JPH03500602A - 昆虫細胞の増殖およびそれによる生産物の発現のための無血清培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 昆虫細胞の増殖およびそれによる生産物の発現のための無血清培地 本発明は、発酵および昆虫細胞培養の分野に属する。より詳しくは、本発明は、 昆虫細胞の培養および繁殖のための改良された培地に関する。更に、本発明は、 昆虫細胞の大スケールでの増殖を支持する無血清培地に関する。その上更に、本 発明は、組換えバクロウィルスまたは野生型ウィルスのいずれかによりそれぞれ 感染され前記無血清培地中で増殖され昆虫細胞は、バクロウィルスにより担持さ れた外来遺伝子の発現を促進するためにバクロウィルスを複製するのに好結果で 使われている。（Ｓｍ１ｔｈら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　、　８２　：　８４０ ４−８４０８（１９８５年１２月）、この中では高レベルのＩＬ−２を生産する ために、ヒ目Ｌ−２をコードするｃＤＮＡを担持している組換えオートグラファ ・カリフォルニカ（釦貝■鉦厘ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ ＡｃＮＰＶ）で感染されたスボドプテラ・フルギペルダ（釘列並圏ユ　紅郵且肛 ム）細胞が報告されている；Ｓｍ１ｔｈら、欧州特許出願公開第１２７，８３９ 号（１９８４年１２月１２日公開）も参照のこと。その中では、宿主昆虫細胞中 で選択された遺伝子を発現することができる組換えバクロウィルスの製造方法が 開示されている；および、Ｊｅａｎｇら、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、。

６１　（３）　ニア０８−７１３（１９８７年３月）、この中ではＭｉ換えＡｃ ＮＰＶウィルスで感染されたＳ、フルギペルダ（委−丘皿ｎ肛血）　（Ｓｒ１） 細胞による機能的なヒトＴ−細胞白血病ウィルス■型（ＨＴＬＶ−Ｉ）　ｐ４０ Ｘタンパク質の生産が報告されている。〕昆虫細胞は、生物学的殺虫剤としての 昆虫ウィルスの生産のために培養されている［：Ｖａｕｇｈｎら、Ｉｎ　Ｖｉｔ ｒｏ、　１３：２１３−２１７（１９７７）；　Ｌｙｎｎら、Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ 、Ｐａｔｈｏｌ、、　３２１−５（１９７８））　、そのようなウィルスとして は、例えば、バクロウィルスおよび非バクロウィルス、例えば感染性軟化病ウィ ルス（ＩＦＶ）および細胞質多角体病ウィルス（ｃｐｖ）が含まれる。模範的で あるのは成る種のバクロウィルス、例えば、核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）およ び顆粒病ウィルス（ＧＶ）であり、これらは昆虫ペストに対して非常に毒性であ る；幾つかの最も有望なものが、農業上重要な昆虫に対して病原性である生物学 的農薬として商業的に開発されてきている［Ｂｕｒｇｅｓ　（ｍン、Ｍｉｃｒｏ ｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｅ５ｔｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅ ａｓｅｓ　１９７０−１９８０（ロンドン、１９８１）　；Ｍｉｌ　ｔｅｎｂｕ ｒｇｅｒら、Ｂｉｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ　ＩＩ　：Ｂａｃｕｌｏｖｊｒｉ ｄａｅ、Ａｄｖ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ＋　３：２９Ｎ１ ９８４）；生物学的農薬としてのそのようなＮＰＶおよびＧ■生産物の議論につ いては、５ｈｉｅｈら、「バクロウィルスの生産および効力」、旦処μ山虱国江 」服」ｌ徂１罰朋旦」Ｌ罵Ｌう：Ｘ　ＩＩ　、　１３５７（１９８０）を参照の こと；Ｈｕｂｅｒ　、ｒベスト管理プログラムにおけるバクロウィルスの利用Ｊ 　、Ｇｒａｎａｄｏｓら（［）　、ＴｈｅＢｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉ ｒｕｓｅｓ：　Ｖｏｌ、Ｉ［Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆ ｏｒ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　ｐｐ、１８１−２０２（１９８６）を 参照のこと〕。

バクロウィルスは非常に安定であり、他の動物ウィルスよりも環境中に長期間存 在することができる。この有用な生物学的安定性は、感染性ウィルス粒子のユニ ークな会合およびウィルスによりコードされるポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒ ｉｎ）と称する構造タンパク質の結晶性集合体であるウィルス閉鎖の結果である 。ウィルス複製の後期には、バクロウィルス粒子はポリヘトリンタンパク質から 成るタンパク譬閉鎖中に埋まるようになる。昆虫は、食物供給を汚染するそれら の閉鎖ウィルス（ＯＶ）を摂取することによりバクロウィルス病を獲得する。ポ リへトリンマトリ・ンクスが、昆虫の外部でのおよび更に昆虫の前編を通過する 間のウィルス粒子を保護する。昆虫の中編において、アルカリ性ｐｏがポリへド リンマトリックスの溶解を活性化し、多数のウィルスの放出をもたらす。細胞外 または非閉鎖ウィルス（ＮＯＶ）型として知られる、核多角体病ウィルス（ＮＰ Ｖｓ）の二次感染型があり、これは感染された細胞の細胞質膜を通ったウィルス のヌクレオカプシドの出芽により生じる。ＮＯＶは昆虫の血リンパを経て二次感 染を蔓延させる原因である。

従来・バクロウィルスの生産は昆虫幼虫を使って達成された；しかしながら、そ のような手段による大スケール生産は魅力的でない。昆虫細胞培養の方がずっと 実用的である（Ｖａｕｇｈｎ、　Ａｄｖ、Ｃｅ１１．Ｃｕ１ｔ、、土：２８１− ２９５（１９８１）；　５ｔａｃｋｔｏｎら、Ｂｕｒｇｅｓ　（ｍ）　、前掲、 ３１３−３２８　）　、オートグラフ７”カリフオルニカ（ハ包［鉦ｈａ　ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の複製を許容するスポドプテラ・フルギペルダ（並剋並圏 ｒａ　ｆｒユ■ゆム）およびトリコブルシア・ニイ　（Ｔｒｉｃｈｏ旦ｕｓｉａ 　ｎｉ）細胞のバッチ法でのおよび半連続的な生産が報告されている（Ｖａｕｇ ｈｎ、　、ｒ。

Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、、　２８：２３３−２３７（１９７６）；Ｈｉｎｋ、 Ｋｕｒｓｔａｋ（［）、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｖｉｒａｌ　Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅ ｓ、４９３−５０６（１９８２）、ｌ。

最大集団倍加時間を有する培養中の昆虫細胞の最大収率を得るために、細胞に増 殖のための理想の栄養的、生物学的および生物物理学的要求物を供給しなければ ならない。最も重要な変数の１つは、昆虫細胞培養培地の組成である。鱗翅目細 胞によく使用される培地の基礎は、Ｗｙａｔｔ、よＬカ」−■Ｌｊ垣−。

リンパに似ており、主として化学的に純粋なアミノ酸、ビタミン、有機酸および 無機酸から成り、そして初めは昆虫血リンパが補足された。後になって、この製 剤から血リンパがウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンおよび全卵の限外濾過物と 置き換えられた（　Ｗｅｉｓｓら、第３章、第６８頁、Ｇｒａｎａｄｏｓら（ｌ ｉｄ）　、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｖｏｌ 、　ＩＩ）１９８６；引用文省略〕。

大スケールでの生体外における昆虫細胞の培養、組換えまたは非組換えウィルス のいずれかによる該細胞の感染、および組換え生産物またはウィルス物質の作製 は、適切な培地の利用可能性に依存する。上記に示した様に、従来の培地は、無 機塩、ビタミン、アミノ酸、糖、および細胞の生理機能にとって重要な多数の他 の有機化合物に加えて、約２−２５重量％の動物血清および／または動物血清ア ルブミンを含有する。

動物血清は、高い値段と比較的少ない入手可能性のために、そして更には、生産 物精製のために生じる厄介な問題のために、限定要因である。昆虫病原性ウィル スまたは組換え生産物の工業生産に必要なスケールでの昆虫細胞の生産は、充分 な量で入手可能であるより安価な成分による動物血清の置換を必要とする。

昆虫細胞の培養のための無血清培地を開発するために多くの研究がなされており 、その多くは、生物学的農薬としてＮＰＶやＧＶを生産させるという状況にあり 、そして次のものを含む：　Ｇｏｏｄｉｙｉｎら、Ｋｕｒｓｔａｋら（ｍ）　Ｉ ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＳ　ｓｔｅｍｓ　Ｔｎ　Ｖｉｔｒｏ、　４５章：４９３ −５０９（１９８０）；Ｇｏｏｄｗｉｎ、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ。

１２：３０３−３０４（１９７６）；　Ｈｉｎｋら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１３ ：１７７（１９７７）；Ｒｏｄｅｒ。

米国特許第４．４５４，２２７号明細書ＨＷｅｉｓｓら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　 ２０：２７Ｈ１９８４）　ＨＧａｒｄｉｎｅｒら、Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ 、、　２５：３６３−３７０（１９７０）；Ｗｉｌｋｉｅら、Ｄｅｖｅｌｏ　、 Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ、、　４６：２９−３７（１９８０）；およびＶａ ｉｌら、Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈ、、　２８：２６３−２６７（１，９７６ ）。

血清がタンパク質加水分解物並びに未精製のおよび特定の脂質により置き換えら れた多数の培地を第１表に列挙する。

第１表 鱗翅目無血清培養 そのような無血清培地に関して、Ｗｅｉｓｓらは、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｕ−ｏｆ 　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ＋　（ＣＲＣプレス１９８６）前掲、第６８頁に おいて次のように指摘している： 培養される昆虫細胞におけるアミノ酸、無機塩、ホルモン、マイトジェン、炭水 化物、有機酸、脂肪酸、糖、脂質並びに−価および二価のカチオンの役割および 利用は、昆虫細胞のための無血清培地の実験的適用を導いた。しかしながら、今 日までにこれらの無血清培地はウィルス複製のために完全に満足できるものでは なく、これは通常血清補足物中に不確定のタンパク質がないことによるものであ ろう。〔引用文は省略した。〕 バクロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）による組換えタンパク質の生産のた めに昆虫細胞を培養する状況において、Ｍｉｌｌｅｒら（Ｓｅｔｌｏｗら（績） 　、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　Ｐｒ１ｎｃｉ　Ｉｅｓ　ａｎｄＭ ｅｔｈｏｄｓ　（８巻）：「外来遺伝子の高レベル発現のための昆虫−バクロウ ィルスの宿主−ベクター系Ｊ　、ｐｐ、２７７−２９８（１９８６）中〕は、第 ２９１頁において、「典型的には細胞およびウィルス増殖の間中は１０％のウシ 胎児血清が存在する。血清により与えられるタンパク質は、それが幾らかのアン タゴニスト活性を含むならば、精製およびおそらく発現にとって問題となり得る 。文献は無血清培地中での昆虫細胞増殖の報告を含むけれども、そのような培地 は、容易にはウィルス増殖を支持しない。」と述べている。次いでＭｉｌｌｅｒ らは、血清代替物として卵黄エマルションを使用するＲｏｄｅｒの米国特許第４ ．４５４．２２７号は、「興味ある異例」であるが、それは「精製問題を軽減す ることが明確でない」と記述している。短期解決策として、本発明者らは、一度 １０％血清含有培地中で感染させれば、細胞を無血清培地に移すことができ、そ してあまり弱まらずに発現がおこるだろうということに注目した。しかしながら 、血清含有培地から無血清培地へのそのような移動は、Ｍｉｌｌｅｒらにより示 唆されたように、大スケールでの工業生産にとっては実用的な解決策ではない。

Ｓｕｍｍｅｒらは、［バクロウィルスベクターのだめの方法および昆虫細胞培養 方法の手引書Ｊ　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅ ｎｔ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、１５５５（Ｔｅｘａｓ　Ａ　＆　Ｍ大学、　１ ９８７年５月）の第３２−３３頁において、「細胞の短期インキュベーション（ 単層の洗浄、細胞の接種、トランスフェクション等）に使われる、ブレースのヤ ママユガ（Ａｎ　ｔｈｅｒｅａｅ）培地（塩、炭水化物およびアミノ酸の比較的 単純な混合物）」、およびｒ３．３ｇ／ｊ２のイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌ ａｔｅ）および３．３ｇ／ｆのラクトアルブミンヒドロライゼー）　（Ｌａｃｔ ａｌｂｕｍｉｎ　Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）　（両者ともＤｉｆｃｏ社から入手 可能）の添加によりＧｒａｃｅの培地から調製される、単層または懸濁液中での 細胞の培養に適当なより完全な培地であるＴＮＭ−ＦＨ培地」の使用を推めでい る。Ｓｕｍｍｅｒらは第３３頁において、「完全増殖培地のためには１０％ウシ 胎児血清（滅菌、熱不活性化されたもの）を加えるｊことを続けて述べており、 そして第９および１０頁の方法の項において、ＳｕｍｍｅｒらはｒＴＮＭ−ＦＨ 培培地＋１亢ように指示している。第１０頁においてＳｕｍｍｅｒらは、「プラ ークアッセイ、感染等のために迅速で且つ薄い付着を促進するためには、無血清 培地中に細胞を播種することが望ましい。

