 일반적인 설명을 포함한다.
또한, 본 기술의 특징 또는 구현예가 마쿠쉬 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 당업자는 본 기술이 또한 마쿠쉬 그룹의 구성원의 임의의 개별 구성원 또는 서브그룹의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.
본원 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 각각이 개별적으로 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고로 명백히 포함된다. 충돌의 경우에, 정의를 포함하는 본원 명세서는 조절될 것이다.
다른 구현예들은 다음의 청구항들 내에 제시된다.
SEQUENCE LISTING <110> RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL <120> GENE THERAPY WITH DYSFERLIN DUAL VECTORS <130> 106887-8070 <140> <141> <150> 63/024,338 <151> 2020-05-13 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3340 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 5' hDYSF DNA fragment v1 <400> 1 atgctgaggg tcttcatcct ctatgccgag aacgtccaca cacccgacac cgacatcagc 60 gatgcctact gctccgcggt gtttgcaggg gtgaagaaga gaaccaaagt catcaagaac 120 agcgtgaacc ctgtatggaa tgagggattt gaatgggacc tcaagggcat ccccctggac 180 cagggctctg agcttcatgt ggtggtcaaa gaccatgaga cgatggggag gaacaggttc 240 ctgggggaag ccaaggtccc actccgagag gtcctcgcca cccctagtct gtccgccagc 300 ttcaatgccc ccctgctgga caccaagaag cagcccacag gggcctcgct ggtcctgcag 360 gtgtcctaca caccgctgcc tggagctgtg cccctgttcc cgccccctac tcctctggag 420 ccctccccga ctctgcctga cctggatgta gtggcagaca caggaggaga ggaagacaca 480 gaggaccagg gactcactgg agatgaggcg gagccattcc tggatcaaag cggaggcccg 540 ggggctccca ccaccccaag gaaactacct tcacgtcctc cgccccacta ccccgggatc 600 aaaagaaagc gaagtgcgcc tacatctaga aagctgctgt cagacaaacc gcaggatttc 660 cagatcaggg tccaggtgat cgaggggcgc cagctgccgg gggtgaacat caagcctgtg 720 gtcaaggtta ccgctgcagg gcagaccaag cggacgcgga tccacaaggg aaacagccca 780 ctcttcaatg agactctttt cttcaacttg tttgactctc ctggggagct gtttgatgag 840 cccatcttta tcacggtggt agactctcgt tctctcagga cagatgctct cctcggggag 900 ttccggatgg acgtgggcac catttacaga gagccccggc acgcctatct caggaagtgg 960 ctgctgctct cagaccctga tgacttctct gctggggcca gaggctacct gaaaacaagc 1020 ctttgtgtgc tggggcctgg ggacgaagcg cctctggaga gaaaagaccc ctctgaagac 1080 aaggaggaca ttgaaagcaa cctgctccgg cccacaggcg tagccctgcg aggagcccac 1140 ttctgcctga aggtcttccg ggccgaggac ttgccgcaga tggacgatgc cgtgatggac 1200 aacgtgaaac agatctttgg cttcgagagt aacaagaaga acttggtgga cccctttgtg 1260 gaggtcagct ttgcggggaa aatgctgtgc agcaagatct tggagaagac ggccaaccct 1320 cagtggaacc agaacatcac actgcctgcc atgtttccct ccatgtgcga aaaaatgagg 1380 attcgtatca tagactggga ccgcctgact cacaatgaca tcgtggctac cacctacctg 1440 agtatgtcga aaatctctgc ccctggagga gaaatagaag aggagcctgc aggtgctgtc 1500 aagccttcga aagcctcaga cttggatgac tacctgggct tcctccccac ttttgggccc 1560 tgctacatca acctctatgg cagtcccaga gagttcacag gcttcccaga cccctacaca 1620 gagctcaaca caggcaaggg ggaaggtgtg gcttatcgtg gccggcttct gctctccctg 1680 gagaccaagc tggtggagca cagtgaacag aaggtggagg accttcctgc ggatgacatc 1740 ctccgggtgg agaagtacct taggaggcgc aagtactccc tgtttgcggc cttctactca 1800 gccaccatgc tgcaggatgt ggatgatgcc atccagtttg aggtcagcat cgggaactac 1860 gggaacaagt tcgacatgac ctgcctgccg ctggcctcca ccactcagta cagccgtgca 1920 gtctttgacg ggtgccacta ctactaccta ccctggggta acgtgaaacc tgtggtggtg 1980 ctgtcatcct actgggagga catcagccat agaatcgaga ctcagaacca gctgcttggg 2040 attgctgacc ggctggaagc tggcctggag caggtccacc tggccctgaa ggcgcagtgc 2100 tccacggagg acgtggactc gctggtggct cagctgacgg atgagctcat cgcaggctgc 2160 agccagcctc tgggtgacat ccatgagaca ccctctgcca cccacctgga ccagtacctg 2220 taccagctgc gcacccatca cctgagccaa atcactgagg ctgccctggc cctgaagctc 2280 ggccacagtg agctccctgc agctctggag caggcggagg actggctcct gcgtctgcgt 2340 gccctggcag aggagcccca gaacagcctg ccggacatcg tcatctggat gctgcaggga 2400 gacaagcgtg tggcatacca gcgggtgccc gcccaccaag tcctcttctc ccggcggggt 2460 gccaactact gtggcaagaa ttgtgggaag ctacagacaa tctttctgaa atatccgatg 2520 gagaaggtgc ctggcgcccg gatgccagtg cagatacggg tcaagctgtg gtttgggctc 2580 tctgtggatg agaaggagtt caaccagttt gctgagggga agctgtctgt ctttgctgaa 2640 acctatgaga acgagactaa gttggccctt gttgggaact ggggcacaac gggcctcacc 2700 taccccaagt tttctgacgt cacgggcaag atcaagctac ccaaggacag cttccgcccc 2760 tcggccggct ggacctgggc tggagattgg ttcgtgtgtc cggagaagac tctgctccat 2820 gacatggacg ccggtcacct gagcttcgtg gaagaggtgt ttgagaacca gacccggctt 2880 cccggaggcc agtggatcta catgagtgac aactacaccg atgtgaacgg ggagaaggtg 2940 cttcccaagg atgacattga gtgcccactg ggctggaagt gggaagatga ggaatggtcc 3000 acagacctca accgggctgt cgatgagcaa ggctgggagt atagcatcac catccccccg 3060 gagcggaagc cgaagcactg ggtccctgct gagaagatgt actacacaca ccgacggcgg 3120 cgctgggtgc gcctgcgcag gagggatctc agccaaatgg aagcactgaa aaggcacagg 3180 caggcggagg cggagggcga gggctgggag tacgcctctc tttttggctg gaagttccac 3240 ctcgagtacc gcaagacaga tgccttccgc cgccgccgct ggcgccgtcg catggagcca 3300 ctggagaaga cggggcctgc agctgtgttt gcccttgagg 3340 <210> 2 <211> 3866 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> 3' hDYSF DNA fragment v1 <400> 2 tcgtcatctg gatgctgcag ggagacaagc gtgtggcata ccagcgggtg cccgcccacc 60 aagtcctctt ctcccggcgg ggtgccaact actgtggcaa gaattgtggg aagctacaga 120 caatctttct gaaatatccg atggagaagg tgcctggcgc ccggatgcca gtgcagatac 180 gggtcaagct gtggtttggg ctctctgtgg atgagaagga gttcaaccag tttgctgagg 240 ggaagctgtc tgtctttgct gaaacctatg agaacgagac taagttggcc cttgttggga 300 actggggcac aacgggcctc acctacccca agttttctga cgtcacgggc aagatcaagc 360 tacccaagga cagcttccgc ccctcggccg gctggacctg ggctggagat tggttcgtgt 420 gtccggagaa gactctgctc catgacatgg acgccggtca cctgagcttc gtggaagagg 480 tgtttgagaa ccagacccgg cttcccggag gccagtggat ctacatgagt gacaactaca 540 ccgatgtgaa cggggagaag gtgcttccca aggatgacat