KR102693318B1 - 리소좀 장애를 위한 유전자 요법 - Google Patents

리소좀 장애를 위한 유전자 요법 Download PDF

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Abstract

일부 측면에서, 본 개시내용은 비정상적인 리소좀 기능과 연관된 질환, 예를 들어, 파킨슨병 및 고셰병 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 베타-글루코세레브로시다제 (GBA) 또는 그의 일부, 리소좀 막 단백질 2 (LIMP2), 프로사포신, 또는 상기의 임의의 조합을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 발현 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 파킨슨병 방법을 필요로 하는 대상체에게 상기 발현 구축물을 투여함으로써 파킨슨병 방법을 제공한다.

Description

리소좀 장애를 위한 유전자 요법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. 119(e)하에 2017년 10월 3일 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/567,296 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS")의 출원일의 이익을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다.
고셰병(Gaucher disease)은 리소좀 산 β-글루코세레브로시다제 (Gcase, "GBA")의 결핍에 기인한, 선천성 글리코스핑고리피드 대사 이상 희귀 질환이다. 환자는 간비장비대, 범혈구감소증으로 이어지는 골수 기능 부전, 폐 장애 및 섬유증, 골 결손을 비롯한, 비-CNS 증상 및 소견을 앓는다. 추가로, 상당수의 환자들은 결함성 도약 안구 운동 및 시선, 발작, 인지 결손, 발달 지연, 및 파킨슨병을 비롯한 운동 장애를 포함하는, 신경학적 증상을 앓는다.
말초 질환 및 조혈 골수 및 내장에서의 주요 임상 증상을 처리하는 여러 치료제들이 존재하며, 이는 효소 대체 요법, 결함성 Gcase에 결합하고, 안정성을 개선시키는 샤페론 유사 소분자 약물, 및 증상 및 병상으로 이어지는, 고셰병에서 축적되는 기질의 생산을 차단하는 기질 감소 요법을 포함한다. 그러나, 고셰병의 다른 측면 및 치료에 대하여 난치성인 것으로 보인다.
(GBA1 유전자의 두 염색체 대립유전자 모두에 돌연변이를 갖는) 고셰병 환자 이외에도, GBA1의 단 하나의 대립유전자에만 돌연변이를 갖는 환자는 파킨슨병 (PD)에 걸릴 위험이 매우 높다. 보행 장애, 휴식시 떨림, 경직, 및 흔히 우울증, 수면 장애, 및 인지 저하를 포함하는, PD 증상의 중증도는 효소 활성 감소 정도와 상관관계를 갖는다. 따라서, 고셰병 환자는 가장 중증의 과정을 갖는 반면, GBA1 중 단일의 가벼운 돌연변이를 갖는 환자는 전형적으로 더욱 양성의 과정을 갖는다. 돌연변이 보유자는 또한, 실행 기능 장애, 정신병, 및 PD 유사 운동 장애를 특징으로 하는 루이소체 치매, 및 특유의 운동 및 인지 장애를 갖는 다계통 위축을 비롯한, 다른 PD 관련 장애의 위험이 높다. 이러한 장애의 거침없이 계속되는 과정을 변경하는 요법은 현재 없다.
예컨대, Gcase (예컨대, GBA1 유전자의 유전자 생성물)와 같은 효소 결핍 뿐만 아니라, 리소좀 기능 또는 리소좀으로의 거대분자 수송에 관여하는 다수의 유전자 (예컨대, 리소좀 막 단백질 1 (LIMP), 이는 또한 SCARB2로도 지칭)에서의 일반적인 변이체가 PD 위험 증가와 연관이 있다. 본 개시내용은 부분적으로 Gcase (또는 그의 일부), 프로사포신 (또는 그의 일부), LIMP2 (또는 그의 일부), 또는 Gcase (또는 그의 일부) 및 PD 연관 유전자 (예컨대, LIMP2, 프로사포신, 및/또는 α-시누클레인 (α-Syn))로부터의 하나 이상의 추가 유전자 생성물의 조합을 코딩하는 발현 구축물 (예컨대, 벡터)에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 유전자 생성물의 조합은 대상체에서 발현되었을 때, 함께 (예컨대, 시너지적으로) 작용하여 PD의 하나 이상의 징후 및 증상을 감소시킨다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 Gcase (예컨대, GBA1 유전자의 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된) Gcase 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Gcase를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO:) 14에 기재된 바와 같은 (예컨대, NCBI 참조 서열 NP_000148.2에 기재된 바와 같은) 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호 15에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR), 예를 들어, Gcase를 코딩하는 핵산 서열에 플랭킹된 AAV ITR을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 프로사포신 (예컨대, PSAP 유전자의 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된) 프로사포신 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로사포신을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호 16에 기재된 바와 같은 (예컨대, NCBI 참조 서열 NP_002769.1에 기재된 바와 같은) 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호 17에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR), 예를 들어, 프로사포신을 코딩하는 핵산 서열에 플랭킹된 AAV ITR을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 LIMP2/SCARB2 (예컨대, SCARB2 유전자의 유전자 생성물)를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된) SCARB2 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LIMP2/SCARB2를 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호 18에 기재된 바와 같은 (예컨대, NCBI 참조 서열 NP_005497.1에 기재된 바와 같은) 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호 29에 기재된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR), 예를 들어, SCARB2를 코딩하는 핵산 서열에 플랭킹된 AAV ITR을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산이며, 여기서 각 유전자 생성물은 독립적으로 표 1에 기재된 유전자 생성물 또는 그의 일부로부터 선택되는 것인, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물 또는 제2 유전자 생성물은 Gcase 단백질 또는 그의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물 또는 제2 유전자 생성물은 LIMP2 또는 그의 일부, 또는 프로사포신 또는 그의 일부이다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물은 Gcase 단백질이고, 제2 유전자 생성물은 LIMP2 또는 그의 일부, 또는 프로사포신 또는 그의 일부이다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 간섭 핵산 (예컨대, shRNA, miRNA, dsRNA 등)을 추가로 코딩한다. 일부 실시양태에서, 간섭 핵산은 α-시누클레인 (α-시누클레인)의 발현을 억제시킨다. 일부 실시양태에서, α-시누클레인을 표적화하는 간섭 핵산은 서열식별번호 20-25 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, α-시누클레인을 표적화하는 간섭 핵산은 서열식별번호 20-25 중 어느 하나에 기재된 서열에 결합한다 (예컨대, 그와 하이브리드화한다).
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 하나 이상의 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, CD68 프로모터, 또는 JeT 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 RNA pol II 프로모터 (예컨대, 또는 RNA pol III 프로모터 (예컨대, U6 등)이다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES는 제1 유전자 생성물과 제2 유전자 생성물 사이에 위치한다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 자기 절단 펩티드 코딩 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기 절단 펩티드는 T2A 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR 서열은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물에 플랭킹된다 (예컨대, 5' 단부에서 3' 단부 방향으로 하기와 같이 배열되어 있다: ITR-제1 유전자 생성물-제2 유전자 생성물-ITR). 일부 실시양태에서, 단리된 핵산의 ITR 서열 중 하나에는 기능성 말단 분해 부위 (trs)가 결손되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ITR 중 하나는 ΔITR이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 변형된 "D" 영역 (예컨대, 야생형 AAV2 ITR 기준으로 변형된 D 서열, 서열식별번호 29)을 갖는 ITR을 포함하는 rAAV 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 D 영역을 갖는 ITR은 rAAV 벡터의 5' ITR이다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역은 예를 들어, 서열식별번호 26에 기재되어 있는 바와 같은 "S" 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역을 갖는 ITR은 rAAV 벡터의 3' ITR이다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역은 "D" 영역이 ITR의 3' 단부에 (예컨대, 벡터의 트랜스진 인서트 기준으로 ITR의 외부 또는 말단 단부 상에) 위치하는 3' ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 영역은 서열식별번호 26 또는 27에 기재되어 있는 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 (예컨대, rAAV 벡터)는 TRY 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, TRY 영역은 서열식별번호 28에 기재되어 있는 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 단리된 핵산은 서열식별번호 1 내지 13, 15, 17, 및 19 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 단리된 핵산은 서열식별번호 14, 16, 및 18중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 펩티드를 코딩한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일-가닥 (예컨대, 단일-가닥 DNA)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 단리된 핵산, 또는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 캡시드 단백질 및 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
일부 실시양태에서, 캡시드 단백질, 예를 들어, AAV9 캡시드 단백질 또는 AAVrh.10 캡시드 단백질은 혈액-뇌 장벽을 건널 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및 비-뉴런 세포를 형질도입한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 조성물 (예컨대, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨병을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 CNS에의 직접 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 대뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사, 대수조내 주사, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS에의 직접 주사는 컨벡션 강화 전달법 (CED)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여는 말초 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 정맥내 주사이다.
도 1은 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부)를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다.
도 2는 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부) 및 LIMP2 (SCARB2) 또는 그의 일부를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다. Gcase 및 LIMP2의 코딩 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 이격되어 있다.
도 3은 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부) 및 LIMP2 (SCARB2) 또는 그의 일부를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다. Gcase 및 LIMP2의 코딩 서열의 발현은 각각 별개의 프로모터에 의해 구동된다.
도 4는 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부), LIMP2 (SCARB2) 또는 그의 일부, 및 α-Syn에 대한 간섭 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다.
도 5는 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부), 프로사포신 (예컨대, PSAP 또는 그의 일부), 및 α-Syn에 대한 간섭 RNA를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다.
도 6은 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부) 및 프로사포신 (예컨대, PSAP 또는 그의 일부)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다. Gcase 및 프로사포신의 코딩 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 이격되어 있다.
도 7은 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부)를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 rAAV 벡터의 한 실시양태를 도시한 개략도이다. 본 실시양태에서, 벡터는 인간 GBA1의 코돈 최적화된 코딩 서열을 구성적으로 발현하기 위해, 4개 파트: CMV 인핸서 (CMVe), CBA 프로모터 (CBAp), 엑손 1, 및 인트론 (int)으로 이루어진, CBA 프로모터 요소 (CBA)를 포함한다. 3' 영역은 또한 WPRE 조절 요소, 이어서, bGH 폴리A 테일을 함유한다. 3개의 전사 조절 활성화 부위가 프로모터 영역의 5' 단부에 포함되어 있다: TATA, RBS, 및 YY1. 플랭킹 ITR을 통해 개재 서열은 정확하게 패키징될 수 있다. 5' ITR 서열의 두 변이체 (삽입 박스)를 평가하였다: 상기 변이체들은 야생형 AAV2 ITR의 20-뉴클레오티드 "D" 영역 내에서 수개의 뉴클레오티드 차이를 보인다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 상단 라인에 제시된 "D" 도메인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터 돌연변이체 "D" 도메인 (예컨대, "S" 도메인, 여기서 뉴클레오티드 변이는 하단 라인에 제시)을 보유한다.
도 8은 도 7에 기술된 rAAV 벡터를 코딩하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도이다.