しかしながら、２時間以上無血清のままにしておくと、細胞はストレスの徴候を 示しはじめるかもしれない」と述べている。

昆虫細胞の増殖のための培地の大部分は、ペプトンおよび血清を含有しており、 そして細胞の増殖や組換えタンパク質および生存可能なウィルス粒子の発現を制 限する貧弱な通気条件下で昆虫細胞を増殖するのに従来使われている。昆虫細胞 の増殖を支持する無血清培地は開発されたが、そのような無血清培地中で増殖さ れそして組換えバクロウィルスで感染された昆虫細胞から、同様に感染されそし て約１０％血清含有培地中で増殖された昆虫細胞により達成されたレベルに匹敵 するレベルの組換えタンパク質の生産を支持する無血清培地はまだ全く示されて いない。更に、上記に指摘したように、昆虫細胞中でのウィルス複製を充分に支 持するものも全く示されていない。

昆虫培地中に脂質栄養素を含める試みは、しばしば細胞に容易に適合できない大 きい不溶性脂質粒子の発生をもたらした。本発明はその課題を解決する。

本明細書に記載される研究は、発表された血清含有および無血清の両方の昆虫培 地中に含まれる幾つかのペプトンおよび他の成分が増殖を阻害するかまたは不要 であることを指摘する。更に本研究は、ペプトン画分の高分子量成分が、培養さ れた昆虫細胞により生産される組換え生産物またはウィルス生産物の精製を妨害 し得るということを指摘する。本発明はそのような成分を除去する手段を提供す る。

更に、昆虫細胞の増殖およびバクロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）による かまたは野生型ウィルスでの感染のいずれかによる組換えタンパク質またはウィ ルス生成物それぞれの生産のための単一の、無血清の低または無タンパク質培地 は常に当業界にとって大きな価値があった。小スケールでは、血清を含有する比 較的高タンパク質の培地中で昆虫細胞を増殖させることができ、次いでそのよう な培地から分離し、そして感染および生産物の発現のための無血清生産培地中に 再懸濁することができる。そのような分離および再懸濁工程は大スケールでの培 養には望ましくない。何故なら、そのような工程に必要な装置および作業が複雑 なためである。発酵作業を単純化し、大スケールの昆虫細胞培養のコストを削減 し、そして組換え生産物およびウィルス生産物の精製を助けるであろう無血清で 且つ低または無タンパク質の単一の培地が当業界において要求されている。本発 明はこの要求を満たす。

貧弱な通気条件が昆虫細胞培養において従来使われている理由は、「昆虫細胞の 脆性」のためである（　Ｗｅｉｓｓら、χ旦坦」−ＬＡＬＪ壓±セｒｖｉｒｕｓ ｅｓ、　Ｖｏｌ、ＩＩ　（第３章）、第８０頁（ＣＲＣブレス１９８６）；　Ｗ ｅｉｓｓら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１６：２２２（１９８０））。

２つの問題点が昆虫細胞の大量培養のための懸濁系の充分な利用を遅らせている と思われる。第一は昆虫細胞の脆性（もろさ）、および第二は高い酸素需要、特 にウィルス感染細胞について、である［　Ｗｅｉｓｓら、ＣＲＣプレス、前掲、 Ｐ２Ｏ；引用文省略〕。Ｔｒａｍｐｅｒらは、Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔ ｅｃｈｎｏｌ、、８　：３３−３６　（１９８６年１月）の第３３頁において、 「（昆虫）細胞をスケールアップする上で遭遇する主な問題点は、それらのサイ ズ（２０！Ｍ程度）および細胞壁の欠乏による細胞の剪断感受性である。この剪 断感受性は、従来の方法における（例えば散布による）充分な酸素の供給を妨げ 得る」と述べている。

Ｔｒａｍｐｅｒらは更に第３５−３６頁において、次のように述べている。

「培養中の昆虫細胞の機械的抵抗力は小さい・・・これは昆虫細胞培養のスケー ルアップにとって限定的な結果を有する。

昆虫細胞の大量培養は、液体表面上に空気／酸素を噴きつけることにより達成で きるものよりもより効率的な溶液への酸素透過を必要とする。しかしながら、充 分な酸素を供給するために細胞懸濁液を通して空気を撹拌および散布することに よるガスの拡散は、おそらく細胞の増殖速度よりも大きな崩壊速度を生じさせる だろう。」 本発明は、従来の貧弱通気培養条件下においてだけでなく、充分な通気条件下に おいても、昆虫細胞が増殖できる培地であって、昆虫細胞は高い生存度で高い細 胞密度まで増殖することができ、そして組換えバクロウィルスで感染された場合 には組換え生産物を、または野生型ウィルスで感染された場合にはウィルス生産 物を、血清含有培地において達成されるレベルに匹敵するレベルで生産すること ができる培地を提供するという要求を満たす。

本発明は、高い生存度で高い細胞密度への昆虫細胞の大スケール増殖のために無 血清の低タンパク質または好ましくは無タンパク質培地が提供される。本発明の 培地は、かなり高いタンパク質含量を有する血清含有培地において認められるも のと同等の密度への細胞増殖を支持する。更に、昆虫細胞を本発明の培地中で増 殖させると、それによる組換え生産物の発現および他のウィルス生産物の生産、 例えばＮＰＶおよびＧ■の生産は、血清含有培地中で増殖させた昆虫細胞の発現 および生産と同等である。

また、本発明は、昆虫細胞の増殖並びに組換えタンパク質または他のウィルス生 産物の生産の両方を支持し、そして更にそのような組換えタンパク質およびウィ ルス生産物の精製に適合できる無血清培地を提供する。

更に本発明の別の観点は、製造中に除去できなかった、そして昆虫細胞のウィル ス生産物または組換え生産物の精製を妨害し得る高分子量の成分、残余のプロテ アーゼおよびエンドトキシンをペプトン画分から限外濾過により除去する任意の 方法である。従って、本発明の別の観点は、高分子量成分、残余のプロテアーゼ およびエンドトキシンを実質的に含まない昆虫細胞培養用の無血清培地に関する 。

また、本発明は、無血清培地中にミクロエマルションの形の脂質成分を提供する 。そのような脂質成分は、少量の乳化剤または乳化剤の組合せを含有する脂質／ 有機溶媒溶液を含んで成る。好ましい乳化剤としては、リン脂質、例えばレシチ ン、またはより好ましくは非毒性非イオン性重合体洗剤、例えばポリソルベート ８０、および第二の乳化剤、好ましくは非イオン性重合体洗剤、より好ましくは プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、さらに好ましくはプルロニック Ｆ６８またはＦ１ａの組合せを含む。

更に、本発明の無血清培地は、所望により、撹拌および／または散布培養におけ る剪断ストレスにより生じる細胞の損傷および細胞死を防ぐ非毒性保護剤を含ん で成る。好ましい本発明の非毒性保護剤は、非毒性水溶性ポリマー、より好まし くは非毒性非イオン性重合体洗剤、プルロニックポリオール、例えばプルロニッ クＦ６８またはプルロニックＦ８８、さらに好ましくはプルロニックＦ６８であ る。

第１図は、組換えバクロウィルスで感染されたＳｆ９昆虫細胞によるｒＣＳＦ− １の生産についての時間推移を表わす。上のパネルは感染の０−４日後にＲＩＡ により測定されたｒＣＳＦ−１の濃度を示す。中のパネルは、同じ時間に渡って トリパンブルー排除法を使って細胞をカウントすることにより測定された昆虫細 胞の生存度を示す。下のパネルは、生産されたｒＣＳＦ−１のウェスタンプロッ ト分析である。

本発明の無血清で低タンパク質または好ましくは無タンパク質の培地は、大スケ ールでの昆虫細胞の増殖のために考案される。本発明の培地は、撹拌および／ま たは散布された、好ましくは充分に通気された条件下における昆虫細胞の増殖に とって良好な栄養環境を提供する。昆虫細胞は、特にウィルス感染細胞について は、高い酸素需要を有する（　Ｗｅｉｓｓら、ＣＲＣプレス、前掲、第８０頁〕 。従って、本発明の培地は、昆虫細胞からのウィルス生産物および組換え生産物 の生産並びに細胞増殖を増強せしめ、そして静置培養またはあまり通気されない 他の従来の培養よりも物質的に要求している充分な通気条件下において細胞を損 傷または死から保護するように考案されている。

本明細書において「充分に通気された」とは、例えば撹拌機（スピナー）または 回転ボトルおよび撹拌フラスコまたは振盪フラスコ中で撹拌することにより、ま たは例えばエアーリフト発酵槽中で散布することにより造られるような非−酸素 制限条件について言う。

［タンパク質ｊという用語は、本明細書中では「ペプトン」という用語を除外す るために定義される。本発明の無血清培地は好ましくはごく低濃度のタンパク質 、即ち約１１０００Ｉｊ／ｄ未満、より好ましくは約５０　ｎ　／　ｍ１未満、 さらに好ましくは約５■／　ｍ１未満のタンパク質を含有し、そして最も好まし くは全くタンパク質を含有しない。

「ペプトン」という用語は、本明細書中では酸または酵素のいずれかによる天然 タンパク質の部分的加水分解により生成した開裂生成物の混合物として定義され る。本発明の無血清培地に使用されるペプトンは、好ましくは約１５，０００未 満の分子量、より好ましくは約１０，０００未満の分子量のものである。

本発明の１つの観点においては、本発明の無血清培地は次のものを含んで成る： （ａ）基礎培地； （ｂ）脂質成分；および （Ｃ）ペプトン成分。

「基礎培地」は、本明細書中では無機塩、糖、アミノ酸、所望により更にビタミ ン、有機酸および／または緩衝剤を含有することがある、栄養素混合物として定 義される。補足物を伴った基礎培地は、細胞の生命、成長および繁殖を維持する のに必要な栄養を供給する。本発明の無血清培地の調製のための出発点として使 われる好ましい基礎培地は、血清、タンパク質、好ましくはいずれのペプトンも 全く含有しない。

本発明の培地の調製のための基礎培地の選択は重要でない。

基礎培地は、適当なペプトンおよび脂質成分が選択できるという意味で、細胞の 生命、増殖および再生産を維持するのに必要なアミノ酸およびビタミン類などの 栄養素を供給するように任意に考慮され得る。

本発明の培地において使用できる商業的に入手可能な基礎培地が多種ある。その ような商業的に入手可能な基礎培地としては、例えば、トリプトースブロスを含 まないＴＣＩＯ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓから 入手可能ＨＧａｒｄｉｎｅｒら、Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ、、　２５： ３６３（１９７５））　、ブレースのヤママユガ（Ａｎ　ｔｈｅｒａｅａ）培地 ［ＶａＢｂｎら、ＴＣＡ　＋１ａｎｕａｌ、３　（１）（１９７６）；Ｙｕｎｋ ｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、旦虹１５６５−１５６６（１９６７））　、マークス のＭ２０培地（Ｙａｕｇｈｎら、ＴＣＡ　Ｍａｎｕａｌ＋　３　（１）（１９７ ６）；Ｍａｒｋｓ、Ｋｒｕｓｅう（ｍ）　、ぼ旦口阻町１世崩肛」Ｌ帥ル匡匈ｌ ｐｐ。

１５３−１５６（１９７３）　）　、グツドウィンのＩＰＬ−５２培地（Ｇｏｏ ｄｗｉｎ。

Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１１：３６９−３７８（１９７５））　、グツドウィンの ＩＰＬ培地（Ｇｏｏｄｗｉｎら、Ｋｕｒｓｔａｋ　ら　（ｉｉ）　、　Ｉｎｖｅ ｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｓ　ｓｔｅｍｓＩｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９８０））　、グツド ウィンのＴＰＬ−７０ペプトン培地（Ｇｏｏｄｗｉｎら、同文献；　Ｇｏｏｄｉ ｙｉｎら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１４：４８５−４９４（１９７８））　、ヒン ジのＴＭＨＦｌ（培地（修正したもの）　（Ｗｉｎｋ。

Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）　、匡４６６−４６７（１９７０））　、パンセン のＳ−３０１培地（Ｈａｎｓｅｎ、Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ　（ｍ）　、Ｉｎｖ ｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａ　１ ｉｃａｔｉｏｎｓ、　ｐｐ、７５−７５−９９（１９７５）ＨＶａｕら、ＴＣＡ 　Ｍａｎｕａｌ、　３（１）（１９７６））　、およびＩＰＬ−４１培地（Ｗｅ ｉｓｓら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　［（６）：４９５−５０２（１９８１）　）が 含まれるが、ここでＩＰＬ−４１が好ましい基礎培地である。

指摘したように、ＩＰＬ−４１は本発明の培地の調製にとって好ましい基礎培地 である。ＩＰＬ−４１基礎培地は、多数の販売業者から商業的に入手可能であり 、そしてＷｅｉｓｓら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ。

１７　（６）　：　４９５−５０２　（１９８１年６月）およびＷｅｉｓｓら、 ＣＲＣＰｒｅｓｓ、前掲、ｐｐ、７Ｏ−７２（１９８６）において記載されてい る。ｗｅｉｓｓら（Ｔｎ　Ｖｉｔｒｏ）の第４９６頁の第１表およびＷｅｉｓｓ ら（舅シュ均透盈９−の第７１−７２頁の第３表は、ＩＰＬ−４１の全組成を略 述しており、そして■／ｌにおいてそれらの比率を提供している。前記の２つの 表は、引用により本明細書に組込まれる。Ｗｅｉｓｓら（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）の 第４９７頁に完全培地ＩＰＬ−４１の調製が記載されており、これにはトリプト ースホスフェートブロス（ＴＰＢ）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）が加えられて いる。本発明の無血清培地を調製する上で使用するＩＰＬ−４１基礎培地は、ト リプトースホスフェートブロス（ＴＰＢ）またはウシ胎児血清を含まない。