tgagtgccca ctgggctgga 600 agtgggaaga tgaggaatgg tccacagacc tcaaccgggc tgtcgatgag caaggctggg 660 agtatagcat caccatcccc ccggagcgga agccgaagca ctgggtccct gctgagaaga 720 tgtactacac acaccgacgg cggcgctggg tgcgcctgcg caggagggat ctcagccaaa 780 tggaagcact gaaaaggcac aggcaggcgg aggcggaggg cgagggctgg gagtacgcct 840 ctctttttgg ctggaagttc cacctcgagt accgcaagac agatgccttc cgccgccgcc 900 gctggcgccg tcgcatggag ccactggaga agacggggcc tgcagctgtg tttgcccttg 960 agggggccct gggcggcgtg atggatgaca agagtgaaga ttccatgtcc gtctccacct 1020 tgagcttcgg tgtgaacaga cccacgattt cctgcatatt cgactatggg aaccgctacc 1080 atctacgctg ctacatgtac caggcccggg acctggctgc gatggacaag gactcttttt 1140 ctgatcccta tgccatcgtc tccttcctgc accagagcca gaagacggtg gtggtgaaga 1200 acacccttaa ccccacctgg gaccagacgc tcatcttcta cgagatcgag atctttggcg 1260 agccggccac agttgctgag caaccgccca gcattgtggt ggagctgtac gaccatgaca 1320 cttatggtgc agacgagttt atgggtcgct gcatctgtca accgagtctg gaacggatgc 1380 cacggctggc ctggttccca ctgacgaggg gcagccagcc gtcgggggag ctgctggcct 1440 cttttgagct catccagaga gagaagccgg ccatccacca tattcctggt tttgaggtgc 1500 aggagacatc aaggatcctg gatgagtctg aggacacaga cctgccctac ccaccacccc 1560 agagggaggc caacatctac atggttcctc agaacatcaa gccagcgctc cagcgtaccg 1620 ccatcgagat cctggcatgg ggcctgcgga acatgaagag ttaccagctg gccaacatct 1680 cctcccccag cctcgtggta gagtgtgggg gccagacggt gcagtcctgt gtcatcagga 1740 acctccggaa gaaccccaac tttgacatct gcaccctctt catggaagtg atgctgccca 1800 gggaggagct ctactgcccc cccatcaccg tcaaggtcat cgataaccgc cagtttggcc 1860 gccggcctgt ggtgggccag tgtaccatcc gctccctgga gagcttcctg tgtgacccct 1920 actcggcgga gagtccatcc ccacagggtg gcccagacga tgtgagccta ctcagtcctg 1980 gggaagacgt gctcatcgac attgatgaca aggagcccct catccccatc caggaggaag 2040 agttcatcga ttggtggagc aaattctttg cctccatagg ggagagggaa aagtgcggct 2100 cctacctgga gaaggatttt gacaccctga aggtctatga cacacagctg gagaatgtgg 2160 aggcctttga gggcctgtct gacttttgta acaccttcaa gctgtaccgg ggcaagacgc 2220 aggaggagac agaagatcca tctgtgattg gtgaatttaa gggcctcttc aaaatttatc 2280 ccctcccaga agacccagcc atccccatgc ccccaagaca gttccaccag ctggccgccc 2340 agggacccca ggagtgcttg gtccgtatct acattgtccg agcatttggc ctgcagccca 2400 aggaccccaa tggaaagtgt gatccttaca tcaagatctc catagggaag aaatcagtga 2460 gtgaccagga taactacatc ccctgcacgc tggagcccgt atttggaaag atgttcgagc 2520 tgacctgcac tctgcctctg gagaaggacc taaagatcac tctctatgac tatgacctcc 2580 tctccaagga cgaaaagatc ggtgagacgg tcgtcgacct ggagaacagg ctgctgtcca 2640 agtttggggc tcgctgtgga ctcccacaga cctactgtgt ctctggaccg aaccagtggc 2700 gggaccagct ccgcccctcc cagctcctcc acctcttctg ccagcagcat agagtcaagg 2760 cacctgtgta ccggacagac cgtgtaatgt ttcaggataa agaatattcc attgaagaga 2820 tagaggctgg caggatccca aacccacacc tgggcccagt ggaggagcgt ctggctctgc 2880 atgtgcttca gcagcagggc ctggtcccgg agcacgtgga gtcacggccc ctctacagcc 2940 ccctgcagcc agacatcgag caggggaagc tgcagatgtg ggtcgaccta tttccgaagg 3000 ccctggggcg gcctggacct cccttcaaca tcaccccacg gagagccaga aggtttttcc 3060 tgcgttgtat tatctggaat accagagatg tgatcctgga tgacctgagc ctcacggggg 3120 agaagatgag cgacatttat gtgaaaggtt ggatgattgg ctttgaagaa cacaagcaaa 3180 agacagacgt gcattatcgt tccctgggag gtgaaggcaa cttcaactgg aggttcattt 3240 tccccttcga ctacctgcca gctgagcaag tctgtaccat tgccaagaag gatgccttct 3300 ggaggctgga caagactgag agcaaaatcc cagcacgagt ggtgttccag atctgggaca 3360 atgacaagtt ctcctttgat gattttctgg gctccctgca gctcgatctc aaccgcatgc 3420 ccaagccagc caagacagcc aagaagtgct ccttggacca gctggatgat gctttccacc 3480 cagaatggtt tgtgtccctt tttgagcaga aaacagtgaa gggctggtgg ccctgtgtag 3540 cagaagaggg tgagaagaaa atactggcgg gcaagctgga aatgaccttg gagattgtag 3600 cagagagtga gcatgaggag cggcctgctg gccagggccg ggatgagccc aacatgaacc 3660 ctaagcttga ggacccaagg cgccccgaca cctccttcct gtggtttacc tccccataca 3720 agaccatgaa gttcatcctg tggcggcgtt tccggtgggc catcatcctc ttcatcatcc 3780 tcttcatcct gctgctgttc ctggccatct tcatctacgc cttcccgaac tatgctgcca 3840 tgaagctggt gaagcccttc agctga 3866 <210> 3 <211> 128 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <220> <223> ITR <400> 3 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttcct 128 <210> 4 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> promoter <400> 4 aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 60 aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 120 ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 180 cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct 240 gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga 300 catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt 360 ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa 420 caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt 480 tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag 540 tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 600 ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg 660 gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac 720 ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca 780 ggagcagcca gc 792 <210> 5 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Intron <400> 5 aggtaagttt agtctttttg tcttttattt caggtcccgg atccggtggt ggtgcaaatc 60 aaagaactgc tcctcagtgg atgttgcctt tacttctagg cctgtacgga agtgttactt 120 ctgctctaaa agctgcggaa ttgtaccc 148 <210> 6 <211> 4689 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> DYSF F5' Expression Cassette v1 <400> 6 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctctaga gtttaagctt gcatgtctaa 180 gctagaccct tcagattaaa aataactgag gtaagggcct gggtagggga ggtggtgtga 240 