도 9는 파킨슨병을 앓는 CBE 마우스 모델에서의 Gcase (예컨대, GBA1 또는 그의 일부)를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 rAAV의 전달에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. P8에 PBS 비히클, 25 mg/kg CBE, 37.5 mg/kg CBE, 또는 50 mg/kg CBE (좌측부터 우측으로)의 매일 IP 전달을 개시하였다. 매일 2회에 걸쳐 생존 (좌측 상단)을 체크하였고, 체중 (우측 상단)은 매일 체크하였다. 모든 군은 n = 8으로 시작하였다. P23에 오픈 필드에서의 총 이동 거리 (좌측 하단) 및 P24에 로타로드에서 떨어질 때까지의 시간 (하단의 중간)에 의해 행동을 사정하였다. CBE를 중단한 조건 (3일째) 및 CBE를 중단하지 않은 조건 (1일째), 둘 모두의 PBS 및 25 mg/kg CBE 처리군 중의 마우스의 피질에서 GCase 기질의 수준을 분석하였다. 응집체 GluSph 및 GalSph 수준 (우측 하단)은 조직 습식 중량 1 mg당 pmol로 제시되어 있다. 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001, 선형 회귀에 의한 처리군에 대한 명목 p 값.
도 10은 CBE 마우스 모델에서의 최대 rAAV 용량에 대한 연구 디자인의 한 실시양태를 도시한 개략도이다. 간략하면, rAAV를 P3에 ICV 주사에 의해 전달하고, P8에 매일 CBE 처리를 개시하였다. P24-25에 오픈 필드 및 로타로드 검정법으로 행동을 사정하고, P36 및 P38에 기질 수준을 측정하였다.
도 11은 CBE 마우스 모델에서의 최대 rAAV 용량의 생전 사정에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. P3에, 마우스를 ICV 전달을 통해 부형제 또는 8.8e9 vg rAAV로 처리하였다. P8에 PBS 또는 25 mg/kg CBE의 매일 IP 전달을 개시하였다. 연구 종료시, 마우스 중 절반을 P36 (1일째)에 그의 최종 CBE 투약 후 다음날 희생시켰고, 나머지 절단은 P38 (3일째)에 희생시키기 전에 3일 동안 CBE를 중단하였다. 모든 처리군 (부형제 + PBS의 경우, n = 8, rAAV + PBS의 경우, n = 7, 부형제 + CBE의 경우, n = 8, 및 rAAV + CBE의 경우, n = 9)의 체중을 매일 측정하였고 (좌측 상단), P36에서의 체중을 분석하였다 (우측 상단). P23에 오픈 필드에서의 총 이동 거리 (좌측 하단) 및 P24에 로타로드에서 떨어질 때까지의 시간 (우측 하단)에 의해 행동을 사정하고, 각 동물에 대하여 3회 시도에 대한 중간값으로서 평가하였다. 치사에 기인하여, 행동 검정법에서 부형제 + CBE 군의 경우, n = 7인 반면, 다른 군은 모두 n=8이었다. 동물들 간의 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다. *p<0.05; ***p<0.001, CBE 처리된 동물에서 선형 회귀에 의한 처리군에 대한 명목 p 값.
도 12는 CBE 마우스 모델에서의 최대 rAAV 용량의 생화학적 사정에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. CBE 중단 전 (1일째) 또는 CBE 중단 후 (3일째), 모든 처리군 (부형제 + PBS의 경우, n = 8, rAAV + PBS의 경우, n = 7, 부형제 + CBE의 경우, n = 7, 및 rAAV + CBE의 경우, n = 9)의 피질을 사용하여 군에서의 GCase 활성 (좌측 상단), GluSph 수준 (우측 상단), GluCer 수준 (좌측 하단), 및 벡터 게놈 (우측 하단)을 측정하였다. 생체분포는 게놈 DNA 1 ㎍당 벡터 게놈으로 제시되어 있다. 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다. (*)p<0.1; **p<0.01; ***p<0.001, CBE 처리된 동물에서 선형 회귀에 의한 처리군에 대한 명목 p 값, 여기서 수집일 및 성별은 공변량으로서 보정.
도 13은 부형제 + PBS, 부형제 + CBE, 및 rAAV + CBE 처리군의 투여 이후의 CBE 마우스 모델에서의 행동 및 생화학적 상관관계에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. 처리군 간에, 로타로드에서의 수행능은 GluCer 축적과 음의 상관관계를 가졌고 (A, 선형 회귀에 의해 p=0.0012), GluSph 축적은 증가된 GCase 활성과 음의 상관관계를 가졌다 (B, 선형 회귀에 의해 p=0.0086).
도 14는 CBE 마우스 모델에서의 GBA1 rAAV의 생체분포에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. 모든 처리군 (부형제 + PBS의 경우, n = 8, rAAV + PBS의 경우, n = 7, 부형제 + CBE의 경우, n = 7, 및 rAAV + CBE의 경우, n = 9)에 대해 간, 비장, 신장, 및 생식선에서 벡터 게놈의 존재를 사정하였다. 생체분포는 게놈 DNA 1 ㎍당 벡터 게놈으로 제시되어 있다. 벡터 참조 표준 곡선을 이용하여 정량적 PCR에 의해 벡터 게놈 존재를 정량화하였고; A260 광학 밀도 측정에 의해 게놈 DNA 농도를 평가하였다. 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001, CBE 처리된 동물에서 선형 회귀에 의한 처리군에 대한 명목 p 값, 여기서 수집일 및 성별은 공변량으로서 보정.
도 15는 CBE 마우스 모델에서의 rAAV 용량 범위의 생전 사정에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. 마우스는 P3에 ICV 전달에 의해 부형제 또는 3개의 상이한 용량의 GBA1 rAAV: 3.2e9 vg, 1.0e10 vg, 또는 3.2e10 vg 중 하나를 받았다. P8에, 25 mg/kg CBE의 매일 IP 처리를 개시하였다. 부형제 및 CBE 또는 부형제 및 PBS를 받은 마우스는 대조군으로서의 역할을 하였다. 모든 처리군은 군당 n = 10 (5M/5F)으로 시작하였다. 모든 마우스를 그의 최종 CBE 투약 후 다음날 (P38-P40) 희생시켰다. 모든 처리군을 매일 체중을 측정하고, P36에 그의 체중을 분석하였다. P24에 로타로드에서 떨어질 때까지의 시간, 및 P30에 테이퍼 빔(Tapered Beam)을 건너는 데 소요되는 시간에 의해 운동 수행능을 사정하였다. 조기 치사에 기인하여, 행동 검정법에 참여한 마우스의 마리수는 부형제 + PBS의 경우, n = 10, 부형제 + CBE의 경우, n = 9, 및 3.2e9 vg rAAV + CBE의 경우, n = 6, 1.0e10 vg rAAV + CBE의 경우, n = 10, 3.2e10 vg rAAV + CBE의 경우, n = 7이었다. 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이고; * p<0.05; **p<0.01, CBE 처리군에서 선형 회귀에 의한 명목 p 값, 여기서 성별은 공변량으로서 보정.
도 16은 CBE 마우스 모델에서의 rAAV 용량 범위의 생화학적 사정에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. 모든 처리군 (부형제 + PBS의 경우, n = 10, 부형제 + CBE의 경우, n = 9, 및 3.2e9 vg rAAV + CBE의 경우, n = 6, 1.0e10 vg rAAV + CBE의 경우, n = 10, 3.2e10 vg rAAV + CBE의 경우, n = 7)의 피질을 이용하여 GCase 활성, GluSph 수준, GluCer 수준, 및 벡터 게놈을 측정하였다. GCase 활성은 총 단백질 1 mg당 GCase ng로 제시되어 있다. GluSph 및 GluCer 수준은 조직 습식 중량 1 mg당 pmol로 제시되어 있다. 생체분포는 게놈 DNA 1 ㎍당 벡터 게놈으로 제시되어 있다. 벡터 참조 표준 곡선을 이용하여 정량적 PCR에 의해 벡터 게놈 존재를 정량화하였고; A260 광학 밀도 측정에 의해 게놈 DNA 농도를 평가하였다. 벡터 게놈 존재를 또한 간에서도 측정하였다 (E). 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다. **p<0.01; ***p<0.001, CBE 처리군에서 선형 회귀에 의한 명목 p 값, 여기서 성별은 공변량으로서 보정.
도 17은 유전적 마우스 모델에서 최대 용량 GBA1 rAAV에서의 테이퍼 빔 분석에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. rAAV 투여 후 4주째에 빔 워크(Beam Walk)에 의해 처리군 (WT + 부형제, n = 5), 4L/PS-NA + 부형제 (n = 6), 및 4L/PS-NA + rAAV (n = 5))의 운동 수행능을 검정하였다. 총 슬립수 및 활동 시간은 상이한 빔에서의 5회 시도에 대한 총합으로 제시되어 있다. 속도 및 속도당 슬립수는 상이한 빔에서의 5회 시도에 대한 평균으로 제시되어 있다. 평균이 제시되어 있다. 오차 막대는 SEM이다.
도 18은 프로사포신 (PSAP), SCARB2, 및/또는 하나 이상의 억제성 핵산과 함께 조합된, GBA1을 코딩하는 rAAV 구축물의 시험관내 발현에 대한 대표적인 데이터를 보여주는 것이다. 데이터는, HEK293 세포를 각 구축물로 형질감염시켰을 때, GFP 형질감염된 세포와 비교하여 관심 트랜스진이 과다발현되었다는 것을 나타낸다.
도 19는 ITR의 "외부"에 (예컨대, 트랜스진 인서트 또는 발현 구축물 기준으로 ITR의 말단에 인접하게) 위치하는 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터 (상단), 및 벡터의 "내부"에 (예컨대, 벡터의 트랜스진 인서트에 인접한 위치에) ITR을 갖는 야생형 rAAV 벡터를 도시한 개략도이다.
도 20은 "D" 서열이 야생형으로 (동그라미 표시) 또는 대안적으로 (예컨대, "외부에"; 사각형 표시) 배치되어 있는 ITR을 갖는 rAAV를 이용한 HEK293 세포의 형질도입에 대한 데이터를 보여주는 것이다. "외부에" 배치된 ITR을 갖는 rAAV는 야생형 ITR을 갖는 rAAV만큼 효율적으로 세포를 형질도입시킬 수 있었다.
본 개시내용은 부분적으로 대상체에서 PD 연관 유전자 생성물의 조합의 발현을 위한 조성물 및 방법에 기초한다. 유전자 생성물은 단백질, 단백질의 단편 (예컨대, 일부), PD 연관 유전자를 억제시키는 간섭 핵산 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 PD 연관 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 PD 연관 유전자를 억제시키는 간섭 핵산 (예컨대, shRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)이다.
PD 연관 유전자란, PD와 유전적으로, 생화학적으로 또는 기능적으로 연관이 있는 유전자 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, (단백질 Gcase를 코딩하는) GBA1 유전자 중 돌연변이를 갖는 개체는 GBA1 중에 돌연변이를 가지지 않는 것과 비교하였을 때, PD가 발생할 위험이 증가되어 있는 것으로 관찰되었다. 또 다른 예에서, PD는 α-시누클레인 (α-Syn)을 포함하는 단백질 응집체의 축적과 연관이 있고; 따라서, (α-Syn을 코딩하는) SCNA가 PD 연관 유전자이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 발현 카세트는 야생형 또는 비-돌연변이체 형태의 PD 연관 유전자 (또는 그의 코딩 서열)이다. PD 연관 유전자의 예는 표 1에 열거되어 있다.