本発明の無血清培地は、更に保護剤を含んで成ることができる。そのような保護 剤は、特に充分に通気された培養条件下において、本発明の培地の好ましい成分 である。従って、本発明の無血清培地は、次のものを含んで成る：（ａ）基礎培 地； （ｂ）脂質成分； （ｃ）ペプトン成分；および （ｄ）保護剤。

充分に通気されそして散布される培養において認められるような充分な通気条件 下での細胞の損傷および死を防ぐために保護剤が必要である。保護剤は振盪フラ スコ中で増殖される昆虫細胞の崩壊／凝集現象、および容器壁への細胞の付着を 防ぐ。更に、保護剤は振盪フラスコ培養における細胞砕片の量を減らし、これは 保護剤の存在により細胞溶解が減少することを示す。保護剤は、更に好ましくは 遊離懸濁液から泡沫層への細胞損失を防ぐ消泡剤として作用し、そして気泡表面 張力降下剤としておよび／または細胞表面安定剤としておよび／または粘度上昇 剤として作用することができる。

保護剤は本明細書中では、撹拌および散布される昆虫細胞培養において昆虫細胞 を損傷および死から保護するために機能的に作用する非毒性の水溶性成分として 定義される。本発明の保護剤は、好ましくは非毒性の水溶性ポリマーである。

候補となる保護剤は、昆虫細胞培養に関する当業者に既知の方法、例えば培養用 に選択した昆虫細胞の懸濁液または単層にそれを添加しそして対照のものと該培 養物の増殖とを比較することにより、培養しようとする昆虫細胞に対して毒性で ないことをまず確認することにより選択される。次いで、非毒性保護剤候補は、 小スケールにおいて該候補薬剤を任意の昆虫細胞の撹拌または散布培養物に添加 し、適当な期間の後、生存度および増殖速度を観察し、そして対照の培養物にお ける細胞の生存度および増殖速度に対して前記培養物の細胞生存度および増殖速 度を比較することにより、保護能力について試験することができる。

本発明の培地中の保護剤は、好ましくは細胞表面安定剤および／または粘度上昇 剤および／または気泡表面張力降下剤である。好ましい保護剤の例は、ヒドロキ シエチルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（カルボキ シメチルセルロースナトリウムのような）、ｇ酸デキストラン、ポリビニルピロ リドン、フィコール、アルギン酸、ポリプロピレングリコール、および非毒性重 合体洗剤である。

非毒性重合体洗剤は本発明の培地における保護剤として好ましい。更に好ましい のは非イオン性である非毒性重合体洗剤である。マクカチェオン（ＭｃＣｕ　ｔ ｃｈｅｏｎ）のＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆堕士扛Ｐ且堕の書（１１ｃｃｕｔｃ ｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、。

１７５　Ｒｏｃｋ　Ｒｏａｄ、Ｇｌｅｎｎ　Ｒｏｃｋ、ＮＪ、Ｕ、Ｓ、Ａ、によ り発行）は、本発明の培地のための保護剤の非毒性非イオン性重合体洗剤候補を 発見する原典の例であり、これらの候補を前述のようにして非毒性および保護能 力についてテストすることができる。

好ましい非毒性非イオン性重合体洗剤は、プロピレンオキシドとエチレンオキシ ドのブロックコポリマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン縮合体） 、好ましくはプルロニックポリオール、例えばプルロニックＦ６８　、　Ｆ７７ 　、　Ｆ１ａおよびＦ２Ｏ３、好ましくはＦ６８およびＦ１ａ、より好ましくは Ｆ６８である。プルロニックポリオールは、ＢＡＳＦ　ＷｙａｎｄｏｔｔｅＣｏ ｒｐ、（１０１Ｃｈｅｒｒｙ　Ｈｉｌｌ　ｒｏａｄ、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１８１． Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ０７０５４．１１．Ｓ、Ａ）から市販されている。

保護剤は、好ましくは、昆虫細胞を損傷から保護するのに最も効果的な濃度で本 発明の培地中に存在するが、その濃度は細胞増殖および再生産に対して非阻害的 である。プルロニックポリオール重合体保護剤は、好ましくは約０．０１％〜約 １％、より好ましくは約０．０５％〜約０．５％、最も好ましくは約０．１％の 濃度（ｗ／ｖ）において本発明の培地中に存在する。

保護剤、好ましくは重合体保護剤が、本発明の培地の脂質成分の乳化剤としても 働くことが更に好ましい。プルロニックポリオール、好ましくはプルロニックＦ ６８またはＦ１ａ、より好ましくはプルロニックＦ６８は、下記に記載のような 本発明の培地の脂質成分中に既に存在する乳化剤と共同して作用することができ る本発明の培地の保護剤／乳化剤である。しかしながら、本発明の培地の保護剤 は、保護剤の定義内に含まれるべき乳化剤である必要はない。

保護剤が乳化剤として機能しないものであれば、本発明の培地は下記に記載のよ うに脂質成分それ自体中に低濃度で存在する他の乳化剤と共同して脂質成分を乳 化する作用をする別の乳化剤を更に含んで成る。保護剤／乳化剤の代わりのその ような乳化剤は、好ましくは洗剤、好ましくは脂質成分の乳化に必要な濃度にお いて昆虫細胞培養物に対して非毒性である非イオン性洗剤である。

ミクロエマルションの形での脂質成分の導入は、細胞への培地中の脂質の利用可 能性を向上させる。脂質成分を乳化させるための１つの選択は、二重乳化剤系で ある。この系では、上述したように、保護剤は保護剤であるだけでなく乳化剤で もあり、そして本発明の培地の脂質成分を構成している脂質／有機溶媒溶液中に 存在する乳化剤または乳化剤の組合せと共同して作用することができる。本発明 の培地の脂質成分を乳化させるためのもう１つの選択は、保護剤が有意に乳化さ せるのではなく、１種または複数の追加の乳化剤が脂質成分有機溶液に添加され る水溶液中に存在し、そして保護剤がその中に存在する乳化剤と共同してミクロ エマルションを形成する作用をする系である。

乳化剤、保護剤／乳化剤、乳化剤の組合せ、または保護剤／乳化剤と乳化剤もし くは複数の乳化剤との組合せが、脂質成分を乳化するのに効果的であるかどうか のテストは、次のようにして簡単に行うことができる。第一に、乳化剤または乳 化剤の組合せの候補を、上記のようにして着目の昆虫細胞に対して非毒性である ことを確かめなければならない。第二に、候補となる乳化剤の乳化能力を一定の 非毒性濃度においてテストする。脂質を適当な有機溶媒、好ましくはアルコール （ＣＩ　Ｃ３）、より好ましくはエタノール中に溶解する。

候補となる乳化剤または乳化剤の組合せの各々を、脂質／有機溶液または独立し た水溶液と混合する。溶液、即ち有機または水溶液に依存して、候補の乳化剤は よりたやすく混合できる。次いで、水溶液を脂質／有機溶液に添加し、そして渦 動によるなどして激しく撹拌する。脂質成分が好結果に乳化されるならば、撹拌 時に透明〜わずかに半透明のミクロエマルションが形成するだろう。

本発明の培地の脂質成分に添加される好ましい乳化剤は、リン脂質、好ましくは レシチン、および非毒性非イオン性重合体洗剤、好ましくは次の式を有するポリ ソルベート化合物を含む。

上式中Ｒは１６〜２０　（１６と２０を含む）個の炭素原子を有する飽和または 不飽和脂肪酸であり； ｔは１０〜３０　（１０と３０を含む）の整数であり；そしてＵは１０〜２０　 （１０と２０を含む）の整数である。

最も好ましくは非毒性非イオン性重合体洗剤／乳化剤はポリオキシエチレン（２ ０）ソルビタンモノオレエートであり、あるいはポリソルベート８０として知ら れるものである。そのような非毒性非イオン性重合体洗剤は、ＩＣＩ　Ａｍｅｒ ｉｃａｓ　Ｉｎｃ。

（Ｎｅｗ　Ｍｕｒｐｈｙ　Ｒｏａｄ　＆　Ｃｏｎｃｏｒｄ　Ｐｉｋｅ、Ｗｉｌｍ ｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ　１９８９７．ＵＳＡ）からツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０と して市販されている。別のポリソルベートはＤｕｒｋｅｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ｌ　Ｆｏｏｄｓ　Ｇｒｏｕｐ／ＳＣＭ　Ｃｏｒｐ、（９００Ｕｎｉｏｎ　Ｃｏｍ ｍｅｒｃｅ　Ｂ１１ｄ、、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉｏ　４４１１５＋ＵＳＡ ）からダルファックス（Ｄｕｒｆａｘ）８０として市販されている。その他の非 毒性非イオン性重合体洗剤候補乳化剤は、マクカチェオン（？１ｃＣｕ　ｔｃｈ ｅｏｎ）のＥｍｕｌｓｉ工１ｅｒｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎｔｓ、前掲、の 書の中に見つけることができる。

前記の非イオン性非毒性重合体洗剤／乳化剤、例えばポリソルベート８０は、約 ５■／２〜約７５■／Ｌ、より好ましくは約２０■／２〜約３０■／！、最も好 ましくは約２５■／２の濃度で本発明の培地中に存在する。

本発明の培地の二重乳化剤系の好ましい例は、保護剤／乳化剤、好ましくはプル ロニツタポリオール、より好ましくはプルロニックＦ６８またはプルロニックＦ ８８、更により好ましくはプルロニックＦ６８と、非毒性非イオン性重合体洗剤 、好ましくはポリソルベート化合物、より好ましくはポリソルベート８０との組 合せである。

乳化剤または乳化剤の組合せに加えて、本発明の培地の脂質成分は、細胞増殖に 不可欠な脂質を含んで成る。そのような脂質は、脂肪酸、ステロイドおよび脂質 可溶性ビタミンから成る群から選択される。好ましくは、そのような脂肪酸は脂 肪酸エステル、より好ましくは多不飽和脂肪酸エステル、更に好ましくは多不飽 和脂肪酸メチルエステルである。本発明の好ましい多不飽和脂肪酸メチルエステ ルの混合物は魚肝油であり、好ましくはビタミンＡを更に含むたら肝油である。

好ましくはステロイドはステロール、より好ましくはコレステロールである。好 ましくは脂質可溶性ビタミンはビタミンＥ（α−トコフェロール）並びにビタミ ンＡを含む。

更に、本発明の培地の脂質成分は、有機溶媒、好ましくはアルコール、好ましく は１〜３個の炭素を含有するもの、より好ましくはエタノールを含んで成る。

多不飽和脂肪酸メチルエステルの混合物、例えば魚肝油、好ましくはだら肝油は 、好ましくは約１■／ｌ〜約５０■／ｌ、より好ましくは約５■／！〜約１５ｍ ｇ／　ｊ２　、最も好ましくは約１０ｍｇ／　ｌの濃度において培地中に存在す る。前記濃度のたら肝油は、好ましい濃度の脂質可溶性ビタミンＡを更に含有す る。ステロール、好ましくはコレステロールは、好ましくは約２■７１〜約７■ ／！、より好ましくは約３■／！〜約５■／ｌ、最も好ましくは約４．５■／２ の濃度である。アルコール、好ましくはエタノールは、約０．５成／ｌ〜約５ｄ ／２、より好ましくは約１ｄ／２の濃度である。脂質成分のα−トコフェロール は、約０．５■／ｌ〜約４■／β、より好ましくは約２■／ｌの濃度である。

脂質成分は、好ましくはミクロエマルションとして本発明の培地本体に添加され る。ミクロエマルションの形である脂質成分の利点は、昆虫細胞への脂質の利用 可能性を向上させることに加えて、脂質成分および残りの培地成分を別々に濾過 滅菌をしなくてよい、選択（ｏｐｔｉｏｎ）を提供することにある。

ミクロエマルションの形の脂質成分を濾過滅菌することなく培地に添加でき、次 いで、例えば小滴の形の脂質が濾過滅菌工程の間に損失され得るという心配なし に、培地全体を濾過滅菌することができる。大スケール生産のためには、そのよ うな利点が重要である。

本発明の培地の脂質成分は、適当な量の有機溶媒、好ましくはＣＩ　Ｃ２アルコ ール中で、適当な量の脂質混合物、好ましくは多不飽和脂肪酸、α−トコフェロ ールおよびコレステロールの混合物、並びに乳化剤を一緒にし、溶液を形成せし めることにより調製される。この時点で、乳化剤（または保護剤／乳化剤）を含 有する水溶液（この溶液は脂質成分溶液の約１０倍の容量であり、所望により濾 過滅菌されている）を、ゆっくりとそして所望により無菌的に、渦動によるなど して撹拌しながら、脂質成分溶液に添加することができる。

それにより脂質成分のミクロエマルションが形成される。これが培地に添加され る脂質ミクロエマルションである。他の選択として、次に脂質成分を容易に濾過 および滅菌できるし、または全ての添加が終了した後で培地全体を濾過滅菌する こともできる。

本発明の培地の典型例は、培地１！あたり次のものを含んで成る： １０■のたら肝油； ２５■のツイーン８０； ４．５■のコレステロール； ２ｍｇのα−トコフェロール；および １　ｍｌのエタノール。