gacgctcctg tctctcctct atctgcccat cggccctttg gggaggagga atgtgcccaa 300 ggactaaaaa aaggccatgg agccagaggg gcgagggcaa cagacctttc atgggcaaac 360 cttggggccc tgctgtctag catgccccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc 420 aaggcctggg gacacccgag atgcctggtt ataattaacc cagacatgtg gctgcccccc 480 cccccccaac acctgctgcc tctaaaaata accctgtccc tggtggatcc cctgcatgcg 540 aagatcttcg aacaaggctg tgggggactg agggcaggct gtaacaggct tgggggccag 600 ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc atgttcccgg cgaagggcca 660 gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa ccagtgagca agtcagccct 720 tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc acgcctgggt ccggggtggg 780 cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc aggggcccct ccctggggac 840 agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc 900 tgccctcatt ctaccaccac ctccacagca cagacagaca ctcaggagca gccagcggcg 960 cgcccaggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt cccggatccg gtggtggtgc 1020 aaatcaaaga actgctcctc agtggatgtt gcctttactt ctaggcctgt acggaagtgt 1080 tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg cggctagcca ccatgctgag 1140 ggtcttcatc ctctatgccg agaacgtcca cacacccgac accgacatca gcgatgccta 1200 ctgctccgcg gtgtttgcag gggtgaagaa gagaaccaaa gtcatcaaga acagcgtgaa 1260 ccctgtatgg aatgagggat ttgaatggga cctcaagggc atccccctgg accagggctc 1320 tgagcttcat gtggtggtca aagaccatga gacgatgggg aggaacaggt tcctggggga 1380 agccaaggtc ccactccgag aggtcctcgc cacccctagt ctgtccgcca gcttcaatgc 1440 ccccctgctg gacaccaaga agcagcccac aggggcctcg ctggtcctgc aggtgtccta 1500 cacaccgctg cctggagctg tgcccctgtt cccgccccct actcctctgg agccctcccc 1560 gactctgcct gacctggatg tagtggcaga cacaggagga gaggaagaca cagaggacca 1620 gggactcact ggagatgagg cggagccatt cctggatcaa agcggaggcc cgggggctcc 1680 caccacccca aggaaactac cttcacgtcc tccgccccac taccccggga tcaaaagaaa 1740 gcgaagtgcg cctacatcta gaaagctgct gtcagacaaa ccgcaggatt tccagatcag 1800 ggtccaggtg atcgaggggc gccagctgcc gggggtgaac atcaagcctg tggtcaaggt 1860 taccgctgca gggcagacca agcggacgcg 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agtcctcttc tcccggcggg gtgccaacta 3600 ctgtggcaag aattgtggga agctacagac aatctttctg aaatatccga tggagaaggt 3660 gcctggcgcc cggatgccag tgcagatacg ggtcaagctg tggtttgggc tctctgtgga 3720 tgagaaggag ttcaaccagt ttgctgaggg gaagctgtct gtctttgctg aaacctatga 3780 gaacgagact aagttggccc ttgttgggaa ctggggcaca acgggcctca cctaccccaa 3840 gttttctgac gtcacgggca agatcaagct acccaaggac agcttccgcc cctcggccgg 3900 ctggacctgg gctggagatt ggttcgtgtg tccggagaag actctgctcc atgacatgga 3960 cgccggtcac ctgagcttcg tggaagaggt gtttgagaac cagacccggc ttcccggagg 4020 ccagtggatc tacatgagtg acaactacac cgatgtgaac ggggagaagg tgcttcccaa 4080 ggatgacatt gagtgcccac tgggctggaa gtgggaagat gaggaatggt ccacagacct 4140 caaccgggct gtcgatgagc aaggctggga gtatagcatc accatccccc cggagcggaa 4200 gccgaagcac tgggtccctg ctgagaagat gtactacaca caccgacggc ggcgctgggt 4260 gcgcctgcgc aggagggatc tcagccaaat ggaagcactg aaaaggcaca ggcaggcgga 4320 ggcggagggc gagggctggg agtacgcctc tctttttggc tggaagttcc acctcgagta 4380 ccgcaagaca gatgccttcc gccgccgccg ctggcgccgt cgcatggagc cactggagaa 4440 gacggggcct gcagctgtgt ttgcccttga gggcggccgc aataaaagat ctttattttc 4500 attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtgt ctagagcatg gcgggttaat cattaactac 4560 aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4620 gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4680 cgagcgcgc 4689 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> PolyA Signal <400> 7 aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 49 <210> 8 <211> 4592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> DYSF F3' Expression Cassette v1 <400> 8 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctgg 180 tcgactctag agttttcgtc atctggatgc tgcagggaga caagcgtgtg gcataccagc 240 gggtgcccgc ccaccaagtc ctcttctccc ggcggggtgc caactactgt ggcaagaatt 300 gtgggaagct acagacaatc tttctgaaat atccgatgga gaaggtgcct ggcgcccgga 360 tgccagtgca gatacgggtc aagctgtggt ttgggctctc tgtggatgag aaggagttca 420 accagtttgc tgaggggaag ctgtctgtct ttgctgaaac ctatgagaac gagactaagt 480 tggcccttgt tgggaactgg ggcacaacgg gcctcaccta ccccaagttt tctgacgtca 540 cgggcaagat caagctaccc aaggacagct tccgcccctc ggccggctgg acctgggctg 600 gagattggtt cgtgtgtccg gagaagactc tgctccatga catggacgcc ggtcacctga 660 gcttcgtgga agaggtgttt gagaaccaga cccggcttcc cggaggccag tggatctaca 720 tgagtgacaa ctacaccgat gtgaacgggg agaaggtgct tcccaaggat gacattgagt 780 gcccactggg ctggaagtgg gaagatgagg aatggtccac agacctcaac cgggctgtcg 840 atgagcaagg ctgggagtat agcatcacca tccccccgga gcggaagccg aagcactggg 900 tccctgctga gaagatgtac tacacacacc gacggcggcg ctgggtgcgc ctgcgcagga 960 gggatctcag ccaaatggaa gcactgaaaa ggcacaggca ggcggaggcg gagggcgagg 1020 gctgggagta cgcctctctt tttggctgga agttccacct cgagtaccgc aagacagatg 1080 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agaacgagac taagttggcc cttgttggga 300 actggggcac aacgggcctc acctacccca agttttctga cgtcacgggc aagatcaagc 360 tacccaagga cagcttccgc ccctcggccg gctggacctg ggctggagat tggttcgtgt 420 gtccggagaa gactctgctc catgacatgg acgccggtca cctgagcttc gtggaagagg 480 tgtttgagaa ccagacccgg cttcccggag gccagtggat ctacatgagt gacaactaca 540 ccgatgtgaa cggggagaag gtgcttccca aggatgacat tgagtgccca ctgggctgga 600 agtgggaaga tgaggaatgg tccacagacc tcaaccgggc tgtcgatgag caaggctggg 660 agtatagcat caccatcccc ccggagcgga agccgaagca ctgggtccct gctgagaaga 720 tgtactacac acaccgacgg cggcgctggg tgcgcctgcg caggagggat ctcagccaaa 780 tggaagcact gaaaaggcac