<표 1>
PD 연관 유전자의 예
Figure 112020043073496-pct00001
단리된 핵산 및 벡터
단리된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 Gcase (예컨대, GBA1 유전자의 유전자 생성물) 또는 그의 일부를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. β-글루코세레브로시다제 또는 GBA로도 지칭되는 Gcase란, 당지질 대사에서 중간체인 화학물질 글루코세레브로시드의 베타-글리코시드 결합을 절단하는 리소좀 단백질을 지칭한다. 인간에서, Gcase는 염색체 1에 위치하는, GBA1 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, GBA1은 NCBI 참조 서열 NCBI 참조 서열 NP_000148.2 (서열식별번호 14)에 의해 제시되는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된) Gcase 코딩 서열, 예컨대, 서열식별번호 15에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 프로사포신 (예컨대, PSAP 유전자의 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 프로사포신은 짧은 올리고당 기를 갖는 글리코스핑고리피드의 이화작용을 촉진시키는 스핑고리피드 활성인자 단백질 (사포신) A, B, C, 및 D에 대한 전구체 당단백질이다. 인간에서, PSAP 유전자는 염색체 10에 위치한다. 일부 실시양태에서, PSAP는 NCBI 참조 서열 NP_002769.1 (예컨대, 서열식별번호 16)에 의해 제시되는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된) 프로사포신 코딩 서열, 예컨대, 서열식별번호 17에 기재된 서열을 포함한다.
본 개시내용의 측면은 LIMP2/SCARB2 (예컨대, SCARB2 유전자의 유전자 생성물)를 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. SCARB2는 세포 내에서의 리소좀 및 엔도솜 수송을 조절하는 막 단백질을 지칭한다. 인간에서, SCARB2 유전자는 염색체 4에 위치한다. 일부 실시양태에서, SCARB2 유전자는 NCBI 참조 서열 NP_005497.1 (서열식별번호 18)에 의해 제시되는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호 19에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈 최적화된 SCARB2 코딩 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산이며, 여기서 각 유전자 생성물은 독립적으로 표 1에 기재된 유전자 생성물 또는 그의 일부로부터 선택되는 것인, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 자연적으로 발생된 유전자의 코딩 부분 (예컨대, cDNA)에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물은 GBA1 유전자에 의해 코딩된 단백질 (또는 그의 단편)이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 SCARB2/LIMP2 유전자 및/또는 PSAP 유전자에 의해 코딩된 단백질 (또는 그의 단편)이다. 그러나, 통상의 기술자는 제1 유전자 생성물 (예컨대, Gcase) 및 제2 유전자 생성물 (예컨대, LIMP2)의 발현 순서가 일반적으로 역전될 수 있다는 것 (예컨대, LIMP2가 제1 유전자 생성물이고, Gcase가 제2 유전자 생성물이다)을 이해한다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 표 1에 열거된 유전자의 단편 (또는 일부)이다. 단백질 단편은 표 1에 열거된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 표 1에 열거된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 50% 내지 99.9% (예컨대, 50% 내지 99.9% 사이의 임의의 값)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 구축물은 모노시스트론성이다 (예컨대, 발현 구축물은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 포함하는 단일 융합 단백질을 코딩한다). 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 폴리시스트론성이다 (예컨대, 발현 구축물은 2개의 전혀 다른 유전자 생성물, 예를 들어, 2개의 상이한 단백질 또는 단백질 단편을 코딩한다).
폴리시스트론성 발현 벡터는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의) 프로모터를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 내인성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 (예컨대, CNS 특이적 프로모터) 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 (CBA 프로모터), CAG 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol . 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2]에 의해 기술된 것과 같은 것), CD68 프로모터, 또는 JeT 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Tornøe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32]에 의해 기술된 것과 같은 것)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물, 또는 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 인자 결합 서열, 인트론 스플라이스 부위, 폴리(A) 부가 부위, 인핸서 서열, 리프레서 결합 부위, 또는 상기의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 추가의 조절 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 이격된다. IRES 부위의 예는 예를 들어, 문헌 [Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30]에 기술되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 자기 절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 의해 이격된다. 자기 절단 펩티드의 예는 T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, 및 BmIFV 2A, 및 문헌 [Liu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193]에 의해 기술된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 자기 절단 펩티드는 T2A 펩티드이다.
병리학상, 장애, 예컨대, PD 및 고셰병은 대개는 α-시누클레인 (α-Syn) 단백질로 구성된 단백질 응집체의 축적과 연관이 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 단리된 핵산은 α-Syn 단백질의 발현을 감소시키거나, 또는 방해하는 억제성 핵산을 포함한다. 억제성 핵산을 코딩하는 서열은 발현 벡터의 비번역 영역 (예컨대, 인트론, 5'UTR, 3'UTR 등)에 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 발현 구축물의 인트론에, 예를 들어, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 서열의 상류쪽 인트론에 위치한다. 억제성 핵산은 이중 가닥 RNA (dsRNA), siRNA, 마이크로RNA (miRNA), 인공 miRNA (amiRNA), 또는 RNA 압타머일 수 있다. 일반적으로, 억제성 핵산은 표적 RNA (예컨대, mRNA)의 약 6개 내지 약 30개의 (예컨대, 6 내지 30 사이의 임의의 정수 (6 및 30 포함)) 연속적인 뉴클레오티드에 결합한다 (예컨대, 그와 하이브리드화한다). 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자는 miRNA 또는 amiRNA, 예를 들어, SNCA (α-Syn 단백질을 코딩하는 유전자)를 표적화하는 miRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 하이브리드화 대상인 SNCA mRNA의 영역과의 미스매치는 포함하지 않는다 (예컨대, miRNA는 "완벽한 것이다"). 일부 실시양태에서, 억제성 핵산은 shRNA (예컨대, SNCA를 표적화하는 shRNA)이다.
본원에 기술된 단리된 핵산은 그 자체 단독으로, 또는 벡터의 일부로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 플라스미드)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일-가닥 (예컨대, 단일-가닥 DNA)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 배큘로바이러스 벡터 (예컨대, 오토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터)이다.
전형적으로, rAAV 벡터 (예컨대, rAAV 게놈)는 두 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진 (예컨대, 하기 각각의 것: 프로모터, 인트론, 인핸서 서열, 단백질 코딩 서열, 억제성 RNA 코딩 서열, 폴리A 테일 서열 등 중 하나 이상의 것을 포함하는 발현 구축물)을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 트랜스진은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 단리된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 두 ITR 서열은 각각 전장의 ITR (예컨대, 길이 대략 145 bp, 및 기능성 Rep 결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 함유하는 것)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 ITR들 중 하나는 말단절단된 것이다 (예컨대, 단축된 것이거나, 또는 전장의 것이 아니다). 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR에는 기능성 말단 분해 부위 (trs)가 결여되어 있고, 자기 상보성 AAV 벡터 (scAAV 벡터) 제조에 사용된다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 예를 들어, 문헌 [McCarty et al. (2003) Gene Ther . 10(26):2112-8]에 기술된 바와 같이, ΔITR이다.
본 개시내용의 측면은 야생형 AAV ITR 기준으로, 예를 들어, 야생형 AAV2 ITR (예컨대, 서열식별번호 29) 기준으로 하나 이상의 변형 (예컨대, 핵산 부가, 결실, 치환 등)을 갖는 ITR을 포함하는 단리된 핵산 (예컨대, rAAV 벡터)에 관한 것이다. 야생형 AAV2 ITR의 구조는 도 19에 제시되어 있다. 일반적으로, 야생형 ITR은, 자기 어닐링하여, 각각 B/B' 및 C/C'로 지칭되는 서열에 의해 형성된) 2개의 크로스 아암, (서열 A/A'에 의해 형성된) 더욱 긴 스템 영역, 및 "D" 영역으로 지칭되는 단일-가닥 말단 영역으로 이루어진 회문 이중 가닥 T 형상의 헤어핀 구조를 형성하는 125개의 뉴클레오티드 영역을 포함한다 (도 19). 일반적으로, ITR의 "D" 영역은 A/A' 서열에 의해 형성된 스템 영역과 rAAV 벡터의 트랜스진을 함유하는 인서트 사이에 위치한다 (예컨대, ITR의 말단 기준으로 ITR의 "내부"에 또는 rAAV 벡터의 트랜스진 인서트 또는 발현 구축물에 인접하게 위치한다). 일부 실시양태에서, "D" 영역은 서열식별번호 27에 기재된 서열을 포함한다. "D" 영역은 예를 들어, 문헌 [Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)]에 개시되어 있는 바와 같이, 캡시드 단백질에 의한 rAAV 벡터의 캡시드화에서 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다.
본 개시내용은 부분적으로 ITR의 "외부"에 (예컨대, 트랜스진 인서트 또는 발현 구축물 기준으로 ITR의 말단에 인접하게) 위치하는 "D" 영역을 포함하는 rAAV 벡터가 비변형된 (예컨대, 야생형) ITR로 ITR을 갖는 rAAV 벡터보다 AAV 캡시드 단백질에 의해 효율적으로 캡시드화된다는 놀라운 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열 (예컨대, "외부 위치에 있는 "D" 서열")을 갖는 rAAV 벡터가 야생형 ITR 서열을 갖는 rAAV 벡터 기준으로 감소된 독성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예컨대, 서열식별번호 27) 기준으로 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예컨대, 서열식별번호 27) 기준으로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과의 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예컨대, 서열식별번호 27) 기준으로 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 핵산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 야생형 "D" 서열 (예컨대, 서열식별번호 27)과 약 10% 내지 약 99% (예컨대, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%) 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 "D" 서열은 문헌 [Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80]에 기술된 바와 같이 "S" 서열로도 지칭되는, 서열식별번호 26에 기재된 서열을 포함한다.
본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터는 예를 들어, 서열식별번호 28에 기재된 바와 같은, 또는 문헌 [Francois, et al. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virol. 2005]에 기술된 바와 같은 "TRY" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TRY 서열은 ITR (예컨대, 5' ITR)과 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터의 발현 구축물 (예컨대, 트랜스진 코딩 인서트) 사이에 위치한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터를 포함하는 배큘로바이러스 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 배큘로바이러스 벡터는 예를 들어, 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43] 및 [Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896]에 의해 기술된 바와 같은, 오토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, HEK293T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜라이(E. coli) 세포이다.
rAAV
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 벡터)에 관한 것이다. "rAAV"라는 용어는 일반적으로 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 본 개시내용에 의해 기술된 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 및 AAV10으로부터 선택되는 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 비-인간 숙주로부터의 캡시드 단백질, 예를 들어, 레수스 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAVrh.10, AAVrh.39 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 rAAV는 야생형 캡시드 단백질의 변이체인 캡시드 단백질, 예컨대, 유래 기점이 되는 야생형 AAV 캡시드 단백질 기준으로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과의 (예컨대¸ 15, 20 25, 50, 100개 등) 아미노산 치환 (예컨대, 돌연변이)을 포함하는 캡시드 단백질 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 rAAV는 특히 CSF 공간 내로, 또는 뇌 실질 내로 직접 도입되었을 때, CNS를 통해 쉽게 확산된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 rAAV는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 건널 수 있는 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 또는 AAVrh.10 혈청형을 갖는 캡시드 단백질 포함한다. rAAV 제조는 예를 들어, 문헌 [Samulski et al. (1989) J Virol . 63(9):3822-8] 및 [Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706]에 의해 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 rAAV (예컨대, AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화되어 rAAV 캡시드 입자를 형성하는 재조합 rAAV 게놈을 포함하는 것)는 배큘로바이러스 벡터 발현 시스템 (BEVS)에서 제조된다. BEVS를 이용하여 rAAV를 제조하는 것은 예를 들어, 문헌 [Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43], [Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896], 미국 특허 번호 8,945,918, 미국 특허 번호 9,879,282, 및 국제 PCT 공개 WO 2017/184879에 의해 기술되어 있다. 그러나, rAAV는 임의의 적합한 방법 (예컨대, 재조합 rep 및 cap 유전자를 이용하는 방법)을 이용하여 제조될 수 있다.