次に所望により濾過／滅菌された脂質成分溶液（ｌｌｄ）に、この典型例におい ては、水中の１０％プルロニックＦ６８１０ｄ（所望により濾過／滅菌されたも の）が、渦動によるなどして撹拌しながらゆっ（りと添加される。

本発明の無血清培地のペプトン成分は、単独または組合せにおいて、広範な加水 分解されたタンパク質生成物から選択され、限定的でなく、多数の他のタンパク 質のタンパク質分解消化生成物の中でも、ウシ肝臓消化物、例えばパンミード（ Ｐａｎｍｅｄｅ）　（Ｐａｉｎｅｓ　＆　Ｂｙｒｎｅｓ　Ｌｔｄ、、Ｇｒｅｅｎ ｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄから市販されている〕、酵母抽出物、例えばイースト レート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ　、から市販されてい る〕、カゼイン消化物、例えばバクトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ） 　（Ｄｉｒｃｏ。

ＵＳＡ　、から市販されている〕、トリプトースがペプトンであるトリプトース ホスフェートブロス（ＴＰＢ）、ラクトアルブミンヒドロライゼート（Ｌａｃｔ ａｌｂｕｍｉｎ　Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ；Ｌ）Ｉ）［Ｄｉｒｃｏ、ＵＳＡ　、 から市販されている］、ゼラチンペプトン、グリセリン−ゼラチンペプトン、お よびウシペプトンを包含する。

好ましくは、ペプトン成分はＴＰＢ、カゼイン消化物、好ましくはバクトカシト ン、ウシ肝臓消化物、好ましくはパンミード、酵母抽出物、好ましくはイースト レート、およびラクトアルブミンヒドロライゼート（ＬＨ）から成る群から選択 された単独のまたは組合せのいずれかにおけるペプトン画分から成る。より好ま しくは、ペプトン成分が、単独でまたは組合せのいずれかにおいて、ＬＨまたは イーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を含んで成る。更に好ましくは、ペプ トン成分が、ＬＨとイーストレートの組合せか、またはイーストレートのみのい ずれか一方を含んで成る。

本発明の培地中に存在する全ペプトン濃度は、個々のペプトン画分の最高濃度の 和と同じくらい高いものであることができ、ここで各ペプトン画分についての前 記最高濃度は、細胞増殖に対して非毒性で且つ非阻害性であるものであり、そし てペプトン画分の最高非毒性非阻害性濃度の合計ペプトン濃度も同様に細胞増殖 に対して非毒性で且つ非阻害性である。

最高ペプトン濃度は、使用される特定のペプトン画分に関して異なることができ るだけでなく、選択される特定の昆虫細胞系に関しても異なることができる。一 般に、本発明の培地中に存在する全ペプトン濃度は、約１■／ｌ〜約１２　ｇ　 ／　ｆ、より好ましくは約２ｇ／！〜約８ｇ／！、更に好ましくは約３ｇ／ｆ〜 約５ｇ／！の範囲で異なることができる。

スボドプテラ・フルギベルダ（釘剋朋旦ユ　江皿旦肛ム）細胞系Ｓｆ９のために 使用される本発明の培地の可能なペプトン成分の一例として、ＴＰＢ　（約Ｏｇ ／！〜約５　ｇ／ｌ、好ましくは約２．５ｇ／ｌ、バタトカシトンおよびパンミ ード（この２種のペプトンは、各々約Ｏｇ／２〜約５ｇ／２、好ましくは各々約 １ｇ／ｊ２の濃度）、酵母抽出物、好ましくはイーストレート（約１■／ｌ〜約 ６ｇ／２、好ましくは約２ｇ／！〜約５ｇ／！の濃度）、並びにＬＨ（約Ｏｇ／ ｆ〜約６　ｇ　／　ｊ２、好ましくは約１■／ｌ〜約４ｇ／！の濃度）の組合せ を挙げることができる。好ましくは前記ペプトン成分からＴＰＢが欠けている。

より好ましくは、該ペプトン成分からカゼイン消化物（バクトカシトン）および ウシ肝蔵消化物（パンミード）もまた欠けており、そして約２ｇ／！〜約５ｇ／ ｌ、好ましくは約４ｇ／ｌの濃度のイーストレートのみ、または各々約０．５　 ｇ　／　Ｒ〜約ｇ／２の濃度のイーストレートとＬＨとの組合せがペプトン成分 であり、ここで全ペプトン濃度が約３ｇ／２〜約５ｇ／！であるものであり、よ り好ましくはイーストレートとＬＨが各々約２ｇ／！の濃度であるペプトン成分 である。

好ましくは、本発明の無血清培地のペプトン成分を構成するペプトンは、（１） ペプトン生成物の製造の間に使用されたいずれかの残余のプロテアーゼ；　（２ ）いずれかのエンドトキシン；および（３）野生型ウィルスで感染された昆虫細 胞により生産されるウィルス生産物または組換えバクロウィルスで感染された場 合に宿主昆虫細胞により発現されるいずれかの組換え生産物の精製を妨害し得る いずれかの高分子量成分、を除去するために限外濾過により前もって精製される 。

残余のプロテアーゼは、昆虫細胞により生産される組換えタンパク質またはウィ ルス生産物を分解することができ（例えばウィルス粒子のタンパク質被膜を分解 することにより）、従って、ペプトン画分の限外濾過は本発明の培地を調製する 好ましい方法と思われる。ペプトン画分は、まず好ましくは予備濾過され、次い でその後の精製を容易にするために組換え生産物またはウィルス生産物の分子量 よりも小さいように選択された分子量カットオフを有する膜、好ましくは２−１ ５．０００分子量カットオフの膜、より好ましくは２−１０，０００分子量カッ トオフの膜、さらに好ましくは１０，０００分子量カットオフの膜、例えばＰＭ ＩＯ膜（Ａｍｉｃｏｎ）を通して限外濾過される。

前記限外濾過工程は、好ましくは逆流濾過装置において、例えば、小スケールに ついては加圧され撹拌されたセル中で、または大スケールについては中空繊維カ ートリッジまたはプレートおよびフレーム装置中で行われる。次いで所望により 、限外濾過液を基礎培地への添加前に濾過滅菌し、これに本発明の他の成分が添 加される。

本発明の無血清培地の好ましいペプトン成分は次（７）よウニして調製される。

ＴＣイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　（Ｄｉｒｃｏ　）の１０％原液 を、０．４５ミクロンのフィルターを通して予備濾過する。次いで濾液を、１０ ，０００分子分子量カットオフ膜ｍｉｃｏｎ）を通して限外濾過する。限外濾過 液を濾過滅菌し、そしてその２０ｄを、好ましくは前記の脂質エマルションが既 に添加されている基礎培地１！に添加する。イーストレー）　（Ｙｅａｓｔｏｌ ａｔｅ）画分について指示したようにして、ＬＨの１０％原液を予備濾過し、限 外濾過し、次いで濾過滅菌し、そして同様にその２０．ｄを培地に添加する。

本発明の無血清培地は、任意の余分な水溶性成分、例えばα−グリセロールホス フェート（約０．２５　ｇ　／　１〜約４　ｇ／ｌ、好ましくは約０．５ｇ／Ｉ ！、〜約２ｇ／ｉ！、、より好ましくは約１ｇ／ｌの濃度）、グリセロール（約 ０．５　ｇ　／　１２〜約５ｇ／！、好ましくは約１　ｇ／Ｉ！、〜約３ｇ／！ 、より好ましくは約２ｇ／！の濃度）、葉酸（約１■／ｌ〜約７■／！、好まし くは約２　ｍｇ　／　ｌ〜約５■／！、そしてより好ましくは約３．５■／２の 濃度）、およびイノシトール（約２■／ｌ〜約２０■／！、好ましくは約５■／ ｌ〜約１５■／β、そしてより好ましくは約１０■／！の濃度）を含むことがで きる。更に、前記任意の余分な水溶性成分は、過酸化防止酵素、例えばカタラー ゼを、約０．５ｍｇ／ｆ〜約１０ｍｇ／ｊ２、好ましくは約１■／Ｉ！、〜約５ ■／２、より好ましくは約３■／βの濃度で含んで成ることができる。

しかしながら、後記の例６において示されるように、培地を単純化しそして細胞 増殖のいずれかの潜在的阻害剤を除去するための努力において、本発明の培地か らそのような余分な水溶性成分を削除する効果を研究した。予備研究は、余分な 水溶性成分のうちの最も高価なα−グリセロールホスフェートの削除が細胞増殖 にとって有利であろうことを示した。

培地から全ての余分な水溶性成分を削除した更なる研究は、遅滞期の長さが短縮 されそして相対増殖速度が増加することを示した。従って、本発明の好ましい無 血清培地は、そういった余分な水溶性成分を含まない。

本発明の無血清培地中で好結果に増殖でき、且つ野生型ウィルスまたは組換えバ クロウィルスのいずれかで感染されると、それぞれウィルス生産物または組換え タンパク質を生産することができる昆虫細胞は、血清含を培地中で増殖し、繁殖 し、そして組換え生産物および／またはウィルス生産物を発現することが示され ているものである。従って、血清含有培地中で増殖され得る昆虫細胞は、従来培 地の血清が、脂質成分、ペプトン成分（好ましくは限外濾過されたもの）、およ び、所望によるが好ましくは培養物に充分に通気すべき場合には、本明細書中に 記載されるような保護剤；で置き換えられている本発明の培地中で増殖させるこ とができる。

更に、約１０％の血清を含むＩＰＬ−４１基礎培地中で増殖できる昆虫細胞は、 本発明の無血清培地中で増殖させることができる。例えば、ボンビクス・そり　 （Ｂｏｍｂ■　肚社）、リマントリア・ディスパーμｙ晩ＩＬ罰　ｄｉ互凹り、 トリ＝２　フＪＬｔシフ・ニイ　（Ｔｒｉｃｈｏ　１ｕｓｉａ　ｎｉ）およびス ポドブテラ・フルギペルダ（釦何並圏胆紅■江肛鼓）由来の昆虫細胞系は、約１ ０％の血清を含む基礎培地、例えばＩＰＬ−４１中で好結果に増殖されている幾 つかの昆虫細胞である。〔一般に、Ｇｒａｎａｄｏｓら（纒）、Ｔｈｅ　Ｂｉｏ ｌｏ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　１９８６）；Ｖ ａｕｇｈｎ。

Ａｄｖ、Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔ、＋　１：２８１（１９８１）；Ｖａｕｇｈｎ、Ｊ 、Ｔｎｖｅｒｔ、Ｐａｔｈｏｌ、＋２８：２３３（１９７６）；Ｖａｕｇｈｎ、 Ｍａｒａｍｏｒｏｓｈ　（ｌｉｄ）　、Ｉｎｖｅｒｔ、Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕ ｒｅ：Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａ　１ｉｃｓ、、ｐ、２９５（１９７６）：およびＶ ａｕｇｈｎ。

Ｂａｒｉｇｏｚｚｉ（Ｗ）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｌ、Ｃｏ１１ｏ　、Ｔｎｖｅｒｔ。

Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　（２ｎｄ、Ｔｒｅｍｅｚｚｏ、１９６７）、ｐ 、１１９（１９６８）、　）また、本発明の培地中で増殖できるそのような昆虫 細胞は、バクロウィルス発現ベクター系または他の野生型ウィルスに対する宿主 であることができる昆虫類のいずれの目からのものでもあることができるが、好 ましくは双翅類目または鱗翅類目からのものである。約３００種の昆虫が核多角 体病ウィルス（ＮＰＶ）病を有することが報告されており、その大部分（２４３ 種）が鱗翅類から単離された（Ｇｒａｎａｄｏｓら（編）…虹Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ 　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：　Ｖｏｌ、ＩＩ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｏｎｔｒｏ１＋ｐｐ、６３−８７中 、ｐ、６４の−ｅｉｓｓら“大スケールでのバクロウィルスの増殖のための細胞 培養法”〕０次の昆虫由来の昆虫細胞系が模範的であるニトリコブルシア・ニイ 　（ｎ違上並りユ堕　旦）（好ましくはＴＮ−３６８細胞系）；オートグラファ ・カリフオルニカ（ハ旦肛用匝ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）　：スポドブテラ・フ ルギペルダ（釘列並圏胆　な■江肛傾）（好ましくはＳｆ９細胞系）；リマント リア・ディスパーｂ臆狼二堕　並鉦肛）：マメストラ・ブラッシカエ（Ｍａｓｅ ｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）　；アエデス・アルポピクツス（Ａｅｄｅｓ紅 胚旺旦旦）；オルギイア・シュードラガタ　（敗■ハ郵μｔｄｏｔμ７Ｈネオデ ィブリオン・サーティファー（勘剋ｎ社並５ｅｒｔｉｆｅｒ）　；アエデス・ア エギブテイ（Ａｅｄｅｓ憇■Ｈｕ；アンセレア・ユーカリブティ（Ａｎｔｈｅｒ ａｅａ７：グノリモシエマ・オペルクレラ（ＧｎｏｒｉｍｏｓｃｈｅＷｌａ匹肛 製旦蛙紅；ガレリア・メロネーラ　（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ） 　；スボドプテラ・リットラリスＣ釦姐肚旦ｎ１ｉｔｔｏｌａｒｉｓ）　；ブラ テラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｅｌｌａ　ｄ；ドロソフィラ畢メラノガスタ−（欺 匹並Ｕ凰　ｍｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒ）；ヘリオシス・ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ ｓ　ｚｅａ）　：スボドプテラ・エクシグア（釦剋並圏ｎ　■ｎｎ）；ラチプル シア・オウ■％　ｏｕ）　；プロプイア・インターバンクテラ（Ｐｒｏｄｉａ　 ｉｎ山ｍ践胚ｌ±罰）；アンセタ・モーレイ（Ａｍｓａｅｔａｍｏｏｒｅｉ）　 ：アブロチイス・Ｃ−二グラム旦肛虹ｎ仁紅肛憇）：アドクソフィエス・オラナ （封■肛敗競ｏｒａｎａ）　：アブロチイス・セゲツムに■ｉｓ　７；ボンビク ス・そり（Ｂｏａ＋ｂｙｘ　ｍｏｒｉ）　；ヒポノミュータ・マリネシス」」瓜 牧μｍ堕ｍａｌｉｎｅｌｌｕｓ）　；コリアス・ユーリサメ　（Ｃｏｌｉａｓ　 ｄ；アンチカルシア・ゲルメタリア（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ　ｅｒｗｍｅｔａｌ ｉａ）ニアバンチレス・メラノスセルスｄ　＋ｍｅｌａｎｏｓｃｅｌｕｓ）：ア ルクチア・カジャ（Ａｒｃｔｉａ　匹口）　；およびボルセトリア・ディスパー （Ｐｏｒｔｈｅｔｒｉａ　鮭肚肛）　＊好ましい昆虫細胞系はスポドブテラ・フ ルギペルダ（と剋並圏胆紅■豆肛ハ）由来のものであり、そして特に好ましいの はＳｆ９細胞系である０本明細書中の例において使用するＳｆ９細胞系は、Ｍａ ｘＤ、Ｓｕｍ＊ｅｒｓ（Ｔｅｘａｓ　Ａ　＆　Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏ Ｃｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ、ＴＸ７７８４３　ＵＳＡ）から得られた。他のＳ 、フルギペルダ細胞系、例えばＩＰＬ−Ｓｆ−２１ＡＥ　Ｉ［［は、Ｖａｕｇｈ ｎら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　ｌｆｉ：２１３−２１７（１９７７）中に記載され ている。