aggcaggcgg aggcggaggg cgagggctgg gagtacgcct 840 ctctttttgg ctggaagttc cacctcgagt accgcaagac agatgccttc cgccgccgcc 900 gctggcgccg tcgcatggag ccactggaga agacggggcc tgcagctgtg tttgcccttg 960 agggggccct gggcggcgtg atggatgaca agagtgaaga ttccatgtcc gtctccacct 1020 tgagcttcgg tgtgaacaga cccacgattt cctgcatatt cgactatggg aaccgctacc 1080 atctacgctg ctacatgtac caggcccggg acctggctgc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Plasmid sequence for DYS F5 Expression Cassette <400> 18 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctctaga gtttaagctt gcatgtctaa 180 gctagaccct tcagattaaa aataactgag gtaagggcct gggtagggga ggtggtgtga 240 gacgctcctg tctctcctct atctgcccat cggccctttg gggaggagga atgtgcccaa 300 ggactaaaaa aaggccatgg agccagaggg gcgagggcaa cagacctttc atgggcaaac 360 cttggggccc tgctgtctag catgccccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc 420 aaggcctggg gacacccgag atgcctggtt ataattaacc cagacatgtg gctgcccccc 480 cccccccaac acctgctgcc tctaaaaata accctgtccc tggtggatcc cctgcatgcg 540 aagatcttcg aacaaggctg tgggggactg agggcaggct gtaacaggct tgggggccag 600 ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc atgttcccgg cgaagggcca 660 gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa ccagtgagca agtcagccct 720 tggggcagcc 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agttaatgat 8220 taacccgcca tgctacttat ctac 8244 <210> 20 <211> 7906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> full DYF expression cassette <400> 20 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120 gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctctaga gtttaagctt gcatgtctaa 180 gctagaccct tcagattaaa aataactgag gtaagggcct gggtagggga ggtggtgtga 240 gacgctcctg tctctcctct atctgcccat cggccctttg gggaggagga atgtgcccaa 300 ggactaaaaa aaggccatgg agccagaggg gcgagggcaa cagacctttc atgggcaaac 360 cttggggccc tgctgtctag catgccccac tacgggtcta ggctgcccat gtaaggaggc 420 aaggcctggg gacacccgag atgcctggtt ataattaacc cagacatgtg gctgcccccc 480 cccccccaac acctgctgcc tctaaaaata accctgtccc tggtggatcc cctgcatgcg 540 aagatcttcg aacaaggctg tgggggactg agggcaggct gtaacaggct tgggggccag 600 ggcttatacg tgcctgggac tcccaaagta ttactgttcc atgttcccgg cgaagggcca 660 gctgtccccc gccagctaga ctcagcactt agtttaggaa ccagtgagca agtcagccct 720 tggggcagcc catacaaggc catggggctg ggcaagctgc acgcctgggt ccggggtggg 780 cacggtgccc gggcaacgag ctgaaagctc atctgctctc aggggcccct ccctggggac 840 agcccctcct ggctagtcac accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc 900 tgccctcatt ctaccaccac ctccacagca cagacagaca ctcaggagca gccagcggcg 960 cgcccaggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt cccggatccg gtggtggtgc 1020 aaatcaaaga actgctcctc agtggatgtt gcctttactt ctaggcctgt acggaagtgt 1080 tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg cggctagcca ccatgctgag 1140 ggtcttcatc ctctatgccg agaacgtcca cacacccgac accgacatca gcgatgccta 1200 ctgctccgcg gtgtttgcag gggtgaagaa gagaaccaaa gtcatcaaga acagcgtgaa 1260 ccctgtatgg aatgagggat ttgaatggga cctcaagggc atccccctgg accagggctc 1320 tgagcttcat gtggtggtca aagaccatga gacgatgggg aggaacaggt tcctggggga 1380 agccaaggtc ccactccgag aggtcctcgc cacccctagt ctgtccgcca gcttcaatgc 1440 ccccctgctg gacaccaaga agcagcccac aggggcctcg ctggtcctgc aggtgtccta 1500 cacaccgctg cctggagctg tgcccctgtt cccgccccct actcctctgg agccctcccc 1560 gactctgcct gacctggatg tagtggcaga cacaggagga gaggaagaca cagaggacca 1620 gggactcact ggagatgagg cggagccatt cctggatcaa agcggaggcc cgggggctcc 1680 caccacccca aggaaactac cttcacgtcc tccgccccac taccccggga tcaaaagaaa 1740 gcgaagtgcg cctacatcta gaaagctgct gtcagacaaa ccgcaggatt tccagatcag 1800 ggtccaggtg atcgaggggc gccagctgcc gggggtgaac atcaagcctg tggtcaaggt 1860 taccgctgca gggcagacca agcggacgcg gatccacaag ggaaacagcc cactcttcaa 1920 tgagactctt ttcttcaact tgtttgactc tcctggggag ctgtttgatg agcccatctt 1980 tatcacggtg gtagactctc gttctctcag gacagatgct ctcctcgggg agttccggat 2040 ggacgtgggc accatttaca gagagccccg gcacgcctat ctcaggaagt ggctgctgct 2100 ctcagaccct gatgacttct ctgctggggc cagaggctac ctgaaaacaa gcctttgtgt 2160 gctggggcct ggggacgaag cgcctctgga gagaaaagac ccctctgaag acaaggagga 2220 cattgaaagc aacctgctcc ggcccacagg cgtagccctg cgaggagccc acttctgcct 2280 gaaggtcttc cgggccgagg acttgccgca gatggacgat gccgtgatgg acaacgtgaa 2340 acagatcttt ggcttcgaga gtaacaagaa gaacttggtg gacccctttg tggaggtcag 2400 ctttgcgggg aaaatgctgt gcagcaagat cttggagaag acggccaacc ctcagtggaa 2460 ccagaacatc acactgcctg ccatgtttcc ctccatgtgc gaaaaaatga ggattcgtat 2520 catagactgg gaccgcctga ctcacaatga catcgtggct accacctacc tgagtatgtc 2580 gaaaatctct gcccctggag gagaaataga agaggagcct gcaggtgctg tcaagccttc 2640 gaaagcctca gacttggatg actacctggg cttcctcccc acttttgggc cctgctacat 2700 caacctctat ggcagtccca gagagttcac aggcttccca gacccctaca cagagctcaa 2760 cacaggcaag ggggaaggtg tggcttatcg tggccggctt ctgctctccc tggagaccaa 2820 gctggtggag cacagtgaac agaaggtgga ggaccttcct gcggatgaca tcctccgggt 2880 ggagaagtac cttaggaggc gcaagtactc cctgtttgcg gccttctact cagccaccat 2940 gctgcaggat gtggatgatg ccatccagtt tgaggtcagc atcgggaact acgggaacaa 3000 gttcgacatg acctgcctgc cgctggcctc caccactcag tacagccgtg cagtctttga 3060 cgggtgccac tactactacc taccctgggg taacgtgaaa cctgtggtgg tgctgtcatc 3120 ctactgggag gacatcagcc atagaatcga gactcagaac cagctgcttg ggattgctga 3180 ccggctggaa gctggcctgg agcaggtcca cctggccctg aaggcgcagt gctccacgga 3240 ggacgtggac tcgctggtgg ctcagctgac ggatgagctc atcgcaggct gcagccagcc 3300 tctgggtgac atccatgaga caccctctgc cacccacctg gaccagtacc tgtaccagct 3360 gcgcacccat cacctgagcc aaatcactga ggctgccctg