제약 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 용어는 물질, 예컨대, 담체 또는 희석제가 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 폐기하지 않고, 비교적 비독성이라는 것, 예컨대, 물질이 비바람직한 생물학적 효과를 유발하지 않거나, 또는 그와 함께 함유되어 있는 조성물의 성분 중 어느 것과도 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서, 개체에게 투여될 수 있다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 본 발명 내에서 유용한 화합물이 그의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 상기 화합물을 환자 내에 또는 환자에게 운반 또는 수송하는 데 관여하는, 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 안정제, 분산화제, 현탁화제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 본 발명의 실시에서 사용되는 제약 조성물에 포함될 수 있는 추가 성분은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
본원에서 제공된 조성물 (예컨대, 제약 조성물)은 장관 (예컨대, 경구적), 비경구적, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 피하, 뇌실내, 경피, 피부간(interdermal), 직장, 질내, 복강내, 국소 (분제, 연고, 크림제, 및/또는 점적제에 의한 경우), 점막, 비강, 협착, 설하를 비롯한, 임의의 경로에 의해; 기관내 주입, 기관지 주입, 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 경구용 스프레이, 비강용 스프레이, 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 경구 투여, 정맥내 투여 (예컨대, 전신 정맥내 주사), 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 환부로의 직접 투여가 구체적으로 고려되는 경로이다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 작용제의 성질 (예컨대, 위장관 환경에서의 그의 안정성), 및/또는 대상체의 상태 (예컨대, 대상체가 경구 투여를 허용할 수 있는지 여부)를 비롯한, 다양한 인자에 의존할 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 화합물 또는 제약 조성물은 대상체의 안구로의 국소 투여에 적합하다.
방법
본 개시내용은 부분적으로 함께 (예컨대, 시너지적으로) 작용하여 파킨슨병을 치료하는, 대상체에서의 PD 연관 유전자 생성물의 조합의 발현을 위한 조성물에 기초한다. 본원에서 사용되는 바, "치료하다" 또는 "치료하는"이라는 것은 (a) 파킨슨병의 발병을 예방하거나, 또는 지연시키고/거나; (b) 파킨슨병의 중증도를 감소시키고/거나; (c) 파킨슨병의 특징적인 증상의 발생을 감소시키거나, 또는 예방하고/거나; (d) 파킨슨병의 특징적인 증상의 악화를 예방하는 것을 지칭한다. 파킨슨병의 증상으로는 예를 들어, 운동 기능장애 (예컨대, 떨림, 경직, 몸동작이 느려지는 서동, 보행 곤란), 인지 기능장애 (예컨대, 치매, 우울증, 불안), 감정 및 행동 기능장애를 포함한다.
따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 조성물 (예컨대, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는, 파킨슨병을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 CNS로 직접, 예를 들어, 대상체의 뇌 및/또는 척수 내로의 직접 주사에 의해 투여된다. CNS에의 직접 주사 방식의 예로는 대뇌내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사, 및 상기의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS 내로 직접 주사하면, 그 결과로 트랜스진은 대상체의 중뇌, 선조체 및/또는 대뇌 피질에서 발현된다 (예컨대, 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물, 및 적용가능할 경우, 제3 유전자 생성물은 발현된다). 일부 실시양태에서, CNS 내로 직접 주사하면, 그 결과로 트랜스진은 대상체의 척수 및/또는 CSF에서 발현된다 (예컨대, 제1 유전자 생성물, 제2 유전자 생성물, 및 적용가능할 경우, 제3 유전자 생성물은 발현된다).
일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 주사는 컨벡션 강화 전달법 (CED)을 포함한다. 컨벡션 강화 전달법은 뇌를 외과적으로 노출시키고, 뇌의 표적 부위 내로 직접 소경 카테터를 배치한 후, 이어서, 치료제 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 rAAV)를 대상체의 뇌로 직접 주입하는 것을 포함하는 치료 전략법이다. CED는 예를 들어, 문헌 [Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother . 9(10):1519-27]에 의해 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 예를 들어, 말초 주사에 의해 말초적으로 투여된다. 말초 주사의 예로는 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 복강내 주사, 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 동맥내 주사, 예를 들어, 대상체의 경동맥 내로의 주사이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 조성물 (예컨대, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 말초적으로 및 대상체의 CNS로 직접, 상기 두 방식 모두에 의해 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 동맥내 주사에 의해 (예컨대, 경동맥 내로의 주사에 의해), 및 실질내 주사에 의해 (예컨대, CED에 의한 실질내 주사에 의해) 조성물을 투여받는다. 일부 실시양태에서, CNS로의 직접 주사 및 말초 주사는 동시에 이루어진다 (예컨대, 같은 시간에 수행된다). 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 이전에 (예컨대, 말초 주사 전 1분 내지 1주 사이에, 또는 그를 초과하는 시간에) 이루어진다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 이후에 (예컨대, 말초 주사 후 1분 내지 1주 사이에, 또는 그를 초과하는 시간에) 이루어진다.
대상체에게 투여되는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 조성물 (예컨대, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)의 양은 투여 방법에 의존하여 달라질 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 rAAV는 약 109 게놈 카피 (GC)/kg 내지 약 1014 GC/kg (예컨대, 약 109 GC/kg, 약 1010 GC/kg, 약 1011 GC/kg, 약 1012 GC/kg, 약 1012 GC/kg, 또는 약 1014 GC/kg)의 역가로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 CSF 공간으로의 주사에 의해, 또는 실질내 주사에 의해 고역가로 (예컨대, >1012 게놈 카피 GC/kg (rAAV)) 투여받는다.
본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 조성물 (예컨대, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 1회 또는 다회에 걸쳐 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20회 또는 그 초과) 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 연속하여 (예컨대, 만성적으로), 예를 들어, 주입 펌프를 통해 투여된다.
실시예
실시예 1: rAAV 벡터
삼중-플라스미드 형질감염을 위해 세포, 예컨대, HEK293 세포를 사용하여 AAV 벡터를 생성한다. ITR 서열은 각 관심 트랜스진에 대한 프로모터/인핸서 요소, 3' 폴리A 신호, 및 번역 후 신호, 예컨대, WPRE 요소를 포함하는 발현 구축물에 플랭킹된다. 단백질 서열의 융합에 의해; 또는 2A 펩티드 링커, 예컨대, T2A 또는 P2A 사용으로 펩티드 결합이 생성되지 못하게 방해됨에 따라 아미노산이 부가된 2개의 펩티드 단편이 유도됨으로써; IRES 요소를 사용하여; 또는 2개의 별개의 발현 카세트를 이용하는 발현에 의해 예컨대, GBA1 및 LIMP2 및/또는 프로사포신과 같은 다중 유전자 생성물이 동시에 발현될 수 있다. 발현 유전자 상류쪽의 효율적으로 스플라이싱된 짧은 인트론 서열의 존재가 발현 수준을 개선시킬 수 있다. shRNA 및 다른 조절 RNA가 잠재적으로 상기 서열 내에 포함될 수 있다. 본 개시내용에 의해 기술된 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 예는 도 1-6 및 하기 표 2에 제시되어 있다.
<표 2>
Figure 112020043073496-pct00002
실시예 2: GBA 결핍 세포로의 바이러스 형질도입에 관한 세포 기반 검정법
예를 들어, GD 환자 단핵구, 또는 hES 세포로부터의 섬유모세포, 또는 환자 유래의 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로서 GBA1 결핍 세포를 수득한다. 이들 세포는 기질, 예컨대, 글루코실세라미드 및 글루코실스핑고신 (GluCer 및 GluSph)을 축적한다. 야생형 또는 돌연변이체 배양 세포주를 Gcase 억제제, 예컨대, CBE로 처리하는 것 또한 GBA 결핍 세포를 수득하는 데 사용된다.
상기 세포 모델을 이용하여, 해당 단백질에 대한 항체 또는 포스포-αSyn을 이용한 후, 형광 현미경법을 이용하여 영상화함으로써 단백질 응집체, 예컨대, α-시누클레인의 축적에 의해 리소좀 결함을 정량화한다. 단백질 마커, 예컨대, LAMP1, LAMP2, LIMP1, LIMP2에 대한 ICC에 의해, 또는 염료, 예컨대, 리소트래커(Lysotracker)를 사용하여, 또는 형광성 덱스트란 또는 다른 마커의 세포내이입 구획을 통한 흡수에 의해 리소좀 이상에 대한 영상화 또한 수행한다. 리소좀과의 결함성 융합에 기인하는 자가포식 마커 축적에 대한, 예컨대 LC3에 대한 영상화 또한 수행될 수 있다. 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA는 상기 마커의 비정상적인 축적을 정량화하는 데 사용된다. 또한, 당지질 기질 및 GBA1의 생성물의 축적은 표준 접근법을 이용하여 측정된다.
치료 종점 (예컨대, PD 연관 병상의 감소)은 활성 및 기능을 확인하고, 정량화하기 위해 AAV 벡터의 형질도임의 발현과 관련하여 측정된다. Gcase는 또한 단백질 ELISA 측정을 사용하여, 또는 표준 Gcase 활성 검정법에 의해 정량화될 수 있다.
실시예 3: 돌연변이체 마우스를 이용한 생체내 검정법
본 실시예는 돌연변이체 마우스를 이용한 AAV 벡터에 관한 생체내 검정법을 기술한다. 돌연변이체 마우스에서의 상기와 같은 AAV 벡터에 관한 생체내 연구는 예를 들어, 문헌 [Liou et al. (2006) J. Biol . Chem . 281(7): 4242-4253], [Sun et al. (2005) J. Lipid Res. 46:2102-2113], 및 [Farfel-Becker et al. (2011) Dis. Model Mech . 4(6):746-752]에 의해 기술된 검정법을 이용하여 수행된다.
예를 들어, 5-10 ㎕의 주사 부피로 진한 AAV 스톡을 사용하여 (예컨대, 2x1011 vg/마우스 용량의) 비히클 대조군 및 AAV 벡터의 경막내 또는 뇌실내 전달을 수행한다. 컨벡션 강화 전달법에 의한 실질내 전달을 수행한다.
처리는 증상 발병 이전 또는 발병 이후에 개시한다. 측정되는 종점은 CNS 및 CSF 중 기질 축적, ELISA에 의한 Gcase 효소 축적 및 효소 활성의 축적, 운동 및 인지 종점, 리소좀 기능장애, 및 α-시누클레인 단량체, 원시섬유 또는 원섬유의 축적이다.
실시예 4: 질환의 화학적 모델
본 실시예는 화학적으로 유도된 고셰병을 앓는 마우스 모델 (예컨대, CBE 마우스 모델)을 이용하는 AAV 벡터에 관한 생체내 검정법을 기술한다. 예를 들어, 문헌 [Vardi et al. (2016) J Pathol . 239(4):496-509]에 기술된 바와 같이, 화학적으로 유도된 고셰병을 앓는 마우스 모델에서 상기 AAV 벡터에 관한 생체내 연구를 수행한다.