本発明の昆虫細胞系は、多数の昆虫−病原性ウィルス、例えばパルボウイルス、 ポックスウィルス、バクロウィルスおよびラブドウィルスの繁殖に適当であり、 この中で、バクロウィルスの群からの核多角体病ウィルス（ＮＰＶ）および顆粒 症ウィルス（ＧＶ）が好ましい。更に好ましいのは、オートグラファ（ハ旦肛鉦 旦）種、スポドプテラ（伽産並旦ｎ）種、トリコブルシア（Ｔｒｉｃｈｏ　１ｕ ｓｉａ）種、ラチブルシア（シ匹ｌ独１邦ｊり一種、ガレリア（Ｇａｌｌｅｒｉ ａ）種およびリマントリア（ｂシ助力１り一種由来のものである。より好ましい のは、バクロウィルス株オートグラファ・カリフォルニカ（ハ旦肛旺匝ｃａｌｉ ｆｏｒｎｉｃａ）　ＮＰＶ　（ＡｃＮＰＶ　）　、ラチプルシア・オウ旦匹肛吐 旦ｎ　匹”）　ＮＰＶ、ガレリア・メロネーラ（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎ ｅｌｌａ）ＮＰＶおよびいずれかのプラーク精製されたＡｃＮＰＶ株、例えばＲ ２、Ｒ９、Ｓｌ　、　Ｍ３株であり、これらはＳｏ＋ｉｔｈら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、、　３０：８２８−８３８（１９７９）；Ｓ＋＋ｉｔｈら、Ｊ、Ｖｉｏｌ、、 ３３：３１１−３１９（１９８０）　：およびＳｍ１ｔｈら、Ｖｉｒｏｌ、、　 ８９：５１７−５２７（１９７８）により特徴づけられ記載されている。

Ｓｍ１ｔｈらに対する欧州特許出願第１２７．８３９号（１９８４年１２月１２ 日に公開）明細書は、選択された遺伝子を宿主昆虫細胞中で発現することのでき る組換えバクロウィルス発現ベクターの製造方法を記載している。前記欧州特許 出願は引用により本明細書に組み込まれる。この組換えバクロウィルス発現べフ ターは野生型バクロウィルスＤＮＡと共に宿主昆虫細胞中に同時トランスフェク トされ、そこで組換えが起こる。次いでＥＰ　１２７．８３９およびＳｕｍｍｅ ｒらの「バクロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養操作のための方法のマニュ アル」、前掲、に記載された方法に従って、組換えバクロウィルスが検出されそ して単離される。得られた組換えバクロウィルスを使って、培養された昆虫細胞 が感染され、そして組み込まれた選択された遺伝子からタンパク質生産物が発現 され、そして培地中に分泌される。ゲノムに適当な遺伝子が挿入されている組換 えＡｃＮＰν発現ベクターで感染されたＳ、フルギペルダ（Ｓ、紅■江肛血）細 胞の培養による組換えβ−インターフェロン、インターロイキン２およびクロラ ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の生産が典型的弓なもの である。そのような組換えバクロウィルス発現系および組換えタンパク質を発現 させることにおけるそれの利用に関する更なる情報は、Ｓｕｍｍｅｒらの同文献 において見い出され得る。

ＥＰ公開番号第１２７，８３９号は、組換えバクロウィルス転移ベクターおよび 組換えバクロウィルスの製造方法並びに宿主昆虫細胞中で組換えタンパク質を発 現せしめるための組換えバクロウィルスの利用方法に関する可能性を提供する。

本発明の例によれば、本発明に従って培養された宿主昆虫細胞により組換えＣ５ Ｆ−１が生産される。しかしながら、本開示および引用により組み込まれた上記 出願明細書の利得を有する当業者は、本発明に従って組換えバクロウィルスで感 染された昆虫により多数の他の組換えタンパク質が生産され得ることを知るだろ う。ＢＥＶＳを介して昆虫細胞中で発現されている他の異種タンパク質は、Ｓｕ ｍｍｅｒら、Ｂａｎｂｕｒ　Ｒｅ　ｏｒｔ：む工弓違１月ヱ」Ｂ旦１易ｌニ士巨 」１」旬りむヱ堕勉見り山−２２：３１９−３２９（１９８５）において概説さ れている。典型的な組換えタンパク質としては、限定なしに、同時係属中の出願 （Ｃｅｔｕｓ　ＤｏｃｋｅｔＮｏｓ、２３４７．２３８２および２８８３）明細 書中に記載されるものを含み、コロニー刺激因子〔例えば、長い形および短い形 のＣ３Ｆ−１またはＭ−ＣＳＦ（後述）、Ｇ−Ｃ５Ｆ、　Ｇ？ｌ−Ｃ３Ｆおよび 特にインターロイキン−３〕、改変されたプロウロキナーゼまたはウロキナーゼ 、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ、）、ＴＰＡ−ウロキナーゼハイブ リッド、毒性タンパク質、例えば完全リシン毒素、リシンＡ鎖、リシンＡ含有生 成物、並びにインターフェロン（α、βおよびＴ並びにそれらのハイブリッド） 、インターロイキン、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチンおよび他の造血成長因 子、ヒト成長ホルモン、並びにブタ、ウシおよび他の成長ホルモン、表皮増殖因 子、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、スーパーオキシドジスムターゼ、第■因子 、第ＸｌＣ因子、心房性ナトリウム利尿因子、ネコ白血病ウィルスワクチン、例 えばｇｐ７０ポリペプチド、レクチン、例え素、ゲロニン、シュードモナス・ア エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕ■亜閃）からの外毒素、フィト ラッカ・アメリカナ（ハム１匹且ａｍｅｒｉｃａｎａ）からの毒性タンパク質（ ＰＡＰＩ。

ＰＡＰ　ｎおよびＰＡＰ−５）、バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ旦藍旦７からの殺虫性タンパク質、多数の酵素、例えばＣＡＴ、並びに無数の 他のハイブリッドタンパク質が含まれる。

「コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ−１）　Ｊとは、Ｃ３Ｆ−１について当業界におい て解釈される活性のスペクトルを表わすタンパク質を言い、即ち、Ｍｅｔｃａｌ ｆ、Ｌ工劇１」１Ｌユｏ１．、７６：８９（１９７０）の標準的な生体外コロニ ー刺激アッセイに適用した時に主としてマクロファージコロニーの形成をもたら すタンパク質を言う。

生来のｃｓｐ−ｉはグリコジル化された二量体である；三量化は活性のために必 要であるかもしれない。本明細書においてＣ５Ｆ−１という用語は二量体と単量 体の両方の形について言及される。

ヒ）Ｃ５Ｆ−１は、ヒトおよびネズミの両方の骨髄細胞に作用できるが、一方ネ ズミＣ３Ｆ−１はヒト細胞に関して活性を示さない。従って、ヒトＣ５Ｆ−１は 、Ｄａｓら、Ｂｌｏｏｄ、　５８：６３０（１９８１）の特異的ネズミラジオレ セブターアッセイにおいて陽性であルヘキである。該タンパク質の生物活性は、 ヒト尿Ｃ５Ｆ−１に対する抗血清を中和することによっても阻害されるＣＤａｓ ら、同文献）。

Ｃ５Ｆ−１は、成熟マクロファージからのプロスタグランジンＥ群、インターロ イキン−１およびインターフェロンの分泌を刺激することができるＣ　Ｍｏｏｒ ｅら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２３　：１７８（１９８４）　）。しかしながら、骨 髄細胞を使った単球／マクロファージコロニーの形成を刺激するタンパク質の能 力（骨髄アッセイ）および精製されたヒト尿Ｃ３Ｆ−１に対する抗血清を中和す ることによる阻害感受性、並びにラジオレセプターアッセイ　（ＲＲＡ）または 従来のラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ）に対する陽性の応答を使って、組換え バクロウィルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を介して昆虫細胞により生産される Ｃ５Ｆ−１を同定することができる。

本発明の無血清培地中で増殖される昆虫細胞は、選択される特定の細胞系に適当 な温度範囲および条件下において培養される。例えば、スポドプテラ・フルギベ ルダ（釦射並にユ旦旦並肛傾）細胞、好ましくはＳｆ９細胞は、約２５°Ｃ〜約 ３２°Ｃ２好ましくは約２７°Ｃ〜約２８°Ｃの温度範囲内で培養され、そして 培地のｐＨは好ましくは約６〜約７、より好ましくは約６．２〜約６．４の範囲 内に維持される。

組換えバクロウィルスでの昆虫細胞の感染の時期を定める効果は、増加された比 生産性にとって重要であることが示された。組換えタンパク質の比生産量は、非 −酸素制限条件下における細胞増殖の指数期の間一定であることがわかった。

非指数増殖条件下での遅い感染は、低い比生産性および低い最終力価をもたらし た。組換えタンパク質生産物の最高全生産量を達成するために、可能な最大細胞 密度まで指数増殖期が延長されるのが好ましい。増殖を制限する条件下、例えば 細胞増殖の定常期における宿主昆虫細胞の感染は、組換えタンパク質生産物の比 生産性の減少をもたらす。

組換タンパク質生産物の比生産性は、培養物が指数増殖期にある限り感染の時点 での細胞密度と比較的無関係である。

例えば、スボドプテラ・フルギペルダ（釦Ｍ並圏胆Ｕ皿江肛傾）細胞が宿主昆虫 細胞であり、そして本発明の培地を使用する時、 （以下余白） 組換えタンパク質生産物の収獲の時期を定めることは、ウィルスおよび細胞の溶 解タンパク質による組換えタンパク質の汚染を回避し、そしてそれにより組換え タンパク質の下流精製を単純化するために重要である。生産物の安定性について 考慮すれば、有意な細胞熔解が起こる前に組換え生産物を収獲することが好まし いであろう。更に、本発明の方法および培地に従って生産しようとする各々の組 換えタンパク質またはウィルス生産物を、発酵の過程に渡り安定性および分解に ついてチェックすべきである。そのような考察が最適な収穫時期の決定の中に加 わるべきである。

次の例は本発明の無血清培地、そのような培地中での非−酸素制限条件下での昆 虫細胞の増殖、および組換えバクロウィルス発現系を介したそのような昆虫細胞 による組換えタンパク質の生産を説明する。これらの例は決して本発明を限定す るものではない。

勇−上 無血清増殖培地の開発 この例は、昆虫細胞の増殖のだめの無血清培地の開発を概説する。血清含有培地 中でのスボドプテラ・フルギペルダ（釦剋亜共ｎ　紅Ｕ■肛傾）細胞（Ｓｒ１） の増殖の結果を、２つの無血清培地候補中での昆虫細胞の増殖と比較した。

対照培地は、Ｗｅｉｓｓら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１７（６）：４９５−５０２ （１９８１年６月）において記載されたＩＰＬ−４１完全培地であり、これはＩ ＰＬ−４１基礎培地に２％（ｖ／ｖ））リプドースホスフェ−ドブ０ス（ＴＰＢ ）および１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することにより調製さ れる。前記の複合対照培地は、約７ｇ／！の全タンパク質濃度において血清とタ ンパク質加水分解物を含有する。

候補となる無血清培地＃　１　（ＳＦＭ　１１）は、ＩＰＬ−４１基礎培地、即 ちＴＰＢとＦＢＳが削除されたＩＰＬ−４１完全培地に、次の補足を加えること によって調製された。

トリプトースホスフェートブロス　２．６ｇ／ｌウシ血清アルブミン（脂肪酸不 合）　１．０ｇ／ｆグリセロール　２．０ｇ／４２ プルロニックポリオール（Ｆ６８）　１．０ｇ／ｉ！。