gccctgaagc tcggccacag 3420 tgagctccct gcagctctgg agcaggcgga ggactggctc ctgcgtctgc gtgccctggc 3480 agaggagccc cagaacagcc tgccggacat cgtcatctgg atgctgcagg gagacaagcg 3540 tgtggcatac cagcgggtgc ccgcccacca agtcctcttc tcccggcggg gtgccaacta 3600 ctgtggcaag aattgtggga agctacagac aatctttctg aaatatccga tggagaaggt 3660 gcctggcgcc cggatgccag tgcagatacg ggtcaagctg tggtttgggc tctctgtgga 3720 tgagaaggag ttcaaccagt ttgctgaggg gaagctgtct gtctttgctg aaacctatga 3780 gaacgagact aagttggccc ttgttgggaa ctggggcaca acgggcctca cctaccccaa 3840 gttttctgac gtcacgggca agatcaagct acccaaggac agcttccgcc cctcggccgg 3900 ctggacctgg gctggagatt ggttcgtgtg tccggagaag actctgctcc atgacatgga 3960 cgccggtcac ctgagcttcg tggaagaggt gtttgagaac cagacccggc ttcccggagg 4020 ccagtggatc tacatgagtg acaactacac cgatgtgaac ggggagaagg tgcttcccaa 4080 ggatgacatt gagtgcccac tgggctggaa gtgggaagat gaggaatggt ccacagacct 4140 caaccgggct gtcgatgagc aaggctggga gtatagcatc accatccccc cggagcggaa 4200 gccgaagcac tgggtccctg ctgagaagat gtactacaca caccgacggc ggcgctgggt 4260 gcgcctgcgc aggagggatc tcagccaaat ggaagcactg aaaaggcaca ggcaggcgga 4320 ggcggagggc gagggctggg agtacgcctc tctttttggc tggaagttcc acctcgagta 4380 ccgcaagaca gatgccttcc gccgccgccg ctggcgccgt cgcatggagc cactggagaa 4440 gacggggcct gcagctgtgt ttgcccttga gggggccctg ggcggcgtga tggatgacaa 4500 gagtgaagat tccatgtccg tctccacctt gagcttcggt gtgaacagac ccacgatttc 4560 ctgcatattc gactatggga accgctacca tctacgctgc tacatgtacc aggcccggga 4620 cctggctgcg atggacaagg actctttttc tgatccctat gccatcgtct ccttcctgca 4680 ccagagccag aagacggtgg tggtgaagaa cacccttaac cccacctggg accagacgct 4740 catcttctac gagatcgaga tctttggcga gccggccaca gttgctgagc aaccgcccag 4800 cattgtggtg gagctgtacg accatgacac ttatggtgca gacgagttta tgggtcgctg 4860 catctgtcaa ccgagtctgg aacggatgcc acggctggcc tggttcccac tgacgagggg 4920 cagccagccg tcgggggagc tgctggcctc ttttgagctc atccagagag agaagccggc 4980 catccaccat attcctggtt ttgaggtgca ggagacatca aggatcctgg atgagtctga 5040 ggacacagac ctgccctacc caccacccca gagggaggcc aacatctaca tggttcctca 5100 gaacatcaag ccagcgctcc agcgtaccgc catcgagatc ctggcatggg gcctgcggaa 5160 catgaagagt taccagctgg ccaacatctc ctcccccagc ctcgtggtag agtgtggggg 5220 ccagacggtg cagtcctgtg tcatcaggaa cctccggaag aaccccaact ttgacatctg 5280 caccctcttc atggaagtga tgctgcccag ggaggagctc tactgccccc ccatcaccgt 5340 caaggtcatc gataaccgcc agtttggccg ccggcctgtg gtgggccagt gtaccatccg 5400 ctccctggag agcttcctgt gtgaccccta ctcggcggag agtccatccc cacagggtgg 5460 cccagacgat gtgagcctac tcagtcctgg ggaagacgtg ctcatcgaca ttgatgacaa 5520 ggagcccctc atccccatcc aggaggaaga gttcatcgat tggtggagca aattctttgc 5580 ctccataggg gagagggaaa agtgcggctc ctacctggag aaggattttg acaccctgaa 5640 ggtctatgac acacagctgg agaatgtgga ggcctttgag ggcctgtctg acttttgtaa 5700 caccttcaag ctgtaccggg gcaagacgca ggaggagaca gaagatccat ctgtgattgg 5760 tgaatttaag ggcctcttca aaatttatcc cctcccagaa gacccagcca tccccatgcc 5820 cccaagacag ttccaccagc tggccgccca gggaccccag gagtgcttgg tccgtatcta 5880 cattgtccga gcatttggcc tgcagcccaa ggaccccaat ggaaagtgtg atccttacat 5940 caagatctcc atagggaaga aatcagtgag tgaccaggat aactacatcc cctgcacgct 6000 ggagcccgta tttggaaaga tgttcgagct gacctgcact ctgcctctgg agaaggacct 6060 aaagatcact ctctatgact atgacctcct ctccaaggac gaaaagatcg gtgagacggt 6120 cgtcgacctg gagaacaggc tgctgtccaa gtttggggct cgctgtggac tcccacagac 6180 ctactgtgtc tctggaccga accagtggcg ggaccagctc cgcccctccc agctcctcca 6240 cctcttctgc cagcagcata gagtcaaggc acctgtgtac cggacagacc gtgtaatgtt 6300 tcaggataaa gaatattcca ttgaagagat agaggctggc aggatcccaa acccacacct 6360 gggcccagtg gaggagcgtc tggctctgca tgtgcttcag cagcagggcc tggtcccgga 6420 gcacgtggag tcacggcccc tctacagccc cctgcagcca gacatcgagc aggggaagct 6480 gcagatgtgg gtcgacctat ttccgaaggc cctggggcgg cctggacctc ccttcaacat 6540 caccccacgg agagccagaa ggtttttcct gcgttgtatt atctggaata ccagagatgt 6600 gatcctggat gacctgagcc tcacggggga gaagatgagc gacatttatg tgaaaggttg 6660 gatgattggc tttgaagaac acaagcaaaa gacagacgtg cattatcgtt ccctgggagg 6720 tgaaggcaac ttcaactgga ggttcatttt ccccttcgac tacctgccag ctgagcaagt 6780 ctgtaccatt gccaagaagg atgccttctg gaggctggac aagactgaga gcaaaatccc 6840 agcacgagtg gtgttccaga tctgggacaa tgacaagttc tcctttgatg attttctggg 6900 ctccctgcag ctcgatctca accgcatgcc caagccagcc aagacagcca agaagtgctc 6960 cttggaccag ctggatgatg ctttccaccc agaatggttt gtgtcccttt ttgagcagaa 7020 aacagtgaag ggctggtggc cctgtgtagc agaagagggt gagaagaaaa tactggcggg 7080 caagctggaa atgaccttgg agattgtagc agagagtgag catgaggagc ggcctgctgg 7140 ccagggccgg gatgagccca acatgaaccc taagcttgag gacccaaggc gccccgacac 7200 ctccttcctg tggtttacct ccccatacaa gaccatgaag ttcatcctgt ggcggcgttt 7260 ccggtgggcc atcatcctct tcatcatcct cttcatcctg ctgctgttcc tggccatctt 7320 catctacgcc ttcccgaact atgctgccat gaagctggtg aagcccttca gctgaggact 7380 ctcctgccct gtagaagggg ccgtggggtc ccctccagca tgggactggc ctgcctcctc 7440 cgcccagctc ggcgagctcc tccagacctc ctaggcctga ttgtcctgcc agggtgggca 7500 gacagacaga tggaccggcc cacactccca gagttgctaa catggagctc tgagatcacc 7560 ccacttccat catttccttc tcccccaacc caacgctttt ttggatcagc tcagacatat 7620 ttcagtataa aacagttgga accacaaaaa aaaaaaaaaa aagtcgacgc ggccgcaata 7680 aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgtctag agcatggcta 7740 cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 7800 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 7860 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgc 7906 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 21 His His His His His His 1 5 <210> 22 <211> 250 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(250) <223> This sequence may encompass 100-250 nucleotides <400> 22 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa 250