예를 들어, 5-10 ㎕의 주사 부피로 진한 AAV 스톡을 사용하여 (예컨대, 2x1011 vg/마우스의) 비히클 대조군 및 AAV 벡터의 경막내 또는 뇌실내 전달을 수행한다. 컨벡션 강화 전달법에 의한 실질내 전달을 수행한다. 꼬리 정맥 주사에 의해 말초 전달을 달성한다.
처리는 증상 발병 이전 또는 발병 이후에 개시한다. 측정되는 종점은 CNS 및 CSF 중 기질 축적, ELISA에 의한 Gcase 효소 축적 및 효소 활성의 축적, 운동 및 인지 종점, 리소좀 기능장애, 및 α-시누클레인 단량체, 원시섬유 또는 원섬유의 축적이다.
실시예 5: PD, LBD , 고셰병 환자에서의 임상 시험
일부 실시양태에서, 특정 형태의 고셰병 (예컨대, GD1)을 앓는 환자는 파킨슨병 (PD) 또는 루이소체 치매 (LBD)가 발생할 위험이 증가되어 있다. 본 실시예는 고셰병, PD 및/또는 LBD를 앓는 환자에서 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 rAAV의 안전성 및 효능을 사정하는 임상 시험을 기술한다.
문헌 [Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med . 122(1):33-39]에 기술된 것과 유사한 연구 디자인을 사용하여 고셰병, PD 및/또는 LBD 치료를 위한 상기 벡터의 임상 시험을 수행한다.
실시예 6: 말초 질환 치료
일부 실시양태에서, 예를 들어, 문헌 [Biegstraaten et al. (2010) Brain 133(10):2909-2919]에 기술된 바와 같이, 특정 형태의 고셰병을 앓는 환자는 말초 신경병증의 증상을 보인다.
본 실시예는 고셰병 (예컨대, 타입 1 고셰병)과 연관된 말초 신경병증의 치료를 위한 본원에 기술된 바와 같은 AAV 벡터에 관한 생체내 검정법을 기술한다. 간략하면, 말초 신경병증의 징후 또는 증상을 앓는 것으로 확인된 타입 1 고셰병 환자는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 rAAV를 투여받는다. 일부 실시양태에서, rAAV의 투여 후에, 예를 들어, 문헌 [Biegstraaten et al.]에 기술된 방법을 사용하여 대상체의 말초 신경병증 징후 및 증상을 모니터링한다.
환자에 (예컨대, 환자의 혈청에, 환자의 말초 조직에 (예컨대, 간 조직, 비장 조직 등에) 존재하는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 형질도입된 유전자 생성물의 수준을 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, 효소 기능성 검정법, 또는 영상화 연구에 의해 검정한다.
실시예 7: CNS 형태의 치료
본 실시예는 CNS 형태의 고셰병의 치료를 위한 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 벡터에 관한 생체내 검정법을 기술한다. 간략하면, CNS 형태의 고셰병 (예컨대, 타입 2 또는 타입 3 고셰병)을 앓는 것으로 확인된 고셰병 환자는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 rAAV를 투여받는다. 환자의 CNS에 (예컨대, 환자의 CNS의 혈청에, 환자의 뇌척수액 (CSF)에, 또는 환자의 CNS 조직에) 존재하는 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 형질도입된 유전자 생성물의 수준을 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, 효소 기능성 검정법, 또는 영상화 연구에 의해 검정한다.
실시예 8: GBA1에 돌연변이를 갖는 대상체에서 파킨슨병의 유 전자 요법
본 실시예는 GBA1 중의 돌연변이를 특징으로 하는 파킨슨병을 앓는 대상체에게 GBA1을 코딩하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 기술한다.
rAAV 벡터 인서트는, 인간 GBA1 (마룬)의 코돈 최적화된 코딩 서열 (CDS)을 구성적으로 발현하기 위해, 4개 파트: CMV 인핸서 (CMVe), CBA 프로모터 (CBAp), 엑손 1, 및 인트론 (int)으로 이루어진, CBA 프로모터 요소 (CBA)를 함유한다. 3' 영역은 또한 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element: WPRE), 전사후 조절 요소, 이어서, 소 성장 호르몬 폴리A 신호 (bGH 폴리A) 테일을 함유한다. 플랭킹 ITR을 통해 개재 서열은 정확하게 패키징될 수 있다. 5' ITR 서열의 두 변이체 (도 7, 삽입 박스, 하단 서열)를 평가하였다: 상기 변이체들은 ITR의 20-뉴클레오티드 "D" 영역 내에서 수개의 뉴클레오티드 차이를 보이며, 이는 패키징 및 발현 효율에 영향을 미치는 것으로 간주된다. rAAV 생성물은 도 7 (삽입 박스, 상단 서열)에 제시된 "D" 도메인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 변이체 벡터는 임상전 연구에서 유사하게 수행된, 돌연변이체 "D" 도메인 (본원에서 "S" 도메인으로 명명, 여기서 뉴클레오티드 변이는 음영 표시로 제시)을 보유한다. 백본은 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자 뿐만 아니라, 역 패키징을 막는 스터퍼(stuffer) 서열을 함유한다. rAAV 벡터를 도시하는 개략도는 도 8에 제시되어 있다. rAAV 벡터는 AAV9 혈청형 캡시드 단백질을 이용하여 rAAV로 패키징된다.
대수조 내로의 (대수조내; ICM) 투시 조영 유도하의 후두하 주사를 통해 GBA1-rAAV를 단일 용량으로 대상체에게 투여한다. 투약 요법 연구의 한 실시양태는 하기와 같다:
단일 용량의 rAAV를, 비임상 약리학 및 독성 연구의 결과에 기초하여 결정된 두 용량 수준 (3e13 vg (저용량); 1e14 vg (고용량) 등) 중 하나로 환자 (N=12)에게 투여한다.
초기 연구는 rAAV 벡터 및 변이체 rAAV S-변이체 구축물 (하기에서 추가로 기술)의 효능 및 안전성을 사정하기 위해, GCase의 억제제인 콘두리톨-b-에폭시드 (CBE)를 매일 전달하는 것을 포함하는 화학적 마우스 모델에서 수행하였다. 추가로, 동형접합성 GBA1 돌연변이를 보유하고, 사포신 (4L/PS-NA)이 부분적으로 결핍되어 있는 유전적 마우스 모델에서도 초기 연구를 수행하였다. 벡터 안전성 및 효능을 추가로 평가하기 위해 마우스 및 비인간 영장류 (NHP)에서 추가의 용량 범위 연구를 수행한다.
AAV 백본 중의 약간 다른 두 버전의 5' 역전된 말단 반복부 (ITR)를 시험하여 제조가능성 및 트랜스진 발현을 사정하였다 (도 7). 145 bp 5' ITR 내의 20 bp "D" 도메인은 최적의 바이러스 벡터 제조를 위해 필요한 것으로 간주되지만, "D" 도메인 내의 돌연변이 또한 일부 경우에 트랜스진 발현을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 무손상 "D" 도메인을 보유하는 바이러스 벡터 이외에, 돌연변이체 D 도메인 (본원에서 "S" 도메인으로 명명)을 포함하는 제2 벡터 형태 또한 평가하였다. rAAV 및 변이체 rAAV, 둘 모두 동일한 트랜스진을 발현한다. 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 상기 두 벡터 모두 생체내에서 효과적인 바이러스를 생산한 반면, 야생형 "D" 도메인을 함유하는 rAAV는 추가 개발을 위해 선택하였다.
GCase 결핍인 CBE 모델을 확립하기 위해, 어린 마우스에 GCase의 특정 억제제인 CBE를 투약하였다. 생후 8일째 (P8)를 시작으로 매일 IP 주사에 의해 CBE를 마우스에 제공하였다. 행동 표현형을 보이는 모델을 확립하기 위해 3개의 상이한 CBE 용량 (25 mg/kg, 37.5 mg/kg, 50 mg/kg) 및 PBS를 시험하였다 (도 9). 더 높은 고용량의 CBE는 용량에 의존하는 방식으로 치사에 이르게 하였다. 50 mg/kg CBE로 처리된 마우스는 모두 P23까지 사망하였고, 37.5 mg/kg CBE로 처리된 8마리의 마우스 중 5마리는 P27까지 사망하였다. 25 mg/kg CBE로 처리된 마우스 중에서 치사는 없었다. CBE 주사맞은 마우스는 오픈 필드 검정법에서 일반적인 운동 장애를 보이지 않은 반면 (PBS를 받은 마우스와 동일한 속도로 동일한 거리를 이동), CBE로 처리된 마우스는 로타로드 검정법에 의해 측정된 바, 운동 협조 및 균형 장애를 보였다.
연구 종료시까지 살아남은 마우스를 그의 최종 CBE 투약 후 그 다음날 (P27, "1일째"), 또는 CBE 중단 3일 후 (P29, "3일째") 희생시켰다. 1일째 및 3일째 코호트, 둘 모두에서 GCase 기질의 축적을 평가하기 위해 25 mg/kg CBE를 받은 마우스의 피질에서 지질 분석을 수행하였다. (본 실시예에서 응집체로 측정된) GluSph 및 GalSph 수준은, GCase 부전증과 일치하는 PBS로 처리된 대조군과 비교하였을 때, CBE로 처리된 마우스에서 유의적으로 축적되었다.
상기 기술된 연구에 기초하여, 25 mg/kg CBE 용량은 생존에는 영향을 주지 않으면서, 행동 장애를 일으켰는 바, 이에, 상기 용량을 선택하였다. CBE 처리 동안 뇌 전역에 걸쳐 GBA1을 광범위하게 분포시키고, 트랜스진을 발현시키기 위해, 생후 3일째 (P3) 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 rAAV 또는 부형제를 전달한 후, 이어서, P8에 IP CBE 또는 PBS의 매일 처리를 개시하였다 (도 10).
rAAV를 받은, CBE로 처리된 마우스는 로타로드에서 부형제를 받은 것보다 통계학상 유의적으로 더욱 우수한 수행능을 보였다 (도 11). 변이체 벡터 처리군의 마우스는 다른 행동 척도, 예컨대, 검사 동안 이동한 총 거리에 있어서는 부형제로 처리된 마우스와 다르지 않았다 (도 11).
생전 연구 완료시, 생화학적 분석을 위해, 마우스 중 절반을 최종 CBE 투약 후 그 다음날 (P36, "1일째"), 또는 CBE 중단 3일 후 (P38, "3일째") 희생시켰다 (도 12). 생물학적으로 삼중으로 수행된 형광분석 효소 검정법을 이용하여, 피질에서 GCase 활성을 사정하였다. GBA1 rAAV로 처리된 마우스에서는 GCase 활성이 증가한 반면, CBE 처리는 GCase 활성을 감소시켰다. 추가로, CBE 및 GBA1-rAAV, 둘 모두를 받은 마우스는 PBS 처리군과 유사한 GCase 활성 수준을 보였는데, 이는 rAAV 전달이 CBE 처리에 의해 유도된 GCase 활성 억제를 극복할 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 기질 GluCer 및 GluSph의 수준을 조사하기 위해 마우스의 운동 피질에서 지질 분석을 수행하였다. 두 지질 모두 CBE를 받은 마우스의 뇌에 축적되었고, rAAV 처리는 기질 축적을 유의적으로 감소시켰다.