α−グリセロールホスフェート　１．０ｇ／Ｉ！。

葉酸　３．６■／！ たら肝油　１０．０■／ｆ ツイーン８０　２５．０■／ｉ コレステロール　４．５■／！ 酢酸α−トコフェロール　２．０■／β候補となる無血清培地＃　２　（ＳＦＭ 　＃２）は、ＩＰＬ−４１基礎培地に次の補足を加えることによって調製された 。

トリプトースホスフェートブロス　２．６ｇ／ｌ酵母抽出物　ＬＯｇ／Ｉ！。

バタトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ）　１．０　ｇ　／　１パンミー ド（Ｐａｎｍｅｄｅ）　１．０　ｇ　／　１ウシ血清アルブミン（脂肪酸不合） 　１．０ｇ／ｆグリセロール　２．Ｏ，ｇ／ｊ！ α−グリセロールホスフェ−）　１．０ｇ／４２プルロニックポリオール（Ｆ６ ８）　１．０ｇ／ｌたら肝油　１０．０ｍｇ／　ｆ 酢酸α−トコフェロール　２．０■／２ＳＦＭ　＃１中のＳｆ９細胞は、１，２ および３継代目において、血清含有対照培地中の同細胞に比較してかなり減少し た速度および最終細胞密度で増殖した。

１縫代目のＳＦ？ｌ　＃２中のＳｆ９細胞の培養は、長い遅滞期を経た後、１０ ％血清含有培地中で増殖されたＳｆ９細胞に典型的な密度にまで増殖した。２継 代目では、細胞はＳＦＭ　１２に適応せず、長い遅滞期を表わさなかった。増殖 速度および最終細胞密度は１０％ＦＢＳを含有する培養物のものに再び接近した 。

ＳＦＭ　！１２は７継代を超える間Ｓｆ９細胞の増殖を維持すること改変された ＳＦＭ　＃２はＳｒ１の増殖とＣ３Ｆ−１の発現を支持する この例は、例１のＳＦＭ　＃２の改変された形が、Ｓ、フルギベルダ（Ｓ、旦■ 几肛並）細胞の増殖と、ゲノム中に生物学的に活性なコロニー刺激因子１　（Ｃ ＳＦ−１）タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が挿入されている組換えバクロ ウィルスＡｃＭ４でＳｆ９紹胞を感染させた時の組換えＣ５Ｆ−１（短い形）の 生産との両方を支持することを証明する。組換えバクロウィルスによ゛り感染さ れたＳｆ９細胞の改変されたＳＦＭ　＃２培養物と１０％血清含有対照培養物の 両方とも、約３００，０ＯＯＵ／ｄの組換えＣ３Ｆ−１を生産した。

Ｓｆ９細胞培養物５０ｄを、２５０ｙＪ！の振盪フラスコ中で２７°Ｃにて１／ ２インチ（１，２７ｃｓｎ）の回転軌道半径で１５ＯＲＰＭにて撹拌しながら増 殖させた。Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒを使って全細胞数をカウントし、そ してトリバンブルー排除により細胞の生存度をチェックした。該細胞は、２％Ｔ ＰＢおよび１０％熱不活性化ＦＢＳおよび０．１％プルロー’−７り（Ｐｌｕｒ ｏｎｉｃ）ポリオール（Ｆ　６８）を含む前記ＩＰＬ−４１完全培地中か、また はすぐ下に記載の変更されたＳＦＭ　１２（ＳＦＭ２Ｍ）’中のいずれかにおい て維持された。

例１のＳＦＭ　＄１２は１　ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する 。血清に代わる他の主要な代替物は３つのペプトンの組合せ：酵母抽出物、バク トカシトンおよびパンミードであり、各々Ｉｇ／／！で補充される。ＳＦＭ　１ ２の組換えタンパク質生産物の下流精製を単純化するためにペプトン含量の変更 を研究した。３ｇ／２のペプトンに加えて、ＳＦＭ　＃２は２．６ｇ／ｌのトリ プトースホスフェートブロスを更に含有する（　ＩＰＬ−４１完全培地が含有す るのは２ｇ／ｌトリプトース）。

ペプトン濃度をそれぞれ１．５ｇ／Ｉ！、、０．６ｇ／ｆ、０．３ｇ／２および Ｏｇ／２に減少させる一方、ＴＰＢ濃度を２．６ｇ／Ｐに維持し、そして３ｇ／ ！のペプトンで増殖された培養物のものと増殖曲線を比較することにより、ペプ トン濃度が重要であることがわかった。ＳＦＭ　１２の３ｇ／！ペプトン培養物 は、充分な細胞増殖速度、即ち、典型的な１０％血清含有培養物の１７時間と比 較して２４時間の集団倍加時間（Ｔｄ）、および１０％血清含有培養物と同等な ４−５　Ｘｌ０６細胞数／成の最大細胞密度をもたらした。しかしながら、ペプ トン濃度を３ｇ／ｌからＯｇ／Ｅに減らすと、到達する最大細胞密度が有意に減 少した。

（１）生産物の精製を妨害し得るいずれかの高分子量成分；（２）ペプトン製造 工程からの潜在的に残余のプロテアーゼ；および（３）エンドトキシンを除去す るために、ペプトンを限外濾過した。ＴＰＢを除くペプトンを、無血清培地に添 加する前に１０．０００分子量カットオフ膜（Ａｍｉｃｏｎ　ＰＭＩＯ）を通し て細胞を加圧撹拌しながら限外濾過した。ペプトン濾過物を含む無血清培地上で のＳｆ９細胞の増殖は、そのままのペプトンを使ったものと同等であることがわ かった。ペプトン限外濾過保留物を水で２０×透析した；付加のペプトンを全く 加えない無血清培養物のものと比較してＳｆ９細胞の増殖を有意に増大させない ことが示された。

組換えＣ３Ｆ−１の精製においてＴＰＢが問題を引き起こすことが決定された。

従って、３つのペプトンについて上述したようにして、無血清培地への添加前に ＰＭＩＯ膜を通してＴＰＢを限外濾過した。ＴＰＢおよび３つのペプトンの両者 のＰＭＩＯ濾過物の組合わせは、１０％血清含有培地および未濾過のＳＦＭ　＃ ２と同様な最大細胞密度へのＳｆ９細胞の増殖をもたらした。

従って、ＳＦＭ２Ｍと称する新規無血清型は、予め限外濾過されたＴＰＢを含む 全てのペプトンを含有する。１０％血清培地中での増殖はＳＦ？Ｉ２Ｍ中でのも のより速かった。

ｐＡｃＭ４と野生型バクロウィルスＤＮＡとで昆虫細胞を同時トランスフェクト することにより組換えバクロウィルスＡｃＭ４を調製し、次いで組換えバクロウ ィルスを検出しそして精製する方法は、本質的には前記米国特許出願明細書中に 記載されるようにして行われた〔欧州特許出願第１２７．８３９号明細書：Ｓｕ ＋ｎｍｅｒら、「バクロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養操作のための方法 のマニュアル」前掲、も参照のこと〕。

組換えバクロウィルスでの感染は、２′＝９の感染多重度（ＭＯＩ）で比較的低 細胞密度（１−１，５Ｘ１０６細胞／ｄ）にて行われた。ＳＦＭ２？ｌおよび１ ０％血清含有対照での培養物は共に３００．０００　Ｕ　／ｄの組換えＣ５Ｆ− １を生産した。Ｃ５Ｆ−１レベルはＲＩＡにより評価された。

Ｃ３Ｆ−１の大部分は、組換えバクロウィルスでの感染後４８時間以内にそして 細胞が溶解する前に生産された。細胞溶解による培養上清の汚染を回避するため に、細胞溶解の前に組換えタンパク質の収穫の時期を定めることが望ましい。

指数増殖期の間にＳＦＭＺｒ中において組換えバクロウィルスＡｃＭ４で感染さ れたＳｆ９細胞により１０６Ｕの組換えＣ３Ｆ−１／７１が生産され得ることが 決定された。組換えＣ５Ｆ−１の化生産量（Ｕ／細胞）は、非−酸素制限条件下 における指数増殖期の間は一定であるように思われた。２．７Ｘ１０’細胞数／ ｄの細胞密度におけるＡｃＭ４での感染は、ＲＩＡにより評価すると１．２Ｘ１ ０６ＵのｒＣＳＦ−１／ｍｌそして骨髄バイオアッセイにより評価すると２．５ Ｘ１０６ＵのｒＣＳＦ−１／ｍｌを生産した。〔骨髄増殖アッセイは、Ｍｏｏｒ ｅら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１３１牝３７４（１９８３）およびＰｒｙｓ　 ｔｏｗｓｋｙら、ＡｍＪ、Ｐａｔｈｏｌ、、旦虹１４９　（１９８４）に従って 行う。〕感染後第１日目から第４日日までの試料のウェスタン分析により（短い クローン）　ｒＣＳＦ−１において殆ど変化が認められなかった。非指数増殖条 件下での遅い感染は、低い化生産性および低い最終力価をもたらした。従って、 高い細胞密度での感染（ただし未だ指数増殖期における）が、ｒＣＳＦ−１生産 を増加させるだろうことが結論づけられた。

■−１ ＳＦＭ２ＭからのＢＳＡの削除 この例は、１ｇ／２のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＳＦＭＺＭ中でのＳ ｆ９細胞の増殖がＢＳＡを全く含まないＳＦ？！２Ｍ中で認められるものと同様 であったことを示す。同様に、そのような本質的に無タンパク質の培地（ＢＳＡ を含まないＳＦＭ２Ｍ）中でのｒＣＳＦ−１の生産は、ＢＳＡを含むＳＦＭ２Ｍ 中で認められるものに等しかった。

Ｓｆ９細胞培養物５０ＩｄをＳＦＭ２ＭおよびＢＳＡを含まないＳＦＭ２？Ｉの 両方において、２５０−の振盪フラスコ中で１１００−１５０ｒｐで撹拌しなが ら（１／２インチの軌道半径で）２７°Ｃにて増殖させた。組換えバクロウィル スＡｃＭ４を用いて、指数的に増殖している培養物を１のＭＯＩにて感染せしめ た。ＢＳＡを含む培養物に対しＢＳＡを含まないものにおいて、増殖速度または 最大細胞ａ度への影響が殆どまたは全く観察されなかった。

ｆ３ｓＡを含まない他のＳＩ’Ｍ２ＭでのＳｆ９細胞培養物を振盪フラスコ中で 増殖させそしてＡｃＭ４で感染させた。１２５−１，０００戒のフラスコ中２５ −２５０　ｄの培養物容量は、感染の４または５日後までに１０６ＵｒＣ５Ｆ− １／　Ｉｎｌを繰返し生産した。

免疫沈降に続＜　５ＤＳ−ＰＡＧＥ、並びにウェスタン分析は、ｒＣ３Ｆ−１（ 短いクローン）がこの木質的に無タンパク質の培地、即ちＢＳＡを含まないＳＦ ？Ｉ２？Ｉの培養ブロス中で分解されないことを示した。

ＢＳＡを含まないＳＦＭ２１’ｌは、カタラーゼ３ｒｎｇ／ｌおよび１０．００ ０より小さい分子量の混合ペプトン５ｇ／Ｊ２を今まで通り含有する。ＢＳＡを 含まないＳＦＭ２Ｍの組成は次のようである。

迂卦（ＵＢｖ１壇 り゛・されたペプトン トリプトースホスフェートプロス　２．６ｇ／１２バタトカシトン（Ｂａｃｔｏ ｃａｓｉｔｏｎｅ）　Ｃカゼモノ消化物〕１ｇ／Ｉ！。

パンミード（Ｐａｎｍｅｄｅ）　（ウシ肝臓消化物：ｌ　１　ｇ　／　１イース トレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　〔酵母消化物〕１ｇ／ｊ２途分夾ｊＱ１１ え分 α−グリセロールホスフェート　１　ｇ　／　Ｉ！。

グリセロール　２ｇ／！ １８表千３−５００６０２　（１４） 葉酸　３，６■／ｌ イノシトール　ｌｋ／　Ｉ！。

カタラーゼ　３．／！ プルロニックポリオール＝Ｅ【Ｌ乙之λ、ｌプルロニックポリオールＦ６８　１ ｇ／Ｉまたら肝油　１０■／ｌ ツイーン（Ｔｉｖｅｅｎ）８０　２５ｍｇ／　１コレステロール　４．５■／２ 酢酸α−トコフェロール　２ｍｇ／Ｉ！。

拠−土 物理的保護剤の重要性 ＢＳＡはＳｆ９細胞の増殖または組換えタンパク質生産物の生産にとって不可欠 ではないが、該培地からのプルロニックポリオール（Ｆ　６８）の削除は１０％ 血清の存在下でさえも振盪フラスコ培養において細胞死をもたらす。プルロニ・ ンクポリオールは、振盪フラスコにおいて物理的保護剤として不可欠であり、そ してそれは脂質を乳化するのにも役立つ。

旦−足 ＢＳＡを含まないＳＦ？１２Ｍのペプトン変更例３ではＢＳＡを含まないＳＦ？ Ｉ２？ｌの組成を概説した。この例では、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２ＦＩのペプ トン成分が変更されている、より単純化された培地が記載される。