Claims (135)

  1. 인간 디스페린(human dysferlin, hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열은:
    (a) 서열번호 1, 6, 또는 18의 뉴클레오티드 서열;
    (b) 서열번호 1, 6, 또는 18의 그들 각각의 전체 길이(full length)에 걸쳐 서열번호 1, 서열번호 6, 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    (c) 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열;
    (d) 서열번호 13 또는 15의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    (e) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는
    (f) 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    로 구성되는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    역전된 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR), 프로모터(promoter), 인트론(intron), 선택 마커(selection marker), 또는 복제기점(origin of replication; ORI)으로부터 선택된 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 ITR은 AAV ITR인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 ITR을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITR은 서열번호 3 또는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 근육-특이적 프로모터(muscle-specific promoter)를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 근육-특이적 프로모터는 인간 골격 액틴 유전자 요소, 심장 액틴 유전자 요소, 데스민 프로모터, 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 트로포닌 I(TNNI2) 프로모터, 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 mef 결합 요소, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 절단된 MCK(tMCK) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 혼성 a-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7) 프로모터, C5-12 프로모터, 뮤린 크레아틴 키나제 인핸서 요소, 골격 빠른-트위치 트로포닌 c 유전자 요소, 느린-트위치 심장 트로포닌 c 유전자 요소(slow-twitch cardiac troponin c gene element), 느린-트위치 트로포닌 i 유전자 요소, 저산소증-유도성 핵 인자(hypoxia-inducible nuclear factor)로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 근육-특이적 프로모터는 MHCK7 프로모터를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 재조합 프로모터를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 재조합 프로모터는 재조합 근육-특이적 프로모터를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 2 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 2 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 5' 공여체 부위(donor site), 분지점(branch point), 및/또는 3' 스플라이스 부위(splice site)를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 2 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 키메라 인트론(chimeric intron)을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 2 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 인간 β-글로빈 유전자로부터의 5' 공여체 부위를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  16. 제 2 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG) 중쇄로부터의 분지점을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 2 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 3' 스플라이스 수용체 부위(splice acceptor site)를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  18. 제 2 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 2 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자(lactamase gene) 또는 카나마이신 내성 유전자(kanamycin resistance gene)인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 1 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  25. 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열로서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 상기 제 2 뉴클레오티드 서열은:
    (a) 서열번호 2, 8 또는 19의 뉴클레오티드 서열;
    (b) 서열번호 2, 8 또는 19의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2, 8 또는 19의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    (c) 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열;
    (d) 서열번호 14 또는 16의 그들 각각의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    (e) hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는
    (f) 상기 (d)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (e)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열;
    로 구성되는, 재조합 폴리뉴클레오티드 서열.
  26. 제 25 항에 있어서,
    역전된 말단 반복부(ITR), 선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(untranslated region; UTR), 또는 폴리아데닐화(polyadenylation; 폴리A) 신호를 포함하는 하나 이상의 추가 뉴클레오티드를 더 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 ITR은 AAV ITR인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  29. 제 25 항, 제 27 항 및 제 28 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 2개의 ITR을 더 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  30. 제 26 항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  31. 제 26 항 내지 제 30 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리A 신호는 인공 폴리A 신호(artificial polyA signal)인, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  32. 제 26 항 내지 제 31 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리A 신호는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  33. 제 26 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  35. 제 25 항에 있어서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 또는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  36. 제 25 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 hDYSF 단백질의 제 1 단편을 암호화하는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  37. 제 25 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  38. 제 25 항 내지 제 36 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 뉴클레오티드는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  39. 이중 아데노-연관 바이러스(adeno-associated viral, AAV) 벡터 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함; 및
    (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함;
    를 포함하는, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템.