지질 수준은 처리군 간에 GCase 활성 및 로타로드에서의 수행능, 둘 모두와 음의 상관관계를 가졌다. rAAV 투여 후 GCase 활성 증가는 기질 감소 및 운동 기능 증진과 연관이 있었다 (도 13). 도 14에 제시된 바와 같이, qPCR에 의해 측정된 바, 벡터 게놈 존재에 의해 예비 생체분포를 사정하였다 (여기서 게놈 DNA 1 ㎍당 >100 벡터 게놈인 것을 양성인 것으로 정의한다). CBE로 처리 및 비처리된, GBA1-rAAV를 받은 마우스, 둘 모두 피질에서 rAAV 벡터 게놈에 대해 양성이었고, 이는 ICV 전달을 통해 rAAV가 피질로 전달된다는 것을 시사하는 것이다. 추가로, 벡터 게놈이 간에서 검출되었고, 비장에서는 거의 검출되지 않았고, 심장, 신장 또는 생식선에서는 전혀 검출되지 않았다. 모든 척도에서 1일째 군과 3일째 군 사이에 통계학상 유의적인 차이는 없었다.
CBE 모델에서의 좀더 큰 대규모 연구를 통해 CBE 모델에서 GBA1-rAAV의 유효 용량을 추가로 조사하였다. 25 mg/kg CBE 용량 모델을 이용하여, 부형제 또는 GBA1-rAAV를 P3에 ICV를 통해 전달하고, P8에 IP PBS 또는 CBE의 매일 처리를 개시하였다. 이전 연구에서 CBE를 중단한 군과 CBE를 중단하지 않은 군 사이에 유사성이 관찰되었다는 점을 고려하여, 모든 마우스를 최종 CBE 투약 (P38-40) 후 다음날 희생시켰다. 군당 마우스 10마리씩 (5M/5F), 하기 5개 군으로 하여, 3개의 상이한 rAAV 용량의 효과를 사정하였다:
부형제 ICV + PBS IP
부형제 ICV + 25 mg/kg CBE IP
3.2e9 vg (2.13e10 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP
1.0e10 vg (6.67e10 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP
3.2e10 vg (2.13e11 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP.
최고 용량의 rAAV는 P37에 CBE 처리와 관련된 체중 증가 불능을 구제하였다. 추가로, 부형제 + CBE 처리군과 비교하였을 때, 상기 용량은 로타로드 및 테이퍼 빔(tapered beam)에서의 수행능을 통계학상 유의적으로 증가시켰다 (도 15). 부형제 처리군 및 rAAV 처리군, 둘 모두를 포함하는, 여러 군에서 치사가 관찰되었다 (부형제 + PBS: 0; 부형제 + 25 mg/kg CBE: 1; 3.2e9 vg rAAV + 25 mg/kg CBE: 4; 1.0e10 vg rAAV + 25 mg/kg CBE: 0; 3.2e10 vg rAAV + 25 mg/kg CBE: 3).
생전 연구 완료시, 생화학적 분석을 위해, 마우스를 희생시켰다 (도 16). 형광분석 검정법에 의해 생물학적으로 삼중으로 피질에서 GCase 활성을 사정하였다. CBE로 처리된 마우스는 감소된 GCase 활성을 보인 반면, 고용량의 rAAV를 받은 마우스는 CBE 처리군과 비교하였을 때, GCase 활성의 통계학상 유의적인 증가를 보였다. CBE로 처리된 마우스는 또한 GluCer 및 GluSph의 축적을 보였으며, 이 둘 모두는 고용량의 rAAV 투여에 의해 구제되었다.
확립된 화학적 CBE 모델에 추가로, Gba1에서의 V394L GD 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 또한 GCase 국재화 및 활성에 영향을 주는 사포신이 부분적으로 결핍되어 있는 4L/PS-NA 유전적 모델에서도 또한 GBA1-rAAV를 평가한다. 상기 마우스는 빔 워크, 로타로드, 및 와이어 행(wire hang) 검정법에서의 그의 수행능에 의해 입증되는 바와 같이, 운동 강도, 협조, 및 균형 장애를 보인다. 전형적으로, 이들 마우스의 수명은 22주 미만이다. 초기 연구에서, P23에 3 ㎕의 최대 역가 바이러스를 ICV에 의해 전달하였고, 여기서 최종 용량은 2.4e10 vg (6.0e10 vg/g 뇌)였다. 군당 마우스 6마리씩이며, 처리군은 하기와 같았다:
WT + 부형제 ICV
4L/PS-NA + 부형제 ICV
4L/PS-NA + 2.4e10 vg (6.0e10 vg/g 뇌) rAAV ICV.
rAAV 전달 후 4주째에 빔 워크 검사에 의한 운동 수행능을 사정하였다. GBA1-rAAV를 받은 돌연변이체 마우스 군은, 운동 기능은 거의 WT 수준으로까지 회복되면서, 부형제로 처리된 돌연변이체 마우스와 비교하였을 때, 총 슬립수는 더 적고, 속도당 슬립수도 더 적은 경향을 보였다 (도 17). 운동 표현형은 상기 마우스가 노화됨에 따라 점점 더 심각해지기 때문에, 상기 행동 및 다른 행동 검사에서의 그의 수행능은 더 늦은 후속 시점에 사정한다. 생전 연구 완료시, 상기 마우스에서 지질 수준, GCase 활성, 및 생체분포를 사정한다.
0.03x, 0.1x, 및 1x 제안된 1상의 임상 고용량에 상응하는, 추가의 더 낮은 용량의 rAAV를 CBE 모델을 이용하여 현재 시험하고 있다. 각 군은 군당 마우스 10마리씩 (5M/5F) 포함한다:
부형제 ICV
부형제 ICV + 25 mg/kg CBE IP
3.2e8 vg (2.13e9 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP
1.0e9 vg (6.67e9 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP
1.0e10 vg (6.67e10 vg/g 뇌) rAAV ICV + 25 mg/kg CBE IP.
운동 표현형 이외에도, 피질에서 지질 수준 및 GCase 활성을 사정한다. 시간 경과에 따른 처리 및 분석 또한 수행한다.
효능 및 안전성 데이터를 평가하기 위해 더 큰 용량 범위의 연구를 개시하였다. 10마리의 4L/PS-NA 마우스 (군당 5M/5F)에 10 ㎕의 rAAV를 주사하였다. 상대 성장 측정 뇌 중량 계산을 이용하면, 용량은 0.15x, 1.5x, 4.4x, 및 14.5x 제안된 1상의 임상 고용량과 상관관계가 있다. 주사군은 하기 군으로 이루어진다:
WT + 부형제 ICV
4L/PS-NA + 부형제 ICV
4L/PS-NA + 4.3e9 vg (1.1e10 vg/g 뇌) rAAV ICV
4L/PS-NA + 4.3e10 vg (1.1e11 vg/g/ 뇌) rAAV ICV
4L/PS-NA + 1.3e11 vg (3.2e11 vg/g 뇌) rAAV ICV
4L/PS-NA + 4.3e11 vg (1.1e12 vg/g 뇌) rAAV ICV.
CBE 모델에서의 비임상 연구에 관한 요약은 하기 표 3에 제시되어 있다.
<표 3>
CBE 마우스 모델에서의 결과 요약
Figure 112020043073496-pct00003
양성 생체분포는 >100 vg/1 ㎍ 게놈 DNA인 것으로 정의된다는 점에 주의한다.
약어: BD = 생체분포; NS = 비유의적; T = 경향; S = 유의적; N/A = 적용불가능; + = 양성; - = 음성.
실시예 9: rAAV 벡터의 시험관내 분석
프로사포신 (PSAP) 및 SCARB2를 단독으로, 또는 GBA1 및/또는 하나 이상의 억제성 RNA와 함께 조합하여 코딩하는 rAAV 벡터의 시험관내 활성을 사정하는 예비 연구를 수행하였다. PSAP 및 프로그래뉼린 (PGRN)을 코딩하는 한 구축물도 시험하였다. 시험된 벡터는 표 4에 제시된 것을 포함한다. "Opt"는 포유동물 세포 (예컨대, 인간 세포)에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 핵산 서열을 지칭한다. 도 18은 HEK293 세포를 각 구축물로 형질감염시켰을 때, 모의 형질감염된 세포와 비교하여 상응한 유전자 생성물이 과다발현되었다는 것을 나타내는 대표적인 데이터를 보여주는 것이다.
<표 4>
Figure 112020043073496-pct00004
실시예 10: ITR "D" 서열 배치 및 세포 형질도입
ITR "D" 서열의 배치가 rAAV 벡터의 세포 형질도입에 미치는 효과를 조사하였다. 도 19에 제시된 바와 같은, 1) 야생형 ITR (예컨대, 트랜스진 인서트에 인접하게 위치하고, ITR의 말단에는 원위에 위치하는 "D" 서열) 또는 2) "D" 서열이 벡터의 "외부"에 위치하는 ITR (예컨대, ITR의 말단에 인접하게 위치하고, 트랜스진 인서트에는 원위에 위치하는 "D" 서열)을 갖는 Gcase 코딩 rAAV를 HEK293 세포에 형질도입시켰다. 놀랍게도, 데이터는 "외부" 위치에 위치하는 "D" 서열을 갖는 rAAV가 효율적으로 패키징될 수 있고, 세포를 형질도입시킬 수 있는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다 (도 20).
실시예 11: 시험관내 독성 연구
오십 (50) 마리의 마우스에 생후 3일째 GBA1 코딩 rAAV를 4 ㎕ 뇌실내 (ICV) 주사를 통해 투여하였다. 모든 마우스는 처리군에 따라 콘두리톨 B-에폭시드 (CBE) 또는 PBS를 생후 8일째부터 연구 종료시까지 매일 복강내 (IP) 주사로 받았다. 마우스를 그의 최종 IP 투약 후 24시간째에 안락사시켰다. 안락사시킨 후, 표적 조직을 수거하고, 냉각 4% 파라포름알데히드 중에 점적 고정시키고, 4℃에서 보관한 후, 조직병리학 프로세싱 및 평가를 위해 보냈다. 연구 진행 동안 여덟 (8)마리의 동물이 사망하였고, 이들은 보내거나, 분석하거나 하지 않았다.
38-40일째에 안락사된 마흔 두 (42) 마리의 동물로부터 얻은 조직을 트리밍하고, 프로세싱하고, 파라핀 블록 중에 포매시켰다. 이어서, ~5 ㎛ 절편을 제작하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 평가를 위해 슬라이드에 부착시켰다.
rAAV 처리에 기인하여, 조직병리학적 소견 또는 독성의 증거는 없었다. 콘두리톨 B-에폭시드 (CBE)로 처리된 마우스에서는 중추 신경계 (CNS)에 대뇌 피질 중 신경교 흉터 및 뉴런 괴사, 및 뇌간 및 흉부 척수 중 뉴런 괴사를 포함하는 소견이 있었다. 고용량의 rAAV 처리는 상기 CNS 소견의 발병률을 현저히 감소시킨 반면, 저용량 및 중간 용량의 바이러스는 용량에 의존하는 방식으로 대뇌 피질 중 신경교 흉터의 발병률을 감소시켰고, 다른 CNS 소견에 미치는 효과는 모호하였다.