ＢＳＡを含まないＳＦｌ’１２Ｍの全ペプトン濃度は５ｇ／ｊ２である。そのよ うな培地中でのＳｆ９細胞の増殖速度は遅く、多数の継代（１０−２０）後は３ Ｏ−４０（７）倍加時間（Ｔｄ）を有し、一方１０％ＢＳＡ含有培地中でのＳｆ ９細胞の倍加時間（Ｔ　ｄ　）は１７−２４時間である。より速い増殖速度を獲 得し、それにより組換えバクロウィルスで感染されたＳｆ９細胞からのより効率 的な組換えタンパク質の生産を獲得するために、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍの ペプトン組成を変更した。また、ペプトンの数の減少は、培地の調製および組換 えタンパク質生成物の下流精製を単純化する。

２．６ｇ／βでＴＰＢを含有する培地に次のペプトン付加を行った、ＢＳＡを含 まないＳＦＭ２？Ｉのペプトン変更培地を調製した： （１）イーストレー１−　（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　３　ｇ　／　ｉ！、、ま たは（２）バクトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ）　３　ｇ　／　ｌ、 または（３）パンミード（Ｐａｎｍｅｄｅ）　３　ｇ　／　ｊ２　。

さらに、それぞれ２ｇ／ｌおよび５　ｇ／１２のトリプトース（Ｔ　Ｐ　Ｂとし て）が唯一のペプトン成分である２つの培地を調製した。この培地を、ＢＳＡを 含まないＳＦＭ２Ｍ中で１５継代（約５０＋世代）に渡り維持されたＳｆ９細胞 に接種した。

２５０戚の振盪フラスコ中の５０５０−１Ｏ０のＳｆ９細胞培養物を２７°Ｃに て１００−１５Ｏｒｐｍで撹拌した。Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒを使って 細胞密度を測定した。典型的な指数増殖期培養物の細胞生存度は、トリバンブル ー排除により調べると、９９−１００％であった。

ペプトン成分としてＴＰＢのみを含む（２ｇ／４２および５ｇ／ｌ）リブドース の両方において）培地において最も貧弱な増殖が認められた。この培地への他の ペプトンの添加が増殖を有意に増加させた。長い遅滞期（指数増殖が始まる前の ２〜３日）が観察されたけれども、ＴＰＢに加えてイーストレートを含む培地に おいて最良の増殖が認められた。

ＴＰＢが細胞増殖を阻害すると思われるので、ＴＰＢが削除されたＢＳＡを含ま ないＳＦＭ２Ｍのペプトン変更物を調製した。ＢＳＡを含まない変更されたＳＦ Ｍ２Ｍの唯一のペプトン成分としての５ｇ／ｆｆｉのパンミード（Ｐａｎｍｅｄ ｅ）は、増殖を阻害するようであった。唯一のペプトン成分としての５ｇ／！の バクトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓ　ｉ　ｔｏｎｅ）は、低い細胞密度への増殖 および遅い指数増殖を支持した。５ｇ／４２のトリペプトン（イーストレート、 パンミードおよびバクトカシトントン）並びに５ｇ、＃！のイーストレートのみ の培養物は、両方とも良好に増殖した；しかしながら、また、長い遅滞期を有す るけれども、イーストレート培養物が最も速い指数増殖速度を有していた。

唯一のペプトン成分としてそれぞれ２．４，６．８およびＬｏｇ／ｆｆｉのイー ストレートを単独で用いた実験は、４ｇ／４２以上の濃度においては、しだいに 増加していく長い遅滞期または指数増殖の阻害が起こることを指摘した。２ｇ、 ＃！のイーストレートを含む培養物については遅滞期が短かった。４ｇ　／　ｌ でのイーストレート培養物は長い遅滞期を有するけれども、それは最も速く増殖 し、そしてわずかに高い最大細胞密度に到達した。

培地のペプトン成分としてイーストレートを含有するそのような培養物の遅滞期 を短縮するために、低濃度（２ｇ／ｆ）のイーストレートを、それぞれ０．２お よび４ｇ／！の限外濾過したラクトアルブミンヒドロライゼート（ＬＨ）と組み 合わせた。というのは、予備実験によりＬＨが全く遅滞期なし七速い増殖速度を 支持することが示されているからである。

ＬＨは明らかに２ｇ／！イーストレート培養物の遅滞期を短縮し、そして最大細 胞密度を増加させた。しかしながら、ＬＨ無しでの４ｇ／！イーストし・−ト培 養物は、４ｇ／２イーストレート培地中で数継代間増殖させたＳｆ９細胞が明ら かにそれの阻害作用に適応したことを示す比較的短い遅滞期を証明した。

従ってこの例は、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍのペプトン組成を、ペプトン成分 として４　ｇ／１．のイーストレートのみかまたはイーストレートとＬＨ（各２ ｇ／ｌ）を含むように有利に変更できたことを示す。

■一旦 水溶性成分の削除：　ＩＳＦＭ−３およびＩＳＦＭ−４例５において記載された ペプトン変更と平行して、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍの他の成分の役割を調べ た。例３に示したように、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍは次の特定の水溶性成分 を含む：α−グリセロールホスフェート（Ｉｇ／／２）；グリセロール（２ｇ／ ｊ２）；葉酸（３，６ｇ／ｆ）；イノシトール（１０ｍｇ／４２）　；およびカ タラーゼ（３ｍｇ／ｆ）、最初の４つの前記成分は、別のレビドプテラン（Ｌｅ ｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫細胞系について文献中に記載された増殖刺激効果の ために無血清培地に加えられている（　Ｇｏｏｄｗｉｎら、ハＭ１国歌ａｔｅ方 生国竪（１９８０）、前掲〕。カタラーゼは、振盪フラスコ中のＳｆ９細胞を増 殖させるのに使用される十分な通気条件下で起こることが予想される過酸化損傷 からの保護剤として加えられている。

ＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍ培地からのこれらの水溶性成分の除去が、最大細胞 密度を維持しながら、遅滞期を短縮しそして比増殖速度を増加させるという細胞 増殖における有利な効果を存することがわかった。従って、無血清培地を、（１ ）基礎培地（ＩＰＬ−４１）　；　（２）プルロニックポリオール−液体エマル ション；および（３）任意のペプトン；を含むように単純化した。

ペプトン成分が２ｇ／！のイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）および２ｇ ／！のＬＨを含んで成る、ＢＳＡおよび水溶性成分を含まないＳＦＭ２ＭをＩＳ ＦＭ−３と命名し、そしてペプトン成分が４ｇ／２のイーストレート（Ｙｅａｓ ｔｏｌａｔｅ）を含んで成るそのような培地をＩＳＦＭ−４と命名した。ＩＳＦ Ｍ−３およびＩＳＦＭ−４培養物は両方とも良好に増殖したが、ＩＳＦ？！−４ 培養物の方がより長い遅滞期を有することがわかった。例えば、ＩＳＦＭ−３お よびＩＳＦＭ−４の組成は次のようである： せ狂Ｕ基礎培上 パ、゛・されたペプトン　４ｇ／ｌ プルロニックポリオールー２　エマルションプルロニツタボリオールＦ６８　１ ｇ／ｆタラ肝油　１０■／２ ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０　２５ｍｇ／　１コレステロール　４．５■／２ 酢酸α−トコフェロール　２■／２ ここで、ＩＳＦＭ−３については、前記限外濾過されたペプトンが２　ｇ／ｉの ラクトアルブミンヒドロライセード（Ｌａｃｔａｌｕｂｕ−ｍｉｎ　Ｈｙｄｒｏ ｌｙｓａｔｅ；ＬＨ）および２ｇ／！のイーストレート（Ｙｅａ　ｓ　ｔｏ　Ｉ 　ａ　ｔｅ）を含んで成り；ＩＳＦＭ−４については、前記限外濾過されたペプ トンが４ｇ／２のイーストレート（Ｙｅａｓ　ｔｏｌａ　ｔｅ）を含んで成る。

ＩＳＦＭ−４の遅滞期の問題を解決するために、イーストレート−供給バッチ培 養をテストした。２ｇ／Ｉ！、のイーストレートを含むＩＳＦ＋１培地を用いて 、Ｓｆ９細胞を１．２Ｘ１０６細胞数／ｍｌに増殖させた。その時点で、更に１ ｇ／！のイーストレートを培養物に添加した。次いで培養物を２．６Ｘ１０６細 胞数／ｄにまで増殖させ、そして更に２ｇ／！のイーストレートを培養物に添加 した。この方策は、より多量のイーストレートが供給された培養物において、短 縮された遅滞期（１５時間）、迅速な細胞増殖（１０％血清含有培地と同等）お よび増加された最大細胞密度（６−７Ｘ１０６細胞数／ｒｄまで）をもたらした 。

イーストレート−供給バッチアプローチ無しでのＩＳＦＭ−４培養の長い遅滞期 は、おそらくイーストレートの適応のために、培地中でのＳｆ９細胞の連続継代 の際には殆ど問題がなった。

培養物は、第３継代目までにはｌ５Ｆ１１−３およびＩＳＦＭ−４中で短い遅滞 期を伴って等しく良好に増殖した。第２表は、それらの２つの培地中での第８継 代の平均増殖特性を示す。それらの培地は、１０％血清含有培地において認めら れるものと同様な増殖速度（Ｔ　ｄ　＝１７−２４時間）および最大細胞密度（ ５Ｘ１０’細胞数／ｄ）を提供した。

ＩＳＦＭ−３１４２２５，Ｏ ＩＳＦＭ−４１５２２６，１ ＊遅滞期は、最初の細胞密度（ＩＸＩＯ’細胞数／ｍ１）に対する指数期プロッ ト（半対数の）を外挿することにより算出さ無血清培地中で増殖されそして組換 えバクロウィルスＡｃＭ４で感染された昆虫細胞による組換えＣ３Ｆ−１の生産 本発明の無血清培地中で２５−３０継代（７５−１２０世代）間増殖されたＳｆ ９細胞を、組換えバクロウィルスＡｃＭ４での感染によるｒＣＳＦ−１の生産に ついてテストした。第３表は、同様な指数増殖条件下でＡｃＭ４で感染されたそ のようなＳｆ９培養物を示す。そのような培養物は、上記の例において概説され た方法に従って増殖された。

第３表 ＡｃＭ４での感染５日後における種にの培地中で増殖しているＳｆ９細胞による ｒＣＳＦ−１の生産１０％血清”　３．２　９．１ ＢＳＡを含まないＳＦＭ２門　２．５　１０．２ＩＳＦＭ−３３，１１０，１ １’ＳＦ？Ｉ−４３，０９，９ ＊１０％血清は、ＴＰＢおよびＦＢＳを含むＩＰｌ、−４１完全培地である。

第３表に示されるように、全ての培養物が、ＲＩＡにより評価すると約１０’　 Ｕ　／ｄの同じレベルのｒＣＳＦ−１を生産した。

ｒＣＳＦ−１の生産は、ＢＳＡを含まないＳＦＭ２？ｌ培地により生じる遅い指 数増殖速度により影響されなかった。

何−主 ＢＳＡを含まない３１６２Ｍ　、　ｌ５Ｆ１１−３およびＩＳＦＭ−４へのＳｒ １の適応 １０％血清含有培地（ＴＰＬ−４１完全培地）中に維持された最初のＳｆ９細胞 が、第１および第２継代目にはＢＳＡを含まないＳＦＭ２Ｍ　、　ＩＳＦＭ−３ およびＩＳＦ？Ｉ−４に容易に適応することがわかった。その後の継代および組 換えバクロウィルスＡｃＦＩ４での感染は、上記の結果を立証し、そしてＢＳＡ を含まないＳＦＭ２Ｍ　。

ＩＳＦＭ−３およびｆＳＦＭ−４が昆虫細胞の大スケール増殖および組換えバク ロウィルス発現ベクター系を介した昆虫細胞による組換えタンパク質の生産に適 当な培地であることを示した。

ＩＳＦＭ−４中で増殖されそして組換えバクロウィルスＡｃＭ６で感染された昆 虫細胞による組換えＣ３Ｆ−１の生産Ｓｆ９細胞の５０成培養物をＩＳＦ？Ｉ− ４中で２７°Ｃにて１０１００−１５Ｏｒｐ　１　／　２インチの軌道半径で） において撹拌しながら２５０雁の振盪フラスコ中で増殖させた。組換えバクロウ ィルスＡｃＭ６を用いて、指数的に増殖している培養物を１のＭｏ１（感染多重 度）において感染させた。

ｒＣＳＦ−１を収穫する最適な時期を決定するために、組換えバクロウィルスで の感染後毎日、培養物の試料を取出し、遠心しそして直ぐに凍結した。ウェスタ ンブロッティング、ＲＩＡおよび骨髄アッセイを使って、それらの試料をｒＣＳ Ｆ−１について分析した。０．１　Ｍ　ＮａＰＯａ　（ｐ）１６．８　）中に透 析されそしてβ−メルカプトエタノールで還元されている、６００ＲＩＡ単位を 含有する試料を、ウェスタン分析のために５Ｏ３−ＰＡＧＥにかけた。

Ｅ、コリからの変性された単量体の１８に−Ａ　ｒＣＳＦ−１（１５８アミノ酸 ）に対するウサギ抗血清をｒＣＳＦ−１の検出のための一次抗体として用いた。

ヤギの抗−ウサギＩｇＧに続いて１２５Ｉ−プロティンＡでのヨウ素化によりプ ロットを現象し、そしてオートラジオグラフィーによりタンパク質を可視化した 。

第１図は、培地中のｒＣＳＦ−１濃度（上のパネル）、昆虫細胞の生存度（中の パネル）およびｒＣＳＦ−１均質性のウェスタン分析、の時間推移をしめす。ｒ バクロウィルスでの感染の日には、ＲＩＡによりごく微量レベルの分泌されたｒ ＣＳＦ−１のみが存在した（上のパネル、第０日）。ｒＣＳＦ−１濃度（ＲＩＡ による）は第４日まで増加し、そして８　Ｘｌ０５Ｕ／戚のピークに達した。骨 髄アッセイはこのＲＩＡデータを支持した。