  40. 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAVrh.10, AAVrh.20, 또는 AAVrh.74인, AAV 벡터.
  42. 제 40 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAVrh.74인, AAV 벡터.
  43. 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAVrh.10, AAVrh.20, 또는 AAVrh.74인, AAV 벡터.
  45. 제 43 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAVrh.74인, AAV 벡터.
  46. 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 제 40 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는, 조성물.
  47. 조성물로서,
    (a) 제 1 재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant adeno-associated viral; rAAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 rAAV 벡터는 제 40 항 내지 제 42 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함함; 및
    (b) 제 2 rAAV 벡터, 여기서 상기 제 2 rAAV 벡터는 제 43 항 내지 제 45 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함함;
    를 포함하는, 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 rAAV 벡터의 몰비는 약 100:1-1:100, 약 10:1-1:10, 약 2:1-1:2, 또는 약 1:1인, 조성물.
  49. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서, 상기 AAV 벡터는:
    (a) 제 1 역전된 말단 반복부(inverted terminal repeat; ITR);
    (b) 인간 디스페린(human dysferlin, hDYSF) 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는:
    i. 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열;
    ii. 서열번호 1 또는 6의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1 또는 6의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    iii. 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열;
    iv. 서열번호 13 또는 15의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 13 또는 15의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    v. hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성됨; 또는
    vi. 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    로 구성됨; 및
    (c) 제 2 ITR;
    을 포함하되,
    상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹되는(flanked), AAV 벡터.
  50. 제 49 항에 있어서,
    프로모터, 인트론, 선택 마커, 또는 복제기점(ORI)으로부터 선택된 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, AAV 벡터.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서,
    상기 ITR은 AAV ITR인, AAV 벡터.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR인, AAV 벡터.
  53. 제 49 항 내지 제 52 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 및/또는 제 2 ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  54. 제 50 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 근육-특이적 프로모터인, AAV 벡터.
  55. 제 54 항에 있어서,
    상기 근육-특이적 프로모터는 미오신 중쇄 복합체-E 박스 근육 크레아틴 키나제 융합 인핸서/프로모터(myosin heavy chain complex―E box muscle creatine kinase fusion enhancer/promoter)인, AAV 벡터.
  56. 제 50 항 내지 제 53 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 재조합 프로모터인, AAV 벡터.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 재조합 프로모터는 재조합 근육-특이적 프로모터인, AAV 벡터.
  58. 제 57 항에 있어서,
    상기 재조합 근육-특이적 프로모터는 MHCK7 프로모터인, AAV 벡터.
  59. 제 50 항 내지 제 58 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  60. 제 50 항 내지 제 59 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 5' 공여체 부위, 분지점, 및/또는 3' 스플라이스 부위를 포함하는, AAV 벡터.
  61. 제 50 항 내지 제 60 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 키메라 인트론인, AAV 벡터.
  62. 제 50 항 내지 제 61 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 인간 β-글로빈 유전자로부터의 5' 공여체 부위를 포함하는, AAV 벡터.
  63. 제 50 항 내지 제 62 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 분지점을 포함하는, AAV 벡터.
  64. 제 50 항 내지 제 63 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄로부터의 3' 스플라이스 수용체 부위를 포함하는, AAV 벡터.
  65. 제 50 항 내지 제 64 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  66. 제 50 항 내지 제 65 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자인, AAV 벡터.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자인, AAV 벡터.
  68. 제 49 항 내지 제 67 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 서열번호 6 또는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  69. 제 49 항 내지 제 68 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는, AAV 벡터.
  70. 제 49 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는, AAV 벡터.
  71. 제 49 항 내지 제 69 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는, AAV 벡터.
  72. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서, 상기 AAV 벡터는:
    (a) 제 1 역전된 말단 반복부(ITR);
    (b) 인간 디스페린 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는:
    i. 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열;
    ii. 서열번호 2 또는 8의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 2 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    iii. 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열;
    iv. 서열번호 14 또는 16의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 14 또는 16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열;
    v. hDYSF 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 hDYSF 단백질의 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성됨; 또는
    vi. 상기 (v)의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 상기 (v)의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드;
    로 구성됨; 및
    (c) 제 2 ITR;
    을 포함하되,
    상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 1 및 제 2 ITR에 의해 플랭킹되는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  73. 제 72 항에 있어서,
    선택 마커, 복제기점(ORI), 비번역 영역(UTR), 또는 폴리아데닐화(폴리A) 신호로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, AAV 벡터.
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서,
    상기 ITR은 AAV ITR인, AAV 벡터.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 AAV ITR은 AAV2 ITR 또는 AAV3 ITR인, AAV 벡터.
  76. 제 72 항 내지 제 75 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITR은 서열번호 3 또는 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  77. 제 73 항 내지 제 76 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리A 신호는 인공 폴리A 신호인, AAV 벡터.
  78. 제 73 항 내지 제 77 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리A 신호는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  79. 제 73 항 내지 제 78 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자인, AAV 벡터.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 항생제 내성 유전자는 β-락타마제 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자인, AAV 벡터.
  81. 제 72 항 내지 제 80 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 서열번호 8 또는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  82. 제 72 항 내지 제 81 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 hDYSF 단백질의 제 2 단편을 암호화하는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하지 않는, AAV 벡터.
  83. 제 72 항 내지 제 82 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 AAV 서열을 포함하지 않는, AAV 벡터.
  84. 제 72 항 내지 제 82 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 하나 이상의 ITR 이외의 바이러스 서열을 포함하지 않는, AAV 벡터.
  85. 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 제 1 AAV 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 제 40 항 내지 제 42 항 및 제 49 항 내지 제 71 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함함; 및
    (b) 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 제 43 항 내지 제 45 항 제 72 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함함;
    를 포함하는, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템.
  86. 제 85 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAVrh.10, AAVrh.20, 또는 AAVrh.74인, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템.
  87. 제 85 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터는 AAVrh.74인, 이중 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 시스템.
  88. 아데노-연관 바이러스(AAV) 패키징 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드;
    (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드; 및
    (c) rep-cap 플라스미드;
    를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 패키징 시스템.
  89. 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드; 및
    (b) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드;
    를 포함하는, 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템.
  90. 제 88 항 또는 제 89 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드는 pHELP 플라스미드를 포함하는, 아데노-연관 바이러스 패키징 시스템.
  91. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법으로서,
    상기 방법은 세포를, 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 또는 제 88 항의 AAV 패키징 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  92. 제 91 항에 있어서,
    상기 세포는 숙주 세포, 선택적으로 포유동물 숙주 세포, 추가로 선택적으로 HEK293인, 방법.