등가물
본 출원은 하기 문헌의 내용, 그 전문을 참조로 포함한다: 2018년 10월 3일 출원된, 대리인 사건 번호 P1094.70003WO00으로 언급되는 국제 PCT 출원; 2018년 10월 3일 출원된, 대리인 사건 번호 P1094.70004WO00으로 언급되는 국제 PCT 출원; 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 62/567,311 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"); 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 62/567,319 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"); 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 62/567,301 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"); 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 62/567,310 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"); 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 가출원 일련 번호 62/567,303 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS"); 및 2017년 10월 3일 출원된 가출원 일련 번호 62/567,305 (발명의 명칭: "GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS").
따라서, 본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 여러 측면을 기술하였는 바, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 변경, 변형 및 개선을 쉽게 착안해 낼 수 있음을 이해하여야 한다. 상기 변경, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부가 되는 것으로 의도되고, 본 발명의 정신 및 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예일 뿐이다.
본원에 본 발명의 여러 실시양태가 기술되고, 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/거나, 본원에 기술된 결과 및/또는 이점들 중 하나 이상의 것을 수득하기 위해 각종의 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상해 낼 수 있을 것이며, 상기 변이 및/또는 변형은 각각 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기술된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성은 예시적인 것임을 의미하며, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시(들)가 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 의존하게 된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상의 실험만을 사용하고도, 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 쉽게 이해하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 실시양태는 단지 예시로서 제공되는 것이며, 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 범주 내에서 본 발명은 구체적으로 기술되고, 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 본원에 기술된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는다면, 둘 이상의 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 발명의 범주 내에 포함된다.
명세서 중 및 청구범위 중 본원에서 사용되는 바, "단수형태"는 달리 명확하게 그 반대로 명시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 중 및 청구범위 중 본원에서 사용되는 바, "및/또는"이라는 어구는 그렇게 결합되어 있는 요소 중 "어느 하나 또는 그 둘 모두," 즉, 일부 경우에서는 공동으로 존재하고, 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명확하게 그 반대로 명시되지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있든 또는 관련이 없든 상관없이, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 예컨대, "포함하는"이라는 제한을 두지 않은 개방형의 표현과 함께 결합하여 사용될 때, "A 및/또는 B"라고 언급하는 것은 한 실시양태에서는 (임의적으로 B 이외의 다른 요소를 포함하면서) B 없이 A를 지칭할 수 있고; 또 다른 실시양태에서는 (임의적으로 A 이외의 다른 요소를 포함하면서) A 없이 B를 지칭할 수 있고; 추가의 또 다른 실시양태에서는 (임의적으로 다른 요소를 포함하면서) A 및 B, 둘 모두를 지칭할 수 있으며; 기타의 경우도 존재할 수 있다.
명세서 중 및 청구범위 중 본원에서 사용되는 바, "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 의미로, 즉, 요소의 개수 또는 요소의 목록 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라, 그 중 1개 초과의 것을 포함하고, 열거되지 않은 추가 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 그 반대로 명확하게 명시된 용어, 예컨대, "~중 단 하나만" 또는 "~중 정확하게 하나," 또는 청구범위에서 사용될 때, "~으로 이루어진"이라는 용어만이 요소의 개수 또는 요소의 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바, "또는"이라는 용어는 오직, 배타적인 용어, 예컨대, "둘 중 어느 하나," "~중 하나," "~중 단 하나만" 또는 "~중 정확하게 하나"라는 용어가 선행될 때 배타적인 대안 (즉, "하나 또는 나머지 다른 하나이지만, 그 둘 모두는 아닌 것")을 나타내는 것으로 해석되어야한다. 청구범위에서 사용될 때, "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 것은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같이, 그의 일반적인 의미를 가져야 한다.
본원, 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여, "적어도 하나의"라는 어구는, 반드시 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하여야 하는 것이 아니라, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것이 아니라, 적어도 하나의 요소가 요소의 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상의 것으로부터 선택된다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있든 또는 없든 그에 상관없이, "적어도 하나의"라는 어구가 지칭하는 요소의 목록 내에 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 임의적으로 존재할 수 있다는 것도 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나의" (또는 동일하게, "A 또는 B 중 적어도 하나의," 또는 동일하게, "A 및/또는 B 중 적어도 하나의")라는 것은 한 실시양태에서는 (임의적으로 B 이외의 다른 요소를 포함하면서) B는 존재하지 않고, 임의적으로 1개 초과의 A를 포함하는 적어도 하나의 A를 지칭할 수 있고; 또 다른 실시양태에서는, (임의적으로 A 이외의 다른 요소를 포함하면서) A는 존재하지 않고, 임의적으로 1개 초과의 B를 포함하는 적어도 하나의 B를 지칭할 수 있고; 추가의 또 다른 실시양태에서, 임의적으로 1개 초과의 A를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의적으로 1개 초과의 B를 포함하는 적어도 하나의 B (및 다른 요소를 포함하는 것) 등을 칭할 수 있다.
상기 명세서 뿐만 아니라, 청구항에서, 예컨대, "포함하는," "비롯한," "보유하는," "갖는," "함유하는," "수반하는," "보유하는" 등의 모든 전환 어구는 제한을 두지 않은 개방형인 것으로, 즉, ~을 포함하나, 이에 제한되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청의 심사 절차에 관한 매뉴얼, 섹션 2111.03(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03)에 기재되어 있는 바와 같이, 오직 "~으로 이루어진" 및 "본질적으로 ~으로 이루어진"이라는 전환 어구만이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 전환 어구여야 한다.
청구항 중의 청구항을 수식하는 서수 용어, 예컨대, "제1," "제2," "제3" 등의 사용은 그 단독으로 한 청구항의 또 다른 청구항 대비의 임의의 우선함, 우위임, 또는 순서, 또는 방법의 조치가 수행되는 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 이는 단지 청구항을 구별하기 위해 특정명을 갖는 한 청구항을 동일명을 갖는 또 다른 항을 구별하는 (서수 용어의 사용을 위한) 라벨로서 사용된다.
명백하게 반대로 명시되지 않는 한, 1개 초과의 단계 또는 조치를 포함하는 본원에서 청구되는 임의의 방법에서, 본 방법의 단계 또는 조치의 순서가 반드시 본 방법의 단계 또는 조치가 언급된 순서로 제한되는 것은 아니라는 것도 또한 이해하여야 한다.
서열
일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자 생성물 (예컨대, 제1, 제2 및/또는 제3 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 카세트는 서열식별번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다 (또는 상기 서열을 갖는 펩티드를 코딩한다). 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 서열식별번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 중 어느 하나의 일부 (예컨대, 단편)에 의해 코딩된다.
SEQUENCE LISTING <110> Prevail Therapeutics, Inc. <120> GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS <130> P1094.70002WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently herewith <150> US 62/567,296 <151> 2017-10-03 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10697 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctgctag ctctgggtat ttaagcccga gtgagcacgc 180 agggtctcca ttttgaagcg ggaggttacg cgttcgtcga ctactagtgg gtaccagagc 240 tccctaggtt ctagaaccgg tgacgtctcc catggtgaag cttggatctg aattcggtac 300 cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 360 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 420 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 480 caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 540 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 600 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 660 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 720 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 780 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 840 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 900 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 960 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1020 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1080 gcgcttggtt taatgacggc ttgttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg 1140 gagctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1200 acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcctcgaa gatccgaagg 1260 gaaagtcttc cacgactgtg ggatccgttc gaagatatca ccggttgagc caccatggaa 1320 ttcagcagcc ccagcagaga ggaatgcccc aagcctctga gccgggtgtc aatcatggcc 1380 ggatctctga caggactgct gctgcttcag gccgtgtctt gggcttctgg cgctagacct 1440 tgcatcccca agagcttcgg ctacagcagc gtcgtgtgcg tgtgcaatgc cacctactgc 1500 gacagcttcg accctcctac ctttcctgct ctgggcacct tcagcagata cgagagcacc 1560 agatccggca gacggatgga actgagcatg ggacccatcc aggccaatca cacaggcact 1620 ggcctgctgc tgacactgca gcctgagcag aaattccaga aagtgaaagg cttcggcgga 1680 gccatgacag atgccgccgc tctgaatatc ctggctctgt ctccaccagc tcagaacctg 1740 ctgctcaaga gctacttcag cgaggaaggc atcggctaca acatcatcag agtgcccatg 1800 gccagctgcg acttcagcat caggacctac acctacgccg acacacccga cgatttccag 1860 ctgcacaact tcagcctgcc tgaagaggac accaagctga agatccctct gatccacaga 1920 gccctgcagc tggcacaaag acccgtgtca ctgctggcct ctccatggac atctcccacc 1980 tggctgaaaa caaatggcgc cgtgaatggc aagggcagcc tgaaaggcca acctggcgac 2040 atctaccacc agacctgggc cagatacttc gtgaagttcc tggacgccta tgccgagcac 2100 aagctgcagt tttgggccgt gacagccgag aacgaacctt ctgctggact gctgagcggc 2160 tacccctttc agtgcctggg ctttacaccc gagcaccagc gggactttat cgcccgtgat 2220 ctgggaccca cactggccaa tagcacccac cataatgtgc ggctgctgat gctggacgac 2280 cagagactgc ttctgcccca ctgggctaaa gtggtgctga cagatcctga ggccgccaaa 2340 tacgtgcacg gaatcgccgt gcactggtat ctggactttc tggcccctgc caaggccaca 2400 ctgggagaga cacacagact gttccccaac accatgctgt tcgccagcga agcctgtgtg 2460 ggcagcaagt tttgggaaca gagcgtgcgg ctcggcagct gggatagagg catgcagtac 2520 agccacagca tcatcaccaa cctgctgtac cacgtcgtcg gctggaccga ctggaatctg 2580 gccctgaatc ctgaaggcgg ccctaactgg gtccgaaact tcgtggacag ccccatcatc 2640 gtggacatca ccaaggacac cttctacaag cagcccatgt tctaccacct gggacacttc 2700 agcaagttca tccccgaggg ctctcagcgc gttggactgg tggcttccca gaagaacgat 2760 ctggacgccg tggctctgat gcaccctgat ggatctgctg tggtggtggt cctgaaccgc 2820 agcagcaaag atgtgcccct gaccatcaag gatcccgccg tgggattcct ggaaacaatc 2880 agccctggct actccatcca cacctacctg tggcgtagac agtgacaatt gttaattaag 2940 tttaaaccct cgaggccgca agcttatcga taatcaacct ctggattaca aaatttgtga 3000 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 3060 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 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135 140 Glu Trp Ser Gln Val His Phe Leu Arg Glu Ile Ile Glu Ala Met Leu 145 150 155 160 Lys Ala Tyr Gln Gln Lys Leu Phe Val Thr His Thr Val Asp Glu Leu 165 170 175 Leu Trp Gly Tyr Lys Asp Glu Ile Leu Ser Leu Ile His Val Phe Arg 180 185 190 Pro Asp Ile Ser Pro Tyr Phe Gly Leu Phe Tyr Glu Lys Asn Gly Thr 195 200 205 Asn Asp Gly Asp Tyr Val Phe Leu Thr Gly Glu Asp Ser Tyr Leu Asn 210 215 220 Phe Thr Lys Ile Val Glu Trp Asn Gly