培養上清の毎日の試料の各々からの６００ＲＩＡ単位のウェスタンプロット分析 （下のパネル）は、感染後１〜３日目はｒＣＳＦ−１が約４０にの三重バンドと ７０にの一重バンドから成ることを示した。４日目には、４５Ｋ　、　３５Ｋ　 、　２５におよび２０にの見掛けのサイズの新しい４本のｒＣＳＦ−１バンドが 現れた。４日目までのｒＣＳＦ−１におけるこの主要な変化は、感染／生産過程 の迅速な死滅と相関していた（上のパネル）。ｒＣＳＦ−１の生物活性は保持さ れるけれども（骨髄アッセイにより確認すると）、該タンパク質のサイズおよび 不均質性が変化した。このことは、このＡｃＭ４　ｒＣＳＦ−１の収穫の時期が 、最も好ましいｒＣＳＦ−１生産物を得るために最適化され得ることを示唆して いる。

ＡｃＭ６による昆虫細胞の感染により生産されるｒＣＳＦ−１の不安定性とは反 対に、上記の例７に従ってＡｃＭ４で感染された昆虫細胞により生産されるｒＣ ＳＦ−１は、細胞死滅期に至るまでおよび怒染後５日目までサイズまたは不均質 性が有意に変化しなかった。

肱−輪 要約すれば、本発明の無血清培地は、撹拌および／または散布された、好ましく は充分に通気された条件下での昆虫細胞ノ大スケール増殖のため、および組換え バクロウィルス発現系を介した組換えタンパク質の生産またはウィルスでの感染 による他のウィルス生産物の生産のための、単純化された低コストの培地を提供 する。そのような培地は、それらの低または木質的にゼロのタンパク質含量、血 清の欠損、およびそれのペプトン成分の限外濾過により、組換えタンパク質の精 製を簡易化する。

寄−１ 上述したように、Ｅ、コリ　？ｌ？Ｉ２９４中の組換えバクロウィルス転移ベク ターｐＡｃＭ４およびｐＡｃＭ６は、１９８７年６月１２日、アメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）　（１２００１Ｐａｒｋｌａｗｎ　 Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　２０８５２（Ｕ、Ｓ、八、）〕に、そ れぞれＡＴＣＣＮｏ、６７４２９および６７４２８のもとに寄託された。

前記寄託はＡＴＣＣと本特許出願の譲受人Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｒａｔｉｏｎと の間の契約に従って行われた。ＡＴＣＣとの契約は、該寄託物を記載および同定 している本出願に関連する米国特許の発行またはいずれかの米国もしくは外国の 特許出願の公告もしくは公開後における前記株およびその子孫の永久的入手可能 性、並びに米国特許庁長官により３５　ＬＩＳＣａ１２２およびそれに準じた施 行規則（８８６０Ｇ　６３８に関する３７　ＣＦＲ０１，１４を含む）に従って 権利を与えられることが決定された人への咳株およびその子孫の入手可能性を保 証する。本出願の譲受人は、寄託中の株が適当な条件下で培養された時に死滅す るかまたは損失もしくは破壊された場合に、通知の俊速やかに同−株の生存培養 物でそれが置き換えられることに同意する。ブタペスト条約の規定のもとで、寄 託物は、寄託された前記培養物が、いかなる場合においても寄託の日から少なく とも３０年間の間、および寄託微生物の試料の分譲に係る請求があった場合には 、当該最新の請求をＡＴＣＣが受領した後少なくとも５年間は、生存可能で且つ 汚染させることのない条件下で保管されるだろう。

寄託された株の入手可能性は、いずれかの政府当局のもとにその特許法に従って 認められる権利に反して本発明を実施する承諾であると解釈してはならない。

また、本発明は、寄託された組換え伝達ベクターにより範囲を限定されるものと 解釈してはならない。というのは、寄託されたベクターは、本発明の特定の観点 の例示であるとしてのみ意図されるからである。宿主昆虫細胞に感染すると組換 えタンパク質を生産させる作用をし得る組換えバクロウィルスを調製するために 使用することのできるいずれの組換えバクロウィルス伝達ベクターでも、本発明 の範囲内にあると考えられる。更に、本明細書中に指示および記載されたものに 加えて、前の説明から当業者に明らかである本発明の種々の変更は、添付された 請求の範囲内であるとみなされる。

１８−　＃ 感染１斐の臼饗ズ。

掩工し中で−のヅ古４生 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２４４３ ２、発明の名称 昆虫細胞の増殖およびそれによる生産物の発現のための無血清培地 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 平成２年１１月６日（発送日） ６、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　通特表千３−５００６０２（１Ｂ） ｌ剛−自＋１６ｆｉｌｌ＾−１１１ｍｍ　ｌＩ＠、ＰＣＴ／ＪＳＢＢ１０２４ｂ ５

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．昆虫細胞の大スケール増殖並びに血清含有培地において達成されるレベルに 匹敵するレベルでの昆虫細胞による組換え生産物およびウイルス生産物の生産を 支持し、そして（ａ）基礎培地； （ｂ）脂質成分；および （ｃ）ペプトン成分 を含んで成る無血清培地。
2. ２．保護剤を更に含んで成る、請求項１に記載の無血清培地。
3. ３．前記組換え生産物が、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイ キン、腫瘍壊死因子、エリスロポイエチン、ヒト、プタもしくはウシの成長ホル モン、表皮増殖因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、改変されたプロウロキナー ゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ＴＰＡ−ウロキナーゼハイブ リッドタンパク質、Ｂ型肝炎ワクチンタンパク質、ネコ白血病ウイルスワクチン タンパク質、スーバーオキシドジスムクーゼ、心房性ナトリウム利尿因子、完全 リシン毒素、リシンＡ鎖、リシンＡハイブリッドタンパク質、レクチン、ジフテ リア毒素、ゲロニン、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素、ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩ，ＰＡＰ−Ｓ、ＣＡ Ｔ、またはバシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質である、請求項１に記載の無血清培地。
4. ４．前記脂質成分がミクロエマルションの形である、請求項３に記載の無血清培 地。
5. ５．前記基礎培地が、無機塩、糖、アミノ酸の栄養素混合物であり、更にビタミ ン、有機酸および／または緩衝剤を含むことがある、請求項２に記載の無血清培 地。
6. ６．前記保護剤がヒドロキシエチルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメ チルセルロース、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドン、フィコール、アル ギン酸、ポリプロピレングリコールおよび非毒性重合体洗剤から成る群から選択 され； 選択された前記保護剤が乳化性質を有さない場合には乳化剤を更に含んで成り； 前記脂質成分の乳化剤がリン脂質および／または非毒性非イオン性重合体洗剤で あり； 有機溶媒が１〜３個の炭素原子を含むアルコールであり；前記脂質成分の脂質が 脂肪酸、ステロイドおよび脂質可溶性ビタミンから成る群から選択され；そして 前記ペプトン成分が約１ｇ／ｌ〜約１２ｇ／ｌの全濃度にて存在する、 請求項５に記載の無血清培地。
7. ７．前記保護剤が非毒性非イオン性重合体洗剤であり；前記脂質成分の乳化剤が レシチンおよび／または次の式を有するポリソルベート化合物； ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、Ｒは１６〜２０（１６と２０を含む）個の炭素原子を有する飽和また は不飽和脂肪酸であり；ｔは１０〜３０（１０と３０を含む）の整数であり；ｕ は１０〜２０（１０と２０を含む）の整数である〕であり； 有機溶媒がエタノールであり； 前記脂質成分の脂質が脂肪酸エステル、ステロール、ビタミンＡおよびα−トコ フェロールから成る群から選択され；そして 前記ペプトン成分のペプトンがカゼイン消化物、ウシ肝臓消化物、酵母抽出物、 トリプトースホスフェートブロス（ＴＰＢ）およびラクドアルブミンヒドロライ ゼート（ＬＨ）から成る群から選択される、 請求項６に記載の無血清培地。
8. ８．前記非毒性非イオン性重合体洗剤がプロピレンオキシドとエチレンオキシド とのブロックコポリマーであり；前記脂質成分の脂質が多不飽和脂肪酸エステル 、ステロール、ビタミンＡおよびα−トコフェロールから成る群から選択され； そして 前記ペプトン成分のペプトンがバンミード（ＰａｎＭｅａｄｅ）、ＴＰＢ、酵母 抽出物、バクトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ）およびラクドアルブミ ンヒドロライゼート（Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ　Ｈｙｄｒｏ−ｌｙｚａｔｅ；Ｌ Ｈ）から成る群から選択される、請求項７に記載の無血清培地。
9. ９．前記非毒性非イオン性重合体洗剤がブルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリ オールであり；前記脂質成分の乳化剤がレシチンおよび／またはポリソルベート ８０であり； 前記脂質成分の脂質が多不飽和脂肪酸メチルエステルの混合物、ステロール、ビ タミンＡおよびα−トコフェロールから成る群から選択され；そして 前記ペプトン成分が、約０ｇ／ｌ〜約５ｇ／ｌの濃度のＴＰＢ、各々が約０ｇ／ ｌ〜約５ｇ／ｌの濃度であるバクトカシトン（Ｂａｃｔｏｃａｓｉｔｏｎｅ）お よびパンミード（ＰａｎＭｅａｄｅ）、約０ｇ／ｌ〜約６ｇ／ｌの濃度の酵母抽 出物、並びに約０ｇ／ｌ〜約６ｇ／ｌの濃度のＬＨから成る群から選択される、 請求項８に記載の無血清培地。
10. １０．前記基礎培地がＩＰＬ−４１であり；前記プルロニックポリオールがブル ロニックＦ６８，Ｆ７７，Ｆ８８およびＦ１０８から成る群から選択され；前記 脂質成分の脂質が魚肝油、コレステロールおよびα−トコフェロールから成る群 から選択され；そして前記ペプトンが酵母抽出物およびＬＨから成る群から選択 される、 請求項９に記載の無血清培地。
11. １１．前記ブルロニックポリオールがプルロニックＦ６８およびプルロニックＦ ８８から成る群から選択され；前記脂質成分の脂質がたら肝油およびコレステロ ールから成る群から選択され；そして 前記ペプトンがイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）およびＬＨから成る群 から選択される、 請求項１０に記載の無血清培地。
12. １２．前記脂質成分が、約１ｍｇ／ｌ〜約５０ｍｇ／ｌの濃度のたら肝油、約２ ｍｇ／ｌ〜約７ｍｇ／ｌの濃度のコレステロール、約０．５ｍｌ／ｌ〜約５ｍｌ ／ｌの濃度のエタノール、約２０ｍｇ／ｌ〜約３０ｍｇ／ｌの濃度のポリソルベ ート８０、および約０．５ｍｇ／ｌ〜約４ｍｇ／ｌの濃度のα−トコフェロール を含んで成り；そして 前記ペプトン成分が約３ｇ／ｌ〜約５ｇ／ｌの全濃度にて存在する、 請求項１１に記載の無血清培地。
13. １３．前記ブルロニックポリオールが約０．０５％〜約０．５％の濃度のブルロ ニックＦ６８であり；そして前記脂質成分が、約５ｍｇ／ｌ〜約１５ｍｇ／ｌの 濃度のたら肝油、約３ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌの濃度のコレステロール、約１ｍ ｌ／ｌの濃度のエタノール、約２５ｍｇ／ｌの濃度のポリソルベート８０、およ び約２ｍｇ／ｌの濃度のα−トコフェロールを含んで成る、 請求項１１に記載の無血清培地。
14. １４．前記ブルロニックＦ６８が約０．１％の濃度であり；前記たら肝油が約１ ０ｍｇ／ｌの濃度であり；前記コレステロールが約４．５ｍｇ／ｌの濃度であり ；そして前記ペプトン成分が約２ｇ／ｌ〜約５ｇ／ｌの濃度のイーストレートお よび約１ｇ／ｌ〜約４ｇ／ｌの濃度のＬＨを含んで成る、 請求項１３に記載の無血清培地。
15. １５．前記ペプトン成分が限外濾過されておりそして各々が約０．５ｇ／ｌ〜約 ４ｇ／ｌの濃度であるイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）とうクドアルブ ミンヒドロライゼート（Ｌａｃｔ−ａｌｂｕｍｉｎ　Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ） との組合せを含んで成る、請求項１４に記載の無血清培地。
16. １６．ＩＳＦＭ−３またはＩＳＦＭ−４と命名された無血清培地。
17. １７．無機塩、糖、アミノ酸を含有し、そして更にビタミンおよび有機酸を含有 することがある栄養素混合物中で昆虫細胞による組換え生産物およびウイルス生 産物の生産のために昆虫細胞を培養および繁殖させることを含んで成る方法にお いて、血清および／または血清アルブミンを脂質成分およびペプトン成分で置き 換えることを含んで成る改良方法。
18. １８．前記改良が血清および／または血清アルブミンに代わる代替品として保護 剤を添加することを更に含んで成る、請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記脂質成分がミクロエマルションの形で添加される、請求項１７に記載 の方法。