  93. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 생산하는 방법으로서,
    상기 방법은 패키징 세포주(packaging cell line)를, 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드로 형질도입(transducing)하는 것을 포함하되, 상기 패키징 세포주는 아데노-연관 바이러스 rep 및 cap 유전자를 발현하는 것인, 방법.
  94. 제 93 항에 있어서,
    상기 AAV rep 유전자는 Rep78인, 방법.
  95. 제 93 항에 있어서,
    상기 AAV cap 유전자는 Rh74 cap 유전자인, 방법.
  96. 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포.
  97. 제 1 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 포함하는, 세포.
  98. 제 88 항 내지 제 97 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라스미드는 서열번호 18 또는 19와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는, AAV 패키징 시스템, 방법, 또는 세포.
  99. 제 88 항 내지 제 97 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라스미드는 서열번호 18 또는 19의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, AAV 패키징 시스템, 방법, 또는 세포.
  100. 디스페리노병증(dysferlinopathy)을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게:
    (a) 유효량의 제 1 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드임; 및
    (b) 유효량의 제 2 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드임;
    을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  101. 제 100 항에 있어서,
    상기 제 1 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 근육내로 또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  102. 제 100 항 또는 제 101 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  103. 디스페리노병증을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게:
    (a) 유효량의 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 제 40 항 내지 제 42 항 및 제 49 항 내지 제 71 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터임; 및
    (b) 유효량의 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 제 43 항 내지 제 45 항 및 제 72 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터임;
    를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  104. 제 103 항에 있어서,
    상기 제 1 AAV 벡터 및/또는 상기 제 2 AAV 벡터는 근육내로 또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  105. 제 103 항 또는 제 104 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 AAV 벡터는 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 방법.
  106. 디스페리노병증을 치료하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 대상체에게 제 39 항 또는 제 85 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항의 AAV 이중 벡터 시스템을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  107. 제 106 항에 있어서,
    상기 AAV 이중 벡터 시스템은 근육내로 또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  108. 디스페리노병증을 치료하는 방법으로서,
    이를 필요로 하는 대상체에게 제 46 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  109. 제 108 항에 있어서,
    상기 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여되는, 방법.
  110. 제 100 항 내지 제 109 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증(Miyoshi myopathy)인, 방법.
  111. 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도로서, 상기 조성물은:
    (a) 제 1 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 1 폴리뉴클레오티드는 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드임; 및
    (b) 제 2 폴리뉴클레오티드, 여기서 상기 제 2 폴리뉴클레오티드는 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드임;
    을 포함하는, 용도.
  112. 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도로서, 상기 조성물은:
    (a) 유효량의 제 1 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 여기서 상기 제 1 AAV 벡터는 제 40 항 내지 제 42 항 및 제 49 항 내지 제 71 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터임; 및
    (b) 유효량의 제 2 AAV 벡터, 여기서 상기 제 2 AAV 벡터는 제 43 항 내지 제 45 항 및 제 72 항 내지 제 84 항 중의 어느 한 항의 AAV 벡터임;
    을 포함하는, 용도.
  113. 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제 39 항 또는 제 85 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항의 AAV 이중 벡터 시스템을 포함하는, 용도.
  114. 디스페리노병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스페리노병증을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제 46 항 내지 제 48 항 중의 어느 한 항의 조성물의 용도.
  115. 제 111 항 내지 제 114 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 근육내로 또는 정맥내로 투여되는, 용도.
  116. 제 111 항 내지 제 114 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증(Miyoshi myopathy)인, 용도.
  117. 제 100 항 내지 제 110 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 AAV 벡터의 유효량은 약 1×106 내지 1×1016 vg/kg, 약 1×108 내지 1×1015 vg/kg, 또는 약 1×1010 내지 1×1014 vg/kg이되, 그 투여량은 슈퍼코일 PCR 정량화 표준(supercoiled PCR quantification standard)에 의해서 측정되는, 방법.
  118. 제 117 항에 있어서,
    상기 제 1 AAV 벡터의 유효량은 1.2e13 vg/kg이되, 그 투여량은 슈퍼코일 PCR 정량화 표준에 의해서 측정되는, 방법.
  119. 제 100 항 내지 제 110 항 및 제 117 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 2 AAV 벡터의 유효량은 약 1×106 내지 1×1016 vg/kg, 약 1×108 내지 1×1015 vg/kg, 또는 약 1×1010 내지 1×1014 vg/kg이되, 그 투여량은 슈퍼코일 PCR 표준(supercoiled PCR standard)에 의해서 측정되는, 방법.
  120. 제 119 항에 있어서,
    상기 제 2 AAV 벡터의 유효량은 1.2e13 vg/kg이되, 그 투여량은 슈퍼코일 PCR 정량화 표준에 의해서 측정되는, 방법.
  121. 제 117 항 내지 제 120 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터의 총 투여량은 2.4e13 vg/kg이되, 그 투여량은 슈퍼코일 PCR 표준에 의해서 측정되는, 방법.
  122. 인간 디스페린(hDYSF) 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  123. 제 122 항에 있어서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
  124. 제 122 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
    세포를, 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드 및 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  125. 제 122 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
    세포를 제 39 항 및 제 85 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항의 이중 AAV 벡터 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  126. 제 124 항 또는 제 125 항에 있어서,
    상기 세포는 진핵 세포(eukaryotic cell)인, 방법.
  127. 제 124 항 또는 제 125 항에 있어서,
    상기 세포는 근육 세포, 심장 세포, 줄기 세포, 위성 세포, 및/또는 간 세포인, 방법.
  128. 제 122 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
    대상체에게 제 1 항 및 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드 및 제 25 항 및 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  129. 제 122 항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,
    대상체에게 제 39 항 및 제 85 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항의 이중 AAV 벡터 시스템 또는 제 47 항 또는 제 48 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  130. 대상체의 근이영양증(muscular dystrophy)을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에서의 제 122 항의 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하는, 방법.
  131. 제 130 항에 있어서,
    대상체에게 제 1 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드 및 제 25 항 내지 제 38 항 중의 어느 한 항의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 제 47 항 또는 제 48 항의 조성물로 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  132. 제 130 항에 있어서,
    대상체에게 제 39 항 및 제 85 항 내지 제 87 항 중의 어느 한 항의 이중 AAV 벡터 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  133. 제 128 항 내지 제 132 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개(canine), 양(ovine), 말(horse), 돼지(porcine), 뮤린(murine), 래트(rat), 토끼(rabbit), 소(bovine), 또는 고양이(feline)로부터 선택된 포유동물인, 방법.
  134. 제 128 항 내지 제 133 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 디스페리노병증을 앓고 있는 것인, 방법.
  135. 제 134 항에 있어서,
    상기 디스페리노병증은 사지 근이영양증 유형 2B(LGMD2B) 또는 미요시 근병증(Miyoshi myopathy)인, 방법.
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