Lys Thr Ser Leu Asp Trp Trp 225 230 235 240 Ile Thr Asp Lys Cys Asn Met Ile Asn Gly Thr Asp Gly Asp Ser Phe 245 250 255 His Pro Leu Ile Thr Lys Asp Glu Val Leu Tyr Val Phe Pro Ser Asp 260 265 270 Phe Cys Arg Ser Val Tyr Ile Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Ser Val Gln 275 280 285 Gly Leu Pro Ala Phe Arg Tyr Lys Val Pro Ala Glu Ile Leu Ala Asn 290 295 300 Thr Ser Asp Asn Ala Gly Phe Cys Ile Pro Glu Gly Asn Cys Leu Gly 305 310 315 320 Ser Gly Val Leu Asn Val Ser Ile Cys Lys Asn Gly Ala Pro Ile Ile 325 330 335 Met Ser Phe Pro His Phe Tyr Gln Ala Asp Glu Arg Phe Val Ser Ala 340 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tgcgcaacaa ggccaacatc 300 cagttcggcg acaacggcac caccatcagc gccgtgagca acaaggccta cgtgttcgag 360 cgcgaccaga gcgtgggcga ccccaagatc gacctgatcc gcaccctgaa catccccgtg 420 ctgaccgtga tcgagtggag ccaggtgcac ttcctgcgcg agatcatcga ggccatgctg 480 aaggcctacc agcagaagct gttcgtgacc cacaccgtgg acgagctgct gtggggctac 540 aaggacgaga tcctgagcct gatccacgtg ttccgccccg acatcagccc ctacttcggc 600 ctgttctacg agaagaacgg caccaacgac ggcgactacg tgttcctgac cggcgaggac 660 agctacctga acttcaccaa gatcgtggag tggaacggca agaccagcct ggactggtgg 720 atcaccgaca agtgcaacat gatcaacggc accgacggcg acagcttcca ccccctgatc 780 accaaggacg aggtgctgta cgtgttcccc agcgacttct gccgcagcgt gtacatcacc 840 ttcagcgact acgagagcgt gcagggcctg cccgccttcc gctacaaggt gcccgccgag 900 atcctggcca acaccagcga caacgccggc ttctgcatcc ccgagggcaa ctgcctgggc 960 agcggcgtgc tgaacgtgag catctgcaag aacggcgccc ccatcatcat gagcttcccc 1020 cacttctacc aggccgacga gcgcttcgtg agcgccatcg agggcatgca ccccaaccag 1080 gaggaccacg agaccttcgt ggacatcaac cccctgaccg gcatcatcct gaaggccgcc 1140 aagcgcttcc agatcaacat ctacgtgaag aagctggacg acttcgtgga gaccggcgac 1200 atccgcacca tggtgttccc cgtgatgtac ctgaacgaga gcgtgcacat cgacaaggag 1260 accgccagcc gcctgaagag catgatcaac accaccctga tcatcaccaa catcccctac 1320 atcatcatgg ccctgggcgt gttcttcggc ctggtgttca cctggctggc ctgcaagggc 1380 cagggcagca tggacgaggg caccgccgac gagcgcgccc ccctgatccg cacc 1434 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 20 tggaagactt cgagatacac tgt 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 21 acagtgtatc tcgaagtctt cca 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 22 tttagaaata agtggtagtc a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 tgactaccac ttatttctaa a 21 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 agggtatcaa gactacgaa 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 ttcgtagtct tgataccct 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 26 tattagatct gatggccgc 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 27 ctccatcact aggggttcct 20 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 28 agctctgggt atttaagccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggtta 60 <210> 29 <211> 145 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> AAV2 ITR <400> 29 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 30 tattagatct gatggccgcg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 31 tccatcacta ggggttcctg 20

Claims (43)

  1. (i) 발현 구축물로서,
    서열식별번호(SEQ ID NO) 15에 기재된 서열을 포함하는 베타-글루코세레브로시다제 (Gcase) 단백질 코딩 서열을 포함하는 트랜스진;
    닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터;
    CMV 인핸서;
    우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element: WPRE); 및
    소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일
    을 포함하는 것인 발현 구축물; 및
    (ii) 상기 발현 구축물에 플랭킹된 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열로서, 제1 ITR 서열은 5' ITR이고, 제2 ITR 서열은 3' ITR인 ITR 서열;
    을 포함하는 단리된 핵산이며,
    트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 단리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 트랜스진이 α-시누클레인을 표적화하는 억제성 핵산을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 여기서 억제성 핵산은 서열식별번호 20에 기재된 서열에 의해 코딩되는 것인 단리된 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 ITR 서열 각각이 야생형 AAV2 ITR 서열인 단리된 핵산.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 ITR 서열 각각이 발현 구축물에 인접한 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, ITR 서열 중 적어도 하나가 발현 구축물 기준으로 ITR 서열의 외부에 위치하는 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현 구축물 기준으로 5'에 위치하는 ITR 서열이 발현 구축물에 인접한 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하고, 발현 구축물 기준으로 3'에 위치하는 ITR 서열이 발현 구축물 기준으로 ITR 서열의 외부에 위치하는 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 단리된 핵산.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5' ITR의 핵산 서열이 서열식별번호 1의 뉴클레오티드 1 - 145이고, 3' ITR의 핵산 서열이 서열식별번호 1의 뉴클레오티드 3867 - 4011인 단리된 핵산.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5' ITR과 발현 구축물 사이에 TRY 영역을 추가로 포함하고, 여기서 TRY 영역은 서열식별번호 28에 기재된 서열을 갖는 것인 단리된 핵산.
  9. (i) 발현 구축물로서,
    서열식별번호 15에 기재된 서열을 포함하는 Gcase 단백질 코딩 서열을 포함하는 트랜스진;
    닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터;
    CMV 인핸서;
    우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소; 및
    소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일
    을 포함하는 발현 구축물; 및
    (ii) 상기 발현 구축물에 플랭킹된 2개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열로서, 제1 ITR 서열은 5' ITR이고, 제2 ITR 서열은 3' ITR인 ITR 서열;
    을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터이며,
    트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, rAAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 트랜스진이 α-시누클레인을 표적화하는 억제성 핵산을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 여기서 억제성 핵산은 서열식별번호 20에 기재된 서열에 의해 코딩되는 것인 rAAV 벡터.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 2개의 ITR 서열 각각이 야생형 AAV2 ITR 서열인 rAAV 벡터.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 2개의 ITR 서열 각각이 발현 구축물에 인접한 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, ITR 서열 중 적어도 하나가 발현 구축물 기준으로 ITR 서열의 외부에 위치하는 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 발현 구축물 기준으로 5'에 위치하는 ITR 서열이 발현 구축물에 인접한 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하고, 발현 구축물 기준으로 3'에 위치하는 ITR 서열이 발현 구축물 기준으로 ITR 서열의 외부에 위치하는 "D" 영역 (서열식별번호 27)을 포함하는 것인 rAAV 벡터.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 5' ITR의 핵산 서열이 서열식별번호 1의 뉴클레오티드 1 - 145이고, 3' ITR의 핵산 서열이 서열식별번호 1의 뉴클레오티드 3867 - 4011인 rAAV 벡터.
  16. 제9항 또는 제10항에 있어서, 5' ITR과 발현 구축물 사이에 TRY 영역을 추가로 포함하고, 여기서 TRY 영역은 서열식별번호 28에 기재된 서열을 갖는 것인 rAAV 벡터.
  17. (i) 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제9항 또는 제10항의 rAAV 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  18. 제17항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 rAAV.
  19. 5'에서 3' 순으로
    (a) 5' 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR);
    (b) CMV 인핸서;
    (c) 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터;
    (d) 서열식별번호 15에 기재된 서열을 포함하는 베타-글루코세레브로시다제 (Gcase) 코딩 서열을 포함하는 트랜스진;
    (e) 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE);
    (f) 소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일; 및
    (g) 3' AAV ITR
    을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 트랜스진이 α-시누클레인을 표적화하는 억제성 핵산을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 여기서 억제성 핵산은 서열식별번호 20에 기재된 서열에 의해 코딩되는 것인 rAAV 벡터.
  21. (i) 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제19항 또는 제20항의 rAAV 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  22. 제21항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 rAAV.
  23. 제9항, 제10항, 제19항, 및 제20항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드.
  24. (i) 발현 구축물로서,
    서열식별번호 15에 기재된 서열을 포함하는 베타-글루코세레브로시다제 (Gcase) 단백질 코딩 서열을 포함하는 트랜스진;
    CBA 프로모터;
    CMV 인핸서;
    WPRE; 및
    소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일
    을 포함하는 것인 발현 구축물; 및
    (ii) 상기 발현 구축물에 플랭킹된 2개의 AAV ITR 서열
    을 포함하는 배큘로바이러스 벡터이며,
    트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 배큘로바이러스 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 트랜스진이 α-시누클레인을 표적화하는 억제성 핵산을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 여기서 억제성 핵산은 서열식별번호 20에 기재된 서열에 의해 코딩되는 것인, 배큘로바이러스 벡터.
  26. (i) 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 rep 단백질 및/또는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터; 및
    (ii) 제2 벡터로서,
    (a) 발현 구축물이며,
    서열식별번호 15에 기재된 서열을 포함하는 베타-글루코세레브로시다제 (Gcase) 단백질 코딩 서열을 포함하는 트랜스진;
    CBA 프로모터;
    CMV 인핸서;
    WPRE; 및
    소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일
    을 포함하는 것인 발현 구축물; 및
    (b) 상기 발현 구축물에 플랭킹된 2개의 AAV ITR 서열
    을 포함하는 제2 벡터
    를 포함하는 세포이며,
    트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 세포.
  27. 제26항에 있어서, 트랜스진이 α-시누클레인을 표적화하는 억제성 핵산을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하고, 여기서 억제성 핵산은 서열식별번호 20에 기재된 서열에 의해 코딩되는 것인 세포.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제1 벡터가 플라스미드이고, 제2 벡터가 플라스미드인 세포.
  29. 제28항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
  30. 제29항에 있어서, 포유동물 세포가 HEK293 세포인 세포.
  31. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제1 벡터가 배큘로바이러스 벡터이고, 제2 벡터가 배큘로바이러스 벡터인 세포.
  32. 제31항에 있어서, 곤충 세포인 세포.
  33. 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질 및 제9항, 제10항, 제19항, 및 제20항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제조하는 방법이며,
    (i) 하나 이상의 AAV rep 단백질 및/또는 하나 이상의 AAV cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터, 및 rAAV 벡터를 세포로 전달하는 단계;
    (ii) rAAV의 패키징을 허용하는 조건하에서 상기 (i)의 세포를 배양하는 단계; 및
    (iii) rAAV 수집을 위해, 배양된 숙주 세포 또는 배양 배지를 수거하는 단계
    를 포함하는 방법.
  34. 제1항의 단리된 핵산, 제9항 또는 제19항의 rAAV 벡터, 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 단백질 및 상기 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV를 포함하는, 파킨슨병 또는 고셰병을 앓거나 또는 앓을 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 대상체의 중추 신경계 (CNS)에의 직접 주사용으로 제형화된 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 대상체의 CNS에의 직접 주사가 대뇌내 주사, 실질내 주사, 경막내 주사, 대수조내 주사, 또는 그의 조합인 제약 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 대상체의 CNS에의 직접 주사가 컨벡션 강화 전달법 (CED)을 포함하는 것인 제약 조성물.
  38. 제34항에 있어서, 말초 주사용으로 제형화된 제약 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 말초 주사가 정맥내 주사인 제약 조성물.
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